CN115094163A

CN115094163A - 一组快速检测新冠病毒s基因点突变的核酸探针及方法

Info

Publication number: CN115094163A
Application number: CN202210542888.6A
Authority: CN
Inventors: 罗志丹; 许恒皓; 王欣竹; 张新亚; 卢辰; 张建; 吴芳
Original assignee: Marine Resources Development Institute Of Jiangsu (lianyungang)
Current assignee: Marine Resources Development Institute Of Jiangsu (lianyungang)
Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2022-05-18
Publication date: 2022-09-23

Abstract

本发明公开了一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针及方法，包括检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP‑1，超分支滚环扩增引物组RCA‑F和RCA‑R以及检测扩增产物所用sgRNA，所述检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP‑1，超分支滚环扩增引物组RCA‑F和RCA‑R均为单链DNA；所述锁式探针PLP‑1的核苷酸碱基序列为SEQIDNo.1所示，其中5’端具备磷酸化修饰；所述超分支滚环扩增引物组包含2条引物，核苷酸碱基序列分别为为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。本发明将锁式探针、超分支滚环扩增反应和CRISPR/Cas12技术联用，可以检测长度低至50nt、高度降解的碎片化病毒RNA中所含有的点突变，操作简单，灵敏度高，反应时间短。

Description

一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针及方法

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学领域，具体为一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针及方法。

背景技术

新冠病毒属于单链正义RNA病毒，在复制过程中十分容易发生突变。目前世界卫生组织认定需要关注的变异毒株有“阿尔法” (Alpha)、“贝塔”(Beta)、伽玛”(Gamma)、“德尔塔”(Delta)和“奥密克戎”(Omicron)等。这些突变株与新冠病毒原始毒株相比，传染性和毒性都发生了很大改变。奥密克戎(Omicron)突变株是目前突变最多、最传染力最强的新冠病毒变异株，其刺突蛋白(S蛋白)至少包含32个突变位点，其中，H655Y、N679K和P681H突变会增强刺突蛋白的切割和与宿主细胞的融合，可能与传播性增加有关；如何在病毒核酸检测时快速区分这些突变位点，一直是研究者关注的重要问题。

新冠病毒的遗传物质为单链RNA，相对双链DNA而言更加不稳定，当采样、核酸提取和保存过程中操作不当，或存在核酸酶、酸、碱等物质时，很容易降解，断裂为小片段。

目前主流的核酸点突变检测手段包括探针法荧光定量PCR和测序法。测序法最为准确，但耗时较长，不利于临床快速检测；探针法荧光定量PCR检测RNA病毒上的点突变，首先需要将病毒RNA逆转录为cDNA，然后使用一对根据突变位点上下游设计的PCR引物，以及一条覆盖突变位点的Taqman-MGB荧光探针进行荧光定量PCR；由于Taqman探针需要设计在两条引物之间，探针法荧光定量PCR需要的模板长度一般不低于100nt，如果病毒核酸在提取和保存过程中受到破坏，碎片化程度较严重，则难以检测。

发明内容

本发明的目的是提供一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针，包括检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP-1，超分支滚环扩增引物组RCA-F和RCA-R以及检测扩增产物所用 sgRNA，所述检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP-1，超分支滚环扩增引物组RCA-F和RCA-R均为单链DNA；所述锁式探针PLP-1的核苷酸碱基序列为SEQ IDNo.1所示，其中5’端具备磷酸化修饰；所述超分支滚环扩增引物组包含2条引物，核苷酸碱基序列分别为为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

