CN111575352A - 一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，该方法通过CRISPR/Cas9的可编程切口功能实现ssRNA和ssDNA的点特异性切割，以产生所需要的单链DNA片段，该片段在3'端具有特定的序列，可以用作引物来激发EXPAR进行指数扩增，从而实现对不同靶标序列ssRNA和ssDNA可视化检测。本发明具有成本低，操作简便，效率高，灵敏度高和特异性强，结果读取简单，减少了对热循环仪器和精密信号采集仪器的依赖。为单链核苷酸的检测提供了新思路和新选择，也将在临床诊断和生物医学研究中发挥关键作用，具有良好的应用前景。

Description

一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或 ssDNA的方法

技术领域

本发明涉及生物医学监测技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法。

背景技术

对于大多数RNA病毒而言，以单链RNA(ssRNA)的形式感染生物，部分DNA病毒以单链DNA(ssDNA)形式进行复制。此外，人体中许多RNA以单链形式存在以执行其特定功能。因此，快速准确检测单链特异性核酸在疾病诊断和病理分析中起着至关重要的作用。同时核酸序列中的单碱基改变，是构成细菌、病毒以及肿瘤抗药性的遗传学基础，同时也和多种疾病有密切关系。所以快速准确的检测出核酸序列中的单碱基改变，同样对生物研究与疾病诊断都将具有重要的作用。

目前，关于核酸的检测方法研究者们已开发了如基于核酸聚合酶、核酸水解酶、脱氧核酶和纳米材料等的多种核酸信号放大技术。比如，目前最多的是基于聚合酶链式反应(PCR)的信号放大技术，即在PCR体系中加入分子信标，通过分子信标与PCR产物的结合来释放荧光，这种方法不仅需要精密的变温控制仪器并且对单链寡核苷酸的检测有一定局限性。研究者们还开发了一种基于核糖核酸酶H(RNaseH)的单循环核酸信号放大技术，即通过环部带有RNA序列的分子信标与目标DNA杂交，在RNaseH的作用下将分子信标的RNA部分水解，从而释放荧光基团。虽然这种技术的目标序列可以为单链寡核苷酸，但由于其为单循环线性信号放大技术，信号放大效率较低从而一定时间内产生的信号强度不足，导致检测灵敏度较低。从而限制了上述方法在实际中的应用范围。

近几年发展起来的恒温扩增技术是用于核酸检测最常用于信号放大的方法，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景，包括滚环扩增(RCA)、催化发夹装配技术(CHA)、杂交链式反应(HCR)、链置换扩增(SDA)和EXPAR。其中，RCA方法涉及繁琐的DNA探针连接过程和引物-模板比例的调整，熵变化驱动的CHA和HCR扩增效率低，且容易引起背景干扰。EXPAR和SDA的高扩增效率使其成为有效的核酸检测扩增策略。然而，ssRNA和ssDNA具有较长的核苷酸序列和不确定的3'末端，这使得ssRNA和ssDNA不能直接用作引发扩增反应的引物。因此，建立用于测量ssRNA和ssDNA的准确而有效的策略仍然是一项极富挑战性的任务。

CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有古细菌中的一种免疫系统，用于抵抗外源物质的入侵。CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)是成簇的规律间隔的短回文重复序列，该系统通过对入侵的病毒核酸进行特异性的识别，利用CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)切割外源核酸从而达到防御的目的。近年来，CRISPR/Cas系统作为一种基因工程中非常重要的工具被广泛应用于基因编辑、基因表达调控及基因检测等研究中。

发明内容

针对上述现有检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，旨在解决传统长链ssRNA或ssDNA检测成本高、对热循环设备依赖性、要求检测人员具有较深的专业知识等问题，以及ssRNA和ssDNA具有较长的核苷酸序列和不确定的3'末端，不能直接应用于链置换扩增(SDA)、EXPAR等恒温扩增技术的问题，使ssRNA和ssDNA现场可视化检测成为可能。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，包括以下步骤：

