CN101528763B

CN101528763B - 分离和检测小多核苷酸的方法和物质

Info

Publication number: CN101528763B
Application number: CN2007800319763A
Authority: CN
Inventors: 艾利尔特·P·道森; 克里斯蒂·E·旺布尔
Original assignee: BioVentures Inc
Current assignee: BioVentures Inc
Priority date: 2006-08-30
Filing date: 2007-08-30
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2027-08-30
Also published as: EP2057181A2; CN101528763A; US20130116154A1; US8329394B2; CA2662837C; CA2662837A1; US20080102470A1; EP2057181A4; WO2008028086A2; WO2008028086A9; WO2008028086A3; ATE544869T1; EP2057181B1

Abstract

适用于分离、标记或检测小多核苷酸的方法的捕获探针。用于从样品中分离目的小多核苷酸的方法，其包括将所述小多核苷酸与所述捕获探针杂交并通过引物延伸或连接作用延长所述小多核苷酸。分离后，通过引物延伸产物的扩增和/或杂交以及随后的双标记检测探针切割来检测目的小多核苷酸的方法。

Description

分离和检测小多核苷酸的方法和物质

相关申请的交叉引用

本申请要求2006年8月30日提交的题目为“Method andSubstances for Isolating RNAs(分离RNAs的方法和物质)”的美国临时专利申请60/824,068的权利；要求2006年9月15日提交的题目为“Method and Substances for Isolating RNAs(分离RNAs的方法和物质)”的美国临时专利申请60/825,888的权利；要求2006年11月1日提交的题目为“Method and Substances for Isolating RNAs(分离RNAs的方法和物质)”的美国临时专利申请60/863,886的权利；要求2006年11月16日提交的题目为“Method and Substances for Isolating RNAs(分离RNAs的方法和物质)”的美国临时专利申请60/866,210的权利；以及要求2006年12月20日提交的题目为“Method and Substances for IsolatingRNAs(分离RNAs的方法和物质)”的美国临时专利申请60/871,094的权利；上述申请的内容以其整体通过引用的方式并入本文公开内容。

发明背景

有种类繁多的天然存在的和合成的小多核苷酸，其具有科学和商业益处。示例性小多核苷酸包括微小RNAs、snoRNAs、短干扰RNAs(天然的或合成的)、指导RNAs、核仁RNAs、核糖体RNAs、tRNAs以及小反义DNAs或小多核苷酸降解产物。特别有益处的是微小RNA(miRNAs)，即天然存在的18至24个RNA残基的单链多核糖核苷酸(polyRNAs)，其来源于更长的天然存在的非编码真核前体RNA转录物(通常具有“发夹”构型)，且miRNAs在细胞发育和分化通路中发挥重要作用。因此，已做了大量努力试图理解和表征miRNAs的时间、空间和细胞表达水平以及表达模式以确定它们在正常和疾病两种状态下的细胞发育和分化中的确切作用。

目前对miRNAs的研究首先是通过从样品中获取总RNA。接着通过凝胶电泳或通过层析分离和粒度选择洗脱将总RNA分离到亚群。然后，切下凝胶的适当段，从凝胶中洗脱出18-24RNAs，或收集包含大小为18-24核糖核苷酸的单链RNA′s的洗脱组分，通常是长度小于500-200核苷酸的RNA组分。接着通过沉淀分离所述RNAs，并表征miRNAs。

然而，当样品量小时，诸如来自肿瘤组织或活检材料的样品，这些方法的效果并不好，因此它们是有缺点的。此外，通过现行的方法分离出的miRNAs的表征通常包括几步扩增程序，随后是检测、定量、克隆和测序。因为这些过程中的众多的步骤以及与miRNAs的反复纯化、分离和鉴定相关的低劣效率，所以现行的方法是耗时的，相对昂贵的，需要相对大量的材料且并不能完全代表在诸如肿瘤的样品内表达的miRNAs群，或那些低丰度表达的miRNAs。另外，这些方法并不能特异地分离和鉴定miRNAs，而是经常分离和鉴定siRNA、tRNA、5S/5.8SrRNA以及来自另外的细胞RNAs的降解RNA。

因此，需要用于分离和鉴定miRNAs、其它的小调节RNAs和短干扰RNAs(siRNAs)的改良方法，其没有上述的这些缺点。

发明概述

依照本发明的一个实施方案，提供了用于分离和检测小多核苷酸的捕获探针(capture probe)。所述捕获探针是包括如下区段的多核苷酸：具有间隔区段序列的间隔区段，该间隔区段有3’端和5’端；具有模板区段序列的模板区段，该模板区段有3’端和5’端；以及具有小多核苷酸结合区段序列的小多核苷酸结合区段。所述间隔区段的5’端与所述小RNA结合区段的3’端连接，且模板区段的3’端与所述小RNA结合区段的5’端连接。

小多核苷酸结合区段通过沃森-克里克碱基配对与一个或多个目的小多核苷酸基本上互补并能够与其杂交。在捕获探针的优选形式中，所述目的小多核苷酸选自miRNA、snoRNA、siRNA和短干扰RNA。

在一个实施方案中，捕获探针还包含能够与固相结合的分子组合物的固相结合区段。

在捕获探针的一个实施方案中，间隔区段包括RNA聚合酶终止位点。

在捕获探针的优选实施方案中，小多核苷酸结合区段与目的miRNA基本上互补并能够与其杂交。

在捕获探针的一个实施方案中，模板区段包括包含多核苷酸聚合酶识别位点的一个或多个序列或与多核苷酸聚合酶识别位点互补的序列。

在捕获探针的一个实施方案中，模板区段包括一个或多个为限制酶识别基序的序列。

在捕获探针的一个实施方案中，模板区段包括一个或多个与RNA切割催化核酸或DNAzyme互补的序列。

本发明的一个实施方案提供了包含两种或更多种捕获探针的组合物。该组合物包括(a)具有第一间隔区段、第一小多核苷酸结合区段和第一模板区段的第一捕获探针，以及(b)具有第二间隔区段、第二小多核苷酸结合区段和第二模板区段的第二捕获探针，其中第二小多核苷酸结合区段与第一小多核苷酸结合区段具有不同的小多核苷酸结合区段序列，并且第二模板区段与第一模板区段具有不同的模板区段序列。

本发明的另一个实施方案提供了分离目的小多核苷酸的方法。该方法包括下述步骤：(a)提供上文所述的一种或多种捕获探针；(b)提供包含目的小多核苷酸的样品；(c)将所述捕获探针与所述样品合并；(d)使所述目的小多核苷酸与所述捕获探针的小多核苷酸结合区段杂交以形成小多核苷酸/捕获探针复合物；(e)将小多核苷酸/捕获探针复合物与多核苷酸聚合酶及一组三磷酸核苷合并，所述聚合酶优选能够用RNA作为引物的聚合酶；以及(f)延伸杂交的目的小多核苷酸以形成延伸产物，其中所述延伸产物包括在3’端与延伸的区段连接的目的小多核苷酸、含有与捕获探针的模板区段互补的序列的延伸的序列，并且其中所述延伸产物与所述捕获探针杂交以形成延伸产物/捕获探针复合物。

在该方法的优选形式中，目的小多核苷酸选自miRNAs、snoRNAs、siRNAs或短干扰RNAs。在特别优选的形式中，目的小多核苷酸是miRNA。

在该方法的一个实施方案中，捕获探针还包含固相结合区段，且通过将捕获探针经所述固相结合区段结合到固体载体，将小多核苷酸/捕获探针复合物或延伸产物/捕获探针复合物捕获到固相。

另一个实施方案提供了检测样品中目的小多核苷酸的方法，其包括如下步骤：(a)如上所述分离目的小多核苷酸，其中将捕获延伸探针附着于荧光珠上，且延伸的区段包含一个或多个标记的核苷酸残基；以及(b)检测所述荧光珠和与所述捕获延伸探针杂交的标记的延伸产物。

另一个实施方案提供了检测目的小多核苷酸的方法，所述方法包括如下步骤：(a)如上所述分离目的小多核苷酸，其中捕获探针的模板区段包含RNA聚合酶识别序列的一条链，且所述延伸步骤形成双链RNA聚合酶启动子；(b)将所述延伸产物/捕获探针复合物与识别双链RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶合并；以及(c)从启动子下游转录所述序列以合成包含小RNA结合序列的单链RNA产物。在该检测方法的优选实施方案中，所述捕获探针的间隔区段包含RNA聚合酶终止位点。在另一个优选实施方案中，该方法还包括重复转录步骤一次或多次。

一个实施方案提供了检测样品中目的小RNA的另一种方法，所述方法包括如下步骤：(a)如上所述分离目的小多核苷酸；(b)提供连接酶和接头区段，该接头区段包含具有3′端和5′端的多核苷酸，该接头区段具有接头区段序列，其中所述接头区段序列通过沃森-克里克碱基配对与间隔区段序列基本上互补，且能够与其杂交；(c)使所述接头区段与所述间隔区段杂交；以及(d)将所述接头区段的3′端连接到所述目的小RNA的5′端以形成连接的延伸产物，该延伸产物与所述捕获探针序列基本上互补且能与其杂交。该方法的一个优选形式还包括通过聚合酶链反应扩增所述连接的延伸产物和捕获探针。

另一个实施方案提供了检测目的小多核苷酸的方法，其包括下述步骤：(a)提供双标记的检测探针，其具有附着于检测探针分子的5’端的一种标记、附着于检测探针的3’端的另一种标记以及检测探针序列，所述序列与捕获探针的模板区段内的检测探针结合序列基本上互补且能与其杂交；(b)如上所述分离小目的多核苷酸，其中(1)合并所述捕获探针和样品还包括向合并物中加入双标记的检测探针；(2)使所述检测探针与捕获探针或小多核苷酸/捕获探针复合物的检测探针结合序列杂交；(3)将具有5’到3’核酸外切酶活性的聚合酶和核苷酸混合物添加到所述杂交的检测探针和小多核苷酸/捕获探针复合物中，以使所述检测探针被多核苷酸聚合酶的5’到3’核酸外切酶水解；以及(4)所述检测探针水解后，检测一种或多种标记的荧光特性的变化。

一个实施方案提供了检测目的小多核苷酸的另一种方法，其包括下述步骤：(a)如上所述分离目的小多核苷酸，其中(1)所述模板区段包含一个或多个序列，所述序列是双链限制酶识别基元基序(motif)的一条链；以及(2)所述延伸步骤将包含于捕获探针的模板区段内的单链限制酶识别序列转变为双链限制酶识别序列。该方法还包含(b)提供识别并作用于所述延伸的区段的限制酶识别序列的限制酶；(c)将限制酶与限制酶识别序列接触；(d)在延伸的区段的限制酶识别序列处或附近使延伸产物产生切口以产生包含所述目的小多核苷酸的3’端片段和5’末端带切口的延伸片段；以及(e)移出并检测所述带切口的延伸片段。在该方法的一种形式中，所述限制酶识别基元基序为由切口核酸内切酶识别。另一种形式中，所述模板区段的限制酶识别基元基序包含一个或多个核苷酸类似物，其使所述模板区段的限制酶识别基元基序抵抗限制酶的核酸内切酶活性。在优选的形式中，该方法还包括用聚合酶延伸包含杂交的目的小多核苷酸的3′-端片段的循环，以复原所述限制酶识别基元基序并移出5’-末端带切口的延伸片段。

所述检测方法的另一个实施方案中，(a)所述捕获探针的模板区段包含第一限制位点和第二限制位点，其中第一限制位点不同于第二限制位点，(b)所述延伸步骤将所述第一限制位点转变成双链限制酶识别序列，其能够在延伸的区段而不是在模板区段上被产生切口，且将所述第二限制位点转变成第二双链限制识别序列；(c)产生切口的步骤包含将延伸产物/捕获探针复合物与切口剂(nicking agent)接触，所述试剂识别并作用于所述第一限制位点，而不是所述第二限制位点，以使所述延伸产物在所述延伸区段的第一限制位点处或附近被选择性地产生切口，以产生带切口的延伸片段。检测步骤随后还包含：(1)提供双标记的检测探针，其与带切口的延伸片段互补且能与其杂交；(2)将所述探针与所述带切口的延伸片段杂交以形成双链探针/带切口的延伸片段复合物；(3)将所述双链探针/带切口的延伸片段复合物与切口剂接触，所述试剂能够识别所述检测探针序列并使其产生切口；以及(4)检测与使所述双标记的检测探针产生切口相关的荧光变化。在该方法的优选形式中，第一限制酶识别基序由切口核酸内切酶(nickingendonuclease)识别。在该方法的另一种形式中，所述模板区段的第二限制酶识别基序包含一个或多个核苷酸类似物，其使所述模板区段的限制酶识别基序抵抗所述限制酶的核酸内切酶活性。

在所述检测方法的另一个实施方案中，(a)所述模板区段还包含一个或多个与DNAzyme基序互补的DNAzyme互补序列、第一侧翼区段和第二侧翼区段，所述第一侧翼区段位于DNAzyme互补序列的5’端的侧面，且所述第二侧翼区段位于DNAzyme互补序列的3’端的侧面；以及(b)带切口的延伸片段的移出提供了功能性的DNAzyme，其能够在DNAzyme切割位点与合适的底物探针杂交并切割合适的底物探针。所述检测步骤还包含(1)提供包含RNA多核苷酸或嵌合的RNA/DNA多核苷酸的合适的底物探针，该底物探针具有附着于底物探针分子的5’端的一种标记以及附着于底物探针分子的3’端的另一种标记，所述底物探针包含具有第一底物探针序列的第一底物探针区段、DNAzyme切割位点以及具有第二底物探针序列的第二底物探针区段，其中所述底物探针的第一底物探针序列与所述模板区段的第一侧翼区段基本上相同，且所述第二底物探针序列与所述模板区段的第二侧翼区段基本上相同；(2)将所述底物探针和带切口的延伸片段接触，以便通过第一底物探针序列和包含于带切口的延伸片段内的互补序列之间以及在所述第二底物探针和包含于带切口的延伸片段内的互补序列之间的沃森-克里克碱基配对，在带切口的延伸片段上形成包含DNAzyme基序的环结构；(3)在DNAzyme切割位点处切割所述底物探针；以及(4)检测与切割所述底物探针相关的荧光变化。

一个实施方案提供了分离和检测小RNAs的试剂盒，其可以包括(1)捕获探针的等摩尔混合物；(2)包含三磷酸脱氧核糖核苷或三磷酸核糖核苷的核苷酸混合物；(3)聚合酶；(4)抗生蛋白链菌素包被的顺磁珠；(5)一种或多种双标记的检测探针，所述检测探针具有与所述捕获探针的模板区段内的检测探针结合序列基本上互补且能与其杂交的检测探针序列；(6)连接酶；(7)与所述捕获探针的间隔区段基本上互补且能与其杂交的寡核苷酸接头；和/或(8)一种或多种对包含于捕获探针内的限制酶识别序列具特异性的限制酶。通过下面的描述，对本发明做了更为详细的说明。

附图说明

通过下面的描述、附带的权利要求书以及附图，可更好地理解本发明的这些和其它的特征、方面和优势，其中：

图1是在依照本发明利用捕获探针分离和检测miRNAs和其它小多核苷酸的方法的某些实施方案中，一些步骤的示意图；

图2是在依照本发明分离和检测miRNAs和其它小多核苷酸的方法的某些实施方案中，一些步骤的另一张示意图，所述方法是利用具有RNA聚合酶识别位点的捕获探针的一种形式；

