JP2011509660A - リボ核酸を検出するための組成物、方法およびキット - Google Patents

リボ核酸を検出するための組成物、方法およびキット Download PDF

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Abstract

１つ以上の種のＲＮＡ分子を検出するための組成物、方法およびキットが、開示される。１つの実施形態において、第１アダプターおよび第２アダプターは、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドを用いて、介在する精製工程を行うことなく、ＲＮＡ分子に連結される。その連結産物は、逆転写され、次いで、その逆転写産物中のリボヌクレオシドのうちの少なくとも一部が、除去される。プライマーが加えられ、そして増幅産物が生成される。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の増幅産物の少なくとも一部の配列が決定され、そして対応するＲＮＡ分子の少なくとも一部が、決定される。いくつかの実施形態において、増幅産物種のうちの少なくとも一部が、直接または間接的に検出されることにより、目的のＲＮＡ分子の存在および／または量の測定が可能になる。

Description

（分野）
本教示は、概して、コードＲＮＡおよび非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含むがこれらに限定されないリボ核酸（ＲＮＡ）を検出、増幅および定量するための方法、試薬およびキットに関する。
（緒言）
ゲノムの発現パターンの解析は、様々な疾患状態を含むがこれに限定されない多岐にわたる生物学的プロセスにおける差次的発現の役割に貴重な見識を提供する。そのような解析は、ｍＲＮＡベースの遺伝子発現解析であるか、低分子非コードＲＮＡベースの発現解析であるかに関わらず、生物科学の多くの学問分野における調査の急速に拡大している手段になっている。低分子非コードＲＮＡの発見は、科学的および医学的な大きな関心領域でもある。ゲノムのどの部分が、いつおよびなぜ転写されるのかを知ることによって、多くの複雑かつ相互に関係する生物学的プロセスがよりよく理解され得ると考えられている。
低分子非コードＲＮＡは、進化の範囲に及ぶ多数の生物における遺伝子制御の重大なエフェクターとして急速に台頭してきた。動物、植物および真菌は、いくつかの異なるクラスの低分子ＲＮＡを含む；そのような低分子ＲＮＡとしては、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｒａｓｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。これらの小さな遺伝子発現調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）は、典型的には、約１８〜４０ｎｔ長のサイズ範囲内に入るが、しかしながら、細胞性プロセスに対するそれらの作用は、甚大である。それらは、発生上のタイミングおよび細胞運命機序、腫瘍進行、神経発生、トランスポゾンサイレンシング、ウイルス防御および多くのものにおいて決定的な役割を果たすと示されている。それらは、標的に結合し、そしてヘテロクロマチンの修飾、翻訳の阻害、ｍＲＮＡの崩壊および発生期のペプチド代謝回転機序さえも含む種々の機序によって負の遺伝子発現をもたらすことによって、遺伝子制御において機能する。ゆえに、所与のサンプル中の低分子ＲＮＡの同定は、遺伝子発現の解析を大きく促進し得る。
一部の低分子ＲＮＡは、ゲノム内の確定した位置から生成される。マイクロＲＮＡは、そのようなクラスである；それらは、典型的には、ポリシストロニック遺伝子クラスターからＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されるか、またはプレｍＲＮＡイントロンからも生成され得る。これまでに、数千の独特のｍｉＲＮＡ配列が知られている。ｐｉＲＮＡまたは内在性ｓｉＲＮＡなどの他のクラスの低分子ＲＮＡは、典型的には、ゲノム内の確定した遺伝子座から転写されない。代わりに、それらは、ウイルス感染またはレトロトランスポゾン発現などの事象に応答して生成され、そして別途細胞に対して重大な損害をもたらし得るこれらの「外来」配列をサイレンシングするように働く。ｎｃＲＮＡに関する説明は、とりわけ、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３に見られる。サンプル中の低分子ＲＮＡの集団全体を配列決定することにより、これらのＲＮＡのすべてのクラスを一度に同定し、プロファイルまでする直接的な方法がもたらされる。
Ｅｄｄｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００１，２：９１９−２９ Ｍａｔｔｉｃｋ ａｎｄ Ｍａｋｕｎｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００６，１５：Ｒ１７−２９ Ｈａｎｎｏｎら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，２００６，ＬＸＸＩ：５５１−６４
（要旨）
本教示は、（ｉ）機能性非翻訳ＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）および低分子非メッセンジャーＲＮＡ（ｓｎｍＲＮＡ）とも称される低分子ＲＮＡ分子；および（ｉｉ）当該分野で公知の方法によって断片化および／または細分されていてもよいし、されていなくてもよい、コードＲＮＡを検出および定量するための方法、試薬およびキットに関する。
ある特定の開示される方法によると、検出される少なくとも１つのＲＮＡ分子、少なくとも１つの第１アダプター、少なくとも１つの第２アダプターおよび二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼを含むライゲーション反応組成物が形成される。第１アダプターは、３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む第１オリゴヌクレオチド、および第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第２オリゴヌクレオチドを含む。第２アダプターは、５’ホスフェート基を含む第３オリゴヌクレオチド、および第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第４オリゴヌクレオチドを含む。第１アダプターおよび第２アダプターは、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼによってライゲーション反応組成物中のＲＮＡ分子に連結されて、連結産物が形成される。第１アダプターおよび第２アダプターは、それらの構造に起因して指向的な様式でＲＮＡ分子とアニールし、各アダプターは、それがアニールしたＲＮＡ分子に、連続的（例えば、第２アダプターおよびＲＮＡ分子が、リガーゼと混合され、第２アダプターが、そのＲＮＡ分子の３’末端に連結されるときに、続いて第１アダプターが、その連結されたＲＮＡ分子−第２アダプターと混合され、次いで、第１アダプターが、そのＲＮＡ分子−第２アダプターの５’末端に連結される（第２アダプターをＲＮＡ分子に連結する工程と、第１アダプターをＲＮＡ分子に連結する工程との間に精製工程が介在する）、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １５：１８８−２００，２００１；Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｕｐｐ．３８：Ｓ２−Ｓ７，２００６を参照のこと）ではなく同時またはほぼ同時に連結される。成分がライゲーション反応組成物に加えられる順序は限定されないこと、および任意の順序で成分を加えてもよいことが認識されるだろう。成分を加えるプロセス中に、反応組成物の成分のすべてが加えられる前に、アダプターが、リガーゼの存在下において対応するＲＮＡ分子と連結され得る（例えば、限定されないが、第１アダプターが加えられる前に、第２アダプターが、リガーゼの存在下において対応するＲＮＡ分子と連結され得る）ならば、および一方のアダプターがＲＮＡ分子に連結される時点と他方のアダプターがＲＮＡ分子に連結される時点との間に精製手順が存在しないならば、そのような反応も、本教示の意図される範囲内であることが認識されるだろう。ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（時折、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと称される）が、連結産物と混合されることにより、反応混合物が形成され、それは、逆転写産物に適した条件下でインキュベートされる。その逆転写産物は、リボヌクレアーゼ、典型的には、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）と混合され、リボヌクレオシドのうちの少なくとも一部が、その逆転写産物から消化されることにより、増幅鋳型を形成する。
その増幅鋳型は、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマーおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（時折、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと称される）と混合されることにより、増幅反応組成物を形成する。その増幅反応組成物は、増幅産物の生成を可能にするのに適した条件下で熱サイクル反応に供される。いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも１種が、検出される。いくつかの実施形態において、レポータープローブおよび／または核酸色素を使用することにより、サンプル中のＲＮＡ種の少なくとも１つの存在が間接的に検出される。ある特定の実施形態において、増幅反応組成物は、レポータープローブ（例えば、限定されないが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、分子ビーコン、ＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭプライマーなど）または核酸色素（例えば、限定されないが、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎもしくは他の核酸結合色素または核酸インターカレート色素）をさらに含む。本教示のある特定の実施形態において、検出は、定量的ＰＣＲを含むがこれに限定されない、リアルタイム検出技術またはエンドポイント検出技術を含む。いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも一部の配列が決定され、それにより、対応するＲＮＡ分子の同定が可能になる。いくつかの実施形態において、ライブラリー特異的ヌクレオチド配列を含む増幅産物のライブラリーは、出発物質中のＲＮＡ分子から生成され、ここで、増幅産物種のうちの少なくとも一部は、ライブラリー特異的識別子、例えば、限定されないが、ライブラリー特異的ヌクレオチド配列（バーコード配列またはハイブリダイゼーションタグあるいは共通のマーカーもしくは親和性タグを含むがこれらに限定されない）を共有する。いくつかの実施形態において、２つ以上のライブラリーが、組み合わされ、解析され、次いで、結果が、ライブラリー特異的識別子に基づいてデコンボリュートされる（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）。
ある特定の開示される方法によると、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性とＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を含むＤＮＡポリメラーゼであるただ１つのポリメラーゼを、逆転写反応組成物において使用し、さらなるポリメラーゼを使用しない。他の方法の実施形態において、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼの両方が、逆転写反応組成物に加えられ、さらなるポリメラーゼは、増幅反応組成物に加えられない。