1)将不同浓度待检测的靶基因、PAMmer、Cas9与sgRNA以适当比例混合于缓冲溶液中，并于37℃条件下孵育30～60min，得到点特异性切割产物；所述靶基因为ssRNA或ssDNA，所述PAMmer与待测靶基因相匹配，所述sgRNA包括锚定序列和引导区序列，所述锚定序列与Cas9蛋白特异性识别，所述引导区序列与所述靶基因的片段相匹配；

2)将步骤1)中得到的点特异性切割产物加入到EXPAR反应体系中进行扩增反应，经phi29DNA聚合酶延伸和Nb.BbvCI选择内切酶切割，得到富G序列的扩增产物；

3)向步骤2)得到的富G序列的扩增产物中加入含K⁺缓冲液和hemin溶液充分反应，再加入过量的ABTS和H₂O₂孵育5min，使富G序列的扩增产物与hemin结合形成G-四链体能够充分反应完全，再用紫外可见分光光度计检测反应体系的紫外可见光的吸收强度；

4)根据不同浓度靶基因的标准溶液做靶基因浓度-紫外可见光的吸收强度的标准曲线，计算回归方程，再根据待测溶液的紫外可见光的吸收强度，计算待测溶液中靶基因的浓度。

本发明通过CRISPR/Cas9的可编程切口功能实现ssRNA和ssDNA的点特异性切割，以产生所需要的单链DNA片段，该片段在3'端具有特定的序列，可以用作引物来激发EXPAR进行检测，该系统中可以人为设计sgRNA中与目标ssRNA或ssDNA互补的spacer区(20nt)从而实现对不同靶标序列ssRNA和ssDNA可视化检测。

作为优选的，所述的sgRNA是通过部分互补的两条DNA单链重叠延伸获得转录模板，再将所述转录模板进行转录得到。

作为优选的，所述重叠延伸的程序：95℃×3min；30个热循环：95℃×20s，52℃×30s，72℃×25s；72℃×10min。

作为优选的，步骤1)中所述PAMmer、Cas9与sgRNA的摩尔比为1:1:1。

作为优选的，步骤1)中所述待检测的靶基因在反应体系中的终浓度为100aM～2.5nM。

作为优选的，步骤2)中所述EXPAR反应体系包括0.3U/μLphi29DNA聚合酶，0.4U/μLNb.BbvCI，1×DNA聚合酶缓冲液，1×CutSmart缓冲液，0.5mMdNTP和10nMEXPAR模板；扩增反应温度为30～45℃，反应时间为1～2h；所述点特异性切割产物作为引物与EXPAR模板相匹配，并延伸合成双链DNA。DNA聚合酶同时具有链延伸和置换功能，Nb.BbvCI内切酶在特定识别位点切割双链DNA中的一条链。

作为优选的，所述phi29DNA聚合酶还可以是KlenowFragment(exo-)DNA聚合酶或vent(exo-)DNA聚合酶。

作为优选的，步骤3)中所述反应温度为30～45℃，反应时间为10～40min。

作为优选的，步骤3)中所述吸收强度为420nm处的紫外吸收信号，检测范围400nm～460nm。

本发明还提供了上述方法在检测ssRNA或ssDNA单碱基突变中的应用。

本发明检测原理为：如图1A所示，Cas9与sgRNA组装在一起形成Cas9/sgRNA二元复合物。靶标ssRNA(或ssDNA)与PAMmer序列杂交。随后，Cas9识别PAMmer序列上的“NGG”(PAM)位点，并促进sgRNA的20nt引导区序列与ssRNA(或ssDNA)靶序列杂交，形成20bp异源双链体。Cas9对异源双链体的PAM附近的特定位置进行剪切，从而释放出目标ssRNA或ssDNA的点特异性切割片段(P1)。