作为本发明的一种优选技术方案，所述检测扩增产物所用sgRNA 的核苷酸碱基序列为SEQ ID No.4。

一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法，具体步骤如下：

步骤一：获取病毒RNA；

步骤二：以步骤一获取的RNA为模板，加入锁式探针PLP-1和连接酶，配制连接反应混合液，进行连接反应；

步骤三：使用超分支滚环扩增引物组RCA-F和RCA-R和具备链置换活性的DNA聚合酶对步骤二的反应产物进行滚环扩增反应；

步骤四：检测扩增产物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤二中的连接反应中，所用的连接酶是Splint R ligase。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤三中的滚环扩增反应中，所用的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤四中检测扩增产物是利用CRISPR/Cas技术检测扩增产物，所用Cas核酸酶是Cas12b。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤二中的连接反应混合液，包括DNA连接酶、RNA模板、锁式探针、反应缓冲液和去离子水。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤三中滚环扩增反应的混合液，包括DNA聚合酶、步骤二所得的产物、扩增引物对、反应缓冲液和去离子水。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤二中的连接反应混合液中，引物的工作浓度是0.5-10nmol/L；所述步骤二中的连接反应条件为25℃，15-60min。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤三中的滚环扩增反应条件为50-65℃，15-60min。

本发明的有益效果：本发明与现有逆转录-探针法荧光定量PCR 技术只能检测长度在100nt以上的RNA模板进行对比，本发明可以检测长度低至40-50nt、高度降解的RNA中所含有的点突变，只需普通恒温设备和简单荧光仪即可进行，不需要PCR仪器，操作简单，效率高，速度快，而且还可以推广到其他点突变检测。

附图说明

图1：为本发明的原理模块图；

图2：为本发明的灵敏度检测结果图；

图3：为本发明将Splint R DNA连接酶换为Taq DNA连接酶的效果图。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明提供一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针，包含一组核酸探针，具体包括检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP-1，超分支滚环扩增引物组RCA-F和RCA-R以及检测扩增产物所用sgRNA；核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、 SEQID No.3和SEQ ID No.4。

步骤一：采用常规的分子生物学方法获取新冠病毒S基因RNA；

步骤二：以步骤一获取的病毒S基因RNA为模板，加入锁式探针PLP-1和连接酶，配制连接反应混合液，进行连接反应，只有含有 N679K突变的RNA模板，能够使锁式探针连接为单链环状DNA；不含该突变的RNA样品中，锁式探针末端无法连接，仍为线状DNA，连接反应条件为25℃，15-60min；

步骤三：使用滚环扩增引物RCA-F和RCA-R和具备链置换活性的DNA聚合酶对步骤二的反应产物进行滚环扩增，以N679K突变获得的环状DNA为模板，能够产生滚环扩增产物；而野生型病毒RNA 无法产生环状DNA，不能进行滚环扩增反应，滚环扩增反应条件为 50-65℃，15-60min；

步骤四：向步骤三的产物中加入Cas12核酸酶和sgRNA，以及单链荧光探针，检测扩增产物，N679K突变获得的滚环扩增产物，带有突变上下游特有序列，能够与sgRNA配对，激活Cas12蛋白的反式切割活性，从而切割单链荧光探针产生荧光信号；而野生型不能进行滚环扩增，无法激活Cas12蛋白。

实施例1：

检测长度仅为50nt的新冠病毒S基因模板；

步骤(1)：以含有新冠病毒奥密克戎变异株S基因的重组质粒 (购自通用生物(安徽)股份有限公司)进行常规PCR和体外转录，获取含有N679K点突变、长度为50nt RNA片段，用来模拟碎片化病毒RNA；用同样方法获得野生型新冠病毒S基因同源区域RNA片段，作为对照。

步骤(2)：将步骤(1)中获取的突变体和野生型RNA模板分别稀释到5fmol/L、0.5fmol/L、0.05fmol/L；同时设置不加模板和不加入探针的模板作为对照，分别进行连接反应；反应体系包括：1.25 U Splint R DNA连接酶(NEB，货号M0375)、1μL RNA模板、1μLPLP-1锁式探针(0.1μmol/L)、2μL 10X反应缓冲液，无酶原水加至 20μL；25℃下孵育15min。

步骤(3)：取4μL步骤(2)的产物，加入2.5μL 10×Bst DNA 聚合酶缓冲液，0.75μLdNTPs(10mmol/L)，1.25μL引物对 RCA-F/RCA-R(10μmol/L)，4U Bst DNA聚合酶(NEB,货号M0275)，无酶原水补齐至25μL，65℃孵育20min；