いくつかの実施形態において、サンプル中のＲＮＡ分子を検出するための方法は、そのサンプルを少なくとも１つの第１アダプター、少なくとも１つの第２アダプター、および二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドと合わせ、ライゲーション反応組成物を形成する工程（ここで、少なくとも１つの第１アダプターおよび少なくとも１つの第２アダプターは、そのサンプルのＲＮＡ分子に連結されて、同じライゲーション反応組成物において連結産物を形成する）およびその連結産物のＲＮＡ分子またはその代用物を検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの第１アダプターは、１０〜６０ヌクレオチドの長さを有し、かつ３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む、第１オリゴヌクレオチド、および第１オリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが二重鎖形成するときに１〜８ヌクレオチドの一本鎖５’部分をさらに含む、第２オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの第２アダプターは、１０〜６０ヌクレオチドの長さを有し、かつ５’ホスフェート基を含む第３オリゴヌクレオチド、および第３オリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとが二重鎖形成するときに１〜８ヌクレオチドの一本鎖３’部分をさらに含む、第４オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、その一本鎖部分は、独立して、縮重ヌクレオチド配列、またはＲＮＡ分子の一部に相補的な配列を有する。いくつかの実施形態において、第１オリゴヌクレオチドと第３オリゴヌクレオチドとは、異なるヌクレオチド配列を有する。連結反応組成物において、検出されるＲＮＡ分子は、少なくとも１つの第１アダプターの一本鎖部分および少なくとも１つの第２アダプターの一本鎖部分とハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子またはその代用物を検出する工程は、連結産物を、ｉ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼ、またはｉｉｉ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせる工程；その連結産物を逆転写することにより、逆転写産物を形成する工程；リボヌクレアーゼＨを用いて逆転写産物からリボヌクレオシドのうちの少なくとも一部を消化することにより、増幅鋳型を形成する工程；その増幅鋳型を、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマー、および連結産物がｉ）におけるように混合されるときはＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせることにより、増幅反応組成物を形成する工程；その増幅反応組成物をサイクル反応に供する（ｃｙｃｌｉｎｇ）ことにより、少なくとも１つの増幅産物を形成する工程、およびその増幅産物の少なくとも一部の配列を決定することによって、ＲＮＡ分子を検出する工程を包含する。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡライブラリーを生成するための方法は、多数の異なるＲＮＡ分子を、多数の第１アダプター種、多数の第２アダプター種および二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼと合わせることにより、ライゲーション反応組成物を形成する工程（ここで、その少なくとも１つの第１アダプターは、３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む第１オリゴヌクレオチド、および第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第２オリゴヌクレオチドを含み、その少なくとも１つの第２アダプターは、５’ホスフェート基を含む第３オリゴヌクレオチド、および第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第４オリゴヌクレオチドを含む）、および少なくとも１つの第１アダプターおよび少なくとも１つの第２アダプターをＲＮＡ分子に連結することにより、多数の異なる連結産物種を形成する工程（ここで、第１アダプターおよび第２アダプターは、同じライゲーション反応組成物中のＲＮＡ分子に連結される）を包含する。その方法は、多数の連結産物種をＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせる工程、多数の連結産物種のうちの少なくとも一部を逆転写することにより、多数の逆転写産物種を形成する工程、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を用いて多数の逆転写産物のうちの少なくとも一部からリボヌクレオシドのうちの少なくとも一部を消化することにより、多数の増幅鋳型種を形成する工程、その多数の増幅鋳型種を、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマーおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせることにより、増幅反応組成物を形成する工程、およびその増幅反応組成物をサイクル反応に供することにより、多数の増幅産物種を含むライブラリーを形成する工程（ここで、その増幅産物種のうちの少なくとも一部は、そのライブラリー中の他の増幅産物種のうちの少なくとも一部と共通の識別配列を含む）をさらに含む。
ある特定の本方法を行うためのキットもまた開示される。本教示のこれらの特徴および他の特徴は、本明細書中で示される。
（図面）
以下で説明される図面は、説明するためだけの目的であることを当業者は理解するだろう。これらの図は、本教示の範囲を決して限定しないと意図される。
図１は、本教示の様々な例示的な方法の実施形態の概要の全体像を提供している。 図２Ａ〜図２Ｂ：図２Ａは、例示的な第１アダプター２１および例示的な第２アダプター２２を模式的に示しており；図２Ｂは、例示的なＲＮＡ分子２３に指向的にアニールされた図１Ａに示される例示的な第１および第２アダプターを模式的に示している。第１アダプター２１とＲＮＡ分子２３の５’末端とに対するライゲーション接合点が、矢印２４によって示されており、第２アダプター２２とＲＮＡ分子２３の３’末端とに対するライゲーション接合点が、矢印２５によって示されている。白長方形は、２１Ａおよび２３などに対するＲＮＡ配列を示している。水平の実線は、２１Ｂおよび２２Ａなどに対するＤＮＡ配列を示している。 図３は、本教示の例示的な実施形態の概要の全体像を提供している。低分子ＲＮＡ分子３３の集団を、第１アダプター３１および第２アダプター３２ならびにＲｎｌ２リガーゼと合わせることにより、連結産物３４が形成される。アニールしていないアダプターおよび／またはアニールされた望まれない副産物分子３５もまた、その連結反応組成物中に存在し得る。その反応組成物を、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせることにより、逆転写産物３６が生成され、次いで、その組成物をリボヌクレアーゼＨと合わせることにより、増幅鋳型３８が生成される。その増幅鋳型３８を、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、順方向プライマー３１０および逆方向プライマー３１１と合わせることにより、増幅反応組成物が形成される。この例証となる実施形態において、逆方向プライマーは、時折「バーコード」配列と称される識別配列３１２をさらに含む。 図４は、本教示の例示的な実施形態の概要の全体像を提供している。この例証となる実施形態において、増幅産物は、ゲル精製され（ゲル精製）、そしてインサート配列（図４において波括弧によって示されている）、第１プライマー領域（図４においてＰ１として示されている）、およびバーコードまたは識別配列（図４においてｂｃとして示されている）を含む第２プライマー領域（図４においてＰ２として示されている）を含む。 図５は、実施例１に記載されるように生成された例示的な増幅産物の電気泳動図を示す。レーン１：１０ｂｐＤＮＡラダー（１００ｎｇ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ／Ｎ１０８２１−０１５，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；レーン２：出発物質は１００ｎｇの全ＲＮＡであり、リガーゼ非含有コントロールである；レーン３：出発物質は１００ｎｇの全ＲＮＡであり、ＲＴ非含有コントロールである；レーン４：出発物質は、１００ｆｍｏｌのｍｉｒＶａｎａＴＭＲｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ ｖ．９．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ４３８８８９１，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）だった；レーン５：出発物質は、１００ｎｇの全ＲＮＡだった；そしてレーン６：出発物質は、５μｇの全ＲＮＡからｆｌａｓｈＰＡＧＥＴＭＦｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍで精製されたＲＮＡだった。 図６は、様々な二本鎖依存性リガーゼを、実施例２に記載されるように単独または組み合わせて用いて生成された例示的な増幅産物の電気泳動図を示している。レーン１：１００ｎｇの１０ｂｐＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；レーン２：１０単位のバクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ２、２００Ｕの逆転写酵素（ＲＴ）；レーン３：１０単位のバクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ２、ＲＴなし；レーン４：１０単位のバクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼＩ、２００ＵのＲＴ；レーン５：１０単位のバクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ１、ＲＴなし；レーン６：１０単位のバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、２００ＵのＲＴ；レーン７：１０単位のバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、ＲＴなし；レーン８：各々５単位のバクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼＩおよびバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、２００ＵのＲＴ；レーン９：各々５単位のバクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼＩおよびバクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、ＲＴなし；およびレーン１０：リガーゼなし、２００ＵのＲＴ。 図７Ａは、実施例４に記載されるように、ほぼ等モル濃度の約５００個の異なる種の合成ｍｉＲＮＡ分子を含む多数の異なるｍｉＲＮＡ分子、およびバクテリオファージＴ４のＲＮＡリガーゼ２とともに、様々な第１アダプター、様々な第２アダプター、または様々な第１アダプターと様々な第２アダプターとの組み合わせを含むライゲーション反応組成物において生成された例示的な連結産物（二重ライゲーションの注釈が付けられた矢印によって示されている）の電気泳動図を示している。図７Ａの上における数字４、６および８は、反応組成物中の各第１アダプターの第２オリゴヌクレオチドおよび各第２アダプターの第４オリゴヌクレオチドにおける縮重ヌクレオチド配列の数に対応する（図７ＢにおいてＮとして示されている）。Ｘ軸：Ｔ３−４は、対応するライゲーション産物が、構造Ｔ３：２７Ｎ（図７Ｂを参照のこと）（この場合、Ｎは、４個の縮重ヌクレオチドに等しい）を含む第１アダプターだけを含むライゲーション組成物中で生成されたことを示している；Ｔ３−６は、対応するライゲーション産物が、構造Ｔ３：２７Ｎ（この場合のＮは、６個の縮重ヌクレオチドに等しい）を含む第１アダプターだけを含むライゲーション組成物中で生成されたことを示している；Ｔ３−８は、対応するライゲーション産物が、構造Ｔ３：２７Ｎ（この場合のＮは、８個の縮重ヌクレオチドに等しい）を含む第１アダプターだけを含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；Ｔ７−４は、対応するライゲーション産物が、構造Ｔ７：Ｎ２８（図７Ｂを参照のこと）（この場合のＮは、４個の縮重ヌクレオチドに等しい）を含む第２アダプターだけを含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；Ｔ７−６は、対応するライゲーション産物が、構造Ｔ７：Ｎ２８（図７Ｂを参照のこと）（この場合のＮは、６個の縮重ヌクレオチドに等しい）を含む第２アダプターだけを含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；Ｔ７−８は、対応するライゲーション産物が、構造Ｔ７：Ｎ２８（この場合のＮは、８個の縮重ヌクレオチドに等しい）を含む第２アダプターだけを含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；Ｔ３−４＋Ｔ７−４は、対応するライゲーション産物が、構造Ｔ３：２７Ｎを含む第１アダプターおよび構造Ｔ７：Ｎ２８を含む第２アダプター（この場合のＮは、両方のアダプターのすべての種において４個の縮重ヌクレオチドに等しい）を含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；Ｔ３−６＋Ｔ７−６は、対応するライゲーション産物が、構造Ｔ３：２７Ｎを含む第１アダプターおよび構造Ｔ７：Ｎ２８を含む第２アダプター（この場合のＮは、両方のアダプターのすべての種において６個の縮重ヌクレオチドに等しい）を含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；Ｔ３−８＋Ｔ７−８は、対応するライゲーション産物が、構造Ｔ３：２７Ｎを含む第１アダプターおよび構造Ｔ７：Ｎ２８を含む第２アダプター（この場合のＮは、両方のアダプターのすべての種において８個の縮重ヌクレオチドに等しい）を含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；数字の２７は、第１アダプターの第１オリゴヌクレオチドの長さを指し、そして数字の２８は、第２アダプターの第３ヌクレオチドの長さを指している。