如图1B所示，以G4-EXPAR(包括X-Y-Y区域)为模板，以点特异性切割片段P1(能特异性的与X区域结合)为引物，在phi29DNA聚合酶的作用下，沿模板的3’端向5’端延伸，延伸的过程中形成双链DNA，在Nb.BbvCI内切酶的作用下激活了次级聚合酶延伸，所产生的链置换效应释放前期的P2和P3产物(图1B中的循环1)。此外，P2和P3还可以用作引物，与G4-EXPAR模板中间的Y区域组装在一起，并通过聚合酶延伸和链置换循环积聚大量扩增产物P2和P3产物(图1B中的循环2)。富G序列的扩增产物(P2和P3)在K⁺的辅助下，可与hemin结合形成G-四链体，具有过氧化氢模拟酶的催化活性。G-四链体/hemin催化H₂O₂分解产生大量的活性氧(ROS)，导致ABTS被氧化成ABTS^·+，颜色由无色变为鲜绿色。因此，Cas-G4EX系统可实现对ssRNA和ssDNA的无标记、点特异性的可视化检测。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过CRISPR/Cas9的可编程切口功能实现ssRNA和ssDNA的点特异性切割。以产生所需要的单链DNA片段，该片段在3'端具有特定的序列，可以用作引物来激发EXPAR进行指数扩增，实现了对任意序列ssRNA和ssDNA的可视化检测。从而解决了长链ssRNA和ssDNA无固定的3’末端，无法作为引物进行链置换扩增(SDA)、EXPAR等恒温扩增的难题。

2、本发明的检测方法整合了CRISPR/Cas9的点特异性识别和切割以及G4-EXPAR的高扩增效率，提供多级信号放大策略，实现高灵敏度对ssRNA和ssDNA检测的新方法，对ssRNA的检测限为250aM，对ssDNA的检测限为100aM。同时本发明Cas-G4EX系统在实际样本检测中具有极其重要的实用价值。本发明为单链核苷酸的检测提供了新思路和新选择，也将在临床诊断和生物医学研究中发挥关键作用，具有良好的应用前景。

3、本发明的检测系统具有响应速度快、准确性高、重复性好、操作简便，灵敏度高和特异性强，结果读取简单，减少了对热循环仪器和精密信号采集仪器的依赖。

4、本发明首次利用PAMmer辅助CRISPR/Cas9系统的单链核酸切割活性，用于ssRNA或ssDNA单碱基突变的检测，扩大了CRISPR/Cas9系统的检测和应用范围，并提供了可行性的理论基础。

附图说明

图1为本发明检测系统对ssRNA/ssDNA检测原理图。

图2为本发明检测系统对ssDNA的灵敏度分析图；图A为不同浓度ssDNA的紫外可见光吸收光谱图；图B为对应的取对数拟合的标准曲线图。

图3为本发明检测系统对ssDNA单碱基突变特异性分析图；图A为CRISPR/Cas9点特异性切割ssDNA的示意图；图B为不同单碱基突变ssDNA在紫外可见光吸收光谱图；图C为不同单碱基突变ssDNA的紫外可见光光谱响应图。

图4为本发明检测系统对ssRNA的灵敏度分析图；图A为不同浓度ssRNA的紫外可见光吸收光谱图；图B为对应的取对数拟合的标准曲线图。

图5为本发明检测系统对ssRNA单碱基突变特异性分析图；图A为CRISPR/Cas9点特异性切割ssRNA的示意图；图B为不同单碱基突变ssRNA在紫外可见光吸收光谱图；图C为不同单碱基突变ssRNA的紫外可见光光谱响应图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

以下实施例所有核酸序列由上海生物有限公司合成，并采用高效液相色谱进行纯化。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1Cas-G4EX检测系统用于ssDNA的检测

本实施例中待检测的靶基因ssDNA的序列如下：

5'-CGTAAGTCTCCGAGGTTGCCATCGATGATTTGAACTTCATCAA-3'

