CN114438262A - 基于信号扩增的自组装免标记检测hbv的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的方法和试剂盒，(1)将待检测的HBV核酸样本进行RCA扩增；(2)将步骤(1)的扩增产物与Cas12a、crRNA和生物素标记的ssDNA混合，孵育反应后加热使Cas12a失活；(3)将S1加入步骤(2)处理后的反应液中孵育杂交，然后加入S2进孵育杂交，完成后加入链霉亲和素磁球振荡孵育，孵育完成后将磁球分离，再加入荧光染料SYBR Green I孵育，孵育完成后使用荧光分光光度计测定荧光强度。因多重信号放大所带来的强大的信号输出性能，所设计提出的方法具有较高的灵敏度和较宽线性范围等优点。

Description

基于信号扩增的自组装免标记检测HBV的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是一种常见的高致死率恶性肿瘤，乙型肝炎病毒(HBV)是其主要病因之一，HBV可以通过多种机制促进HCC的发生。乙肝病毒可以通过肠外和性途径进行传播，其潜伏期大约为1-6个月。到目前为止，预防HBV感染的策略是接种疫苗。然而，疫苗接种可能对部分人群无效。当人感染HBV时，血清中HBV DNA浓度升高，可以被检测到。因此，DNA检测可能成为HBV早期诊断的重要方法。

近年来，出现了多种检测乙肝病毒感染的分析技术，包括电化学，电化学发光、分子印迹法、表面增强拉曼散射(SERS)、荧光、比色等，在这些方法中，荧光方法具有简单、无放射性、低成本和高灵敏度等突出优点，凭借这些优点促进了荧光在生物传感方式的发展。但仅通过目标与信号输出为1:1信号输出原位杂交模式，灵敏度较低，不能满足实际需求，所以在信号输出之前结合信号放大策略实现高灵敏度检测。随着，核酸扩增策略，特别是基于等温扩增的方法，它们可以提高在恒定温度下的检测灵敏度而被广泛应用。例如：聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、滚环转录(RCT)以及基于杂交链式反应(HCR)等。因此，将信号放大策略应用于传感策略中在临床诊断中是非常可取的。

CRISPR-Cas系统是由聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成，是生物学界一项很有前途的新技术。随着CRISPR-Cas系统的不断发展，不仅应用在基因编辑方面，同时在生物传感领域也开始了一场革命。CRISPR-Cas系统能够实现精确的基于序列的识别和高效的核酸催化裂解。根据其信号输出方式已经存在有荧光、电化学、电化学发光、比色等，上述输出方式中，大多数以标记探针为主，而其中荧光标记探针的合成步骤繁琐，成本高，并且容易造成信号泄漏。因此，荧光染料SYBR Green I(SG I)对双链DNA(dsDNA)的荧光特异性吸引了科学工作者的兴趣。但荧光增强效率与dsDNA的数量有关，需要提供高含量的dsDNA来增加来改善荧光增强。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：本发明的第一目的是提供一种非诊断目的的基于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的方法，本发明的另一目的是提供一种基于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒。

本发明的技术方案为：非诊断目的的基于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测的HBV核酸样本DNA，与P-DNA环化后进行RCA扩增；

(2)将步骤(1)的扩增产物与Cas12a、crRNA和生物素标记的ssDNA混合，孵育反应后加热使Cas12a失活；

(3)将S1加入步骤(2)处理后的反应液中进行孵育杂交，然后加入S2进行孵育杂交，完成后加入链霉亲和素磁球振荡孵育，孵育完成后将磁球分离，再加入荧光染料SYBRGreen I孵育，孵育完成后使用荧光分光光度计测定荧光强度。

其中，

ssDNA的核苷酸序列:5’-TTTTTTTTTTTTGTTTCTGTTCTCCCTGG-3(SEQ ID No.1)，

S1的核苷酸序列:5’-GTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTGTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTCCAGGGAGAACAGAAAC-3’(SEQ ID No.2)，