图3显示了在依照本发明分离和检测miRNAs或其它小多核苷酸的方法的某些其它实施方案中，一些步骤的图解，所述方法利用捕获探针指导接头连接。

图4显示了在依照本发明使用捕获探针和检测探针检测miRNAs或其它小多核苷酸的方法的其它实施方案中，一些步骤的图解。

图5显示了在依照本发明分离和检测miRNAs或其它小多核苷酸的方法的其它实施方案中，一些步骤的图解，所述方法使用产生切口位点的另一种形式的捕获探针

图6显示了在依照本发明使用另一种形式的捕获探针和检测探针检测miRNAs或其它小多核苷酸的方法的其它实施方案中，一些步骤的图解。

图7显示了在依照本发明分离和检测miRNAs或其它小多核苷酸的方法的其它实施方案中，一些步骤的图解，所述方法使用能产生DNAzyme的另一种形式的捕获探针

图8是使用10um扫描分辨率和70％激光增益的杂交的GenoExplorer^TMmiRNA芯片的扫描图像；以及

图9是利用依照本发明的方法检测的12种不同miRNAs样品的荧光强度图表。

发明详述

依照本发明的一个实施方案，提供了分离例如诸如miRNAs(小RNAs)、短干扰RNAs以及其它小调节RNAs和DNAs的小多核苷酸的方法。依照本发明的另一个实施方案，提供了鉴定目的小多核苷酸的方法。在一个实施方案中，鉴定目的小多核苷酸的方法包括依照本发明首先分离所述目的小多核苷酸。依照本发明的另一个实施方案，提供了适用于分离小多核苷酸的方法的一种或多种捕获探针以及一组或多组捕获探针。在一个实施方案中，分离小多核苷酸的方法是依照本发明的方法。现在具体地公开所述方法和捕获探针。

如在本文公开内容中所使用的，除了上下文另有规定，术语“包含(comprise)”和该术语的变异，诸如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”并非意图排除其它添加物、组分、整体或步骤。

如在本文公开内容中所使用的，术语“小RNAs”指天然存在的、18至24个RNA残基的单链RNA，通常在5’末端带有磷酸基团，通常称为“成熟微小RNAs”，其来源于通常具有“发夹”构型的更长的天然存在的前体RNA。

如在本文公开内容中所使用的，术语“小多核苷酸(smallpolynucleotide)”和“小多核苷酸(small polynucleotides)”指长度为17至200个残基的多核苷酸，通常是单链RNA或DNA，其包括非编码调节RNAs组，包括例如miRNAs、snoRNAs、snRNAs、siRNAs、反义DNAs和冈崎区段(Okazaki fragments)。

如在本文公开内容中所使用的，术语“一个或多个小多核苷酸”、“小多核苷酸(a small polynucleotide)”和“小多核苷酸(the smallpolynucleotide)”被规定为是同义的，其指一个目的小多核苷酸或多个目的小多核苷酸，除非上下文另有规定。

如在本文公开内容中所使用的，术语“一种或多种捕获探针”、“捕获探针(a capture probe)”、“捕获探针(the capture probe)”、“捕获延伸探针(capture-extension probe)”、“捕获延伸探针(capture-extensionprobes)”、“捕获和延伸模板探针(capture and extension template probe)”以及“捕获和延伸探针(capture and extension template probes)”被规定为是同义的，且可指单数或复数，除非上下文另有规定。

如在本文公开内容中所使用的，术语“基本上互补的(substantiallycomplementary)”以及该术语的变异，诸如“基本互补(substantialcomplement)”意指第一条链上所有连续残基的至少90％与第二条链相同长度的一串连续残基互补。结合本文公开内容，本领域的技术人员会理解，一条链可以短于另一条链但仍然基本上互补。例如，就本文公开内容公开的本发明而言，小RNA或小RNA结合区段可以短于或长于互补的目的小RNA，然而，优选的是所述小RNA结合区段与其对应的小RNA长度相同且基本上互补。

如本文公开内容中所使用的，术语“杂交(hybridize)”及诸如“杂交(hybridizes)”和“杂交(hybridized)”的该术语的变异，是指互补的核酸单链或链的区段的沃森-克里克碱基配对以产生反向平行的双链核酸，且如本文公开内容中所使用的，除非另有详细说明或除非上下文另有所指，杂交应该被理解为发生在基本上互补的链之间。例如，在含5ug酵母tRNA、总体积为50μl的水性缓冲液存在时，通过将等摩尔浓度如100皮摩尔的成对单链的每一条合并，然后在于25℃轻摇下孵育混合物1小时，可完成杂交，所述酵母tRNA溶于水性缓冲液包含400mMMOPS、80mM DTT和40mM MgCl₂，且pH为7.3。的总体积为50μl的水性缓冲液中。

如本文公开内容中所使用的，术语“近端(near the end)”和该术语的变异指在确定的末端残基的20％残基范围内。例如，20个残基链的近端指该链确定的5’或3’端或末端的头4个残基。

如本文公开内容所使用的，术语“延伸”或“延伸反应”指通过聚合酶与用于反应发生的所有附加试剂和条件的联合作用，延伸多核苷酸的3’端。

捕获探针

依照本发明的一个实施方案，提供了捕获探针10，其适用于分离小RNAs或DNAs的方法。参照图1A，所述探针从其3’端到其5’端包含下述共价结合或连接的区段：a)固相结合区段20，b)间隔区段30，和c)具有小多核苷酸结合区段序列的小多核苷酸结合区段40，其中所述小多核苷酸结合区段通过沃森-克里克碱基配对与一个或多个目的小多核苷酸基本上互补并能与其杂交，以及d)模板区段50。

在一个实施方案中，所述捕获探针10包含选自一种或多种多核苷酸、一种或多种核苷酸类似物以及一种或多种多核苷酸和多核苷酸类似物的组合的物质。

在一个实施方案中，所述捕获探针包含能结合于固相的分子组合物的固相结合区段20，所述分子组合物例如诸如偶联到所述捕获探针3’端的生物素，其能够结合固定到固相的抗生物素或抗生蛋白链菌素，所述固相例如诸如抗生蛋白链菌素包被的顺磁颗粒或抗生蛋白链菌素包被的微量滴定板的孔。在另一个实施方案中，所述固相结合区段20是能够共价结合到固相的物质，例如，诸如利用在该固相结合区段的伯胺和固相上的羧酸基团之间的碳二亚胺活化和酰胺键形成，偶联到固相上羧酸基团的伯胺。将多核苷酸共价偶联到固相的其它合适的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，所述固相结合区段20是捕获探针10的3’端、5’端或两端，它们也可以在捕获探针10的间隔区段30或模板区段50或该两个区段的内部。此外，可以在合成捕获延伸探针10的过程中加入固相结合区段20，例如在多核苷酸合成过程中加入生物素亚磷酰胺，这一点会被本领域的技术人员理解。另外，可以在包含间隔区段30、小多核苷酸结合区段40和模板区段50的连续捕获探针合成后，引入固相结合区段20，例如通过使用生物素化的dUTP作为生物素的来源经由末端转移酶的作用将生物素标记的dUTP掺入捕获探针的3’末端。

捕获探针的间隔区段30包含多核苷酸序列，其具有预定序列或预定大小，且经设计，能提供一种或多种功能特征。在一个实施方案中，所述间隔区段具有足以使与多核苷酸结合区段形成的杂交复合物的位阻最小化的长度。在一个实施方案中，所述间隔区段包括用于扩增反应的引物结合位点。在如图3所示的另一个实施方案中，所述间隔区段包括用于连接反应中的接头的停泊位点(docking site)。仍在另一个实施方案中，所述间隔区包括一个或多个理想的限制酶识别位点。在另一个实施方案中，所述间隔区包括RNA聚合酶识别位点。在如图2A所示的一个实施方案中，所述间隔区包括转录终止位点36。

间隔区段30的多核苷酸可以是天然存在的、合成的或核苷酸类似物，包含5-50个核苷酸或5-40个核苷酸，优选5-30个核苷酸。在一个实施方案中，所述间隔区段30由RNA组成。在一个实施方案中，所述间隔区段30由DNA组成。在一个实施方案中，所述间隔区段30由多核苷酸类似物组成。在一个实施方案中，所述间隔区段30由多个选自RNA、DNA、RNA的多核苷酸类似物和DNA的多核苷酸类似物的多核苷酸或多核苷酸类似物的嵌合体组成。在另一个实施方案中，捕获探针10的间隔区段30包含具有6-100个碳原子的碳骨架或其它骨架构型的有机物质，例如具有3-33个重复单位的聚乙二醇，或诸如包含1-17个单元的氨基己酸重复单位的酰胺类。

小多核苷酸结合区段40经设计，与目的多核苷酸形成杂交复合物。在一个实施方案中，所述目的小多核苷酸是小RNA分子。在一个实施方案中，所述目的小多核苷酸是小DNA分子。在一个实施方案中，所述小多核苷酸结合区段40由18至24个DNA残基组成。在另一个实施方案中，该小多核苷酸结合区段40由18个或19个或20个或21个或22个或23个或24个DNA残基组成。在另一个实施方案中，所述小多核苷酸结合区段40包含17-100个多核苷酸的DNA。在另一个实施方案中，所述小多核苷酸结合区段40包含17至60个多核苷酸的DNA。在另一个实施方案中，所述小多核苷酸结合区段40包含17至40个多核苷酸。

小多核苷酸结合区段40通过沃森-克里克碱基配对与一个或多个目的小多核苷酸基本上互补并能够与其杂交，所述目的小多核苷酸包括具有预定序列或具有预定大小的目的小多核苷酸，其来自包含化学相关的物质的样品，例如诸如信使RNAs、转运RNAs、核糖体RNAs和基因组DNA的混合物。如本领域技术人员结合本文公开内容所理解的，目的小多核苷酸60可以从任何合适来源的任何已知的小RNA中选择。在一个实施方案中，所述目的小多核苷酸60选自公共数据库。在一个优选的实施方案中，所述目的小多核苷酸60是miRNA，且所述公共数据库是由桑格研究所(Sanger Institute)提供的中心信息库http://miRNA.sanger.ac.uk/sequences/，新发现的以及先前已知的miRNA序列可以提交到该库来命名和分配术语，以及将序列放在数据库内存档和用于通过万维网的在线检索。通常，由桑格研究所收集的关于miRNAs序列的数据包括种类、来源、对应的基因组序列和基因组位置(通常是染色体的坐标)，以及用于成熟的完全加工的miRNA的全长转录产物和序列。

如本领域的技术人员结合本文公开内容所理解的，为了选择小多核苷酸结合区段40的序列，当靶小RNAs包含miRNA时，从例如诸如桑格研究所数据库或其它合适的数据库的合适来源中选择目的miRNA或一组目的miRNA。在优选的实施方案中，如果一组目的miRNAs选自包含一种或多种miRNAs的重复条目的来源时，首先去除重复的条目以使该组目的miRNAs的序列只包含每种目的miRNA的一个序列。在一个实施方案中，该组目的miRNAs由来自单一来源或数据库的每种miRNA的一个组成，诸如桑格研究所提供的中心信息库中列出的每种miRNA的一个。

在另一个实施方案中，目的小多核苷酸60是真核生物的小RNA。在另一个实施方案中，所述目的小RNA是灵长类的小RNA。在另一个实施方案中，所述目的小RNA是病毒小RNA。在优选的实施方案中，所述目的小RNA是人类小RNA。在另一实施方案中，所述一组目的小RNA都是真核miRNA。在另一实施方案中，该组目的小RNA都是灵长类miRNAs。在另一实施方案中，该组目的小RNA都是人类miRNAs。

在另一实施方案中，目的小多核苷酸60是真核小DNA。在另一实施方案中，所述目的小DNA是灵长类小DNA。在另一实施方案中，所述目的小DNA是病毒小DNA。在优选的实施方案中，所述目的小DNA是人类小DNA。在另一实施方案中，所述的一组目的小DNA都是真核生物DNA。在另一实施方案中，该组目的小DNA都是灵长类DNAs。在另一实施方案中，该组目的小DNA都是人类DNAs。

其次，选择的小多核苷酸结合区段40与目的小多核苷酸序列60基本互补。在优选实施方案中，小多核苷酸结合区段40在长度和序列上与目的小多核苷酸序列60恰好互补。在另一实施方案中，所述小多核苷酸结合区段与目的小多核苷酸区段的互补超过90％，所述小多核苷酸结合区段的长度与目的小多核苷酸序列的长度相同。在另一实施方案中，小多核苷酸结合区段40与的目的小多核苷酸60区段的互补超过80％，所述小多核苷酸结合区段具有与目的小多核苷酸序列60相同的长度。

在一个实施方案中，小多核苷酸结合区段40由RNA组成。在一个实施方案中，所述小多核苷酸结合区段40由DNA组成。在一个实施方案中，所述小多核苷酸结合区段40由多核苷酸类似物组成。在一个实施方案中，所述小多核苷酸结合区段40由多个选自RNA、DNA、RNA的多核苷酸类似物和DNA的多核苷酸类似物的多核苷酸或多核苷酸类似物的嵌合体组成。

此外，小多核苷酸结合区段40可以与miRNAs、snoRNAs、siRNAs或短干扰RNAs互补，由此促进它们的测定。

表I提供了一列小多核苷酸结合区段40样本，其由DNA以及与小RNA结合区段40恰好互补的miRNAs组成。如本领域的技术人员结合本文公开内容所理解的，其它小RNA结合区段40也是有用的，包括例如是表I所列的小RNA结合区段40的cDNA的小RNA结合区段40。

表I

人类_MIRNAs的8种小RNA结合区段的实例

微小RNA	作为DNA多核苷酸的小RNA结合区段	SEQ ID NO：
			hsa-let-7a	AACTATACAACCTACTACCTCA	SEQ ID NO：1
hsa-let-7e	ACTATACAACCTCCTACCTCA	SEQ ID NO：2
			hsa-miR-106a	GCTACCTGCACTGTAAGCACTTT	SEQ ID NO：3
hsa-miR-126^*	CGCGTACCAAAAGTAATAATG	SEQ ID NO：4
			hsa-miR-135a	TCACATAGGAATAAAAAGCCATA	SEQ ID NO：5
hsa-miR-138	GATTCACAACACCAGCT	SEQ ID NO：6
			hsa-miR-154	CGAAGGCAACACGGATAACCTA	SEQ ID NO：7
hsa-miR-154^*	AATAGGTCAACCGTGTATGATT	SEQ ID NO：8

捕获探针的模板区段50包含具有预定序列或预定大小的多核苷酸序列，其经设计，提供一种或多种功能特征。

在特别优选的实施方案中，包含捕获探针的模板区段50的多核苷酸可以作为通过多核苷酸聚合酶的作用合成互补多核苷酸链的模板。

在如图4所示的一个实施方案中，模板区段包括检测探针52的结合位点。

在如图2所示的另一个实施方案中，模板区段包括多核苷酸聚合酶识别位点54或与多核苷酸聚合酶识别位点互补的位点。在优选的实施方案中，所述多核苷酸聚合酶识别位点54是选自T7、SP6、T3DNA依赖的RNA聚合酶、大肠杆菌的2型RNA聚合酶和单链DNA依赖的N4RNA聚合酶的多核苷酸合成启动子的基序。然而，如本领域的技术人员结合本文公开内容会理解的，所述多核苷酸合成启动子基序可以是任何其它合适的多核苷酸合成启动子的基序。