図７Ｂは、本教示の例示的な第１および第２アダプターを模式的に示しており、ここで、Ｎは、例示的な第１アダプターまたは第２アダプターの下側の鎖、すなわち、それぞれ第２オリゴヌクレオチドまたは第４オリゴヌクレオチドにおける連なった縮重ヌクレオシドを表している。 図８Ａ：実施例５に記載され、図８Ｂに示されているように、様々な第１アダプター、様々な第２アダプター、または様々な第１アダプターと様々な第２アダプターとの組み合わせを用いて生成された例示的な連結産物（矢印で示されている）の電気泳動図を示している。Ｘ軸：Ｔ３ｒ２−６は、対応するライゲーション産物が、Ｔ３ｒ２：２７ ６Ｎ（図８Ｂを参照のこと）（６Ｎは、６個の縮重ヌクレオチドに等しく、ｒ２は、２つの３’リボヌクレオチドを示している）を含む第１アダプターだけを含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；Ｔ７−６は、対応するライゲーション産物が、Ｔ７：６Ｎ ２８（図８Ｂを参照のこと）（６Ｎは、６個の縮重ヌクレオチドに等しい）を含む第２アダプターだけを含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；Ｔ３ｒ２−６＋Ｔ７−６は、対応するライゲーション産物が、Ｔ３ｒ２：２７ ６Ｎを含む第１アダプターおよびＴ７：６Ｎ ２８を含む第２アダプター（ｒ２は、２つの３’リボヌクレオチドを示しており、６Ｎは、両方のアダプターのすべての種において６つの縮重ヌクレオチドに等しい）を含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；ｒＴ３−６は、対応するライゲーション産物が、ｒＴ３：２７ ６Ｎ（６Ｎは、６つの縮重ヌクレオチドに等しく、ｒＴ３は、すべてがリボヌクレオチドであることを示している）を含む第１アダプターだけを含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している。ｒＴ７−６は、対応するライゲーション産物が、ｒＴ７：６Ｎ ２８（ｒＴ７は、すべてがリボヌクレオチドであることを示しており、６Ｎは、６つの縮重ヌクレオチドに等しい）を含む第２アダプターだけを含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している；そしてｒＴ３−６＋ｒＴ７−６は、対応するライゲーション産物が、ｒＴ３：２７ ６Ｎを含む第１アダプターおよびｒＴ７：６Ｎ ２８を含む第２アダプター（ｒＴ３およびｒＴ７は、すべてがリボヌクレオチドであることを示しており、６Ｎは、両方のアダプターのすべての種において６つの縮重ヌクレオチドに等しい）を含むライゲーション反応物中で生成されたことを示している。図８Ｂは、本教示の第１および第２アダプターの２つの例示的なセットを模式的に示している（この２セットは、（ｉ）ｒＴ３：２７ ６Ｎ（上の第１アダプター）およびｒＴ７：６Ｎ ２８（上の第２アダプター）、ならびに（ｉｉ）Ｔ３ｒ２：２７ ６Ｎ（下の第１アダプター）およびＴ７：６Ｎ ２８（下の第２アダプター）を含み、ここで、６Ｎは、例示的な第１アダプターの下側の鎖および例示的な第２アダプターの下側の鎖における連なった６つの縮重ヌクレオシドを表している。 図９Ａ〜図９Ｃ。図９Ａおよび図９Ｂは、実施例６に記載されるように本教示のある特定の実施形態に従って生成された例示的な連結産物の電気泳動図を示している。第１アダプターと第２アダプターとの３つの異なる組み合わせを、二重ライゲーション効率について試験した。これらの組み合わせは、第１オリゴヌクレオチドの３’末端上の２つのリボヌクレオシドを除いて上側の鎖（すなわち、第１および第３オリゴヌクレオチド）が両方ともＤＮＡであるか、上側の鎖（すなわち、第１および第３オリゴヌクレオチド）が両方ともＲＮＡであるか、または５’（第１）アダプターにおける上側の鎖（すなわち、第１オリゴヌクレオチド）がＲＮＡかつ３’（第２）アダプターにおける上側の鎖（すなわち、第３オリゴヌクレオチド）がＤＮＡである、第１アダプターおよび第２アダプターを含んでいた。図９Ｃは、例示的な第１アダプター（ｒＴ３：２７ ６Ｎ）および第２アダプター（Ｔ７：６Ｎ ２８）を有する後者のアダプター構造の実施形態の模式図を提供している（図８Ｂにも個別に記載されている）。 図１０Ａおよび図１０Ｂは、一連のライゲーション反応組成物を用いて、本教示のある特定の実施形態に従って生成された例示的なライゲーション産物を示している２つの電気泳動図を示しており、そのライゲーション反応組成物の各々は、（１）Ｒｎｌ２リガーゼ、（ｉｉ）２および０．２ピコモル（ｐｍｏｌ）という濃度での合成ｍｉＲＮＡ分子のプール（ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ ｖ ９．１，Ｐ／Ｎ ４３８８８９１（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；本明細書中で記載される）、および（ｉｉｉ）実施例６に示され、記載されるような、１０／５０、５／２５、１／５、１／５０、５／５０、１０／５０、２５／５０、５／１００または５／５００（上側の鎖／下側の鎖）という上側の鎖と下側の鎖の比での本明細書中に開示されるような第１および第２アダプターを含む。 図１１は、核酸の様々な部分集合がサンプルから除去および／または精製されている本教示のある特定の実施形態を模式的に示している。この方法の実施形態は、低分子ＲＮＡの検出および単離ならびにホールトランスクリプトーム配列決定に使用され得る。 図１２は、実施例７によって提供されるように、同じ例証となる増幅産物のアリコートとともにＳＯＬｉＤＴＭＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用し、例示的な配列決定検出技術を用いて測定されたＬｏｇ２（ＦＣ）（Ｌｏｇ２（ＦＣ ＳＯＬｉＤＴＭ）としてｘ軸に示されている）に対する、本教示の１つの方法に従って生成された例証となる増幅産物の例示的なＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースの検出を用いて測定された−ΔΔＣＴのｌｏｇ２倍率変化（ＦＣ）（Ｌｏｇ２（ＦＣ）ＴａｑＭａｎ（−ｄｄＣｔ）としてｙ軸に示されている）のグラフを示している。 図１３Ａおよび図１３Ｂは、実施例７に記載されるようにＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色を用いて可視化された、本教示のある特定の実施形態によって生成された例示的な増幅産物を含む電気泳動図を示している。 図１４は、リアルタイムＰＣＲ反応における検出用であるインターカレート色素のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（例えば、実施例８）または電気泳動的に分離された増幅産物のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色（「ＳＹＢＲ（登録商標）アッセイ」）を用いて、本教示に従って生成された例示的な増幅産物を定量することによって目的のＲＮＡ分子を検出する工程を含む本教示の様々な実施形態を模式的に示している。ＬＥＧｅｎＤ：リガーゼ高感度遺伝子検出（Ｌｉｇａｓｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）とは、本明細書中に提供されるようなアッセイのための二本鎖依存性リガーゼの使用のことを指す。 図１５は、実施例８に記載されるような本教示の増幅産物を模式的に示している。Ｐ１とは、順方向ＰＣＲプライマーの一部のことを指す。Ｐ２とは、逆方向ＰＣＲプライマーの一部のことを指す。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、実施例８に記載されるように、例示的なサンプル（図１６Ａ）またはサンプル中に存在する２つのｎｃＲＮＡ分子（内在性ｍｉＲＮＡのｍｉＲ−１６（図１６Ｂ、菱形の記号が付された上の曲線）およびｍｉＲ−２１（図１６Ｂ、四角の記号が付された下の曲線）に加えられる、リアルタイムＰＣＲにおいて検出されたＲＮＡ分子の例証となるプロットを示している。図１６Ａに対する傾きおよびｙ切片は：ＳＩＣ３４（丸、上の線）：ｙ＝−３．２５６８ｘ＋３２．９１６、Ｒ２＝０．９９１８；ＳＩＣ８（三角）：ｙ＝−３．４１１６ｘ＋２９．４４４、Ｒ２＝０．９８８６；ＳＩＣ３７（四角）：ｙ＝−２．８５１７ｘ＋２３．６８５、Ｒ２＝０．９９３５；およびＳＩＣ３６（菱形、下の線）：ｙ＝−３．０３８１ｘ＋１９．５８７、Ｒ２＝０．９９９である。 図１７は、実施例１１に提供されるような低分子ＲＮＡライブラリーを生成するためのＳＯＬｉＤＴＭＳｍａｌｌ ＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔの手順の全体像を提供している。サイズ選択された増幅低分子ＲＮＡは、「鋳型化ビーズ調製」ステージにおけるＳＯＬｉＤＴＭエマルジョンＰＣＲ手順に入る。
（例示的な実施形態の説明）
前述の全般的な説明と以下の詳細な説明の両方が、単に例示的かつ説明的であり、本教示の範囲を限定すると意図されないことが理解されるべきである。本願において、特に具体的に述べられない限り、単数形の使用は、複数形を含む。例えば、「順方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）」は、２つ以上の順方向プライマー；例えば、特定の順方向プライマー種の１つ以上のコピーならびに１つ以上の異なる順方向プライマー種が、存在し得ることを意味する。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」またはそれらの基語の改変物（例えば、限定されないが、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」）の使用は、限定すると意図されない。用語「および／または」は、その用語の前後のことが、共にまたは別々にとられ得ることを意味する。限定としてではなく例示する目的で、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」もしくは「Ｙ」または「ＸおよびＹ」を意味し得る。
本明細書中で使用される節の表題は、単に構成上の目的のためであって、記載される主題を限定すると決して解釈されるべきでない。特許、特許出願、論文、書籍および専門書を含む、本願において引用される文献および同様のもののすべてが、任意の目的のためにそれらの全体が明確に参考として援用される。援用される文献および同様のものの１つ以上が、本明細書における用語の定義と矛盾するように用語を定義しているか、または使用している場合、本明細書が支配する。本教示は、様々な実施形態とともに記載されるが、本教示がそのような実施形態に限定されると意図されない。それどころか、本教示は、当業者が理解するように、様々な代替物、改変物および等価物を包含する。
用語「またはそれらの組み合わせ」とは、本明細書中で使用されるとき、その用語の前に列挙された項目の順列および組み合わせのすべてのことを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃまたはそれらの組み合わせ」は、以下のもの：Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣまたはＡＢＣのうちの少なくとも１つ、および特定の文脈において順序が重要である場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣまたはＣＡＢのうちの少なくとも１つも含むと意図される。この例に続いて、１つ以上の項目または用語の繰り返し（例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなど）を含む組み合わせが明確に含まれる。特に文脈から明らかでない限り、典型的には任意の組み合わせにおける項目または用語の数について制限がないことを当業者は理解するだろう。
ある特定の開示される方法（例えば、限定されないが、図１に示される例示的な実施形態）によると、検出される少なくとも１つのＲＮＡ分子、少なくとも１つの第１アダプター、少なくとも１つの第２アダプターおよび二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼを含むライゲーション反応組成物が形成される（ＲＮＡ分子への第１および第２アダプターのハイブリダイゼーションとして示される）。典型的には、出発物質は、多数のＲＮＡ種ならびに多数の異なる第１アダプターおよび異なる第２アダプターを含む。
図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、少なくとも１つの第１アダプター２１は、３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む第１オリゴヌクレオチド２１Ａ、および第１オリゴヌクレオチド２１Ａと第２オリゴヌクレオチド２１Ｂとが共にハイブリダイズするときに一本鎖５’部分２１Ｃを含む第２オリゴヌクレオチド２１Ｂを含み（図２Ａ）、ここで、少なくとも１つの第２アダプター２２は、５’ホスフェート基（図２Ｂにおいて「Ｐ」として示される）を含む第３オリゴヌクレオチド２２Ａ、および第３オリゴヌクレオチド２２Ａと第４オリゴヌクレオチド２２Ｂとが共にハイブリダイズするときに一本鎖３’部分２２Ｃを含む第４オリゴヌクレオチド２２Ｂを含む（図２Ａ）。この例証となる実施形態において、第１オリゴヌクレオチド内のヌクレオシドのすべてが、リボヌクレオシドであるが、他の実施形態では、第１オリゴヌクレオチドのヌクレオシドのすべておよび２つだけが、リボヌクレオシドであり得るが、但し、第１オリゴヌクレオチド２１Ａの最も３’側の２つのヌクレオシドは、リボヌクレオシドであり；残り部分の第１オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシドまたは両方の組み合わせを含み得ることが認識されるべきである。