S2的核苷酸序列:5’-AGGAGGAGACATAATAGGCACACGTTTCTGTTCTCCCTGG-3’(SEQ IDNo.3)，

P-DNA的核苷酸序列为：5’-ATAACTGAAAGCCAACTCGGCTACCTTGACACTTCTTTCGGGCTTCCTCGTACCACTACATCCAT-3(SEQ ID No.4)

crRNA的核苷酸序列为：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCUUGACACUUCUUUCGGGC-3(SEQ ID No.5)。

SYBR Green I可以特异性结合dsDNA产生较强的荧光信号，本发明设计了三条DNA序列，其中生物素修饰的ssDNA(记为BIO，下同)仅可以与S1杂交而不与S2杂交形成部分杂交的dsDNA，S1的暴露端可以与S2部分杂交形成dsDNA，同时S2的暴露端又可以与S1杂交，两者不断杂交生成大分子的结构，为SYBR Green I提供位点。形成以BIO-S1双链部分为树干，以S1与S2不断杂交部分为树冠，形成的“树状”结构作为信号输出，避免荧光基团的修饰。

具体地，包括以下步骤：

(1)RCA扩增反应

将5μL待检测核酸样本、5μL 2μM的P-DNA混匀90℃孵育5min后冷却至室温，然后，加入1μL 40U/μL T4 DNA连接酶和1.5μL 10×T4 DNA连接酶缓冲溶液h和2.5μL无酶水混合均匀，在室温下孵育2h，时间结束之后，1μL 2U/μL phi29 DNA聚合酶、2μL10mM dNTP和1.5μL 10×phi29 DNA聚合酶缓冲溶液在30℃孵育1.5h，反应结束后将反应混合物加热至65℃10min使phi29 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶失活；

(2)Cas12a系统的剪切反应

步骤(1)反应完成后，与1μL 500nM Cas12a、1μL 1.5μM crRNA、0.5μL 1μMssDNA、2.5μL 10×Cas12a缓冲溶液，混合均匀，在37℃下孵育1.5h，反应结束后将反应混合物加热至65℃10min使Cas12a失活；

(3)免标记自组装反应

将1μL 2μM S1加入到步骤(2)剪切反应的混合物中在37℃下孵育1h，之后再加入1μL 2μM S2在37℃下孵育2h，然后在反应体系中加入5μL 2mg/ml链霉亲和素磁球，并在37℃振荡孵育0.5h，通过磁力架经磁场作用将反应产物从混合物中分离，然后与SYBR Green I混合孵育0.5h，使用荧光分光光度计测定其荧光强度。

本发明还公开了一种基于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒，该试剂盒包括以下组成部分：

(1)RCA扩增试剂：P-DNA、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲溶液、phi29 DNA聚合酶、dNTP、phi29 DNA聚合酶缓冲溶液；

(2)Cas12a检测试剂：Cas12a、crRNA、生物素标记的ssDNA；

(3)自组装报告试剂：S1、S2、链霉亲和素磁球、SYBR Green I；

所述P-DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，ssDNA的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示，S1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，S2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明中，目标转导的滚环扩增(RCA)对目标进行一对多的指数倍扩增。扩增产物含有激活序列用来激活Cas12a系统对单链DNA(ssDNA)进行切割，ssDNA一端用生物素修饰(表示为BIO)。通过DNA之间的自组装反应，生成大量dsDNA为荧光染料SYBR Green I(SG I)提供位点，增强荧光信号。同时引入链霉亲和素修饰的磁球，通过生物素与链霉亲和素的特异性结合到磁球上面，通过磁场进行分离，实现对断裂与未断裂的BIO的分离，进而实现免标记信号输出。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

免标记树状结构的信号输出可以产生聚集荧光，增强荧光信号，同时成本低。RCA反应的循环扩增在短时间将目标进行一对多的放大，同时为Cas12a系统提供充足的激活链，确保Cas12a系统的活性。另外Cas12a系统因其独特的“乱切”反应，实现对在信号输出的循环扩增。因多重信号放大所带来的强大的信号输出性能，所设计提出的方法具有较高的灵敏度和较宽线性范围等优点。