在一个实施方案中，模板区段包括转录终止位点。

在如图5所示的另一个实施方案中，模板区段包含一个或多个为限制酶识别基序56的序列。在特别优选的实施方案中，当特异性限制酶识别基序56存在时，其不存在于通过本发明的方法分离和鉴定的miRNA或其它目的小多核苷酸的DNA类似物中。在一个实施方案中，所述限制酶识别基序56存在时，被切口核酸内切酶识别。在优选的实施方案中，模板区段的限制位点基序56并不被切口核酸内切酶切割。在特别优选的实施方案中，所述限制位点56由诸如从纽英生物技术公司(New England Biolabs)(Ipswich，MA)得到的N.BbvCI、N.AlwI、N.BstNBI、N.Bpu10I等切口核酸内切酶识别。在一个实施方案中，所述限制酶识别基序56由选自BamHI、Hind III和EcoR I的限制酶识别。因为BamH I、Hind III和EcoR I还作用于一些miRNA序列的DNA等同物，所以在优选的实施方案中，所述限制位点基序56由选自Not I、Xho I、Xma I和Nhe I的限制酶识别。在优选的实施方案中，所述限制酶识别基序56包含一个或多个修饰的核苷酸或核苷酸类似物，其保护模板区段免受限制酶的核酸内切酶活性的影响。例如，模板区段50的限制酶识别基序56可以包含一个或多个抵抗水解的核苷酸间键(internucleoside bond)，诸如硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯(boranophosphate)键、甲基磷酸酯键或肽键。核苷酸类似物的可选实例是在限制酶识别基序56中由脱氧尿苷代替脱氧胸苷。然而，如本领域的技术人员结合本文公开内容会理解的，也可以使用其它合适的限制位点基序。

在如图7所示的另一个实施方案中，模板区段50包含与DNAzyme互补的一个或多个序列130。RNA切割DNA酶(DNAzyme)的实例包括“10-23”和“8-17”通用RNA切割DNA酶，两者都包含保守的催化序列(分别是GGCTAGCTACAACGA和TCCGAGCCGGACGA)。该保守的催化结构域侧面是能够通过沃森-克里克碱基配对与靶RNA杂交的可变结合结构域。侧翼结合结构域与靶RNA的杂交形成了包含催化结构域的环结构。由示例的“10-23”DNAzyme的切割发生在靶RNA的嘌呤-嘧啶二核苷酸处，而由示例的“8-17”DNAzyme的切割发生在靶RNA的AG二核苷酸处。因此，如本领域的技术人员结合本文公开内容所理解的，依照本实施方案，与DNAzyme基序互补的序列130包含与保守的催化序列互补的序列。

在一个实施方案中，捕获探针的模板区段50包含多核苷酸，所述多核苷酸包含的核苷酸为天然存在的、合成的核苷酸或核苷酸类似物。

在一个实施方案中，模板区段50包含1-50个核苷酸，在另一个实施方案中，该模板区段包含1-40个核苷酸，且仍在另一实施方案中，该模板区段包含1-30个核苷酸。

在一个实施方案中，模板区段50由RNA组成。在一个实施方案中，模板区段50由DNA组成。在一个实施方案中，模板区段50由多核苷酸类似物组成。在一个实施方案中，所述模板区段由多个选自RNA、DNA、RNA的多核苷酸类似物和DNA的多核苷酸类似物的多核苷酸或多核苷酸类似物的嵌合体组成。

在一组捕获探针10中，模板区段50可以包含相同的序列、不同的序列或序列和长度均不同的序列。例如，在一组捕获探针10中包含不同长度的多核苷酸的模板区段50可以用于产生它们各自的靶标小多核苷酸诸如miRNAs的不同延伸产物。此外，不同长度的延伸产物可以随后用于使用标准的方法例如诸如使用毛细管电泳来区分不同的靶标小RNAs。

如本领域的技术人员结合本文公开内容所理解的，捕获探针10的合成使用已知的方法。例如，所述方法可以包括，首先选择固相结合区段20、间隔区段30、小多核苷酸结合区段40和模板区段50的序列，然后合成它们。例如，在一个实施方案中，3’固相结合区段20包含生物素；间隔区段30包含诸如AGCTC的5个核苷酸的短DNA多核苷酸区段、或者诸如T7 DNA依赖性RNA启动子的多核苷酸、多核苷酸TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO：9)或其互补序列CCCTATAGTGAGTCGTATTA(SEQ ID NO：10)或不与目的小多核苷酸60互补的其它多核苷酸；小多核苷酸结合区段40包含目的小RNA 60的一个或多个互补DNA序列，诸如表I中所列的那些；以及模板区段50包含诸如例如SP6DNA依赖性RNA聚合酶启动子54，例如DNA多核苷酸ATTTAGGTGACACTATAG(SEQ ID NO：11)或不与目的小多核苷酸互补的其它多核苷酸。此外，捕获探针的间隔区段30和模板区段50两者之一或两者可以包括限制位点56。

在特别优选的实施方案中，捕获探针10的3’端倒数第二位(penultimate)由例如磷酸酯、硫代磷酸酯、生物素、双脱氧核苷酸、3’胺(amine)等封闭，以使其不能延伸。这样封闭3’端以阻止延伸为本领域所熟知。这样封闭末端的目的是通过几种聚合酶固有的拟末端转移酶活性或潜在末端转移酶活性阻止捕获探针10的延伸。

捕获探针10的合成可以通过亚磷酸酰胺化学容易地实现，且可以从本领域熟知的众多来源获取，本领域的技术人员结合本文公开内容应理解这一点。现参照表II，其显示了左侧栏中所列的用于检测的目的小RNAs 60(如同表1所列，所有目的小RNAs 60都是人类miRNAs)的8种样本捕获探针10。

表II

探针名称	序列	SEQ ID NO：
			ILLUM-ED V1-7a	ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGAACTATACAACCTACTACCTCAGCTAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA	SEQ ID NO：12
ILLUM-ED V1-7e	ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGACTATACAACCTCCTACCTCAGCTAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA	SEQ ID NO：13
			ILLUM-ED V1-106a	ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGGCTACCTGCACTGTAAGCACTTTGCTAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA	SEQ ID NO：14
ILLUM-ED V1-126^*	ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCGCGTACCAAAAGTAATAATGGCTAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA	SEQ ID NO：15
			ILLUM-ED V1-135a	ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGTCACATAGGAATAAAAAGCCATAGCTAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA	SEQ ID NO：16
ILLUM-ED V1-138	ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGGATTCACAACACCAGCTGCTAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA	SEQ ID NO：17
			ILLUM-ED V1-154	ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCGAAGGCAACACGGATAACCTAGCTAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA	SEQ ID NO：18
ILLUM-ED V1-154^*	ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGAATAGGTCAACCGTGTATGATTGCTAGCCCCTATAGTGAGTCGTATTA	SEQ ID NO：18
			探针元件5′-3′方向	5′SP6SENSE，XhoI，uRNA REVCOMPL，NheI，T7REVCOMPL，在合成中3′生物素任选

使用方法

分离/捕获

依照本发明的另一实施方案，提供了从包含目的小多核苷酸的样品中分离miRNA(微小RNA)或其它目的小多核苷酸的方法。依照本发明的另一实施方案，提供了鉴定miRNAs或其它小多核苷酸的方法。在一个实施方案中，用于鉴定miRNAs或其它小多核苷酸的方法首先包括依照本发明分离小多核苷酸。参照图1，显示了该方法的某些实施方案中的一些步骤。所显示的步骤并非意图限制，也不是意指描述的每一步对该方法是必需的，而仅是示例性步骤。

从图1A中可以看出，该方法包括首先提供包含miRNA或其它目的小多核苷酸60的样品。适于通过本发明的方法分析的样品包含或潜在地包含小RNAs和小DNAs。在一个实施方案中，所述样品还包含一种或多种与目的miRNA化学上相关的物质，例如诸如选自信使RNA、转运RNA、核糖体RNA、siRNA、5S/5.8SrRNA、基因组DNA以及前述的组合的物质。在一个实施方案中，所述样品还包含一种或多种除了miRNA以外的RNA，例如诸如选自信使RNA、转运RNA、核糖体RNA、siRNA、5S/5.8SrRNA以及前述的组合的物质。样品中RNA的全部，不管RNA的类型，构成了样品中的“总RNA”。

在一个实施方案中，合适的样品从全血、组织培养、细胞培养、诸如肝、肺、脑的完整组织或甚至诸如线虫(C.elegans)或果蝇(Drosophila)的完整有机体的真核细胞中获取。也可以从受一些病毒侵袭的组织中分离小多核苷酸，因为这些微生物产生miRNAs，这些miRNAs能够抑制免疫反应或修饰其它宿主因素以通过损害宿主因素使所述微生物持续存在和感染，否则所述微生物就转向对它们有利的宿主资源。同样，小多核苷酸可在细菌或原核生物中存在，调节它们诸如生物膜形成的过程以及诸如致病性的细菌的其它活性。这些样品来源在本领域中是熟知的。

在一个实施方案中，样品来自真核生物。在另一个实施方案中，所述样品来自灵长类。在优选的实施方案中，所述样品来自人类。

在一个实施方案中，样品包含选自血液、脑、心脏、肠、肝、肺、胰腺、肌肉、叶、花、植物的根和植物的茎的组织或组织液。

细胞裂解产物适合用于捕获探针10，特别是当中和了能降解样品中待检测的miRNAs或小多核苷酸或降解与所述样品接触的捕获探针10的核酸酶时，然而，在合成过程中，通过用核酸酶抗性骨架如诸如肽核酸的酰胺或更为常见的硫代磷酸修饰的骨架合成捕获探针，可以使抵抗捕获探针对核酸酶的作用。在另一个实施方案中，所述样品是包埋固定的组织切片，其中样品中固定的小多核苷酸，例如miRNAs，作为捕获-延伸探针10的固相结合区段或元件20。

在一个实施方案中，该方法还包括提供样品后从所述样品中分离总RNA。在优选的实施方案中，使用本领域已知的方法或使用可从诸如QIAgen、Invitrogen、Promega等供应商广泛获得的商品化试剂盒从所述样品中分离总RNA。如本领域技术人员结合本文公开内容所理解的，当该方法包括提供样品后从所述样品中分离总RNA时，术语“样品”指用于该方法其余步骤的分离的总RNA。

目的小多核苷酸60具有目的小多核苷酸序列，且包含3’端和5’端。在一个实施方案中，所述目的小多核苷酸是miRNA，其由18至24个残基组成。在另一个实施方案中，目的miRNA由18或19或20或21或22或23或24个RNA残基组成。

目的小多核苷酸60通过沃森-克里克碱基配对与依照本发明的捕获探针10的小多核苷酸结合区段40基本上互补且能与其杂交。在一个实施方案中，所述小多核苷酸是公开数据库中所列的目的miRNA。在优选的实施方案中，所述公共数据库是由桑格研究所提供的中心信息库http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/，miRNA序列提交到该库来命名和分配术语，并将序列放在数据库内存档和用于通过万维网的在线检索。通常，由桑格研究所所收集的关于miRNAs序列的数据，包括种类、来源、对应的基因组序列和基因组位置(通常是染色体的坐标)，以及用于成熟的完全加工的miRNA(带有5’末端磷酸基团的miRNA)的全长转录产物和序列。

在一个实施方案中，提供的样品包含多个目的miRNAs 60，其中所述多个miRNAs的每一个或其它目的小多核苷酸60具有彼此相同的目的小多核苷酸序列。在一个实施方案中，提供的样品包含多个目的miRNAs 60，其中所述多个目的miRNAs 60的至少两个具有彼此不同的目的miRNA序列。在一个实施方案中，提供的样品包含多个目的miRNAs 60，其包含具有第一目的miRNA序列的第一目的miRNA以及具有第二目的miRNA序列的第二目的miRNA，其中所述第一目的miRNA序列不同于所述第二目的miRNA序列。在另一实施方案中，提供的样品包含多个目的miRNAs 60，其包含具有第一目的miRNA序列的第一目的miRNA、具有第二目的miRNA序列的第二目的miRNA以及具有第三目的miRNA序列的第三目的miRNA，其中所述第一目的miRNA序列不同于所述第二目的miRNA序列，其中所述第一目的miRNA序列不同于所述第三目的miRNA序列，且其中所述第二目的miRNA序列不同于所述第三目的miRNA序列。

其次，该方法还包含提供捕获探针10。在一个实施方案中，提供的捕获探针10是依照本发明的捕获探针10。当所述捕获探针10是依照本发明的捕获探针时，所提供的捕获探针10在所有方面都具有依照本发明所公开的捕获探针10的特征和属性，出于清楚的目的，其中一些会在下文重复。如在图1中所观察到的，捕获探针10从左到右，从该捕获探针10的3′端到该捕获探针的5′端包含图1中所描述的如下三个区段：a)具有间隔区段序列的间隔区段30；b)具有多核苷酸结合区段序列的小多核苷酸结合区段40；以及c)具有模板区段序列的模板区段50，其包括3′端和5′端，其中所述间隔区段50的5′端与所述多核苷酸结合区段40的3′端连接，且其中多核苷酸结合区段40的5′端与所述模板区段50的3′端连接。该多核苷酸结合区段40对目的miRNA或其它小多核苷酸60的特异性允许该方法直接用于包含与miRNA相关的物质的样品或用于分离的总RNA，而不需要目前的技术方法中所必需的从所述样本或总RNA中特异性分离miRNAs，例如诸如通过凝胶电泳或层析纯化。

在特别优选的实施方案中，捕获探针10的3’端倒数第二位由例如磷酸酯、硫代磷酸酯、生物素、双脱氧核苷酸、3’胺等封闭，以使其不能延伸。这样封闭3’端以阻止延伸为本领域技术人员所述熟知。这样封闭末端的目的是通过几种聚合酶固有的拟末端转移酶活性或潜在末端转移酶活性阻止捕获探针10的延伸。

在一个实施方案中，提供了多种捕获探针10作为包含两种或多种捕获探针的组合物或混合物。所述混合物包括(a)具有第一间隔区段30、第一小多核苷酸结合区段40以及第一模板区段50的第一捕获探针10；以及(b)具有第二间隔区段20、第二小多核苷酸结合区段40以及第二模板区段50的第二捕获探针10，其中所述第二小多核苷酸结合区段40与第一多核苷酸结合区段40具有不同的小多核苷酸结合区段序列，且第二模板区段50与第一模板区段50具有不同的模板区段序列。因此，结合于捕获探针10的不同的小多核苷酸的存在与相关的模板区段50中的可检测的差异相互关联。在优选的实施方案中，第一模板区段50与第二模板区段50在长度上不同。

参照图1A，该方法接着包括将捕获探针10与样品合并，所述样品在图1A中由目的小多核苷酸60代表。在优选实施方案中，所述方法包括将所述样品与所述捕获探针10在溶液中合并。