図２Ａの例証となる第２および第４オリゴヌクレオチドの一本鎖部分（それぞれ、２１Ｂの２１Ｃおよび２２Ｂの２２Ｃ）は、縮重六量体配列として示されている（ＮＮＮＮＮＮとして示されている）。しかしながら、配列特異的一本鎖部分ならびにそれよりも長い一本鎖部分およびそれよりも短い一本鎖部分を有する第１および／または第２アダプターを使用することは、本教示の範囲内である。いくつかの実施形態において、縮重配列は、デオキシリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、縮重配列の長さは、４、６または８ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオシドを含み、第２、第３および第４オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含む。
一本鎖部分２１Ｃを除いて、第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドは、実質的に相補的であるように設計される。その実質的に相補的な部分は、１０〜６０ヌクレオチドの長さを有し得る。第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが、アニールまたは二重鎖形成することにより第１アダプターが形成されるとき、それらは、１つの平滑末端を有し得るか（図２Ａおよび図２Ｂにおけるように）、または一本鎖部分を有する末端と反対の末端に１、２もしくは３ヌクレオチドのオーバーハングを有し得る。そのオーバーハングは、第１オリゴヌクレオチド上に存在してもよいし、第２オリゴヌクレオチド上に存在してもよい。
一本鎖部分２２Ｃを除いて、第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドは、実質的に相補的であるように設計される。その実質的に相補的な部分は、１０〜６０ヌクレオチドの長さを有し得る。第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとが、アニールまたは二重鎖形成することにより第２アダプターが形成されるとき、それらは、１つの平滑末端を有し得るか（図２Ａおよび図２Ｂにおけるように）、または一本鎖部分を有する末端と反対の末端に１、２もしくは３ヌクレオチドのオーバーハングを有し得る。そのオーバーハングは、第１オリゴヌクレオチド上に存在してもよいし、第２オリゴヌクレオチド上に存在してもよい。
図１に戻って、ライゲーション反応組成物は、第１アダプターおよび第２アダプターがＲＮＡ分子とアニールするのに適した条件下でインキュベートされる。第１および第３オリゴヌクレオチド（「上の鎖」）は、第２および第４オリゴヌクレオチド（「下の鎖」）に対して１：１〜１：１０のモル比で存在し得る。いくつかの実施形態において、「上の鎖」と「下の鎖」とのモル比は、１：５または１：２である。二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドを使用することにより、アニールされた第１アダプター−ＲＮＡ分子−第２アダプター複合体が連結され、それにより連結産物が形成される（図１における「ライゲーション」として示される）。第１アダプターおよび第２アダプターは、２つの別個の連続的なライゲーション反応（その２つのアダプターをＲＮＡ分子に連結する間に１つ以上の分離工程または精製工程が介在する）としてではなく、同じ反応組成物中においてＲＮＡ分子に連結される。ライゲーション反応組成物の成分を加える順序および２つのアダプターがＲＮＡ分子に連結される順番は、典型的には、提供される本教示の限りではないことが理解されるだろう。
図２Ｂに示されるように、ある特定の実施形態において、第１および第２アダプターが、ＲＮＡ分子にハイブリダイズされて、（ｉ）第１アダプターの第１オリゴヌクレオチドの３’末端とＲＮＡ分子の５’末端とが、隣接してアニールすることにより、第１ライゲーション接合点（例えば、図２Ｂにおける２４）が形成され（ＲＮＡ分子と第１アダプターの一本鎖部分との間の相補性に起因して）、そして（ｉｉ）第２アダプターの第３オリゴヌクレオチドの５’末端と同じＲＮＡ分子の３’末端とが、隣接してアニールすることにより、第２ライゲーション接合点（例えば、図２Ｂにおける２５）が形成され（ＲＮＡ分子と第２アダプターの一本鎖部分との間の相補性に起因して）、ここで、その第１および第２ライゲーション接合点の両方が、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドを使用するライゲーションに適している。いくつかの実施形態において、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドは、Ｒｎｌ２ファミリーリガーゼ（Ｒｎｌ２リガーゼを含むがこれに限定されない）を含む。
ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼが、適当なヌクレオチド三リン酸および適切な塩を含む緩衝溶液をとともに、上記連結産物と混合される。この反応混合物は、その連結産物を鋳型として使用して逆転写産物が生成されるのに適した条件下でインキュベートされる（図１において「逆転写」として示されている）。第４オリゴヌクレオチドがＲＴプライマーとして働くので、別個の逆転写プライマーは必要ない。
いくつかの実施形態において、その逆転写産物は、アレイ上に置かれ、当業者に公知の標準的な方法を用いて検出される。いくつかの実施形態において、その逆転写産物は、ビオチンで標識され、検出は、それに結合するストレプトアビジンを用いることによる。いくつかの実施形態において、その逆転写産物は、ガラス繊維フィルター、ビーズを用いて精製されるか、またはゲル精製される。いくつかの実施形態において、その逆転写産物を、リボヌクレアーゼ活性を含むペプチドと混合されることにより、消化反応組成物を形成し、そしてその逆転写産物からリボヌクレオシドのうちの少なくとも一部を消化するのに適した条件下でインキュベートすることにより、増幅鋳型を形成する。いくつかの実施形態において、リボヌクレアーゼ活性を含むそのペプチドは、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を含む（図１において「ＲＮａｓｅＨ消化」と示されている）。
その増幅鋳型を、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマー、およびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むペプチドと合わせることにより、増幅反応組成物を形成する。ＲＮＡ指向性ポリメラーゼ活性とＤＮＡ指向性ポリメラーゼ活性の両方を有するＤＮＡポリメラーゼが、上記の逆転写反応において使用されるときは、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼを含むさらなるペプチドが、加えられる必要はない。その増幅反応組成物を、増幅産物の生成を可能にするのに適した条件下で熱サイクル反応に供する（図１において「増幅」と示されている）。その増幅産物の少なくとも一部の配列が決定され、それにより、対応するＲＮＡ分子の検出が可能になる（図１において「配列決定」として示されている）。
図３に模式的に示される１つの例示的な実施形態によると、低分子ＲＮＡ分子３３の集団を、ＲＮＡ（白四角で示されている）を含む第１オリゴヌクレオチドを含む第１アダプター３１および第２アダプター３２ならびにＲｎｌ２リガーゼと合わせることにより、ライゲーション反応組成物が形成される。そのライゲーション反応組成物を、アニールが生じるのに適した条件下でインキュベートし、そして第１アダプターおよび第２アダプターが、低分子ＲＮＡ分子とアニールすることにより、ＲＮＡ分子の５’末端にアニールされた第１アダプターおよび低分子ＲＮＡ分子の３’末端にアニールされた第２アダプターを含むライゲーション鋳型が形成される。そのリガーゼは、第１アダプターをＲＮＡ分子の５’末端に、および第２アダプターをＲＮＡ分子の３’末端に、ライゲーション接合点（図３において黒点として示され、矢印によって示されている）において連結することによって、連結産物３４を生成する。ライゲーション反応組成物中のアダプターおよびＲＮＡ分子の濃度に応じて、いくつかのアニールしていない第１アダプター３１および／または第２アダプター３２もまた、そのライゲーション反応組成物中に存在し得る。さらに、特に、第１および／または第２アダプターが、縮重配列を含むとき、アニールした望まれない副産物分子３５も形成され得る。
連結産物を含む反応組成物は、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと混合され、適当な条件下で逆転写産物３６が生成される。逆転写産物３６を含む反応組成物は、リボヌクレアーゼＨと混合され、そして連結産物のリボヌクレオシドのうちの少なくとも一部が消化され、増幅鋳型３８が生成される。この点において、その増幅鋳型が、第２アダプターの第３オリゴヌクレオチドとアニールした逆転写産物のｃＤＮＡ鎖を本質的に含むことを当業者は認識するだろう。増幅鋳型３８は、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、順方向プライマー３１０および逆方向プライマー３１１と混合されることにより、増幅反応組成物が形成される。この例証となる実施形態において、逆方向プライマーは、時折「バーコード」配列と称される識別配列３１２をさらに含む。所与の増幅反応組成物中の逆方向プライマーのすべてが、同じ識別配列を含み、その配列がその後のアンプリコンに組み込まれる場合、同じ増幅反応組成物から生成されるアンプリコンのすべては、その反応組成物から生じたと同定され得る。
その増幅反応組成物は、温度サイクル反応に供されることにより、ポリメラーゼ連鎖反応の発生が可能になり、複数の増幅産物が生成される。この例証となる実施形態において、その増幅産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）および／または高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ；時折、高圧液体クロマトグラフィと称される）を用いて精製される。その精製された増幅産物は、当該分野で公知の任意の技術を用いて配列決定され、そしてその配列に対応するＲＮＡ分子が同定される。開示される方法が、種々の解析（発現プロファイリング、１つ以上の対応するサンプル中の１つ以上の特異的ＲＮＡ分子の定量（例えば、薬物処置有りおよび無し；悪性組織／腫瘍組織および対応する正常組織サンプル；対応する胚、新生児、青年期および／または成体の組織を用いる発生的研究）および低分子ＲＮＡ発見を含むがこれらに限定されない）にとって有用であり得ることを当業者は認識するだろう。
増幅産物の複数のライブラリーが生成される場合、各増幅産物ライブラリーは、そのライブラリーに対する独特の識別配列またはバーコードによって同定され得ることが認識されるだろう。いくつかの実施形態において、所与の増幅産物ライブラリーに対するＰＣＲプライマー混合物は、順方向プライマー（説明の目的で、図３における順方向プライマー３１０を参照のこと）および独特の識別配列またはバーコードを含む逆方向プライマー（説明の目的で、図３における識別子配列３１２を含む逆方向プライマー３１１を参照のこと）を含む。そのようなプライマー対を含む増幅反応組成物がサイクル反応に供されるとき、バーコードは、そのライブラリーの増幅産物に組み込まれる。したがって、例示的な第１プライマーが、増幅反応組成物中のこれらの例示的な逆方向プライマーのいずれかとマッチし得ることにより、逆方向プライマーのバーコードまたはその相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む増幅産物のライブラリーが生成される。
限定としてではなく説明の目的で、例示的な順方向プライマーおよび例示的な逆方向プライマーＢＣ１（実施例１１を参照のこと）を含むＰＣＲプライマー混合物を用いて生成される第１ライブラリー中の各増幅産物は、バーコード配列ＡＡＧＣＣＣおよび／またはその相補物を含み；例示的な順方向プライマーおよび例示的な逆方向プライマーＢＣ２を含むＰＣＲプライマー混合物を用いて生成される第２ライブラリー中の各増幅産物は、バーコード配列ＣＡＣＡＣＣおよび／またはその相補物を含む；など。したがって、増幅産物の複数のライブラリーが、配列決定の前にプールされ得、各ライブラリーに対応する出発物質中のＲＮＡ分子は、標的（ＲＮＡ分子）配列、またはそのライブラリーに対するバーコードまたは識別配列と組み合わされる配列の少なくとも一部を用いて同定され得る。様々な識別配列が、所与の増幅反応組成物において生成される増幅産物を独自に標識するために使用され得ることを当業者は認識するだろう。