附图说明

图1基于Cas12a系统的免标记荧光检测用于HBV DNA检测原理图；

图2免荧光标记自组装反应的可行性；(A)显示了BIO、S1和S2之间不同组合的荧光光谱；(B)BIO、S1和S2之间不同组合的非变性PAGE电泳分析；

图3免标记荧光检测HBV DNA荧光测量：(a)存在P-DNA、HBV；(b)存在P-DNA，不含HBV；

图4免标记荧光检测HBV DNA的可行性凝胶电泳分析；(A)琼脂糖凝胶电泳；(B)非变性PAGE电泳；

图5树状结构的BIO、S1、S2之间的浓度比对荧光强度的影响；

图6目标转导的滚环扩增(RCA)反应条件对信号输出的影响。(A)RCA响应时间对荧光强度的影响；(B)P-DNA浓度对荧光强度的影响；(C)phi29 DNA聚合酶的浓度对荧光强度的影响；

图7Cas12a系统剪切反应条件对信号输出的影响。(A)cas12a浓度对荧光强度的影响；(B)crRNA浓度对荧光强度的影响；(C)裂解反应时间对荧光强度的影响；

图8与HBV DNA(10nM)相比，含错配碱基的荧光响应。误差条表示标准偏差(n＝3)；

图9(A)HBV DNA检测系统在10pM-2μM不同浓度HBV DNA下的荧光响应；(B)荧光响应与HBV浓度对数之间的线性关系。误差条表示标准偏差(n＝3)。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

1、试剂和仪器

寡核苷酸是由Sangon Biotech(中国上海)公司合成和纯化的，其序列由表1中列出。T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)由New England Biolabs(中国北京)公司提供。LbCas12a蛋白(Cas12a)购自广州美格生物科技有限公司(中国广州)链霉亲和素磁珠(平均直径为300nm)购自百迈格生物(中国江苏)和SYBR Green I(SG I)(10000×)购自北京索莱宝科技有限公司。实验中所使用的水均为超纯水(18.2MΩcm)，所有其他试剂均为分析纯。

在日立F-7000荧光分光光度计(日本日立)上记录荧光光谱。使用Molecular

GelDoc^TMXR+成像系统(美国Bio-Rad)扫描凝胶电泳图像。整个实验中所使用的水(18.2MΩcm)用Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore)进行预处理。

表1实验所用到的核苷酸序列

2、本发明的检测原理

2.1系统构成

本发明的检测主要包括有三个过程：目标转导的滚环扩增(RCA)对目标进行一对多的指数倍扩增；Cas12a、crRNA和单链DNA(ssDNA)切割系统，ssDNA一端用生物素修饰(表示为BIO)以及免荧光标记自组装报告系统。如图1所示，以HBV DNA为模型，阐述了使用Cas12a系统对HBV DNA进行免标记检测的工作原理。在目标存在时，通过简单地碱基互补配对将环状模板的两端拉近，在T4 DNA连接酶的作用下进行闭环，之后由phi29DNA聚合酶引发RCA反应进行大量扩增。扩增产物中含有可以激活Cas12a系统活性的核酸序列，将其作为激活链，加入Cas12a与crRNA之后，Cas12a系统被激活进行反式切割BIO，将生物素端切割分离BIO的断裂即“树根”的断裂。

对于免荧光标记自组装报告系统通过主干链(S1)与BIO进行杂交奠定生长的基础单位——树干，之后加入支链(S2)进行自组装形成树状结构，生成大量的双链DNA(dsDNA)结构为SGΙ提供大量键合位点产生强烈的荧光信号。加入链霉亲和素修饰的磁球，利用生物素与链霉亲和素的特异性结合，在磁场作用下实现磁分离。在目标存在时，因生物素端的断裂树状结构存在与溶液中，加入SGΙ产生强烈的荧光信号。