在一个实施方案中，合并捕获探针10和样品包括合并约等摩尔量的每种捕获探针10。在另一个实施方案中，合并捕获探针10与样品包括将约等摩尔量的每种捕获探针10与一定量的样品合并，所述样品被期望含有捕获探针10的约1/10摩尔量的目的小多核苷酸60。在另一个实施方案中，合并捕获探针10与样品包括将约等摩尔量的每种捕获探针10与一定量的样品合并，所述样品被期望含有捕获探针10的约1/2和1/10摩尔量的目的小多核苷酸。在一个实施方案中，合并捕获探针10与样品包括将样品与0.1pmol/μl至100pmol/μl的每种捕获探针10在合适的缓冲液中合并以产生包含捕获探针10和所述样品的溶液。在优选的实施方案中，样品中总RNA的量从约10pg到约10μg之间变动，更优选从约10ng到约1μg之间变动。在优选的实施方案中，所述缓冲液选自TRIS、MOPS和SSC；包括诸如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠的碱性盐；且还可以包括核酸酶抑制剂以及促进剂，诸如葡聚糖硫酸酯、聚乙二醇或聚丙烯酰胺。示例性的缓冲液包括(a)溶于0.1-2.0M氯化钠的1X TE缓冲液；(b)溶于1mM EDTA和100mM氯化钠的0.1M MOPS，以及(c)20mM MOPS、1.8M氯化锂、1mMEDTA、100μM金精三羧酸(aurintricarboxylic acid)pH 6.8。如本领域的技术人员结合本文公开内容会理解的，选择的缓冲液pH应是使目的反应最优化的一个。通常，所选的pH是6至8，优选6.4至7.4且更优选接近7.0。在优选的实施方案中，该方法还包括将一种或多种核糖核酸酶抑制剂添加到样品和捕获探针10的合并物中，所述酶抑制剂例如诸如选自十二烷基硫酸锂(LiDS)、十二烷基硫酸钠、金精三羧酸的铵盐和金精三羧酸的铵盐的钠盐、β巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(Tris(2-Carboxyethyl)-Phosphine Hydrochloride)(TCEP)或人胎盘核糖核酸酶抑制剂的核糖核酸酶或核酸酶抑制剂。这些抑制剂被包括以抑制核酸酶而不降低探针与其靶多核苷酸相互杂交的能力，这一点会被本领域的技术人员所理解。

参照图1B，将捕获探针10和样品合并后，该方法包括使目的小多核苷酸60与小多核苷酸结合区段40杂交以形成小多核苷酸/捕获探针复合物(图1B)。在一个实施方案中，使目的小多核苷酸60与小多核苷酸结合区段40杂交包括在25℃至60℃下，孵育包含捕获探针10和样品的溶液1至60分钟，直至几乎所有的目的miRNA 60与捕获探针10杂交，由此将目的小多核苷酸10从样品中其它的物质中隔离出。

除了小多核苷酸结合区段40以外，捕获探针10还包含固相结合区段20、间隔区段30和能作为多核苷酸聚合酶模板的模板区段50。随后例如通过将生物素化的捕获探针10结合到抗生蛋白链菌素包被的顺磁颗粒及随后通过磁珠的作用临时性固定顺磁颗粒和移除剩余的生物样品，将该组捕获探针10和杂交的靶RNAs 60捕获到固相。与检测诸如miRNAs的小多核苷酸的其它方法不同，使用本文公开内容的方法允许回收和进一步处理移除的生物样品以用于诸如mRNAs或基因组DNA的其它分子种类的分析。随后，在所述颗粒释放入洗涤缓冲液后，将所述颗粒洗涤几轮以从顺磁珠和捕获延伸探针杂交复合物中移除未杂交的多核苷酸和其它物质。

固定的捕获探针10方法的一个优势是不需要用于诸如小核仁RNAs、siRNAs、微小RNA和反义RNAs的非编码蛋白RNAs的总RNA样品的初始富集。优选地，所述捕获探针10会在溶液中与特异性靶标杂交。其次，当捕获探针10固定于固体载体上时，可移除未结合的材料并由此完成特异性靶标的富集。另一个优势是便于缓冲液的交换。仍另一个优势是小多核苷酸可以从结合的捕获探针中洗脱。所述洗脱的小多核苷酸是高度浓缩和富集的，适用于多种下游分析方法，所述洗脱方法为本领域所熟知，例如使用80℃的水或甲酰胺，所述下游应用如凝胶电泳、连接和测序、标记和杂交等。

延伸

接着，如图1B所示，该方法包含延伸反应。延伸反应的第一步包含将小多核苷酸/捕获探针复合物与多核苷酸聚合酶和一组三磷酸核苷酸合并。该延伸反应还包括延伸杂交的目的小多核苷酸60以形成延伸产物80，其中所述延伸产物80与捕获探针10杂交以形成延伸产物/捕获探针复合物(图1C)。所述延伸产物包含在3’端与延伸的区段连接的目的小多核苷酸60，所述延伸的区段包含与捕获探针10的模板区段50互补的序列(图1D)。在本发明的一个实施方案中，所述延伸的区段包含一个或多个标记的或修饰的核苷酸残基。

通常，所述核苷酸聚合包含DNA的聚合以获得组成延伸产物80的RNA-DNA嵌合体。在本发明的一个实施方案中，结合到捕获探针10的杂交的小多核苷酸60通过聚合酶的作用进行延伸，该聚合酶利用杂交的小RNA作为引物。在另一个实施方案中，如果捕获-延伸探针10的延伸模板区段50是DNA，则聚合酶是DNA依赖性DNA聚合酶，能够利用所述杂交的小多核苷酸60的3’端作为引物。在另一个实施方案中，所述聚合酶是多核苷酸聚合酶，其可以利用RNA作为引物，诸如T4、T7、大肠杆菌Pol I、MMLV逆转录酶、Bst聚合酶、Phi-29聚合酶等或这些酶的一种或多种的组合。在优选的实施方案中，所述多核苷酸聚合酶缺乏所有的核酶活性，且能够容易地利用标记的三磷酸核苷酸作为杂交的小多核苷酸延伸的底物，所述小多核苷酸诸如作为延伸反应引物的miRNA。

用于延伸反应的核苷酸混合物通常是一组三磷酸核苷，通常是NTPs，例如ATP、CTP、GTP和UTP，或是dNTPs，例如dATP、dCTP、dGTP和TTP(或dUTP)。在一个实施方案中，三磷酸核苷的至少一种包含诸如荧光素、花青3、花青5、生物素、氨丙烯基、地高辛、四甲基若丹明等的可检测标记。广泛多样的可检测三磷酸核苷可以从Roche(Indianapolis，IN)、Invitrogen(Carlsbad，CA)和其它商家购买。在优选的实施方案中，标记的三磷酸核苷的浓度低于其它三种三磷酸核苷的浓度。例如，在一个实施方案中，未标记的三磷酸核苷在延伸反应中的浓度为5至300微摩尔，标记的三磷酸核苷的浓度则为5至30微摩尔。然而，如本领域所理解的，不同的聚合酶在链合成中具有不同的利用此类修饰的核苷酸的能力。因此，在某些情况下，使用的标记的三磷酸核苷的浓度可以与延伸反应中所使用的未标记的三磷酸核苷的浓度相当。三磷酸核苷浓度的此类调整本领域内是熟知的。此外，本领域已知，可调整延伸反应中使用的缓冲液和或温度以适应修饰的三磷酸核苷在延伸反应中的掺入。

选择用于延伸反应的缓冲液不应该妨碍小多核苷酸60与其捕获探针10的杂交，且适合由聚合酶引发的延伸反应。缓冲液的优选形式允许或促进修饰的核苷酸在延伸产物中的掺入。

在一个实施方案中，聚合酶是来自大肠杆菌的Klenow酶的无核酸酶形式；三磷酸核苷酸是dATP、dCTP、dGTP，每种100微摩尔，标记的dNTP是用花青3标记的dUTP，浓度为10微摩尔；延伸缓冲液包含0.05M Tris-HCL、0.01M MgCl2、1.0mM DTT、0.05mg/ml BSA以及20单位的核糖核酸酶抑制剂，如能够抑制真核核糖核酸酶的重组哺乳动物蛋白。

检测/鉴定

延伸产物80的分析可以使用本领域已知的技术来进行，所述技术包括，但不限于，通过利用对待评价的miRNAs或其它小多核苷酸特异的微阵列的杂交和检测、基于聚合酶链反应(PCR)的分析、序列分析、流式细胞术和电泳分析。

也会被本领域的技术人员所理解的是，一组捕获探针10可以首先结合到诸如荧光编码珠的固相，所述编码珠被指定根据探针对给定小多核苷酸的特异性或与给定小多核苷酸的互补来鉴定每种捕获探针。在一个实施方案中，一组编码珠中的每种独特唯一的编码珠对应于待评价的一组miRNAs内的一种独特唯一的miRNA。通过流量法(flowmethod)用于测定的所述这类编码珠可从诸如Luminex(Austin，TX)的众多供应商获得。本领域的技术人员应当理解的是，随后适于杂交的条件下，将所述组的编码珠与包含待评价或待测量的miRNAs的生物样品接触。此外，然后洗涤所述杂交珠以移除样品中未杂交的材料和其它组分。然后在标记的dNTP(s)存在下，通过上文所述的DAN聚合酶作用，延伸所述珠。然后直接测定这些编码珠来确定生物样品中miRNAs或其它小多核苷酸的存在和数量是可能的。为了降低背景和干扰，理想的是，通过洗涤所述珠，然后通过流量检测进行分析，从所述珠中移除延伸反应中未结合的组分，此类方法在本领域内已被充分了解。

逆转录

在许多实施方案中，目的多核苷酸60的随后扩增、检测和/或鉴定还可以包含所得的延伸产物80的逆转录以产生cDNA。通过本领域技术人员已知的任何方法并结合本文公开内容，可以完成合适的逆转录引物的设计以及使用逆转录酶以产生延伸产物的cDNA拷贝。

扩增

术语“PCR反应”、“PCR扩增”、“PCR”、“预PCR”和“实时定量PCR”是用于表明应用核酸扩增系统的可互换的术语，所述系统增加了待检测的靶核酸。这种系统的实例包括聚合酶链反应(PCR)系统和连接酶链反应(LCR)系统。最近描述的和本领域的技术人员已知的其它方法是基于核酸序列的扩增(NASBA^TM，Cangene，Mississauga，Ontario)和Qβ复制酶系统。可实时监测或不实时监测所述扩增反应形成的产物，或仅在反应后监测作为终点测量结果。

RNA扩增

在如图2所示的一个实施方案中，该方法还包括将包含在捕获探针的间隔区段30或模板区段50内的部分RNA聚合酶识别序列54转变成完整的RNA聚合酶识别序列54和72且最终转变成双链RNA聚合酶启动子54和72。随后利用识别双链RNA聚合酶启动子54和72的RNA聚合酶，RNA转录产生了扩增的单链RNA分子。这种单链RNA分子90可用于多种下游应用，包括涉及核酸微阵列的基因表达研究以及通过细胞内的反义或RNAi活性敲除与转录物互补的对应miRNA或其它RNA。

术语“RNA聚合酶识别序列”意在包括单链和双链核苷酸序列54和72。当以单链形式时，所述核苷酸序列对应于双链RNA聚合酶启动子的模板链或非模板链。“模板链”指一条核酸链，在其上通过模板依赖性核酸聚合酶活性用核苷酸或核苷酸类似物合成一条互补链。“非模板链”指与模板链互补的核酸链。当以双链形式时，所述核苷酸序列对应于双链RNA聚合酶启动子的模板链和非模板链。

在一个实施方案中，捕获探针的模板区段包含RNA聚合酶识别位点70的非模板链。在另一个实施方案中，间隔区段包含RNA聚合酶识别位点的模板链。

任何RAN聚合酶识别序列54都可以用于本文所述的方法中，只要它被RNA聚合酶特异性识别。优选地，所用的RNA聚合酶识别序列被诸如T7、T3或SP6RNA聚合酶的噬菌体RNA聚合酶识别。示例性的T7RNA聚合酶识别序列是TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO：20)。示例性的T3RNA聚合酶识别序列是AATTAACCCTCACTAAAGGG(SEQ ID NO：21)。示例性的SP6RNA聚合酶识别序列是AATTTAAGGTGACACTATAGAA(SEQ ID NO：22)。

例如，参照图2B，目的小多核苷酸60(例如mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、非编码RNAs，反义DNAs等)与捕获探针10的小多核苷酸结合区段40杂交，其中模板区段50包含必需的RNA聚合酶识别位点54(在图2B的情况下，是RNA聚合酶启动子的非模板链)。

随后的延伸产物80包含目的多核苷酸60和与该目的小多核苷酸的3′端相邻的延伸的区段70，所述延伸区段70包含与模板区段50的RNA聚合酶识别位点互补的序列(图2C)。包含RNA聚合酶识别位点54和其互补序列72的双链区产生了RNA聚合酶启动子。

在一个实施方案中，为了检测目的多核苷酸60，使用RNA聚合酶转录如上文所述而形成的延伸产物80，这样就形成了包含与目的多核苷酸互补的序列40的RNA产物90，所述RNA聚合酶识别位于延伸产物80相对端的RNA聚合酶启动子54和72。将双链延伸产物/捕获探针复合物与识别RNA聚合酶启动子54和72的RNA聚合酶合并，产生了包含与所述目的小多核苷酸互补的序列即cRNA 40(图2D)的单链RNA产物。在90的一个方面，捕获探针的间隔区段30可以包括RNA聚合酶终止位点36，例如T7终止序列GCTAGTTATTGCTCAGCGG(SEQ ID NO：23)。在此情形下，cRNA转录物90会包含与RNA聚合酶识别位点54直接相邻且在所述位点54下游的残基，其在终止位点36前的残基的3’端终止。如果省略了终止位点36，则所述酶会聚合在启动子基序中的转录起始点下游的整个序列，包括目的多核苷酸的互补链40以及通过例如接头区段的连接作用追加在目的多核苷酸60的5’端的任何其它序列。

优选地，转录反应在核糖核苷酸包括标记的核糖核苷酸存在时发生。在一个方面，标记核苷酸。如果需要制备包含cRNA的标记的多核苷酸，则可以略去未标记的UTP，并用标记的UTP取代，或与标记的UTP混合。标记可以包括，例如荧光标记或放射性标记。

RNA转录产物90的检测指示样品中存在待检目的多核苷酸60，可以进一步用于目的多核苷酸60的定量。可以通过本领域技术人员已知的任何方法实现上述转录的产物90的检测。优选地，使用掺入转录物90的标记的检测实现产物90的检测。优选地，在转录产物按大小分离后或与其同时进行所述检测。

连接

促进目的小多核苷酸扩增和/或检测的另一种方式包括连接反应，以便进一步延长小多核苷酸延伸产物80。“连接”或“共价偶联”指两个邻近核苷酸序列的共价偶联，如与捕获探针的间隔区段30基本上互补且与其杂交的接头序列100，其与邻近的miRNA或其他的小多核苷酸延伸产物80共价偶联。所述反应受连接酶的催化，在一个核苷酸序列的5’端和邻近核苷酸序列的3’端之间，如捕获探针的两个邻近区段之间或该两条邻近区段的互补物之间，形成磷酸二酯键。适宜的酶包括下列酶：EC6.5.1.1(DNA连接酶(ATP))和EC 6.5.1.3(RNA连接酶(ATP))。