1、sgRNA的体外转录和纯化

1)通过互补的两条单链的重叠延伸得到用于crRNA转录的双链DNA模板，其中一条携带T7启动子序列(5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGG-3')，退火体系：溶有正向引物T7-sgRNA-F(10μM)和反向引物T7-sgRNA-R(10μM)的1xTE缓冲液20μL。梯度退火程序：95℃×3min；30个热循环：95℃×20s，52℃×30s，72℃×25s；72℃×10min，用SanPrep柱PCR产物纯化试剂盒纯化双链DNA转录模板。

两条互补引物序列如下：

正向引物T7-sgRNA-F：

5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATGAAGTTCAAATCATCGAGTTTTAGAGCTA GAAATAGC-3'(划横线部分为20nt互补区)；

反向引物T7-sgRNA-R：

5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC(划横线部分为20nt互补区)。

2)使用T7RNA转录试剂盒对所制备的双链DNA转录模板进行转录，制备sgRNA。该步骤在37℃条件下反应16h，转录体系为：20μL。转录完成后，利用DNaseI对DNA模板进行降解，然后用RNA纯化试剂盒对转录产物进行纯化，置于-20℃保存。转录得到的sgRNA的序列为：

5'-GGGGAUGAAGUUCAAAUCAUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAA UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3'

2、CRISPR/Cas9点特异性切割

加入终浓度为1×NEBuffer3.1(25mMTris-HCl，50mMNaCl，5mMMgCl₂和0.5mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，pH7.9)、200nMspCas9、200nMsgRNA，200nMPAMmer(核苷酸系列为：5'-TGGCAACCTCGC-3')和不同浓度的ssRNA或ssDNA，总体系为20μL。然后将反应体系置于37℃下孵育60分钟，随后通过在90℃下加热10分钟，得到点特异性切割产物。

3、G4-EXPAR反应和可视化检测

1)EXPAR扩增：加入终浓度为0.3U/μLphi29聚合酶，0.4U/μLNb.BbvCI，1×phi29聚合酶缓冲液，1×CutSmart缓冲液，0.5mMdNTP，10nMEXPAR模板，20μL点特异性切割产物和适量双蒸水混合，总体积30μL，然后将上述反应体系置于37℃下反应2小时，并在80℃下灭活20分钟，得到EXPAR扩增产物。

2)可视化检测：将55μLHEPES缓冲液(30mMHEPES，200mMNaCl，20mMKCl，pH6)和5μLhemin溶液(10μM)添加到30μLEXPAR扩增产物中，并在37℃下反应25分钟。然后添加5μL40mMABTS和5μL40mMH₂O₂到上述混合物中，孵育5分钟。使用紫外可见分光光度计测量紫外可见吸收光谱。

实施例2Cas-G4EX检测系统用于ssDNA检测的灵敏度试验

为了验证本发明Cas-G4EX检测系统的灵敏度，将不同浓度的ssDNA(100aM，1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM和1nM)分别加入到CRISPR/Cas9点特异性切割反应体系中。其它的实验步骤同实施例1，结果如图2所示。

从紫外可见吸收光谱图中(图2A)可以看出，随着靶基因ssDNA浓度的增加，反应体系的颜色逐渐变深，吸收光谱强度也随之增加。这主要是因为存在的靶基因ssDNA越多，产生的G-四链体就越多，催化活性也就越高。从对应的拟合模拟曲线的数据(图2B)分析表明，所构建的检测方法在100aM到1nM之间具有良好的线性拟合(R²＝0.98226)，Cas-G4EX系统可的紫外可见吸收响应(ΔAbs)与ssDNA浓度遵循回归方程：ΔAbs＝0.12518lgCssDNA(M)+1.34233，实际检测限为100aM。这表明该系统能够高灵敏度地检测ssDNA。