相反，当目标不存在时，无法引发RCA反应，同时在phi29 DNA聚合酶的外切酶作用下P-DNA被消化，无RCA产物，因此无法激活Cas12a系统，无法进行“乱切”对BIO进行切割，所以自组装产物在磁场作用下被富集在磁球上，向溶液中加入SGΙ无明显的荧光信号恢复。

通过上述原理，打破常规的Cas12a系统荧光标记输出模式，利用Cas12a系统的切割反应，实现免标记信号的输出。

2.2首先对免荧光标记自组装报告系统进行了验证

ssDNA(BIO):5’-TTTTTTTTTTTTGTTTCTGTTCTCCCTGG-3’

S1:5’-GTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTGTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTCCAGGGAGAACAGAAAC-3’

S2:5’-AGGAGGAGACATAATAGGCACACGTTTCTGTTCTCCCTGG-3’

SGΙ可以特异性结合dsDNA产生较强的荧光信号，我们设计了三条DNA序列，其中生物素修饰的ssDNA即BIO仅可以与S1杂交而不与S2杂交形成部分杂交的dsDNA，S1的暴露端可以与S2部分杂交形成dsDNA，同时S2的暴露端又可以与S1杂交，两者不断杂交生成大分子的结构，为SGΙ提供位点。形成以BIO-S1双链部分为树干，以S1与S2不断杂交部分为树冠，形成的“树状”结构作为信号输出，避免荧光基团的修饰。

其荧光光谱如图2中A所示，BIO、S1、S2三者成功杂交(曲线a)，其荧光强度增加最多。同时，通过图2中B对BIO、S1、S2三者之间的杂交关系进行验证。BIO可以与S1进行杂交形成dsDNA(图2中B，泳道4)，S1-BIO分子量增加导致其移动速度比BIO(图2中B，泳道3)、S1(图2中B，泳道1)移动速度慢，而BIO不会与S2(图2中B泳道5)进行杂交形成双链，泳道5中呈现BIO与S2两个条带。而S1与S2可以相互杂交并且不断延展形成分子量不等的结构(图2中B，泳道6)，当BIO、S1、S2同时存在时，同样形成分子量不等的结构(图2中B，泳道7)与荧光光谱曲线结果相符合。由于空阻的不断变化，条带迁移速度不同，泳道6、7呈阶梯状分布，因此可得出所形成的分子量不等的结构，以BIO-S1为树干，由S1、S2不断延伸的分子量不等的冠状结构。

基于上述结论分别进行了荧光实验和非变性PAGE电泳分析来研究所提出的检测HBV DNA策略的可行性。如图3所示，在HBV DNA存在的情况下，可以看到明显的高荧光信号(图3，曲线a)，表明HBV DNA可以与P-DNA互补，在T4 DNA连接酶与phi29 DNA聚合酶作用下引发RCA反应，产生大量的ssDNA。ssDNA在Cas12a和crRNA三者同时存在下组装激活Cas12a系统的活性，启动Cas12a系统的反式剪切反应，得到大量被切断的的BIO链。因此，将S1、S2加入到反应液中，生成大量的树状结构，加入磁球后，因“树根”的断裂，树状结构得以留存在溶液中，特异性插入SGΙ时，得到显著增强的荧光响应。而在对照实验没有HBV的系统中荧光强度低(图3，曲线b)，这是因为没有HBV DNA时，无RCA反应的发生，溶液中存在的P-DNA在phi29 DNA聚合酶作用下被降解。由于体系中没有扩增产物的生成，仅在Cas12a和crRNA两者同时存在下无发组装形成具有活性的Cas12a系统，所以Cas12a系统的反式剪切反应被抑制，BIO链保持完整。将S1、S2加入到反应液中，生成大量的树状结构，加入磁球后，由完整的BIO链通过生物素与链霉亲和素的特异性结合到磁球上面，在溶液中加入SGΙ，没有明显的荧光信号。