図４は、本教示の別の例示的な実施形態を模式的に示している。この実施形態によると、第１および第２アダプターは、ＲＮＡ分子とハイブリダイズし（図４においてアダプターハイブリダイゼーションとして示されている）、適当な条件下かつ適切なリガーゼの存在下において、連結産物が生成される（図４においてライゲーションとして示されている）。その連結産物に逆転写酵素が加えられ、適当な条件下で逆転写産物が生成される（図４において逆転写として示されている）。その逆転写産物は、リボヌクレアーゼＨで消化され、そして増幅鋳型が形成される（図４においてＲＮａｓｅＨとして示されている）。増幅鋳型、順方向プライマー、逆方向プライマーおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼを含む増幅反応組成物が形成される。その増幅反応組成物を、線形の増幅の範囲内に留まる数サイクルの熱サイクル反応（一般に、約１２〜１５サイクルまたは１つの例示的な実施形態によると１２〜１８サイクル）に供することにより、ポリメラーゼ連鎖反応が生じ、そして増幅産物が生成される（図４においてＰＣＲとして示されている）。この例証となる実施形態において、増幅産物は、ゲル精製される（図４においてゲル精製として示されている）ことにより、精製された増幅産物がもたらされる。適切にサイズ分画されるかまたは断片化されたＲＮＡ分子を使用するという条件で、増幅産物は、挿入配列（図４において波括弧によって示されている；ある特定の実施形態において、インサートサイズは、約１５塩基対〜約１００塩基対である）、第１プライマー領域（図４においてＰ１として示されている）、およびバーコードまたは識別配列（図４においてｂｃとして示されている）を含む第２プライマー領域（図４においてＰ２として示されている）を含む。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、交換可能に使用され、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合によって連結された２’−デオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオシド（ＲＮＡ）、またはヌクレオチド間アナログおよび関連する対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋などを含む、ヌクレオシドモノマーの一本鎖および二本鎖のポリマーのことを指す。ポリヌクレオチドは、全体的にデオキシリボヌクレオシド、全体的にリボヌクレオシド、またはそれらのキメラ混合物から構成され得る。以下でさらに説明されるように、例えば、第１アダプターは、３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを有する第１オリゴヌクレオチドを含む。第１オリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５またはそれ以上のリボヌクレオシドを有し得、いくつかの実施形態では、それらのリボヌクレオシドは、連続している。いくつかの実施形態において、第２、第３または第４オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含む。そのヌクレオチドモノマー単位は、本明細書中に記載されるヌクレオチドのいずれかを含み得、それらとしては、ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログが挙げられるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドは、時折、当該分野においてオリゴヌクレオチドと称されるとき、典型的には、数モノマー単位から（例えば、５〜４０または５〜６０）数千モノマーヌクレオチド単位までのサイズの範囲である。特に示されない限り、ポリヌクレオチド配列が示されるときはいつでも、ヌクレオチドが、左から右に向かって５’から３’への順であることが理解されるだろう。
検出されるＲＮＡ分子：いくつかの実施形態において、本教示のＲＮＡ分子は、全ＲＮＡ、全ＲＮＡのサブセットもしくは画分またはその両方を含む。いくつかの実施形態において、検出されるＲＮＡ分子を含むサンプルは、特定のサンプルまたはサンプルのプールから得られるＲＮＡのすべてを含む。他の実施形態において、全ＲＮＡは、サブセットに細分され、そして検出されるＲＮＡ分子は、その細分されたサブセットの１つ以上に存在する。典型的には、ＲＮＡ分子は、サンプル中の全ＲＮＡまたはＲＮＡ分子のサブセットをもたらす当該分野で公知の任意の技術を用いてサンプルから抽出される。
いくつかの実施形態において、検出されるＲＮＡ分子は、典型的には、ライゲーション反応組成物を形成する前に断片化される。いくつかの実施形態において、全ＲＮＡは、断片化され得るか、または細分されたＲＮＡは、本明細書中に提供される方法を用いて断片化され得、そして解析され得る。いくつかの実施形態において、検出されるＲＮＡ分子は、複数の異なるＲＮＡ種を含み、それらとしては、ライゲーション産物を生成する前に断片化されてもよいし、されなくてもよい、複数の異なるｍＲＮＡ種が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、そのＲＮＡは、当該分野で周知の方法を用いて、化学的に、酵素的に、機械的に、加熱によって、またはそれらの組み合わせによって断片化される。断片化されたＲＮＡは、本明細書中に提供される方法を用いて解析される。したがって、コードＲＮＡ（例えば、発現解析の場合）または非コードＲＮＡを含む、ＤＮＡから転写される配列が解析される、ホールトランスクリプトーム解析が行われ得る。
いくつかの実施形態において、ある特定のサイズ範囲の低分子ＲＮＡ分子および／または断片化ＲＮＡが、例えば、サイズ分画手順を用いてサンプルから得られる。いくつかの実施形態では、全ＲＮＡが断片化され、そして第１および第２アダプターを連結する前にサイズ分画され得るが；他の実施形態では、全ＲＮＡが、ライゲーション反応組成物において使用される。限定としてではなく説明の目的で、ある特定の分画技術が図１１に示されている。
いくつかの実施形態において、ポリＡ選択プロセスを行うことにより、ポリＡを欠くＲＮＡ分子（ポリＡマイナスＲＮＡ分子）からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が分離される。いくつかの実施形態において、例えば、限定されないが、当該分野で公知のポリＡ選択技術（オリゴ−ｄＴクロマトグラフィを含むがこれに限定されない）を用いて全ＲＮＡからｍＲＮＡのうちの少なくとも一部を分離することによって、全ＲＮＡが、サブセットに細分される。そのような実施形態において、ポリＡ＋画分またはポリＡ枯渇画分のいずれかを本教示において使用することにより、その画分中に存在するＲＮＡ分子のうちの少なくとも一部が検出され得る。いくつかの実施形態において、両方の画分を別々に使用することにより、各画分中に存在するＲＮＡ分子のうちの少なくとも一部が検出され得る。いくつかの実施形態において、目的のＲＮＡ分子は、ポリＡマイナスＲＮＡ分子（例えば、限定されないが、大きい非コードＲＮＡ）を含む。
ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡ分子の集団またはポリＡマイナスＲＮＡ分子の集団は、その集団中の豊富なＲＮＡ分子（例えば、限定されないが、リボソームＲＮＡ）またはハウスキーピング遺伝子もしくは高度に発現される遺伝子からのｍＲＮＡ（アクチンｍＲＮＡおよびグロビンｍＲＮＡを含むがこれらに限定されない）の少なくとも１種が枯渇されている。例えば、ある特定のｍＲＮＡまたはＲＮＡのクラス（例えば、限定されないが、高コピー数ｍＲＮＡ（例えば、アクチン、ＧＡＰＤＨ、グロビンおよび他の「ハウスキーピング」ｍＲＮＡ））；およびＲＮＡのクラス（例えば、限定されないが、１８Ｓ ＲＮＡおよび２８Ｓ ＲＮＡ）が、全ＲＮＡから枯渇されている（例えば、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＧＬＯＢＩＮｃｌｅａｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）キット（米国特許出願公報ＵＳ２００６／０２５７９０２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ Ａｂｕｎｄａｎｔ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓもまた参照のこと）などの市販のキットを用いて）。
化学的断片化という用語は、本明細書中で広い意味において使用され、ＲＮＡを含むサンプルを、金属イオン（例えば、限定されないが、亜鉛（Ｚｎ２＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）およびマンガン（Ｍｎ２＋））および熱に曝露することを含むが、これらに限定されない。
酵素的断片化という用語は、広い意味において使用され、ヌクレアーゼ活性を含むペプチド（例えば、エンドリボヌクレアーゼまたはエキソリボヌクレアーゼ）が、ＲＮＡ分子のうちの少なくとも一部を切断または消化するのに適した条件下で、そのＲＮＡを含むサンプルを、そのペプチドと混合することを含む。例示的なヌクレアーゼとしては、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅｓ）（例えば、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅＴ２、ＲＮａｓｅＵ２、ＲＮａｓｅＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＰＨ、リボヌクレアーゼＶ１、オリゴリボヌクレアーゼ（例えば、ＥＣ３．１．１３．３）、エキソリボヌクレアーゼＩ（例えば、ＥＣ３．１．１１．１）およびエキソリボヌクレアーゼＩＩ（例えば、ＥＣ３．１．１３．１））が挙げられるが、これらに限定されないが、しかしながら、１つ以上のより小さい構成成分へのＲＮＡ分子の加水分解を触媒する任意のペプチドが、本教示の企図の範囲内である。核酸（例えば、限定されないが、リボザイム）によるＲＮＡ分子の断片化もまた、本教示の範囲内である。
機械的断片化という用語は、広い意味において使用され、機械的な力（超音波処理、衝突または物理的衝撃および剪断力を含むがこれらに限定されない）に曝露されるときに核酸が断片化される任意の方法を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡの非常に小さいフラグメントは、「精製」工程（例えば、限定されないが、本教示に従って残存しているより大きなＲＮＡ分子を用いる前の、ゲル電気泳動、ガラス繊維フィルターまたは磁気ビーズを用いる精製）を用いて除去される。
ある特定の実施形態において、本教示の方法は、物理的分離方法を用いて細分されたＲＮＡ分子を使用し、その物理的分離方法としては、サイズ分離方法（例えば、遠心分離、カラムクロマトグラフィ／ゲルふるい分けおよび電気泳動的分離）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、目的のＲＮＡ分子の電気泳動的分離は、ｆｌａｓｈＰＡＧＥＴＭＦｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、または当該分野で公知の方法に従ってアガロースもしくはポリアクリルアミドゲルからバンドを切り出すことによるサイズ分離を含む。いくつかの実施形態において、ある特定の開示される方法において使用されるＲＮＡ分子は、ｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を含むがこれに限定されない種々のサンプル調製キットおよび試薬のいずれかを用いてサンプル中のＲＮＡ分子のサブセットを抽出することによって得られ得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、免疫沈降され得る。
非コードＲＮＡまたはｎｃＲＮＡという用語は、サイズに関係なく、タンパク質に翻訳されない任意のＲＮＡ分子のことを指す。例示的なｎｃＲＮＡとしては、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、エフェレンス（ｅｆｆｅｒｅｎｃｅ）ＲＮＡ（ｅＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、反復配列関連ｓｉＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、シグナル認識粒子ＲＮＡ、プロモーターＲＮＡ（ｐＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および転移メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）が挙げられる。
ＲＮＡ分子を再構築するために、より長い分子が、細分および／または断片化され得、そして画分および／またはフラグメントが、検出され得るので、検出されるＲＮＡ分子の長さが、本教示の限りではないことを当業者は認識するだろう。いくつかの実施形態において、検出されるＲＮＡ分子の長さは、１２〜５００ヌクレオチド、１５〜１１０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１８〜１１０ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２５〜約６０ヌクレオチド、２０〜約４５ヌクレオチド、２０〜約４１ヌクレオチド、２０〜約４０ヌクレオチド、２１、２２、２３、２４もしくは２５〜約３６、３７、３８、３９、４０もしくは４１ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の整数の範囲である。いくつかの実施形態において、検出されるＲＮＡ分子は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４１ヌクレオチドの長さを有する。
ＲＮＡを細分または断片化するために使用される技術が、本教示の限りでないこと、および典型的には、様々な細分または断片化の技術が、ＲＮＡ分子の画分またはフラグメントが検出されるかに応じて使用され得ることを当業者は認識するだろう。
ある特定の実施形態において、出発物質は、少なくとも１つの合成ＲＮＡ分子（例えば、とりわけ、較正または標準化のために使用され得るスパイクインコントロール（ｓｐｉｋｅ−ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ））を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの合成ＲＮＡ分子種が、天然に存在するＲＮＡ分子を含むサンプルに加えられ、そして少なくとも１つの合成ＲＮＡ種および少なくとも１つの天然に存在するＲＮＡ種の存在が、開示される方法に従って検出される。