实施例3Cas-G4EX检测系统用于ssDNA单碱基突变的特异性分析。

为了验证本发明Cas-G4EX检测系统的对ssDNA单基因突变，将不同突变位点的ssDNA分别加入到CRISPR/Cas9点特异性切割反应体系中，MD1、MD2和MD4的突变位点为CRISPR/Cas9非点特异性切割位点，MD3的突变位点为CRISPR/Cas9点特异性切割位点。其它的实验步骤同实施例1，结果如图3所示。

其中MD1、MD2、MD3和MD4的序列分别为：

注：加粗并画下划线标记处为单基因的突变位点。

结果分析：非切割位点的突变序列(MD1，MD2和MD4)呈现出与非突变靶序列几乎一致的显色响应(图3B)。相反，切割位点的突变序列(MD3)在ΔAbs中的净吸光度可忽略不计(图3C)，这表明Cas-G4EX系统具有区分具有切割位点单碱基突变的能力。这是由于CRISPR/Cas9的点特异性识别和切割以及EXPAR的序列依赖性延伸。靶序列切割位点的错配导致Cas9/sgRNA的切割效率低。具有3'-突变切割的引物片段与G4-EXPAR模板不匹配，抑制了EXPAR的扩增效率。因此，本发明可以人为的设计靶标ssDNA与PAMmer的结合位点，以实现对靶标ssDNA中具有PAM位点的任意点特异性序列的检测。

实施例4Cas-G4EX检测系统用于ssRNA的检测

本实施例中待检测的靶基因ssRNA的序列如下：

5'-CGUAAGUCUCCGAGGUUGCCAUCGAUGAUUUGAACUUCAUCAA-3'

1、sgRNA的体外转录和纯化

1)通过互补的两条单链的重叠延伸得到用于crRNA转录的双链DNA模板，其中一条携带T7启动子序列(5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGG-3')，退火体系：溶有正向引物T7-sgRNA-F(10μM)和反向引物T7-sgRNA-R(10μM)的1xTE缓冲液20μL。梯度退火程序：95℃×3min；30个热循环：95℃×20s，52℃×30s，72℃×25s；72℃×10min，用SanPrep柱PCR产物纯化试剂盒纯化双链DNA转录模板。

两条互补引物序列如下：

正向引物T7-sgRNA-F：

5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATGAAGTTCAAATCATCGAGTTTTAGAGCTA GAAATAGC-3'(划横线部分为20nt互补区)；

反向引物T7-sgRNA-R：

5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC(划横线部分为20nt互补区)。

3)使用T7RNA转录试剂盒对所制备的双链DNA转录模板进行转录，制备sgRNA。该步骤在37℃条件下反应16h，转录体系为：20μL。转录完成后，利用DNaseI对DNA模板进行降解，然后用RNA纯化试剂盒对转录产物进行纯化，置于-20℃保存。转录得到的sgRNA的序列为：

5'-GGGGAUGAAGUUCAAAUCAUCGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUA AGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3'

2、CRISPR/Cas9点特异性切割

分别加入终浓度为1×NEBuffer3.1(25mMTris-HCl，50mMNaCl，5mMMgCl₂和0.5mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，pH7.9)、200nMspCas9、200nMsgRNA，200nMPAMmer(核苷酸系列为：5'-TGGCAACCTCGC-3')和ssRNA，总体系为20μL。然后将反应体系置于37℃下孵育60分钟，随后通过在90℃下加热10分钟，得到点特异性切割产物。

3、G4-EXPAR反应和可视化检测

1)EXPAR扩增：加入0.3U/μLphi29聚合酶，0.4U/μLNb.BbvCI，1×phi29聚合酶缓冲液，1×CutSmart缓冲液，0.5mMdNTP，10nMEXPAR模板，20μL点特异性切割产物和适量双蒸水混合，总体积30μL，然后将上述反应体系置于37℃下反应2小时，并在80℃下灭活20分钟，得到EXPAR扩增产物。