为了验证所提实验过程的可行性，如图4中A所示，进行了琼脂糖凝胶电泳与非变性PAGE分析。首先，对RCA反应(图4中A)进行琼脂糖凝胶电泳的验证，HBV DNA存在时，可以与P-DNA杂交形成部分杂交的缺口的环形ssDNA，导致空间位阻增强，因此泳道3中的DNA比P-DNA(泳道2)、HBV(泳道1)运行得慢，说明HBV与P-DNA成功杂交。HBV DNA与P-DNA的进而引发RCA反应(泳道4)，生成的长链DNA其分子量大于5000bp，因此其移动速度缓慢位于加样的端口位置。而缺乏HBV DNA时，P-DNA无法形成环形DNA，无RCA反应的发生(泳道6)无长链DNA存在与反应液中。同时由于phi29 DNA聚合酶的外切酶活性，可以消化P-DNA，因此溶液中的P-DNA被降解，P-DNA条带明显变浅。

然后，通过非变性PAGE分析了Cas12a的剪切反应。如图4中B所示，上清液中含有分子量不等的“树根”断裂的树状结构(泳道5)，这是因为在目标存在的情况下，引发RCA反应生成激活链，进而激活Cas12a系统的反式剪切作用BIO断裂，经磁分离作用，树状结构存在与溶液中。反应体系中不存在目标时，如图4中B泳道6所示，树状结构急剧减少，条带变浅。目标不存在时，无RCA反应的发生，进而Cas12a系统的活性被抑制。BIO链完整，通过生物素与链霉亲和素的特异性结合固定在磁球上，从溶液中分离经磁分离作用，上清液中的分子量不等的树状结构被磁球带走，与荧光实验结果相同。

2.3反应条件的优化

在所设计的检测策略中，自组装反应的发生与信号输出存在着直接的联系。因此，组装成树状结构的BIO、S1、S2之间的摩尔比是影响信号的重要因素之一，并对浓度比进行优化。如图5所示，在SA-MB保持不变的情况下(10μL 2mg/mL)，三者当比例增加到1:4:4时，其荧光差值最大，此时的1:4:4作为最佳(BIO为1μM、S1为4μM、S2为4μM)。这是因为随着BIO、S1、S2比例的不断增加，组成的树状结构基元变大，双链结构增加，SGΙ位点增加，有利于提高信号，但同时空间位阻增加，反而不利于磁球对树状结构的富集，因此选定1:4:4为最佳的BIO、S1、S2比例。通过优化对比得出的最佳条件，在最佳分离条件下进行构筑的树作为信号报告分子，将此时的BIO、S1、S2以及对应的MB定义为整体，并将其命名为reporter。聚合反应时间、P-DNA的浓度以及phi29 DNA聚合酶的浓度影响RCA反应过程对激活Cas12a系统有重要影响。因此，首先优化了聚合反应时间。如图6中A所示，荧光强度随着时间的延长而增加，当时间达到90min之后荧光强度不再发生明显的变化达到平台。因此，聚合反应时间选择90min作为最佳反应时间。随后，对P-DNA的浓度进行优化。如图6中B所示，当P-DNA的浓度从0.5μM增加至6μM时，荧光强度逐渐增加，并在2μM时达到平台期。最后对phi29 DNA聚合酶的浓度进行优化，在2U/μL时荧光强度达到最大值(图6中C)。因此，选择2μM P-DNA和2U/μL phi29DNA聚合酶为最佳条件。

在此基础上，对Cas12a的剪切反应进行了优化。如图7中A所示，随着Cas12a酶浓度的增加，荧光强度不断增加，当浓度到达0.5μM时为增长幅度骤减，趋于平缓。因此选0.5μM为进行下一步实验。接着对cr RNA的浓度进行了优化，如图7中B所示，随着浓度的增加，荧光不断增加，达到1.5μM之后不在增加，选择1.5μM为最佳。最后对CRISPR/Cas12a的剪切反应的反应时间进行了优化，得出时间到达90min时，荧光强度最佳，因此选90min为最佳实验。最终确定的最佳反应条件为RCA反应时间选择90min、P-DNA的浓度为2μM、phi29 DNApolymerase的浓度为2U/μL、Cas12a酶浓度为0.5μM、crRNA的浓度为1.5μM、剪切反应的反应时间为90min。