目的小多核苷酸60与捕获探针10杂交后，根据本发明这一方面的方法还包括提供接头区段100(图3A)。在一个实施方案中，所述接头区段100包含选自下述的物质：包括核糖核苷酸以及脱氧核糖核苷酸的一种或多种的多核苷酸，一种或多种的核苷酸类似物，以及一种或多种多核苷酸和多核苷酸类似物的组合。在一个实施方案中，所述接头100可抵抗核酸酶的降解。在优选的实施方案中，所述接头100包含核酸酶抗性核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述接头100包含具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸，该骨架使所述接头能抵抗核酸酶降解。

接头100具有接头序列，并包含3’端和5’端。在一个实施方案中，接头序列通过沃森-克里克碱基配对与本发明的捕获探针10的间隔区段30基本上互补并能与其杂交。

接头100包含6至50个残基。在优选的实施方案中，所述接头100包含至少10个残基，且所述接头100的3’端的至少10个残基与间隔区段30的5’端处或其附近的相应残基恰好互补。

在一个实施方案中，允许接头100与间隔区段30杂交，随后连接于延伸产物80，形成与捕获探针序列10(图3B)基本上互补并能与其杂交的连接的延伸产物110。通过提供具有对捕获探针10的间隔区段序列30具特异性的接头序列的接头100，可协助此类连接反应，以便在序列特异性杂交时，小多核苷酸靶标60和所述接头100可彼此紧密靠近。

在优选的实施方案中，接头100的3’端通过适宜的连接酶如T4多核苷酸连接酶或通过另一个适宜的化学反应能连接于目的miRNA 60的5’端。

参照图3A，如图3A通过与捕获探针10杂交的目的小多核苷酸60和延伸的区段70所示，该方法接着包括将接头100与样品和捕获探针10合并。在优选的实施方案中，该方法包括将接头100和杂交的捕获探针/延伸产物10/80在溶液中合并。可选地，如本领域技术人员结合本文公开的内容会理解的，捕获探针10、接头100以及样品可同时合并或以任何顺序依次合并。例如，首先将捕获探针10与样品合并，接着将捕获探针和样品与接头100合并；或可选地，例如，首先将捕获探针10和接头100合并，接着将捕获探针10和接头100与样品合并；或可选地，例如，首先将接头100与样品合并，接着将捕获探针10与接头100和样品合并。

在一个实施方案中，合并捕获探针10、接头100以及样品包括将约等摩尔量的捕获探针10和接头100合并。在另一个实施方案中，合并捕获探针10、接头100和样品包括将约等摩尔量的捕获探针10和接头100与一定量的样本合并，所述样本被期望含有捕获探针10或接头100的约1/10摩尔量的目的小多核苷酸60。在一个实施方案中，合并捕获探针10、接头100和样品包括将样品与0.1pmol/μl至100pmol/μl的每种捕获探针10和接头100在适当的缓冲液中合并，以产生包含捕获探针10、接头100和样品的溶液。在优选的实施方案中，所述缓冲液选自TRIS、MOPS以及SSC；并包括诸如氯化钠、氯化钾、柠檬酸钠的碱性盐；以及还可以包括核酸酶抑制剂和促进剂，诸如葡聚糖硫酸酯、聚乙二醇、聚丙烯酰胺。示例性的缓冲液包括(a)溶于0.1-2.0M氯化钠的1×TE缓冲液；(b)溶于1mM EDTA和100mM氯化钠的0.1M MOPS，以及(c)20mMMOPS、1.8M氯化锂、1mM EDTA、100μM金精三羧酸(pH 6.8)。如同本领域技术人员结合本文公开的内容会理解的，选择的缓冲液pH将是最优化目的反应的pH。通常，所选的pH是6至8，优选6.4至7.4，且更优选接近7.0。在优选的实施方案中，该方法还包括将一种或多种核糖核酸酶抑制剂加入到样品和捕获探针10的合并物中，所述酶抑制剂例如诸如选自十二烷基硫酸锂(LiDS)、十二烷基硫酸钠、金精三羧酸的铵盐以及金精三羧酸的钠盐、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-甲酰乙基)-膦盐酸盐(TCEP)或人胎盘核糖核酸酶抑制剂的核糖核酸酶或核酸酶抑制剂。如同本领域技术人员所理解的，此类抑制剂可抑制核酸酶，而不降低探针和它们的靶多核苷酸彼此杂交的能力。

参照图3B，接头100、捕获探针10以及样品合并后，该方法包括使接头100与间隔区段30杂交，由此将接头100、目的小多核苷酸60以及任选地延伸的区段70与捕获探针10结合。在一个实施方案中，使接头100与间隔区段30杂交以及使目的小多核苷酸60与小多核苷酸结合区段40杂交，包括在足以使接头100与捕获探针10的间隔区段30杂交的条件下、在25℃至60℃下将包含接头100、捕获探针10和样品的溶液孵育1至60分钟。

在优选的实施方案中，接头100与间隔区段30在接头100的3’端的最后一个残基与间隔区段30上的残基杂交的位置处杂交，距离目的小多核苷酸60的5’端的1至5个残基。在特别优选的实施方案中，接头100与间隔区段30在接头100的3’端的最后一个残基与间隔区段30上的残基杂交的位置处杂交，与目的小多核苷酸60的5’端直接相邻。

接下来，如图3B所示，该方法包括将和间隔区段30杂交的接头100的3’端与和小多核苷酸结合区段40杂交的目的小核苷酸60的5’端共价连接。接头100的3’端与目的小多核苷酸60的5’端的连接以及目的小多核苷酸3’端向延伸的区段70的3’端的延伸，可以以包括同时、依次的任何顺序实现。在一个实施方案中，如本领域技术人员结合本文公开的内容会理解的，所述连接可通过标准技术实现。在优选的实施方案中，连接包括在存在适宜的缓冲液和必要辅助因素的情况下用适宜的连接酶如T4多核苷酸连接酶处理带有杂交的接头100的捕获探针10以及含有目的小多核苷酸60的延伸产物80足够的时间以使连接接近全部完成。如本领域技术人员结合本文公开的内容会理解的，捕获探针10中存在的间隔区段30通过使接头100的3’端与目的小多核苷酸60的5’端匹配的方式促进接头100与目的小多核苷酸60的连接。连接和延伸步骤的结合，产生了由已共价连接在一起的接头100、目的小多核苷酸60和延伸的区段70的链所限定的“连接的延伸产物”110(连接的接头-目的小多核苷酸-延伸的区段)，且其中连接的延伸产物110与捕获探针10杂交。

在一个实施方案中，如本领域技术人员结合本文公开的内容会理解的，接头100的5’端包含诸如荧光染料的标记以便于检测。此外，如本领域技术人员结合本文公开的内容所理解的，只要标记的存在不干扰本发明的方法的其他步骤，接头100可包含诸如荧光染料的标记，以便于除接头100的5’端以外的位置处的检测。在其他的实施方案中，通过连接作用与目的小多核苷酸60结合的接头序列100，可单独或与相邻的小多核苷酸60的核酸序列联合，部分地顺应PCR扩增的引物或标记的检测探针的引物。

检测探针

在某些实施方案中，目的多核苷酸的检测和鉴定可使用检测探针。“检测探针”指能识别特定的靶核苷酸序列的核酸结合分子，通常用于包括定量或实时PCR分析以及终点分析的扩增反应中。此类探针同样可用于监控靶标小多核苷酸序列、其附加的区段和/或互补物的延伸、反转录和/或扩增。

检测探针通常包括荧光分子或荧光团，包括但不限于带SO₃而非羧基的荧光素染料的磺酸衍生物、荧光素的亚磷酰胺形式、CY3或CY5的亚磷酰胺形式(可从例如Amersham购买获得)、氨基烯丙基、地高辛、四甲基若丹明等。多种可检测的三磷酸核苷可从Roche(Indianapolis，IN)、Invitrogen(Carlsbad，CA)以及其他的生产商购买。

术语“双标记探针”指带有两种附着标记的寡核苷酸。一方面，一种标记附着于探针分子的5’端，而另一种标记则附着于该分子的3’端。特定类型的双标记探针含有附着于一端的荧光分子以及附着于另一端可通过荧光共振能力转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)使该荧光团淬灭的分子。因此，双标记检测探针也可以包含淬灭剂，包括但不限于Black Hole淬灭剂(Biosearch，Novato，CA)、Iowa Black(IDT，Coralville，Iowa)、QSY淬灭剂(Molecular Probes，Invitrogen，Carlsbad，CA)以及Dabsyl和Dabcyl磺酸盐/碳酸盐淬灭剂(Epoch，Bothell，WA)。

“5’核酸酶测定探针”指可通过DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性而水解的双标记探针。探针的降解可使荧光团和淬灭剂分离，从而增强荧光发射。“5’核酸酶测定探针”经常称为“TaqMan测定探针”，且“5’核酸酶测定”称为“TaqMan测定”。在本申请中，这些名称可交换使用。

“分子指示标(Molecular Beacon)”指单标记或双标记探针，其可能不受DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性的影响。已对探针、聚合酶或测定条件进行了专门修饰，以避免标记或组成型核苷酸通过DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性而分离。例如，分子指示标的特定方面可含有许多核酸酶抗性残基，以抑制DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性的水解。检测的原理因此依赖于分子指示标与其靶序列结合后标记产生的信号中的可检测差异。在本发明的一方面中，寡核苷酸探针在经选择的测定温度下形成受寡核苷酸5’和3’端处的互补序列介导的分子内发夹结构。该寡核苷酸具有附着于一端的荧光分子和附着于另一端的分子，当两者在发夹结构中彼此紧密接近时，该分子可将该荧光团淬灭。

结合的检测可通过测量与靶标结合后一种或多种标记的特性的变化直接进行(如具有或不具有茎结构的分子指示标类型测定)，或通过结合后的随后反应间接进行，所述随后反应如5’核酸酶测定中通过DNA聚合酶的5’核酸酶活性的切割。在某些实施方案中，具有分子内发夹结构的双标记探针如茎环结构探针和双Scorpion^TM探针，在扩增过程中既可作为引物，又可作为探针。

检测探针也可以包含两种探针，其中，例如，荧光团位于1种探针上，而淬灭剂位于另一种探针上，其中所述两种探针一起在靶标上杂交可淬灭信号，或者其中靶标上的杂交可经由荧光的变化改变信号特征。

在某些实施方案中，DNA结合染料可用于检测在扩增过程中积累的双链DNA产物，所述DNA结合染料当与双链DNA结合后发射荧光。使用非共价结合的小沟结合物(minor groove binders，MGB)和/或嵌入标记，如不对称花青染料、DAPI、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR Gold、PicoGreen、噻唑橙、Hoechst 33342、溴化乙锭、1-O-(1-芘基甲基)丙三醇以及Hoechst 33258，并由此在缺少检测探针时，使扩增产物实时或终点可视化。在某些实施方案中，实时可视化包括可使用嵌入的检测探针和基于序列的检测探针两者。

在如图4所示的一个实施方案中，该方法包括：(a)提供包含目的小多核苷酸60的样品、捕获探针10和双标记检测探针120，所述双标记检测探针120具有附着于检测探针分子的5’端的一个标记、附着于检测探针120的3’端的另一个标记以及检测探针序列，所述序列与捕获探针10的模板区段50内的检测探针结合序列52基本上互补并能与其杂交。如图4A所示，将样品、捕获探针10以及检测探针120合并后，使目的小多核苷酸60与多核苷酸结合区段40杂交，并使检测探针120与捕获探针10的检测探针结合序列52杂交。

在一个实施方案中，多核苷酸聚合酶优选具有能在延伸过程中切割杂交的小多核苷酸60的下游多核苷酸的5’核酸外切酶活性。如图4B所示，通过向反应混合物中加入聚合酶和核苷酸混合物，杂交的目的小多核苷酸60得以延伸，形成延伸产物80，而检测探针120可通过多核苷酸聚合酶的5’至3’核酸外切酶水解。可选地，在检测探针120切割以及随后两种标记分离后，通过测量一种或多种标记的荧光特性的变化，检测目的小多核苷酸60的结合。

在另一个实施方案中，延伸产物80的延伸的区段70以及检测探针，含有限制酶识别的互补序列。当检测探针和延伸的区段结合形成双链杂交复合物时，检测探针序列可被限制酶识别和切割。在优选的实施方案中，限制酶是切口核酸内切酶，其使所述复合物的单链产生切口。可选地，延伸反应物可以包括反应混合物中的一种或多种核苷酸类似物，所述核苷酸类似物使延伸的区段可抵抗核酸内切酶的作用。随后使所述探针产生切口提供了可检测的荧光变化。

带切口的延伸产物

在图5所示的一个实施方案中，该方法包括提供捕获探针10，其中模板区段50包含一个或多个序列，其是双链限制酶识别基序的一条链56，在本文被称为限制位点基序。

接下来，如上文所公开的，该方法包括使捕获探针10和含有目的小多核苷酸60的样品合并，以及使所述目的小多核苷酸60与小多核苷酸结合区段40杂交，形成小多核苷酸/捕获探针复合物。接下来如图5A和5B所示，该方法包含延伸反应，其中将小多核苷酸/捕获探针复合体与多核苷酸聚合酶和一组三磷酸核苷合并。所述延伸反应还包括延伸杂交的目的小多核苷酸以形成延伸产物80，其中将所述延伸产物80与捕获探针10杂交，形成延伸产物/捕获探针复合物。一方面，延伸步骤将包含于捕获探针10的模板区段50内的单链限制酶识别序列56转变成双链限制酶识别序列56和74。

在一个实施方案中，双链限制位点56、74可受到切口剂的识别和作用。在优选的实施方案中，延伸的区段70的限制位点基序74可被切口核酸内切酶切割。在另一个实施方案中，模板区段50的限制酶识别基序56含有一个或多个核苷酸类似物，其保护模板区段50免受切口剂的核酸内切酶活性的作用。例如，可通过使限制位点的某些核苷酸间键对水解产生抗性，如通过将它们转变成硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯键、甲基磷酸酯键或肽键，或通过代入特异性的限制核酸内切酶不能识别的核苷酸变体，促进该限制位点内的精确切割。在一个具体方面中，限制酶的特异性可排除含有取代dT的dU或类似地取代dG的dI(脱氧次黄嘌呤核苷(deoxyinosine))的序列的识别和切割，但仍然能识别和作用于相反链(opposite strand)的互补序列。

下一步，如图5C所示，包括使延伸产物/捕获探针复合物与切口剂接触，以使延伸产物80在双链限制位点的一条链74上被选择性地产生切口，以产生带切口的延伸产物82。使延伸产物80产生切口得到了含有目的小多核苷酸60的3’端片段以及含有延伸的片段70部分的5’端片段，后者在本文被称为带切口的延伸片段82。