いくつかの実施形態において、検出されるＲＮＡ分子は、効率的なライゲーションのために５’−モノホスフェートおよび３’−ヒドロキシルを有する。例えば、いくつかの低分子ＲＮＡの生合成は、トリホスフェートを含む５’末端を有するＲＮＡ分子をもたらす。本教示のある特定の実施形態によると、そのようなＲＮＡ分子は、アダプターライゲーションおよび増幅に適さない。したがって、５’キャップ構造を有するインタクトなｍＲＮＡ分子および５’トリホスフェートを有するＲＮＡ分子（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の内在性ｓｉＲＮＡ（Ｐａｋ ２００７）などの低分子ＲＮＡを含む）は、まずキャップ除去酵素（例えば、限定されないが、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）、ヌクレアーゼＰ１、Ｄｃｐ１ｐキャップ除去酵素、Ｄｃｐ２キャップ除去酵素またはＤｃｐＳキャップ除去酵素）で処理されることにより、ＲＮＡ分子の５’末端を５’モノホスフェートに変換されない限り、反応組成物中のハイブリダイズされたアダプターに効率的に連結できない。目的のＲＮＡ分子が、５’−トリホスフェートを含む場合、本教示のある特定の実施形態は、タバコ酸性ピロホスファターゼを使用することにより、ＲＮＡ分子の５’末端を５’モノホスフェートに変換して、ライゲーションに適するものにする。
いくつかの実施形態において、ある特定の断片化技術によって生成されたフラグメントは、はじめは、酵素的ライゲーションに適した末端を有しない；いくつかの実施形態において、そのようなフラグメントは、キナーゼ（例えば、限定されないが、バクテリオファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ）で処理されることにより、５’末端または３’末端を本教示に従う連結に適するものにする。
検出されるＲＮＡは、少なくとも１つの第１アダプター、少なくとも１つの第２アダプターと混合され、そしてアニールされて、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼを含むポリペプチドが、連結産物を形成し得るので、検出されるＲＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
本教示によると、目的のＲＮＡ分子は、合成のものであってもよいし、天然に存在するものであってもよい。ＲＮＡ分子は、当該分野で周知のオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成され得る。ＲＮＡ分子はまた、当該分野で公知の方法に従って、インビボまたはインビトロにおいて生化学的に合成され得、その方法としては、例えば、米国特許第５，９５８，６８８号；同第５，７２３，２９０号；同第５，５１４，５４５号；同第５，０２１，３３５号；同第５，１６８，０３８号；同第５，５４５，５２２号；同第５，７１６，７８５号；同第５，８９１，６３６号；および同第６，２９１，１７０号を含むがこれらに限定されないインビトロ転写技術であるがこれらに限定されない。そのような技術に関する詳細な説明は、とりわけ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅら、ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００５年５月までの改訂を含む）（本明細書中以後「Ｂｅａｕｃａｇｅら」）；およびＢｌａｃｋｂｕｒｎ ａｎｄ Ｇａｉｔに見られる。ＲＮＡ分子、アダプターおよびプライマーの合成に有用な自動核酸合成装置は、数多くの供給源（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が挙げられる）から市販されている。ＲＮＡ分子、アダプターおよびプライマーは、当該分野で周知のインビボでの方法および／またはインビトロでの方法を用いて生合成的にも生成され得る。そのような科学技術に関する説明は、とりわけ、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらに見られる。第４オリゴヌクレオチドが開始可能な（ｐｒｉｍｅａｂｌｅ）基質である限り、ヌクレオシドアナログ（例えば、２’−ＯＭｅ−、ＬＮＡ−、ハロ−またはアラビノ−誘導体）またはユニバーサル核酸塩基を、アダプターに組み込むことができる。精製されたＲＮＡまたは部分的に精製されたＲＮＡは、数多くの供給源から市販されており、それらとしては、ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）Ｐｏｌｙ（Ａ）、ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）Ｔｕｍｏｒ ＲＮＡおよびｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）；Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ，Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ，ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡが挙げられる。
いくつかの実施形態において、検出されるＲＮＡ分子は、サンプル中に存在する。用語「サンプル」は、本明細書中で広い意味において使用され、広範囲の生物学的材料、ならびにＲＮＡを含むかまたは含むと疑われるそのような生物学的材料に由来するかまたはそれらから抽出される組成物を含むと意図される。例示的なサンプルとしては、全血；赤血球；白血球；バフィーコート；毛；爪およびクチクラ材料；頬側スワブ、咽頭スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍スワブ、鼻咽頭スワブなどを含むスワブ；尿；痰；唾液；精液；リンパ液；羊水；脳脊髄液；腹膜滲出液；胸水；嚢胞からの体液；滑液；硝子体液；房水；包液（ｂｕｒｓａ ｆｌｕｉｄ）；眼洗浄液；眼吸引液；血漿；肺洗浄液；肺吸引液；および肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓、バイオプシー材料などを含む組織が挙げられる。上記の例示的な生物学的サンプルのいずれかから得られた溶解産物、抽出物または材料もまた、本教示の範囲内であることを当業者は認識するだろう。外植される材料、初代細胞、二次細胞株などを含む組織培養細胞ならびに任意の細胞から得られた溶解産物、抽出物または材料もまた、本明細書中で使用されるとき、生物学的サンプルという用語の意図される意味の範囲内である。法医学的、農学的および／または環境的な環境から得られる少なくとも１つのＲＮＡ分子を含むかまたは含むと疑われる材料もまた、サンプルという用語の意味の範囲内である。ある特定の実施形態において、サンプルは、合成核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、完全に合成であり、例えば、少なくとも１つの合成核酸配列を含む緩衝溶液を含むコントロールサンプルであるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、サンプルは、環境的サンプル（例えば、土壌、水または大気サンプル）である。
植物のｍｉＲＮＡは、３’末端に２’−Ｏ−メチル基を有し得、そして本明細書中で言及されるようなライゲーション反応において連結され得る。しかしながら、そのようなライゲーションの効率は、３’末端に２’−ＯＨを有するＲＮＡ種と比べて低い。
第１アダプターおよび第２アダプター：上で述べたように、少なくとも１つの第１アダプターは、３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む第１オリゴヌクレオチド、および図２Ａに示されているように第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするとき、一本鎖５’部分を含む第２オリゴヌクレオチドを含む。第１および第２オリゴヌクレオチドは、以下でさらに説明される一本鎖部分を除いて、実質的に相補的であるように設計される。その実質的に相補的な部分は、１０〜６０ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、その実質的に相補的な部分は、１０〜４０ヌクレオチド、１２もしくは１５〜３０ヌクレオチド、２０、２１、２２もしくは２３〜２５、２７もしくは２９ヌクレオチド、またはこれらの範囲のいずれかの間の任意の整数の範囲の長さを有し得る。第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが、アニールまたは二重鎖形成することにより第１アダプターが形成されるとき、それらは、１つの平滑末端を有し得るか（図２Ａおよび図２Ｂにおけるように）、または一本鎖部分を有する末端と反対の末端に１、２もしくは３ヌクレオチドのオーバーハングを有し得る。そのオーバーハングは、第１オリゴヌクレオチド上に存在してもよいし、第２オリゴヌクレオチド上に存在してもよい。
また、上で述べたように、少なくとも１つの第２アダプターは、５’ホスフェート基を含む第３オリゴヌクレオチド、および図２Ａに示されているように第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖３’部分を含む第４オリゴヌクレオチドを含む。第３および第４オリゴヌクレオチドは、以下でさらに説明される一本鎖部分を除いて、実質的に相補的であるように設計される。その実質的に相補的な部分は、１０〜６０ヌクレオチドの長さを有し得る。第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとが、アニールまたは二重鎖形成することにより第２アダプターが形成されるとき、それらは、１つの平滑末端を有し得るか（図２Ａおよび図２Ｂにおけるように）、または一本鎖部分を有する末端と反対の末端に１、２もしくは３ヌクレオチドのオーバーハングを有し得る。そのオーバーハングは、第１オリゴヌクレオチド上に存在してもよいし、第２オリゴヌクレオチド上に存在してもよい。
いくつかの実施形態において、第１オリゴヌクレオチドが、３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含むことを除いて、第１、第２、第３および第４オリゴヌクレオチドは、独立して、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む。図２Ａの例証となる実施形態において、第１オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシドのすべては、リボヌクレオシドであるが、他の実施形態では、第１オリゴヌクレオチドのヌクレオシドのうちのすべておよび２つだけが、リボヌクレオシドであり得るが、但し、第１オリゴヌクレオチドの最も３’側の２つのヌクレオシドは、リボヌクレオシドであり；残りの第１オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシドまたは両方の組み合わせを含み得ることが認識されるべきである。いくつかの実施形態において、第２、第３および第４オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドを含み、そして第１オリゴヌクレオチドのすべてが、リボヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、第１オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオシドを含み、そして第２、第３および第４オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含む。第１および第２アダプターのオリゴヌクレオチドの長さは、互いに独立している。
第１、第２、第３および第４オリゴヌクレオチドの配列は、上に記載されたようにアダプターの二重鎖形成される部分において実質的な相補性が達成されるようなものである。いくつかの実施形態において、第１オリゴヌクレオチドの配列と第３オリゴヌクレオチドの配列とは、異なる。アダプターの二重鎖形成された部分のヌクレオチドの特定の配列は、本明細書中の方法に限定されるものではない。いくつかの実施形態において、アダプター配列の一部は、「プロモーター配列」を含み、それには、適当なポリメラーゼ（例えば、限定されないが、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）を使用した転写の開始に適した配列が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、第１アダプターは、第１プロモーターに対する「プロモーター配列」を含み、そして第２アダプターは、第２プロモーターに対する「プロモーター配列」を含む。
第１オリゴヌクレオチドの３’末端および第３オリゴヌクレオチドの５’末端は、検出されるＲＮＡ分子に対するライゲーションに適するものであり、そのＲＮＡ分子もまた、ライゲーションに適するものである。「ライゲーションに適した」オリゴヌクレオチドとは、少なくとも１つの検出されるＲＮＡ分子、ならびに少なくとも１つの第１アダプターおよび／または少なくとも１つの第２アダプターのことを指し、それらの各々は、適切な反応基を含む。例示的な反応基としては、第１アダプターの第１オリゴヌクレオチドの３’末端上の遊離ヒドロキシル基および検出されるＲＮＡ分子の５’末端上の遊離ホスフェート基、検出されるＲＮＡ分子の３’末端上の遊離ヒドロキシル基および第２アダプターの第３オリゴヌクレオチドの５’末端上の遊離ホスフェート基が挙げられるが、これらに限定されない。
アダプターの一本鎖部分：例証となる第２および第４オリゴヌクレオチドの一本鎖部分は、縮重六量体配列として図２Ａに示されている（ＮＮＮＮＮＮとして示されている）。しかしながら、配列特異的一本鎖部分ならびにより長いおよびより短い一本鎖部分を有する第１および／または第２アダプターの使用は、本教示の範囲内である。