2)可视化检测：将55μLHEPES缓冲液(30mMHEPES，200mMNaCl，20mMKCl，pH6)和5μLhemin溶液(10μM)添加到30μLEXPAR扩增产物中，并在37℃下反应25分钟。然后添加5μL40mMABTS和5μL40mMH₂O₂到上述混合物中，孵育5分钟。使用紫外可见分光光度计测量紫外可见吸收光谱。

实施例5Cas-G4EX检测系统用于ssRNA检测的灵敏度试验

为了验证本发明Cas-G4EX检测系统的灵敏度，将不同浓度的ssRNA(250aM，2.5fM，25fM，250fM，2.5pM，25pM，250pM和2.5nM)分别加入到CRISPR/Cas9点特异性切割反应体系中。其它的实验步骤同实施例5，结果如图4所示。

从紫外可见吸收光谱图中可以看出，随着靶基因ssRNA浓度的增加，反应体系的颜色逐渐变深，吸收光谱强度也随之增加。这主要是因为存在的靶基因ssRNA越多，产生的G-四链体就越多，催化活性也就越高。从对应的拟合模拟曲线的数据分析表明，所构建的检测方法在250aM到2.5nM之间具有良好的线性拟合(R²＝0.97246)，Cas-G4EX系统可的紫外可见吸收响应(ΔAbs)与ssRNA浓度遵循回归方程：ΔAbs＝0.08602×lgCssRNA(M)+1.57699，实际检测极限为250aM。这表明该系统能够高灵敏度地检测ssRNA。

实施例6Cas-G4EX检测系统用于ssRNA单碱基突变的特异性分析。

为了验证本发明Cas-G4EX检测系统的对ssRNA单基因突变，将不同突变位点的ssRNA分别加入到CRISPR/Cas9点特异性切割反应体系中，MR1、MR2和MR4的突变位点为CRISPR/Cas9非点特异性切割位点，MR3的突变位点为CRISPR/Cas9点特异性切割位点。其它的实验步骤同实施例5，结果如图5所示。

其中MR1、MR2、MR3和MR4的序列分别为：

注：加粗并画下划线标记处为单基因的突变位点。

结果分析：非切割位点的突变序列(MR1，MR2和MR4)呈现出与非突变靶序列几乎一致的显色响应(图5B)。相反，切割位点的突变序列(MR3)在ΔAbs中的净吸光度可忽略不计(图5C)，这表明Cas-G4EX系统具有区分具有切割位点单碱基突变的能力。这是由于CRISPR/Cas9的点特异性识别和切割以及EXPAR的序列依赖性延伸。靶序列切割位点的错配导致Cas9/sgRNA的切割效率低。具有3'-突变切割的引物片段与G4-EXPAR模板不匹配，抑制了EXPAR的扩增效率。因此，本发明可以人为的设计靶标ssDNA与PAMmer的结合位点，以实现对靶标ssDNA中具有PAM位点的任意点特异性序列的检测。

实施例9可行性试验

为了评估Cas-G4EX系统的适用性，将不同浓度的ssRNA或ssDNA(1fM，100fM和1000fM)分别加标到10％的人血清中，然后使用Cas-G4EX系统测量血清样品中的ssRNA或ssDNA，具体实验步骤分别同实施例1和实施例5，结果如表1和表2所示。

表1Cas-G4EX系统在人血清中对ssRNA进行检测(n＝3)

表2Cas-G4EX系统在人血清中对ssDNA进行检测(n＝3)

从结果可以看出，本发明的Cas-G4EX系统对ssRNA和ssDNA检测的回收率在93.25％至111.98％之间，RSD均低于5％。结果表明，Cas-G4EX系统为实际样本中ssRNA或ssDNA的点特异性检测提供了可靠的可视化方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆大学；

<120> 一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggcaacctc gc 12

<210> 2

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

cguaagucuc cgagguugcc aucgaugauu ugaacuucau caa 43

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgtaagtctc cgaggttgcc atcgatgatt tgaacttcat caa 43