如图5D所示，该方法还包括用聚合酶延伸含有杂交的目的小多核苷酸60的、带切口的延伸产物的3’端片段，以便复原切口位点，并移出带切口的延伸片段82。

通过带切口的延伸片段82的热变性以及移动，可促进带切口的延伸片段82的移出。因此，在优选的实施方案中，聚合酶和限制酶是热稳定酶，其能在为适应带切口的延伸片段的变性和移动而增加的温度下，保持酶活性。具有应用潜力的DNA聚合酶包括Vent(外切)、Deep Vent(外切)、Pfu(外切)、Bst(大片段)、Bca(外切)、phi 29，T7(外切)以及Klenow(外切)。耐热聚合酶和/或高持续性聚合酶(processive polymerases)，特别是具有链替代活性的聚合酶，可能是有优势的。

在一个实施方案中，进一步的延伸、切割以及取代步骤的循环可导致带切口的延伸片段82的线性扩增，从而反映最初与捕获探针10杂交的靶标小多核苷酸60的初始浓度。

检测带切口的延伸产物

带切口的延伸产物82的检测，指示样品中存在待检目的多核苷酸60，并可进一步用于目的多核苷酸60的定量。上文所述的带切口的延伸片段82的检测可通过利用本领域已知的技术的本领域技术人员已知的任何方式来实现，所述技术包括但不限于，与带切口的延伸片段82结合的标记的检测、针对微阵列的一种或多种带切口的延伸片段82的杂交和检测、克隆和测序或定量实时PCR。

在一个实施方案中，通过与信号产生探针(signal generating probe)接触，可便于带切口的延伸片段82的检测，所述信号产生探针具有与被移开的带切口的延伸片段82互补并能杂交的序列。在优选的实施方案中，信号产生探针的长度为约15-25个核苷酸残基。信号产生探针与带切口的延伸片段82形成双链复合物的杂交随后可用诸如SYBR Green或溴化乙锭等嵌入染料(intercalating dye)来检测，所述嵌入染料一旦选择性地与双链核酸结合，便能产生荧光信号。在优选的实施方案中，带切口的延伸片段82具有与特异性的目的小多核苷酸60相关的带切口的延伸片段序列。在优选的实施方案中，第一信号产生探针具有第一信号产生探针序列，第二信号产生探针具有第二信号产生探针序列，每种都具有预定的序列或预定的大小，其中所述第一信号产生探针序列和所述第二信号产生探针序列的序列或大小或者序列和大小两者彼此不同。检测和区分两个或多个信号产生探针的序列和/或大小允许每次测定检测几个靶标。

在另外的实施方案中，信号产生探针具有能够从嵌入染料中转移能量的荧光团。在优选的实施方案中，第一信号产生探针具有第一荧光团，而第二信号产生探针具有第二荧光团，其中所述第一荧光团的荧光发射光谱不同于所述第二荧光团的荧光发射光谱。检测和区分两个或更多个荧光团的不同的荧光发射光谱允许每次测定复用几个靶标。

同理，在另外的实施方案中，与被移开的带切口的延伸片段杂交的信号产生探针可以是分子指示标，以便其在未杂交状态时，其淬灭剂和荧光团经其发夹结构彼此邻近，但当与被移开的带切口的延伸片段杂交时，因为荧光团和淬灭剂彼此分离而允许产生荧光，故观察到可检测的荧光。因此，荧光与样品中存在的最初的小多核苷酸成比例。可设计分子指示标，其与唯一的带切口的延伸片段杂交，该片段通过上文所述的每个唯一靶向的捕获探针，与靶向的小多核苷酸相关联。

在如图6所示的一个实施方案中，该方法包括提供捕获探针，其中模板区段包含第一限制位点56以及第二限制位点58，其中所述第一限制位点56作为在延伸产物80或顶链(top strand)中产生切口位点的模板，而所述第二限制位点58经修饰，可抵抗模板区段50或底链(bottom stand)的切割。本发明此方面的捕获探针的实例显示于表III中。

接下来，如上文所公开的，该方法包括将捕获探针10和含有目的小多核苷酸的样品合并，并使目的小多核苷酸60与小多核苷酸结合区段40杂交，形成小多核苷酸/捕获探针复合物。接着，该方法包含延伸反应，其中将小多核苷酸/探针复合物与多核苷酸聚合酶和一组三磷酸核苷合并。所述延伸反应还包括延伸杂交的目的小多核苷酸60，形成延伸产物80，其中将所述延伸产物80与捕获探针10杂交，形成延伸产物/捕获探针复合物。一方面，延伸步骤将捕获探针的第一限制位点56转变成能在顶链74即延伸的区段70而不是底链56即模板区段50上产生切口的双链限制酶识别序列，相反，捕获探针的第二限制位点58则转变成第二个双链限制序列58、76，其在相应的模板区段50上不被选择性地产生切口。

如图6A所示的下一步骤包括将延伸产物/捕获探针复合物与识别并作用于第一限制位点56、74的切口剂接触，以便使延伸产物80在双链限制位点56、74的一条链即顶链74上选择性地产生切口，产生带切口的延伸片段。在一个实施方案中，切口剂是切口核酸内切酶，且延伸的区段70的限制位点基序74切口剂切割。在另一个实施方案中，模板区段50的限制酶识别基序含有一个或更多个核苷酸类似物，所述核苷酸类似物保护模板区段50免受切口剂的核酸内切酶活性的作用。例如，通过使限制位点的某些核苷酸间键对水解产生抗性，如通过将它们转变成硫代磷酸酯键、硼烷磷酸酯键、甲基磷酸酯键或肽键，或通过代入不能被特异性限制核酸内切酶识别的核苷酸变体，促进在限制位点内精确地产生切口。在一个具体方面，限制酶的特异性可排除含有取代dT的dU的序列的识别和切割，但仍然能识别和作用于相反链的互补序列。含有第一Nt.AlwI限制位点和第二Nb.BbvCI限制位点的捕获探针10的实例显示于下文的表V中，其中所述第二位点含有用于取代脱氧T的脱氧U。含有第一Nt.AlwI限制位点和第二Nb.BbvCI限制位点的捕获探针10的其他实例也显示于下文的表V中，其中所述第二位点含有硫醇化的骨架(thiolated backbone)。

如图6B所示，使延伸产物80产生切口，产生了含有目的小多核苷酸60的3’端片段和含有延伸的区段70部分的5’端片段，后者在本文中称为带切口的延伸片段82。

该方法还包含通过聚合酶的作用移出带切口的延伸区段82，其含有第二限制位点76的未修饰的顶链。在如图6C所示的一个实施方案中，通过接触与带切口的延伸片段82互补并能与其杂交的检测探针120，可易化带切口的延伸片段82的检测。双链探针/带切口的延伸片段复合物的形成更新了第二双链限制识别序列，所述序列现在能够在底链即探针序列120上被产生切口。在优选的实施方案中，检测探针的长度为约15-25个核苷酸残基。

接下来该方法还包括使双链探针/带切口的延伸区段复合物与能识别检测探针序列120并使其产生切口的切口剂接触。在优选的实施方案中，探针是双标记的检测探针120，以便产生切口的反应提供可检测的荧光变化。本具体实施方案的双标记检测探针序列的实例，显示于表IV中。

表III

带两个切口位点的_MIRNA捕获探针

探针名称	序列5’-3’	SEQ ID NO：
			34AMP dU_HSA¹-miR-135a	ATCAGGA/ideoxyU²/CAGCTGAGCCTCAGCATTCACATAGGAATAAAAAGCCATAACAC	SEQ ID NO：24
38AMP dU_HSA¹-miR-138	ATCAGGA/ideoxyU²/CAGCTGAGCCTCAGCATGATTCACAACACCAGCTACAC	SEQ ID NO：25
			56AMP dU_HSA¹-miR-154	ATCAGGA/ideoxyU²/CAGCTGAGCCTCAGCATCGAAGGCAACACGGATAACCTAACAC	SEQ ID NO：26
34AMP dU_HSA¹-miR-135a	ATCAGGATCAG^C^3TGAGCCTCAGCATTCACATAGGAATAAAAAGCCATAACAC	SEQ ID NO：27
			38AMP dU_HSA¹-miR-138	ATCAGGATCAG^C^3TGAGCCTCAGCATGATTCACAACACCAGCTACAC	SEQ ID NO：28
56AMP dU_HSA¹-miR-154	ATCAGGATCAG^C^3TGAGCCTCAGCATCGAAGGCACACGGATAACCTAACAC	SEQ ID NO：29

¹名称中“HSA”对应于由给定捕获探针所结合的各自人类miRNA

²“ideoxyU”对应于取代T的dU

³“*”对应于骨架中的硫代磷酸键

表IV

双标记检测探针

名称	序列5’-3’	SEQ ID NO：
			QF Probe 15’_3’	/5IAbFQ/CAGGATCAGCTGAGAGCC/IFluorT/CA/3Phos/	SEQ ID NO：30
QF Probe 25’_3’	/5IAbFQ/CAGGATCAGCTGAGAGCCTCA/36-FAM/	SEQ ID NO：31

“5IAbFQ”对应于5′Iowa Black FQ^TM(IDT)

“IFluorT”对应于荧光标记的T

“36-FAM”对应于3’末端荧光

DNAzyme基序的并入

在如图7所示的一个实施方案中，该方法包括提供捕获探针10，其中模板区段50包含一个或多个与RNA切割催化的核酸互补的序列，本文将其称为“DNAzyme基序”130。RNA切割DNA酶(DNAzyme)的实例包括“10-23”和“8-17”通用RNA切割DNA酶，其分别含有保守的催化序列GGCTAGCTACAACGA(SEQ ID NO：32)和TCCGAGCCGGACGA(SEQ ID NO：33)。保守的催化结构域的侧面为能通过沃森-克里克碱基配对与靶RNA杂交的可变结合结构域。侧翼结合结构域与靶RNA的杂交产生含有催化结构域的环结构。经示例性的“10-23”DNAzyme的切割发生于靶RNA的嘌呤-嘧啶二核苷酸上，而经示例性“8-17”DNAzyme的切割发生于靶RNA的AG二核苷酸上。因此，本实施方案的DNAzyme互补物130含有与保守的催化序列互补的序列，这点会被本领域技术人员结合本公开的内容所理解。除了DNAzyme互补基序130外，本实施方案的模板区段50包含分别位于DNAzyme互补物的5’端和3’端的侧面的第一侧翼区段132和第二侧翼区段134。优选地，第一侧翼区段和第二侧翼区段每个的长度均为约5-20个核苷酸残基，更优选约7-10个，最优选约8-9个核苷酸残基。

在一个实施方案中，如上文所述，模板区段50还包含限制位点56。在优选的实施方案中，所述限制位点56位于3’方向的下游，并可与第二探针区段重叠。

表V提供了含有与“10-23”保守的催化序列互补的DNAzyme互补物的捕获探针的实例，其中DNAzyme互补物的侧翼在5’端为包含第一侧翼区段的9个残基，在3’端为包含第二侧翼区段的9个残基。此外，表V的捕获探针都含有可以被切口核酸内切酶N.BbvCI(New EnglandBiolabs，Ipswich MA)识别的限制酶识别基序。

接下来，如上文所述，该方法包含将捕获探针和含有目的小多核苷酸60的样品合并，使目的小多核苷酸60与小多核苷酸结合区段40杂交以形成小多核苷酸/捕获探针复合物。接着，该方法包括延伸反应，其中将小多核苷酸/捕获探针复合物与多核苷酸聚合酶和一组三磷酸核苷合并。所述延伸反应还包含延伸杂交的目的小多核苷酸60以形成延伸产物80，其中所述延伸产物80与捕获探针10杂交，形成延伸产物/捕获探针复合物。

在如图7A所示的优选实施方案中，下一步骤包含将延伸产物/捕获探针复合体与识别并作用于限制位点74的切口剂接触，以便使在双链限制位点的一条链即顶链74上的延伸产物80被选择性产生切口，以产生带切口的延伸片段82。

在如图7B和7C所示的一个实施方案中，延伸产物或优选带切口的延伸片段82的移出，提供了能与适宜底物杂交并将其切割的功能DNAzyme。适宜的底物探针140可以是RNA多核苷酸或嵌合的RNA/DNA多核苷酸。底物探针130包含具有第一探针序列的第一探针区段132、切割位点以及具有第二探针序列的第二探针区段134。底物探针140的第一探针序列与模板区段50的第一侧翼序列132基本上相同。同样，底物探针140的第二探针序列134与模板区段50的第二侧翼序列134基本上相同。在优选的实施方案中，DNAzyme互补物基序78含有与“10-23”保守催化结构域互补的序列。

底物探针140可以是RNA多核苷酸或嵌合的DNA/RNA多核苷酸，其具有含有一个或多个核糖核苷酸残基的DNAzyme敏感切割位点142。所述底物探针140包含具有第一探针序列的第一探针区段132、切割位点142以及具有第二探针序列的第二探针区段134。底物探针140的第一探针序列132与模板区段50的第一侧翼序列132基本上相同。同样，所述底物探针140的第二探针序列134与模板区段50的第二侧翼序列134基本上相同。在优选的实施方案中，所述切割位点142包含与嘧啶残基相邻的嘌呤残基。

在一个实施方案中，通过探针序列132、134与包含在延伸产物80内或带切口的延伸片段82内的互补序列136、138之间的沃森-克里克碱基配对，在带切口的延伸片段82中形成环结构。接着，该方法还包括在切割位点142切割底物探针。在优选的实施方案中，底物探针140是双标记的检测探针，以便产生切口的步骤提供可检测的荧光变化。本具体实施方案的双标记底物探针的实例显示于表VI中。

表V

含有DNA_ZYME基序的捕获探针

名称	序列5′-3′	SEQ.ID NO.
			S1DNZ 34hsa-miR-135a	CAGGACGACTCGTTGTAGCTAGCCTGTACCTCAGCATATTCACATAGGAATAAAAAGCCATAAC	SEQ ID NO：34
S1DNZ 38hsa-miR-138	CAGGACGACTCGTTGTAGCTAGCCTGTACCTCAGCATATGATTCACAACACCAGCTAC	SEQ ID NO：35
			S1DNZ 56hsa-miR-154	CAGGACGACTCGTTGTAGCTAGCCTGTACCTCAGCATATCGAAGGCAACACGGATAACCTAAC	SEQ ID NO：36
S2DNZ 34hsa-miR-135a	ACATTCACCTCGTTGTAGCTAGCCTTGACCTCAGCGAATTCACATAGGAATAAAAAGCCATAAC	SEQ ID NO：37
			S2DNZ 38hsa-miR-138	ACATTCACCTCGTTGTAGCTAGCCTTGACCTCAGCGAATGATTCACAACACCAGCTAC	SEQ ID NO：38
S2DNZ 56hsa-miR-154	ACATTCACCTCGTTGTAGCTAGCCTTGACCTCAGCGAATCGAAGGCAACACGGATAACCTAAC	SEQ ID NO：39

表VI

双标记的DNA_ZYME底物探针

名称	序列5′-3′	SEQ ID NO.
			S1 FAM SUBS ZYME1	/5IABFQ/CAGGACGArCrGrUGTACCTCA/36-fam/	SEQ ID NO：40
S2 CY3 SUBS ZYME2	/5IABFQ/ACATTCACrCrGrUTGACCTCA/3CY3SP/	SEQ ID NO：41