2.4 HBV传感平台的特异性

通过比较靶DNA信号与一个碱基错配(MT1)和两个碱基错配(MT2)的错配序列(浓度为100nM)，研究了该方法的特异性。从图8可以看出，错配序列所产生的荧光信号和与空白信号非常接近，并且远低于目标DNA所产生的信号，表明所提出的方法检测序列特异性DNA时具有合理的特异性。

2.5 HBV传感平台的分析能力

如图9中A和B所示，在最佳反应条件下，不同浓度的HBV与荧光强度的变化关系。如图9中A，在10pM-2μM范围内，体系的荧光强度随着HBV DNA浓度的增加而不断增大；如图9B所示，荧光强度与HBV DNA浓度呈现良好的线性关系，线性范围在10pM～100nM之间，线性方程为F＝571.8LogC_{HBV DNA}+1804.8，其中，F为HBV DNA在某浓度下的荧光强度，C为HBV DNA的浓度。线性方程的回归系数R²为0.9808。计算的该方法的检测限为1.28pM。我们所提出的检测方法检测限低于或相当于与已经报道的HBV DNA检测方法，见表2。

表2 HBV DNA检测方法比较

2.6血清中HBV的检测

为探讨所提出的传感策略在实际应用中的可行性，对掺有不同浓度的HBV DNA进行测试。将血清用稀释300倍后进行目标HBV的检测。步骤如下：将不同浓度的HBV加入稀释的血清中，得到100pM、1nM和10nM的不同浓度的溶液，根据上述步骤进行检测。测得100pM、1nM和10nM的回收率为99％、105％、98.3％，在90％～110％之间，其相应的标准偏差为1％、0.8％、1.4％，均小于2％。结果表明，所提出的方法具有实际应用的可能性。

总之，我们提出了一种应用于Cas12a系统的免标记荧光信号输出策略。在我们所提的策略中，免标记树状结构的信号输出可以产生聚集荧光，增强荧光信号，同时成本低。RCA反应的循环扩增在短时间将目标进行一对多的放大，同时为Cas12a系统提供充足的激活链，确保Cas12a系统的活性。另外Cas12a系统因其独特的“乱切”反应，实现对在信号输出的循环扩增。因多重信号放大所带来的强大的信号输出性能，所设计提出的方法具有较高的灵敏度和较宽线性范围等优点。

实施例1

1、目标转导的滚环扩增(RCA)反应

将5μL待检测核酸样本、5μL 2μM的P-DNA混匀90℃孵育5min后冷却至室温。然后，加入1μL 40U/μL T4 DNA连接酶和1.5μL 10×T4 DNA连接酶缓冲溶液h和2.5μL无酶水混合均匀，在室温下孵育2h。时间结束之后，1μL 2U/μL phi29 DNA聚合酶、2μL10mM dNTP和1.5μL 10×phi29 DNA聚合酶缓冲溶液在30℃孵育1.5h，反应结束后将反应混合物加热至65℃10min使phi29 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶失活。

2、Cas12a系统的剪切反应

上述反应完成后，与1μL 500nM Cas12a、1μL 1.5μM crRNA、0.5μL 1μM BIO、2.5μL10×Cas12a缓冲溶液，混合均匀，在37℃下孵育1.5h，反应结束后将反应混合物加热至65℃10min使Cas12a失活。

3、免标记自组装反应

将1μL 2μM S1加入到剪切反应的混合物中在37℃下孵育1h，之后再加入1μL 2μMS2在37℃下孵育2h。用Tris-HCL缓冲溶液洗涤3次后重悬于Tris-HCL缓冲溶液中的链霉亲和素磁球(MB，2mg/ml)。然后在反应体系中加入处理过的MBs 5μL，并在37℃振荡孵育0.5h。通过磁力架经磁场作用将反应产物从混合物中分离，然后与SGΙ混合孵育0.5h，使用FL-7000荧光分光光度计测定其荧光强度。然后，在1×TAE缓冲溶液中用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物。