いくつかの実施形態において、一本鎖部分は、独立して、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドとリボヌクレオシドとの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、一本鎖部分は、デオキシリボヌクレオシドを含む。
アダプターの一本鎖部分のいくつかの実施形態において、その一本鎖部分の長さは、１ヌクレオチドもの短さであり、８ヌクレオチドもの長さである。いくつかの実施形態において、一本鎖部分の長さは、２、４、６または８ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、一本鎖部分の長さは、４または６ヌクレオチドである。第２オリゴヌクレオチドの一本鎖部分の長さは、第４オリゴヌクレオチドの一本鎖部分の長さと独立している。
いくつかの実施形態において、一本鎖部分のヌクレオシド配列は、検出される特定のＲＮＡ分子の５’配列または３’配列に対して相補的であるように設計される。いくつかの実施形態において、その検出される特定のＲＮＡ分子は、少なくとも１つの第１アダプターの一本鎖部分および少なくとも１つの第２アダプターの一本鎖部分とハイブリダイズし、ライゲーション反応が生じ得る。特定の配列にハイブリダイズするために、いくつかの実施形態において、一本鎖部分の長さは、独立して、４〜６ヌクレオチド長である。そのような方法において、ＲＮＡ分子は、本明細書中の方法によって指向的に検出される。当業者は、検出されるＲＮＡ分子の５’配列または３’配列に対応する一本鎖部分を設計することができ、そして本明細書中に提供される検出方法を用いて、そのＲＮＡ分子に対応するセンス配列またはアンチセンス配列を検出することができる。
いくつかの実施形態において、一本鎖部分の配列は、縮重配列に対して相補性を有するサンプルのすべてのＲＮＡ分子がアダプターの一本鎖部分にアニールすることを可能にする縮重配列であるように設計される。いくつかの実施形態において、縮重一本鎖部分は、１〜８ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、縮重一本鎖部分は、４、６または８ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、縮重ヌクレオシド配列は、デオキシリボヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、第２または第４オリゴヌクレオチドの一本鎖部分の配列は、縮重配列であり、その第２または第４オリゴヌクレオチドの他の配列は、検出されるＲＮＡ分子に対応する配列である。
アニールまたはハイブリダイズ：用語「アニールする」および「ハイブリダイズする」（基語のハイブリダイズするおよびアニールするの変化形を含むがこれらに限定さない）は、交換可能に使用され、二重鎖、三重鎖または他のより高度に整列された構造の形成をもたらす、１つの核酸と別の核酸とのヌクレオチド塩基対形成相互作用を意味する。主要な相互作用は、典型的には、ヌクレオチド塩基特異的であり、例えば、ワトソン−クリックおよびフーグスティーンタイプの水素結合によるＡ：Ｔ、Ａ：ＵおよびＧ：Ｃである。ある特定の実施形態において、塩基スタッキングおよび疎水性相互作用もまた、二重鎖の安定性に寄与し得る。例えば、プライマーが相補的または実質的に相補的な配列にアニールする条件は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）およびＷｅｔｍｕｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９，１９６８に記載されているように、当該分野で周知である。通常、アニールが起きるか否かは、とりわけ、核酸の相補的な部分の長さ、ｐＨ、温度、一価および二価の陽イオンの存在、ハイブリダイズ領域におけるＧおよびＣヌクレオチドの割合、媒質の粘度、ならびに変性剤の存在によって影響される。そのような可変項目は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響する。核酸の相補的な部分におけるある特定のヌクレオチドアナログまたは副溝結合剤の存在もまた、ハイブリダイゼーション条件に影響し得る。したがって、好ましいアニール条件は、特定の適用方法に依存し得る。しかしながら、そのような条件は、過度の実験を行うことなく、当業者によって通例のとおり決定され得る。典型的には、アニール条件は、核酸が、相補的または実質的に相補的な配列と選択的にハイブリダイズするが、反応物中の他の配列に任意の有意な程度でハイブリダイズしないことを可能にするように選択される。
用語「選択的にハイブリダイズする」およびその変化形は、適当な条件下において、所与の配列が、相補的または実質的に相補的な一連のヌクレオチドを含む第２配列とアニールするが、望まれない配列にアニールしないことを意味する。この適用において、１つの配列が、別の配列と選択的にハイブリダイズするかまたはアニールするという記載は、それらの配列の両方の全体が、互いにハイブリダイズする状況およびその配列の一方または両方の一部だけが、他方の配列の全体または他方の配列の一部にハイブリダイズする状況を包含する。この定義の目的で、用語「配列」は、核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プライマー、標的特異的部分、増幅産物特異的部分、プライマー結合部位、ハイブリダイゼーションタグおよびハイブリダイゼーションタグ相補物を含む。
用語「対応する」とは、本明細書中で使用されるとき、その用語が関係するエレメント間の少なくとも１つの特異的な関係性のことを指す。例えば、第１アダプターの一本鎖５’部分は、その一本鎖部分にハイブリダイズする末端のヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子に対応する。第２アダプターの一本鎖３’部分は、その一本鎖部分にハイブリダイズする末端のヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子に対応する。さらなる例としては、プライマーが、対応する相補的または実質的に相補的な核酸のプライマー結合部分に結合する場合、特定の親和性タグが、対応する親和性タグに結合する場合（例えば、ストレプトアビジンに対するビオチンの結合であるがこれに限定されない）、および特定のハイブリダイゼーションタグが、その対応するハイブリダイゼーションタグ相補物とアニールする場合；などが挙げられる。
この適用において、１つの配列が、別の配列と、同じである、実質的に同じである、相補的である、または実質的に相補的であるという記載は、その両方の配列が、互いに完全に同じであるか、実質的に同じであるか、または相補的であるか、もしくは実質的に相補的である状況、およびそれらの配列の一方の一部分だけが、他方の配列の一部またはその全体と同じであるか、実質的に同じであるか、相補的であるか、または実質的に相補的である状況を包含する。この定義の目的で、用語「配列」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プライマー、連結産物、逆転写産物、増幅鋳型、増幅産物、プライマー結合部位、ハイブリダイゼーションタグおよびハイブリダイゼーションタグ相補物を含む。
用語「変性する」または「変性」とは、本明細書中で使用されるとき、二本鎖増幅産物または二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチドが、２つの一本鎖ポリヌクレオチドに変換される任意のプロセスのことを指す。二本鎖ポリヌクレオチドの変性としては、二重鎖を変性させることによって、その２つの一本鎖成分を放出させるための種々の熱的または化学的な技術が挙げられるが、これらに限定されない。使用される変性技術が、その後の増幅工程および／または検出工程を阻害しないか、またはかなり妨害しない限り、一般に限定されないことを当業者は認識するだろう。
ライゲーション：用語「連結する」またはその形態は、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドを使用する酵素的ライゲーションプロセスのことを指すために本明細書中で使用され、ここで、鋳型に隣接してハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの直接隣接した末端間に、ヌクレオチド間結合が形成される。その結合の形成は、二重鎖依存的および二重鎖特異的または鋳型依存的および鋳型特異的とも呼ばれる、二本鎖に依存的および特異的である。そのヌクレオチド間結合としては、３’−リボヌクレオシドと５’−リボヌクレオチドとの間または３’−リボヌクレオシドと５’−デオキシリボヌクレオシドとの間のホスホジエステル結合の形成が挙げられ得るが、これらに限定されない。用語「二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ」とは、本明細書中で使用されるとき、特に、オリゴヌクレオチドが鋳型分子に直接隣接してハイブリダイズされるときに、３’末端のリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドと５’ホスフェート基を有するオリゴヌクレオチドとの間のニックを優先的に塞ぐかまたは連結するＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドのことを指す。例えば、限定されないが、第１アダプターの第１オリゴヌクレオチドの３’末端と第１アダプターがアニールされるＲＮＡ分子との間のニックは、図２Ｂにおいてライゲーション接合点２４として模式的に示されている。
ある特定の実施形態において、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドは、バクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４Ｒｎｌ２）（Ｒｎｌ２の酵素的に活性な変異体またはバリアントを含むがこれらに限定されない）によって例証されるＲｎｌ２ファミリーリガーゼである。Ｔ４Ｒｎｌ２は、異なるヌクレオチジルトランスフェラーゼモチーフに起因して、リガーゼのＲｎｌ１ファミリーとは異なるＲＮＡリガーゼファミリーに対するプロトタイプリガーゼである（例えば、Ｈｏ ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９（２０）：１２７０９−１４（２００２）；およびＹｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１７６０１−０８（２００３）を参照のこと）。Ｔ４Ｒｎｌ２ファミリーは、とりわけ、ビブリオファージＫＶＰ４０Ｒｎｌ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（ＴｂＲＥＬ１およびＴｂＲＥＬ２）およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ（ＬｔＲＥＬ１およびＬｔＲＥＬ２）のＲＮＡ編集リガーゼ（ＲＥＬｓ）、ポックスウイルスＡｍＥＰＶ（エントモポックスウイルス）リガーゼ、バキュロウイルスＡｃＮＰＶリガーゼ、ならびにバキュロウイルスＸｃＧＶリガーゼを含む。いくつかの実施形態において、ＲＥＬリガーゼを用いるとき、第２および第４オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含み得、そしてある特定の実施形態において、第２および第４オリゴヌクレオチドの一本鎖部分は、リボヌクレオチドを含み得る。
Ｔ４Ｒｎｌ２リガーゼは、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から市販されているか、またはそのリガーゼは、Ｎａｎｄａｋｕｍａｒら、ＪＢＣ ２８０（２５）：２３４８４−２３４８９，２００５；Ｎａｎｄａｋｕｍａｒら、ＪＢＣ ２７９（３０）：３１３３７−３１３４７，２００４；およびＮａｎｄａｋｕｍａｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ１６：２１１−２２１，２００４に記載されているように単離され得る。Ｔ４Ｒｎｌ２酵素は、ファージＴ４の遺伝子ｇｐ２４．１によってコードされる。ある特定の実施形態において、リガーゼ活性を含むポリペプチドは、Ｔ４Ｒｎｌ２もしくはＲｎｌ２ファミリーのリガーゼの別のメンバー、またはその酵素的に活性な変異体またはバリアントを含む。
ある特定の実施形態において、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドは、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼ（ＤｒａＲｎｌ）（Ｒａｙｍｏｎｄら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５（３）：８３９−８４９，２００７）、またはＤｒａＲｎｌタイプのリガーゼ（真菌のＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ由来のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿３６７８４６、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＥ７６３９６、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ由来のアクセッション番号ＸＰ＿３８０７５８またはアメーバであるＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ由来のアクセッション番号ＥＡＬ６１７４４を有するリガーゼを含むがこれらに限定されない）である。いくつかの実施形態において、リガーゼは、上で言及したリガーゼ、またはその酵素的に活性な変異体もしくはバリアントのいずれかの組み合わせを含み得る。