试剂盒

在本发明另一个实施方案中，提供了含有一种或多种用于分离、标记和检测小RNAs如人类miRNA的试剂的试剂盒。试剂盒的优选形式包括：(a)捕获探针的等摩尔混合物；(b)含有三磷酸脱氧核糖核苷或三磷酸核糖核苷的核苷酸混合物；(c)聚合酶；(d)抗生蛋白链菌素包被的顺磁珠；(e)一种或多种双标记检测探针；(f)连接酶；(g)与捕获探针的间隔区段基本上互补并能与其杂交的寡核苷酸接头；或(h)一种或多种对包含于捕获探针中的限制酶识别序列特异的限制酶。

在一个实施方案中，试剂盒包含本发明的的捕获延伸探针，例如诸如表II所列的那些与小RNA结合区段的等摩尔混合物，所述小RNA结合区段包含已知的人类成熟miRNA群的互补序列。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含选自下述一种或多种物质：标记缓冲液，包含0.5MTris-HCL、0.1M MgCl₂、10mM DTT、0.5mg/ml BSA以及诸如能抑制真核RNases的重组哺乳动物蛋白的RNase抑制剂；核苷酸混合物，含有例如10微摩尔的花青3-dUTP或花青5-dUTP，以及每种100微摩尔的未标记的dATP、dCTP以及dGTP；诸如多核酸酶聚合酶的标记酶，例如无核酸外切酶的Klenow(USB Corp.；Cleveland，OH US)；诸如1μm抗生蛋白链菌素包被的顺磁珠的捕获珠；包含例如0.5M Tris-HCL、0.1M MgCl₂以及10mM DTT的珠洗涤缓冲液；包含例如甲酰胺的标记的miRNA洗脱缓冲液；诸如Microcon

YM 10装置的缓冲液交换装置以及0.1×TE洗涤缓冲液。

包括摘要和附图的说明书中公开的所有特征，以及公开的任何方法或过程中的所有步骤，可以任何组合的方式进行组合，一些此类特征和/或步骤相互排斥的组合除外。除非另有明确说明，包括摘要和附图的说明书中公开的每个特征，可被满足相同、等同或相似目的的可选特征来替代。因此，除非另有明确说明，所公开的每个特征仅是一系列总的等同或相似特征的一个实例。

前述讨论决不是进行限制，且检测由本发明的方法标记和测量的miRNAs的其他方式是很容易想到的，诸如通过电泳检测miRNA的延伸群，或例如通过miRNAs的延伸，其中样品自身作为诸如组织切片的固相。下文的描述的对本发明进行了更详细的说明。

实施例1

如下进行本发明的一个实施方案。首先用本文公开内容中公开的标记方法，标记来自外周血单核细胞的人类总RNA样品，随后与商购的miRNA微阵列玻片杂交，测量通过本文公开的方法制备的分离的杂交探针的荧光，并分析结果。

小RNA捕获-延伸探针

包含对应于210个单一的人类miRNAs和2份重复的3个其他的人类miRNAs的miRNA结合区段的一组捕获-延伸探针，总计为216个捕获延伸-探针被设计为与它们的对应人类miRNAs完全且特异性地互补，其中的8个实例显示于表III中，它们具有不同miRNA结合区段，具有相关的相同的固相结合区段、相同的延伸区段以及相同的间隔区段，所述固相结合区段由加入附着于每个捕获-延伸探针5’端的生物素来促进。从集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA US)获得小RNA捕获-延伸探针。将单个小RNA捕获探针重悬浮于含2％乙腈(Sigma Aldrich；St.Louis，MO US)的0.1×TE缓冲液中，使每个探针复合物的终浓度为100pmol/ul。

表VII

5’生物素化的捕获探针以及它们的互补_MIRNA的代表性实例

捕获探针名称	探针序列	互补miRNA	SEQ ID NO：
				EPD 1	/5BIO/ATTTAGGTGACACTATAGAAACTATACAACCTACTACCTCACCCTATAGTGAGTCGTATTA	hsa-let-7a	SEQ ID NO：42
EPD 5	/5BIO/ATTTAGGTGACACTATAGAACTATACAACCTCCTACCTCACCCTATAGTGAGTCGTATTA	hsa-let-7e	SEQ ID NO：43
				EPD 14	/5BIO/ATTTAGGTGACACTATAGAGCTACCTGCACTGTAAGCACTTTTCCCTATAGTGAGTCGTATTA	hsa-miR-106a	SEQ ID NO44：
EPD 24	/5BIO/ATTTAGGTGACACTATAGACGCGTACCAAAAGTAATAATGCCCTATAGTGAGTCGTATTA	hsa-miR-126^*	SEQ ID NO：45
				EPD 35	/5BIO/ATTTAGGTGACACTATAGATCACATAGGAATAAAAAGCCATACCCTATAGTGAGTCGTATTA	hsa-miR-135a	SEQ ID NO：46
EPD 39	/5BIO/ATTTAGGTGACACTATAGAGATTCACAACACCAGCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA	hsa-miR-138	SEQ ID NO：47
				EPD 56	/5BIO/ATTTAGGTGACACTATAGACGAAGGCAACACGGATAACCTACCCTATAGTGAGTCGTATTA	hsa-miR-154	SEQ ID NO：48
EPD 201	/5BIO/ATTTAGGTGACACTATAGAAATAGGTCAACCGTGTATGATTCCCTATAGTGAGTCGTATTA	hsa-miR-154^*	SEQ ID NO：49

“/5BIO/”表示在合成中加入的5’生物素。

向每个1.5ml的螺口试管(screw cap tube，Starstedt；Newton，NC US)中加入7ul每种探针，制备来自桑格中心(Sanger Center)的216个捕获探针的集合。混合物中的探针是等摩尔的，在捕获-延伸探针混合物中，其终浓度为约0.5pmol/每种捕获探针/ul。

小RNA与混合的捕获探针的杂交

将0.5ug分离自外周血单核细胞(BioChain；Hayward，CA US)的总RNA加入到浓度为0.5pmol/探针/ul的1.0ul混合的捕获探针和10个单位的RNasin

(Promega；Madison，WI US)中。在Bio-Rad 96孔Multiplate(Bio-Rad Laboratories，Inc.；Hercules，CA US)中集合上述组分，并在离心机中短暂律动，进行混合。通过在热循环仪(Bio-Rad Laboratories，Inc.)中于42℃孵育所述组分30分钟，随后5分钟每秒降低1℃至25℃，进行杂交。

通过延伸进行标记

使用捕获探针作为模板以及使用杂交的miRNA作为引物，利用Klenow无核酸外切酶活性的DNA聚合酶(USB；Cleveland，OH US)，实现通过延伸的标记。将含有1X Klenow反应缓冲液(USB)，0.1mM dATP、dGTP、dCPT(Promega Corp.；Madison，WI US)与0.0065mM花青3-dUTP(Enzo Life Sciences，Inc.；Farmingdale，NY US)以及5个单位的Klenow无核酸外切酶活性的DNA聚合酶(USB)的反应组分混合，随后加入到含有杂交的miRNA和捕获探针的孔中，至10ul的总反应体积。然后将平板在离心机中短暂律动，进行混合。将该平板用箔覆盖避光，并在室温下孵育1小时。加入10ul 0.5M EDTA(Sigma Aldrich Corp.；St.Louis，MOUS)，终止反应。利用在含有溴化乙锭的预制的Nuseive/GTG(3∶1)琼脂糖凝胶(BMA CORP.；Rockland，ME US)上运行1.0ul标记的反应产物，进行电泳。通过观察到延伸产物族的一簇适当大小的条带来证实所述标记。

磁珠捕获和洗脱来自捕获探针的标记的小RNA

将剩余的9ul标记反应混合物和5.0ul抗生蛋白链菌素A-Beads^TM(Aureon；Vienna，Austria)转移至新的1.5ml的螺口试管(Starstedt；Newton，NC US)。轻弹试管以便混合，并用箔避光，在室温下孵育20分钟以捕获探针-miRNA延伸产物。20分钟后，通过将该1.5ml试管放置于磁性架(magnet stand，Grace Biolabs；Bend，OR US)上洗涤所述珠-探针杂交复合物并允许在试管的一侧收集磁珠。吸出多余液体并弃掉，随后加入100ul 1X Klenow无核酸外切酶活性的反应缓冲液(USB)。轻弹试管以混合内容物，随后放回磁性架，取走多余液体并弃掉，并加入100ul 1X Klenow无核酸外切酶活性的反应缓冲液(USB)。将所述试管混合后放回磁性架上，吸走多余液体并弃掉，加入20ul 100％去离子化的甲酰胺(Bio Ventures，Inc.；Murfreesboro，TN US)，以从捕获探针-珠复合物中洗脱标记的小RNA延伸产物。加入甲酰胺2分钟后，轻弹试管以便混合，并放回磁性架上。将含有洗脱的标记的小RNA延伸产物的20ul甲酰胺转移至新的1.5mL螺口试管。随后，使用Microcon

YM 10超过滤装置(Millipore Corp.；Billerica，MA US)，进行缓冲液交换，以便用0.1X TE替换甲酰胺。将180ul 0.1X TE加入含有洗脱的标记的小RNA延伸产物的20ul体积中，并将全部体积即200ul转移至放置于1.5ml收集管中的柱上。随后，10℃下，将所述管在离心机中于14,000×g离心30分钟。弃掉液体，将超过滤装置放回收集管内，并向该超过滤装置加入100ul 0.1XTE。随后将所述超过滤装置10℃下于14,000×g再次离心10分钟，弃掉液体。随后将该超过滤装置反转并放入新的收集管中，10℃下3,000×g倒旋5分钟。20ul回收液中含有在适宜的缓冲液中用于杂交的标记的小RNA。

标记的小RNA杂交于小RNA生物芯片上

将25ul 2X杂交缓冲液(Genosensor；Tempe，AZ US)加入到20ul标记的miRNA和5ul无菌DI水中，短暂律动以便混合，随后吸至GenoExplorer^TM小RNA生物芯片(Genosensor)的活性区域上，并用20×20塑料盖玻片(TedPella，Inc.；Redding，CAUS)覆盖。随后将玻片置于湿润的小室中，密封，并在室温下将其置于黑暗处杂交过夜约18小时。孵育过夜后，将玻片在25ml 3X SSC缓冲液和0.2％SDS中洗涤一次5分钟，随后在1X SSC缓冲液和0.1％SDS洗涤一次5分钟。用0.1X SSC缓冲液进行第三和第四次洗涤，每次2分钟。洗涤包括将玻片浸入缓冲液中并轻轻搅动规定的时间。洗涤后，将玻片用压缩的空气进行空气干燥，随后进行玻片的扫描。

玻片的扫描和分析

使用Perkin Elmer(Wellesley，MA US)的ScanArray

Express HT微阵列扫描仪，扫描玻片。在70％的增益(gain)以及20um的分辨率下，对全部盖玻片的轻松扫描(easy scan)，对通过仪器软件进行定量来说，是足够的。通过输入由miRNA微阵列制造商提供的.gal文件，完善样点结果和玻片信息。所述.gal文件包括鉴定的所有样点，以及盖玻片样点的位置、直径和间距。

表VIII

用于定量的输入数据的表示

起始阵列模式信息

单位 μm

阵列行(Array Rows) 4

阵列列(Array Columns) 1

样点行(Spot Rows) 21

样点列(Spot Columns) 24

阵列行的间隔 5000

阵列列的间隔 5000

样点行的间隔 200

样点列的间隔 200

样点直径 120

空隙 0

样点/阵列 504

总样点 2016

末端阵列模式信息

起始图像信息

图像ID 通道图像荧光团

-1 CH1 Alexa 546

-1 CH2 Alexa 546

末端图像信息

起始标准化信息

标准化方法 LOWESS

末端标准化信息

参照图8，其显示了使用10um扫描分辨率和70％激光增益的杂交的GenoExplorer^TM miRNA芯片的扫描图像。

根据miRNA微阵列玻片布局，每个样点重复印三次，在每个样点以及整个玻片内中允许点到点的标准化。除miRNA样点外，还有由仅缓冲液或加入样品时不发出荧光的其他的未知序列组成的阴性对照样点。GenoExplorer^TM miRNA芯片含有总计632个样点，代表三份重复的成熟miRNAs和前体miRNAs。将所有阴性对照样点的平均强度和中值强度进行平均，获得背景水平的代表值。将背景的每个平均强度值和中值强度值从样品样点的平均强度值和中值强度值中减去，获得扣除干扰的信号值。一旦获得上述值后，则在三个重复的值中，对单个样品的值进行平均，获得每个代表的样品样点的平均信号强度值。三个重复样点之间具有高标准偏差的那些样品样点不用于最后的分析，因为它们没有准确地代表样品强度。一旦标准化，加入到总RNA样品内用于小RNA延伸标记的216个捕获探针中，总共有198个被认为是阳性的。标准化后，底数为2的对数(log₂)或信号强度从4.64的低阳性到13.28的高阳性变动。hsa-mir-198miRNA对应于log₂13.28的最高信号强度，点到点的标准偏差为log₂0.099。其他样点也存在，但被去掉，因为三个重复样点中的一个与其他重复点相比，位于可接受的强度范围外。

参照图9，其显示了使用花青3在0.5ug分离自外周血单核细胞的人类总RNA中检测到的12种不同miRNAs样品的荧光强度的图表，其中所检测到的12种不同miRNAs从1到12为：135a、369、024、453、154、7e、154^*、138、325、106a、126和7a。

在进行本实验前，外周血单核细胞中miRNAs的特异性是未知的。大多数miRNA微阵列的研究是在诸如肿瘤或非肿瘤的特异性组织上进行的。该微阵列的结果显示，使用本发明的方法，捕获-延伸探针能特异性地捕获存在于总RNA样品中的miRNAs并促进其标记，且标记的产物可用于诸如微阵列分析的下游应用。在本实施例中，当杂交至微阵列上时，使用了0.5ug总RNA的相对小的样品体积，并产生了可接受的信号强度。为了玻片杂交后收到可接受的信号强度，大多数现行的标记方法需要多达50ug的起始总RNA原料。

结合某些优选的实施方案，对本发明进行了相当详细的说明，其他的实施方案也是可行的。因此，不应当将所附的权利要求书的范围限定于本文公开内容包含的优选实施方案的描述。本文引用的所有参考文献以引用的方式整体并入本文。