所述ssDNA的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示，S1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，S2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，P-DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

实施例2基于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒的制作

该试剂盒包括以下组成部分：

(1)RCA扩增试剂：P-DNA、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲溶液、phi29 DNA聚合酶、dNTP、phi29 DNA聚合酶缓冲溶液；

(2)Cas12a检测试剂：Cas12a、crRNA、生物素标记的ssDNA；

(3)自组装报告试剂：S1、S2、链霉亲和素磁球、SYBR Green I。

所述ssDNA的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示，S1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，S2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，P-DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

序列表

<110> 聊城大学

<120> 基于信号扩增的自组装免标记检测HBV的方法和试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttttttttt ttgtttctgt tctccctgg 29

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgtgcctat tatgtctcct cctgtgtgcc tattatgtct cctcctccag ggagaacaga 60

aac 63

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggaggagac ataataggca cacgtttctg ttctccctgg 40

<210> 4

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ataactgaaa gccaactcgg ctaccttgac acttctttcg ggcttcctcg taccactaca 60

tccat 65

<210> 5

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uaauuucuac uaaguguaga uccuugacac uucuuucggg c 41

Claims (4)

1.非诊断目的的基于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测的HBV核酸样本DNA，与P-DNA环化后进行RCA扩增；

(2)将步骤(1)的扩增产物与Cas12a、crRNA和生物素标记的ssDNA混合，孵育反应后加热使Cas12a失活；

(3)将S1加入步骤(2)处理后的反应液中进行孵育杂交，然后加入S2进行孵育杂交，完成后加入链霉亲和素磁球振荡孵育，孵育完成后将磁球分离，再加入荧光染料SYBR GreenI孵育，孵育完成后使用荧光分光光度计测定荧光强度；

其中，ssDNA的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示，S1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，S2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，P-DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征子在于，生物素标记的ssDNA、S1、S2的浓度比例为1:4:4。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)RCA扩增反应

将5μL待检测核酸样本、5μL 2μM的P-DNA混匀90℃孵育5min后冷却至室温，然后，加入1μL 40U/μL T4 DNA连接酶和1.5μL 10×T4 DNA连接酶缓冲溶液h和2.5μL无酶水混合均匀，在室温下孵育2h，时间结束之后，1μL 2U/μL phi29 DNA聚合酶、2μL 10mM dNTP和1.5μL 10×phi29 DNA聚合酶缓冲溶液在30℃孵育1.5h，反应结束后将反应混合物加热至65℃10min使phi29 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶失活；

(2)Cas12a系统的剪切反应

步骤(1)反应完成后，与1μL 500nM Cas12a、1μL 1.5μM crRNA、0.5μL 1μM ssDNA、2.5μL 10×Cas12a缓冲溶液，混合均匀，在37℃下孵育1.5h，反应结束后将反应混合物加热至65℃ 10min使Cas12a失活；

(3)免标记自组装反应

将1μL 2μM S1加入到步骤(2)剪切反应的混合物中在37℃下孵育1h，之后再加入1μL 2μM S2在37℃下孵育2h，然后在反应体系中加入5μL 2mg/ml链霉亲和素磁球，并在37℃振荡孵育0.5h，通过磁力架经磁场作用将反应产物从混合物中分离，然后与SYBR Green I混合孵育0.5h，使用荧光分光光度计测定其荧光强度。

4.于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组成部分：

(1)RCA扩增试剂：P-DNA、T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲溶液、phi29 DNA聚合酶、dNTP、phi29 DNA聚合酶缓冲溶液；

(2)Cas12a检测试剂：Cas12a、crRNA、生物素标记的ssDNA；

(3)自组装报告试剂：S1、S2、链霉亲和素磁球、SYBR Green I；

所述ssDNA的核苷酸序列为如SEQ ID No.1所示，S1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，S2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，P-DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

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