步骤(4)：取4.5μL步骤(3)的产物，加入2μL Cas12b(上海惠诚生物科技有限公司，货号HA11504)，1μL sgRNA，1μL 10× TOLO缓冲液，0.5μL荧光探针(5’-HEX-TTTTT-LFN-3’)，1μL牛磺酸(500mmol/L)，60℃孵育30min，荧光仪通道设置为HEX，采集荧光信号。

结果如附图2所示：当模板量低至0.5fmol/L时，N679K突变体荧光信号仍与不加模板的对照、以及野生型对照有显著差异，表明对于长度仅为50nt的新冠病毒S基因单点突变体，本方法检测灵敏度可达0.5fmol/L，总反应时间不超过1h，且全部为恒温反应，对设备要求较低。

实施例2：

不同连接酶效果对比：

将实施例1的步骤(2)所用连接酶改为HiFi Taq DNA连接酶 (NEB，货号M0647)，反应体系变为：1μL HiFi Taq DNA连接酶、 1μL RNA模板、1μL PLP-1锁式探针(0.1μmol/L)、2μL 10X反应缓冲液，无酶原水加至20μL；反应程序为：①95℃3分钟，②95℃ 30秒，③58℃4分钟；其中②③重复35个循环，其余步骤均不变。

结果如图3所示，突变体模板浓度在50fmol/L时尚可与对照区分，到5fmol/L与对照无显著差异，表明本方法中，Taq DNA聚合酶的效果远不如Splint R DNA连接酶。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏省海洋资源开发研究院（连云港）

<120> 一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttagtctgag tctgataact agcgcgtccg tccaaccgtc tgtgcttatg ttatgcgatg 60

ctacactacg tgcccgccga ggagac 86

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtccgtccaa ccgtctgtgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatcgcata acataagcac 20

<210> 4

<211> 111

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gucuagagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggcc acuuuccagg uggcaaagcc 60

cguugagcuu cucaaaucug agaaguggca cgaaaacuuc aagauguggu c 111

Claims

1.一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针，包括检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP-1，超分支滚环扩增引物组RCA-F和RCA-R以及检测扩增产物所用sgRNA，其特征在于，所述检测新冠病毒S基因N679K突变的锁式探针PLP-1，超分支滚环扩增引物组RCA-F和RCA-R均为单链DNA；所述锁式探针PLP-1的核苷酸碱基序列为SEQ ID No.1所示，其中5’端具备磷酸化修饰；所述超分支滚环扩增引物组包含2条引物，核苷酸碱基序列分别为为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

2.根据权利要求1所述的一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针，其特征在于：所述检测扩增产物所用sgRNA的核苷酸碱基序列为SEQ ID No.4。

3.一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法，其特征在于：具体步骤如下：

步骤一：获取病毒RNA；

步骤四：检测扩增产物。

4.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法，其特征在于：所述步骤二中的连接反应中，所用的连接酶是Splint R ligase。

5.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法，其特征在于：所述步骤三中的滚环扩增反应中，所用的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。

6.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法，其特征在于：所述步骤四中检测扩增产物是利用CRISPR/Cas技术检测扩增产物，所用Cas核酸酶是Cas12b。

7.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法，其特征在于：所述步骤二中的连接反应混合液，包括DNA连接酶、RNA模板、锁式探针、反应缓冲液和去离子水。

8.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法，其特征在于：所述步骤三中滚环扩增反应的混合液，包括DNA聚合酶、步骤二所得的产物、扩增引物对、反应缓冲液和去离子水。

9.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法，其特征在于：所述步骤二中的连接反应混合液中，引物的工作浓度是0.5-10nmol/L；所述步骤二中的连接反应条件为25℃，15-60min。

10.根据权利要求3所述的一组快速检测新冠病毒S基因点突变的核酸探针的方法，其特征在于：所述步骤三中的滚环扩增反应条件为50-65℃，15-60min。