<210> 4

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccacccaat ccctcccaat cctcagcccc acccaatccc tcccaatcct cagcacgatg 60

gcaacctcgg agactta 77

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgtaagtctc cgaggttggc atcgatgatt tgaacttcat c 41

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgtaagtctc cgaggttgcc atccatgatt tgaacttcat c 41

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgtaagtctc cgaggttgcc atcgatcatt tgaacttcat c 41

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgtaagtctc cgaggttgcc atcgatgatt tgaaattcat c 41

<210> 9

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

cguaagucuc cgagguuggc aucgaugauu ugaacuucau caa 43

<210> 10

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

cguaagucuc cgagguugcc auccaugauu ugaacuucau caa 43

<210> 11

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

cguaagucuc cgagguugcc aucgaucauu ugaacuucau caa 43

<210> 12

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

cguaagucuc cgagguugcc aucgaugauu ugaaauucau caa 43

<210> 13

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaaattaata cgactcacta taggggatga agttcaaatc atcgagtttt agagctagaa 60

atagc 65

<210> 14

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60

gctatttcta gctctaaaac 80

Claims (10)

1.一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将不同浓度待检测的靶基因、PAMmer、Cas9与sgRNA以适当比例混合于缓冲溶液中，并于37℃条件下孵育30～60min，得到点特异性切割产物；所述靶基因为ssRNA或ssDNA，所述PAMmer与待测靶基因相匹配，所述sgRNA包括锚定序列和引导区序列，所述锚定序列与Cas9蛋白特异性识别，所述引导区序列与所述靶基因的片段相匹配；

2）将步骤1）中得到的点特异性切割产物加入到EXPAR反应体系中进行指数扩增反应，经phi29 DNA聚合酶延伸和Nb.BbvCI选择内切酶切割，得到富G序列的扩增产物；

3）向步骤2）得到的富G序列的扩增产物中加入含K⁺缓冲液和hemin溶液充分反应，再加入过量的ABTS和H₂O₂孵育5min，用紫外可见分光光度计检测反应体系的紫外可见光的吸收强度；

4）根据不同浓度靶基因的标准溶液做靶基因浓度-紫外可见光的吸收强度的标准曲线，计算回归方程，再根据待测溶液的紫外可见光的吸收强度，计算待测溶液中靶基因的浓度。

2.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，所述的sgRNA是通过部分互补的两条DNA单链重叠延伸获得转录模板，再将所述转录模板进行转录得到。

3.根据权利要求2所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，所述重叠延伸的程序：95℃×3 min；30个热循环：95℃×20 s，52℃×30s，72℃×25 s；72℃×10 min。

4.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，步骤1）中所述PAMmer、Cas9与sgRNA的摩尔比为1:1:1。

5.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，步骤1）中所述待检测的靶基因在反应体系中的终浓度为100aM~2.5nM。

6.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，步骤2）中所述EXPAR反应体系包括0.3U/μL phi29DNA聚合酶，0.4U/μLNb.BbvCI，1×DNA聚合酶缓冲液，1×CutSmart缓冲液，0.5 mM dNTP和10 nM EXPAR模板；扩增反应温度为30~45℃，反应时间为1~2 h；所述点特异性切割产物作为引物与EXPAR模板相匹配，并延伸合成双链DNA。

7.根据权利要求6所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，所述phi29DNA聚合酶还可以是Klenow Fragment(exo-) DNA聚合酶或vent(exo-) DNA聚合酶。

8.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，步骤3）中所述反应温度为30~45℃，反应时间为10~40min。

9.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法，其特征在于，步骤3）中所述吸收强度为420 nm处的紫外吸收信号，检测范围400nm~460nm。

10.如权利要求1~9任一项所示方法在检测ssRNA或ssDNA单碱基突变中的应用。

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