序列表

<110>艾利尔特·道森

克里斯蒂·旺布尔

<120>分离和检测小多核苷酸的方法和物质

<130>17171-6PCT

<150>US 60/824,068

<151>2006-08-30

<150>US 60/825,888

<151>2006-09-15

<150>US 60/863,886

<151>2006-11-01

<150>US 60/866,210

<151>2006-11-16

<150>US 60/871,094

<151>2006-12-20

<160>49

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>1

aactatacaa cctactacct ca 22

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>2

actatacaac ctcctacctc a 21

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>3

gctacctgca ctgtaagcac ttt 23

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>4

cgcgtaccaa aagtaataat g 21

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>5

tcacatagga ataaaaagcc ata 23

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>6

gattcacaac accagct 17

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>7

cgaaggcaac acggataacc ta 22

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>8

aataggtcaa ccgtgtatga tt 22

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>9

taatacgactcac tataggg 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>10

ccctatagtg agtcgtatta 20

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>11

atttaggtga cactatag 18

<210>12

<211>74

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>12

atttaggtga cactatagaa ctcgagaact atacaaccta ctacctcagc tagcccctat 60

agtgagtcgt atta 74

<210>13

<211>73

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>13

atttaggtga cactatagaa ctcgagacta tacaacctcc tacctcagct agcccctata 60

gtgagtcgta tta 73

<210>14

<211>75

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>14

atttaggtga cactatagaa ctcgaggct cctgcactgt aagcactttg ctagccccta 60

tagtgagtcg tatta 75

<210>15

<211>73

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>15

atttaggtga cactatagaa ctcgagcgcg taccaaaagt aataatggct agcccctata 60

gtgagtcgta tta 73

<210>16

<211>75

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>16

atttaggtga cactatagaa ctcgagtcac ataggaataa aaagccatag ctagccccta 60

tagtgagtcg tatta 75

<210>17

<211>69

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>17

atttaggtga cactatagaa ctcgaggatt cacaacacca gctgctagcc cctatagtga 60

gtcgtatta 69

<210>18

<211>74

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>18

atttaggtga cactatagaa ctcgagcgaa ggcaacacgg ataacctagc tagcccctat 60

agtgagtcgt atta 74

<210>19

<211>74

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>19

atttaggtga cactatagaa ctcgagaata ggtcaaccgt gtatgattgc tagcccctat 60

agtgagtcgt atta 74

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>20

taatacgact cactataggg 20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>21

aattaaccct cactaaaggg 20

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>22

aatttaaggt gacactatag aa 22

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>23

gctagttatt gctcagcgg 19

<210>24

<211>52

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>脱氧尿苷

<400>24

atcagganca gctgagcctc agcattcaca taggaataaa aagccataac ac 52

<210>25

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>脱氧尿苷

<400>25

atcagganca gctgagcctc agcatgattc acaacaccag ctacac 46

<210>26

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>脱氧尿苷

<400>26

atcagganca gctgagcctc agcatcgaag gcaacacgga taacctaaca c 51

<210>27

<211>52

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(13)

<223>骨架中的硫代磷酸键

<400>27

atcaggatca gctgagcctc agcattcaca taggaataaa aagccataac ac 52

<210>28

<211>46

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(13)

<223>骨架中的硫代磷酸键

<400>28

atcaggatca gctgagcctc agcatgattc acaacaccag ctacac 46

<210>29

<211>50

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(13)

<223>骨架中的硫代磷酸键

<400>29

atcaggatca gctgagcctc agcatcgaag gcacacggat aacctaacac 50

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>30

caggatcagc tgagagcctc a 21

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>31

caggatcagc tgagagcctc a 21

<210>32

<211>15

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>32

ggctagctac aacga 15

<210>33

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>33

tccgagccgg acga 14

<210>34

<211>64

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>34

caggacgact cgttgtagct agcctgtacc tcagcatatt cacataggaa taaaaagcca 60

taac 64

<210>35

<211>57

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>35

caggacgact cgttgtagct agcctgtacc tcagcatatg attcacaaca ccagcta 57

<210>36

<211>63

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>36

caggacgact cgttgtagct agcctgtacc tcagcatatc gaaggcaaca cggataacct 60

aac 63

<210>37

<211>64

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>37

acattcacct cgttgtagct agccttgacc tcagcgaatt cacataggaa taaaaagcca 60

taac 64

<210>38

<211>58

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>38

acattcacct cgttgtagct agccttgacc tcagcgaatg attcacaaca ccagctac 58

<210>39

<211>63

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>39

acattcacct cgttgtagct agccttgacc tcagcgaatc gaaggcaaca cggataacct 60

aac 63

<210>40

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(11)

<223>RNA

<400>40

caggacgacg ugtacctca 19

<210>41

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(11)

<223>RNA

<400>41

acattcaccg utgacctca 19

<210>42

<211>61

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>42

atttaggtga cactatagaa actatacaac ctactacctc accctatagt gagtcgtatt 60

a 61

<210>43

<211>60

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>43

atttaggtga cactatagaa ctatacaacc tcctacctca ccctatagtg agtcgtatta 60

<210>44

<211>63

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>44

atttaggtga cactatagag ctacctgcac tgtaagcact tttccctata gtgagtcgta 60

tta 63

<210>45

<211>60

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>45

atttaggtga cactatagac gcgtaccaaa agtaataatg ccctatagtg agtcgtatta 60

<210>46

<211>62

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>46

atttaggtga cactatagat cacataggaa taaaaagcca taccctatag tgagtcgtat 60

ta 62

<210>47

<211>56

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>47

atttaggtga cactatagag attcacaaca ccagctccct atagtgagtc gtatta 56

<210>48

<211>61

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>48

atttaggtga cactatagac gaaggcaaca cggataacct accctatagt gagtcgtatt 60

a 61

<210>49

<211>61

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成的

<400>49

atttaggtga cactatagaa ataggtcaac cgtgtatgat tccctatagt gagtcgtatt 60

a 61

Claims

1.包含多核苷酸的捕获探针，所述多核苷酸由以下组成：

由间隔区段序列组成的间隔区段，该间隔区段具有3’端和5’端；

由模板区段序列组成的模板区段，该模板区段具有3’端和5’端；以及

由小多核苷酸结合区段序列组成的小多核苷酸结合区段；以及任选地，

能结合于固相的分子组合物的固相结合区段；

其中所述小多核苷酸结合区段通过沃森-克里克碱基配对与一个或多个目的小多核苷酸基本上互补并能与其杂交，其中所述目的小多核苷酸选自RNA多核苷酸、DNA多核苷酸和其组合；

其中所述间隔区段的5’端与所述小多核苷酸结合区段的3’端连接；且

其中所述模板区段的3’端与所述小多核苷酸结合区段的5’端连接。

2.如权利要求1所述的捕获探针，其中所述间隔区段包括RNA聚合酶终止位点。

3.如权利要求1所述的捕获探针，其中所述小多核苷酸结合区段与目的miRNA基本上互补且能与其杂交。

4.如权利要求1所述的捕获探针，其中所述模板区段包括选自下述的一个或多个序列：

(a)多核苷酸聚合酶识别位点或与多核苷酸聚合酶识别位点互补的序列；

(b)为限制酶识别基序的一个或多个序列；以及

(c)与RNA切割催化核酸互补的一个或多个序列。

5.包含权利要求1所述的两种或多种捕获探针的组合物，所述组合物包含：

(a)具有第一间隔区段、第一小多核苷酸结合区段和第一模板区段的第一捕获探针；以及

(b)具有第二间隔区段、第二小多核苷酸结合区段和第二模板区段的第二捕获探针，其中所述第二小多核苷酸区段与所述第一多核苷酸结合区段具有不同的多核苷酸结合区段序列，并且所述第二模板区段与所述第一模板区段具有不同的模板区段序列。

6.分离目的小多核苷酸的方法，其包括：

(a)提供权利要求1所述的一种或多种捕获探针；

(b)提供包含目的小多核苷酸的样品，其中所述目的小多核苷酸选自miRNAs、snoRNAs、siRNAs或短干扰RNAs；

(c)将所述捕获探针与所述样品合并；

(d)将所述目的小多核苷酸与所述捕获探针的小多核苷酸结合区段杂交以形成小多核苷酸/捕获探针复合物；

(e)将所述小多核苷酸/捕获探针复合物与能够用RNA作为引物的多核苷酸聚合酶和一组三磷酸核苷酸合并；以及

(f)延伸所述杂交的目的小多核苷酸以形成延伸产物，所述延伸产物包括在3’端与延伸的区段连接的所述目的小多核苷酸、含有与所述捕获探针的模板区段互补的序列的延伸的序列，其中所述延伸产物与所述捕获探针杂交以形成延伸产物/捕获探针复合物。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述目的小多核苷酸是miRNA。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述捕获探针还包含固相结合区段，并且通过将捕获探针经由所述固相结合区段结合到固体载体上，将所述小多核苷酸/捕获探针复合物或所述延伸产物/捕获探针复合物捕获到固相。

9.从样品中检测目的小多核苷酸的方法，所述方法包括：

(a)依照权利要求6所述的方法分离目的小多核苷酸，其中所述捕获探针附着于荧光珠上，且所述延伸的区段包含一个或多个标记的核苷酸残基；以及

(b)检测所述荧光珠和与捕获延伸探针杂交的标记的延伸产物。

10.检测目的小多核苷酸的方法，其包括：

(a)依照权利要求6所述的方法分离目的小多核苷酸，其中所述捕获探针的模板区段包含RNA聚合酶识别序列的一条链，且延伸步骤形成双链RNA聚合酶启动子；

(b)将所述延伸产物/捕获探针复合物与识别双链RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶合并；

(c)转录启动子下游的序列以合成包含小多核苷酸结合序列的单链RNA产物。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述捕获探针的间隔区段包含RNA聚合酶终止位点。

12.如权利要求10所述的方法，其还包括重复所述转录步骤一次或多次。

13.用于检测样品中目的小多核苷酸的方法，包括：

(a)依照权利要求6所述的方法分离所述目的小多核苷酸；

(b)提供连接酶和接头区段，所述接头区段包含具有3′端和5′端的多核苷酸，所述接头区段具有接头区段序列，其中所述接头区段序列通过沃森-克里克碱基配对与间隔区段序列基本上互补且能与其杂交；

(c)使接头区段与间隔区段杂交；

(d)将接头区段的3′端与所述目的小多核苷酸的5′端连接以形成与所述捕获探针序列基本上互补且能与其杂交的连接的延伸产物。

14.如权利要求13所述的方法，其还包括通过聚合酶链反应扩增所述连接的延伸产物和所述捕获探针。

15.检测目的小多核苷酸的方法，其包括：

(a)提供双标记的检测探针，其具有附着在检测探针分子5′端的一种标记、附着在检测探针分子3′端的另一种标记以及检测探针序列，所述检测探针序列与捕获探针模板区段内的检测探针结合区段基本上互补且能与其杂交；

(b)依照权利要求6所述的方法分离目的小多核苷酸，其中

(1)合并所述捕获探针和样品还包括将双标记的检测探针添加到该合并物；

(2)使所述检测探针与所述捕获探针或小多核苷酸/捕获探针复合物的检测探针结合序列杂交；

(3)将具有5′至3′核酸外切酶活性的聚合酶和核苷酸混合物添加到杂交的检测探针和小多核苷酸/捕获探针复合物，以使所述检测探针被所述多核苷酸聚合酶的5′至3′核酸外切酶水解；以及

(4)检测探针水解后，检测一种或多种标记的荧光特性的变化。

16.检测目的小多核苷酸的方法，其包括：

(a)依照权利要求6所述的方法分离目的小多核苷酸，其中：

(1)所述模板区段包含一个或多个序列，所述序列是双链限制酶识别基序的一条链；以及

(2)延伸步骤将包含于所述捕获探针的模板区段内的单链限制酶识别序列转变为双链限制酶识别序列；

(b)提供识别并作用于延伸的区段的限制酶识别序列的限制酶；

(c)将所述限制酶与所述限制酶识别序列接触；

(d)在所述延伸的区段的限制酶识别序列处或其附近使所述延伸产物产生切口，以产生包含目的小多核苷酸的3′端片段和5′端带切口的延伸片段；以及

(e)移出和检测所述带切口的延伸片段。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述限制酶识别基序由切口核酸内切酶识别。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述模板区段的限制酶识别基序包含一个或多个核苷酸类似物，所述类似物使所述模板区段的限制酶识别基序抵抗所述限制酶的核酸内切酶活性。

19.如权利要求16所述的方法，其还包括用聚合酶延伸所述包含杂交的目的小多核苷酸的3′端片段，以复原所述限制酶识别基序并移出5′端带切口的延伸片段。

20.如权利要求16所述的方法，其中

(a)所述捕获探针的模板区段包含第一限制位点和第二限制位点，其中所述第一限制位点不同于所述第二限制位点；

(b)所述延伸步骤将所述第一限制位点转变为能在延伸的区段而不是模板区段上被产生切口的双链限制酶识别序列，并且将所述第二限制位点转变为能在延伸的区段而不是模板区段上被产生切口的第二双链限制识别序列；

(c)产生切口的步骤包含将所述延伸产物/捕获探针复合物与识别并作用于所述第一限制位点的切口剂接触，以使所述延伸产物在所述延伸区段的第一限制位点处或其附近被选择性地产生切口，以产生带切口的延伸片段；以及

(d)所述检测步骤包含：

(1)提供双标记的检测探针，其与带切口的延伸片段互补并能与其杂交；

(2)将所述探针与所述带切口的延伸片段杂交以形成双链探针/带切口的延伸片段复合物；

(3)将所述双链探针/带切口的延伸片段复合物与能识别所述检测探针序列并使其产生切口的的切口剂接触；以及

(4)检测与使所述双标记的检测探针产生切口相关的荧光变化。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一限制酶识别基序由切口核酸内切酶识别。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述模板区段的第二限制酶识别基序包含一个或多个核苷酸类似物，其使所述模板区段的限制酶识别基序抵抗限制酶的核酸内切酶活性。

23.如权利要求16所述的方法，其中

(a)所述模板区段还包含一个或多个与DNAzyme基序互补的DNAzyme互补序列、第一侧翼区段和第二侧翼区段，所述第一侧翼区段位于所述DNAzyme互补序列的5’端侧面，且所述第二侧翼区段位于所述DNAzyme互补序列的3’端侧面；

(b)带切口的延伸区段的移出提供了功能性DNAzyme，其能够在DNAzyme切割位点与合适的底物探针杂交并将其切割；

(c)所述检测步骤还包括：

(1)提供包含RNA多核苷酸或嵌合的RNA/DNA多核苷酸的合适的底物探针，所述底物探针具有结合到所述底物探针分子的5’端的一种标记以及结合到所述底物探针的3’端的另一种标记，所述底物探针包含具有第一底物探针序列的第一底物探针区段、DNAzyme切割位点和具有第二底物探针序列的第二底物探针区段，其中所述底物探针的第一底物探针序列与所述模板区段的第一侧翼区段相同，并且所述第二底物探针序列与所述模板区段的第二侧翼区段相同；

(2)将所述底物探针和所述带切口的延伸片段接触，以便在带切口的延伸区段上，通过所述第一底物探针序列和包含在所述带切口的延伸片段内的互补序列之间以及所述第二底物探针和包含在所述带切口的延伸片段内的互补序列之间的沃森-克里克碱基配对，形成包含DNAzyme基序的环结构；

(3)在DNAzyme切割位点切割所述底物探针；以及

(4)检测与切割底物探针相关的荧光变化。

24.分离和检测小多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)权利要求1的捕获探针的等摩尔混合物；

(b)选自下述的一种或多种物质：

(1)包含三磷酸脱氧核糖核苷或三磷酸核糖核苷的核苷酸混合物；

(2)聚合酶；

(3)抗生蛋白链菌素包被的顺磁珠；

(4)一种或多种双标记的检测探针，所述检测探针具有与所述捕获探针的模板区段内的检测探针结合序列基本上互补且能与其杂交的检测探针序列；

(5)连接酶；

(6)寡核苷酸接头，其与所述捕获探针的间隔区段基本上互补且能与其杂交；以及

(7)一种或多种对包含于所述捕获探针内的限制酶识别序列特异的限制酶。