ある特定の実施形態において、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドが、プレアデニル化（ｐｒｅａｄｅｎｙｌａｔｅｄ）され得るか、第３オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドが、プレアデニル化され得るか、または検出されるＲＮＡ分子の５’末端のヌクレオチドが、プレアデニル化され得るか、またはそれらの組み合わせである。Ｈｏら（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １２：３２７−３３９）は、Ｔ４Ｒｎｌ２のＣ末端ドメインが、３’−ＯＨと５’−ＰのＲＮＡ末端を塞ぐ際に機能するＴ４Ｒｎｌ２に対する機序を示している。Ｒｎｌ２タンパク質のＮ末端のセグメント（１〜２４９）は、自律的なアデニリルトランスフェラーゼ／Ａｐｐ−ＲＮＡリガーゼドメインとして機能すると報告されている。一般に、ＲＮＡリガーゼは、活性化された共有結合性の中間体が関与する一続きの３つのヌクレオチジル移行工程を介して、３’−ＯＨと５’−ＰＯ４のＲＮＡの末端を連結する。ＲＮＡリガーゼは、ＡＴＰと反応することにより、ピロホスフェートに加えて共有結合性のリガーゼ−ＡＭＰ中間体を形成する。次いで、ＡＭＰは、リガーゼ−アデニレートから５’−ＰＯ４ＲＮＡ末端に移行されることにより、ＲＮＡ−アデニレート中間体（ＡｐｐＲＮＡ）を形成する。次いで、リガーゼは、ＲＮＡ−アデニレート上のＲＮＡ ３’−ＯＨによる攻撃を触媒することにより、ホスホジエステル結合を介してその２つの末端を塞ぎ、そしてＡＭＰを放出する。ＲＮＡライゲーションに対する機序は、Ｎａｎｄａｋｕｍａｒら（同書２００５，２００４ａ，２００４ｂ）、Ｙｉｎら（ＪＢＣ ２７８：２０，１７６０１−１７６０８；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１９：１４１−１５１，２００４）、Ｈｏら［同書；ＰＮＡＳ，９９：２０，１２７０９−１２７１４，２００２）、Ｇｕｍｐｏｒｔら（Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ ２，Ｃｈｉｒｉｋｊｉａｎ，Ｊ．Ｇ．およびＰａｐａｓ，Ｔ．Ｓ．編、１９８１，３１３−３４５）およびＲａｙｍｏｎｄら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：３，８３９−８４９，２００７）によってさらに考察されている。プレアデニル化された物質（例えば、リガーゼ−アデニレート、ＲＮＡ−アデニレートまたはキメラＤＮＡ／ＲＮＡ−アデニレート）は、本教示のいくつかの実施形態における使用について企図されている。
ある特定の実施形態によると、第１アダプターの少なくとも１種、第２アダプターの少なくとも１種、ＲＮＡ分子の少なくとも１種、および二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドは、ライゲーション反応組成物中で混合される。１つのアダプターが、１つの反応において目的のＲＮＡ分子の一方の末端に連結され、次いで、別のアダプターが、第２の反応において同じ目的のＲＮＡ分子の反対側に連結されるかまたは組み込まれる（ここで、ゲル精製、リン酸化または逆転写の工程が介在することが多い）他の技術とは対照的に、本教示のアダプターの各々は、同じインキュベート期間中に、すなわち、同時またはほぼ同時に、同じ反応組成物において、対応するＲＮＡ分子と連結されることが認識されるべきである（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １５：１８８−２００，２００１；Ａｍｂｒｏｓ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６５：１３１−５８，２００４；Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．Ｓｕｐｐ．３８：Ｓ２−Ｓ７，２００６；Ｔａｋａｄａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４（１７）：ｅ１１５，２００６；Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：１８９−２０７，２００６；およびＴａｋａｄａ ａｎｄ Ｍａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２（１２）：３１３６−４５，２００７を参照のこと）。本教示に関して、ライゲーション反応組成物に成分を加える順序は、通常、重大ではなく、特に明確に述べられない限り、用語「ライゲーション反応組成物を形成する」または本明細書中で使用される類似の用語の範囲内に包含されると意図されることが理解されるべきである。したがって、一方のアダプター（例えば、第１アダプター）を、ＲＮＡ分子およびリガーゼを含む反応組成物に加えた後、続いて他方のアダプター（この例では、第２アダプター）をその反応組成物に連続的に加えることは、一方のアダプターの添加と他方のアダプターの添加の間にインキュベート工程が存在するか否かに関係なく、本教示の意図される範囲内である。
逆転写：いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子の検出は、連結産物を逆転写することにより、逆転写産物を形成することを含む。用語「逆転写する」および「逆転写」ならびにその形態は、本明細書中で使用されるとき、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ転写活性を有するポリペプチドを用いて、鋳型依存的様式で二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子にデオキシリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのアナログを連続的に触媒的に付加することに基づいて、連結産物から出発してそのハイブリッド分子を生成するプロセスのことを指す。本教示によると、第２アダプターの第４オリゴヌクレオチドは、ライゲーション産物を逆転写するためのプライマーとして働き得ることにより、逆転写産物を生成する。ゆえに、逆転写のための別個のプライマーの付加は、必要はない。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ転写活性を有するポリペプチドは、ＭＭＬＶ逆転写酵素（その酵素的に活性な変異体またはバリアントを含む）、例えば、限定されないが、ＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（Ａｍｂｉｏｎ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；または逆転写活性を含むが、対応する野生型の逆転写酵素と比べてＲＮＡｓｅＨ活性が低いポリペプチド（例えば、限定されないが、ＲＮａｓｅＨ−マイナスＨＩＶ−１逆転写酵素（Ｗｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（６）：４７９４−４８０５，１９９９）などの「ＲＮａｓｅＨマイナス」変異体）を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ転写活性は、ある特定の反応条件下において、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、限定されないが、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよびＣａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ）によって行われ得る。
リボヌクレアーゼＨ消化：いくつかの実施形態において、逆転写産物は、リボヌクレアーゼＨによって消化されることにより、リボヌクレオシドのうちの少なくとも一部が除去され、それにより増幅鋳型が形成される。用語「消化する」とは、特にリボヌクレアーゼに対する言及において、より小さい成分へのＲＮＡの触媒（例えば、限定されないが、本教示の増幅鋳型として働き得る一本鎖または実質的に一本鎖のｃＤＮＡ分子を生成するための、ＲＮａｓｅＨによる逆転写産物のＲＮＡ鎖の切断）のことを指す。
増幅：用語「増幅する」および「増幅」は、広い意味において使用され、典型的には鋳型依存的様式で、増幅鋳型の少なくとも一部、増幅産物の少なくとも一部、またはその両方が、再生成されるかまたは複製される、任意の技術（相補的なコピーの合成を含む）のことを指し、これには、線形または指数関数的に核酸配列を増幅するための広範な技術が含まれるがこれらに限定されない。増幅技術のいくつかの非限定的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、非同調性プライマーＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および非対称性ＰＣＲを含むがこれらに限定されない）、プライマー伸長、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、核酸鎖ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、転写など（それらの複合のバージョンまたは組み合わせを含む）が挙げられる。そのような技術に関する説明は、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，同書；Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ａｕｓｕｂｅｌら；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ，Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）；Ｍｓｕｉｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３４：５０１−０７（１９９６）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ，ＰＣＲ Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．，２０００（「ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ」）；Ｒａｐｌｅｙ，Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（２０００），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（「Ｒａｐｌｅｙ」）；米国特許第６，０２７，９９８号および同第６，５１１，８１０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３１２５６およびＷＯ０１／９２５７９；Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６４３−５０（１９９１）；Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｆａｖｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：５６１−６４（２０００）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３（７）：５４５−５０（２００６）；およびＲａｂｅｎａｕら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２８：９７−１０２（２０００）に見られる。
増幅は、熱サイクル反応工程（時折、サイクル反応工程または熱的サイクル反応工程と称される）を含み得るか、または等温的に行われ得る。ある特定の実施形態において、増幅工程は：プライマーを、増幅鋳型、増幅産物、またはそれらの相補物の相補的または実質的に相補的な配列とハイブリダイズさせる工程；ポリメラーゼを用いて鋳型依存的様式でヌクレオチドの鎖を合成する工程；および新たに形成された核酸二重鎖を変性することにより、鎖を分離する工程の連続的な工程の少なくとも１つのサイクル、典型的には、複数のサイクルを含む。そのサイクルは、要望どおりに繰り返されてもよいし、繰り返されなくてもよい。いくつかの実施形態において、増幅工程は、サーマルサイクラー（例えば、限定されないが、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、９６００、２７００または２４００サーマルサイクラー（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製））において増幅反応組成物をサイクル反応に供する工程を包含する。ある特定の実施形態において、新たに形成された核酸二重鎖は、最初に変性されずに、その後の１つ以上の工程において二本鎖の形態で使用され、いずれかの鎖または両方の鎖が、目的の対応するＲＮＡ分子に対する代用物として働き得るが、そうである必要はない。ある特定の実施形態において、一本鎖アンプリコンが生成される（例えば、限定されないが、非対称性ＰＣＲ、非同調性ＰＣＲまたは転写）。
プライマー伸長は、ポリメラーゼなどの伸長酵素を用いて、鋳型にアニールされたプライマーを５’＝＞３’方向で延長することにより、伸長産物を形成する工程（例えば、限定されないが、連結産物を逆転写する工程または増幅鋳型もしくは増幅産物を増幅する工程）を含む増幅技術である。ある特定の実施形態によると、適切な緩衝液、塩、ｐＨ、温度およびヌクレオチド三リン酸を用いるとき、ポリメラーゼは、アニールされたプライマーの３’末端から出発して、鋳型鎖に相補的なヌクレオチドを組み込むことにより、相補鎖を生成する。ある特定の実施形態において、プライマー伸長に使用されるポリメラーゼは、５’−エキソヌクレアーゼ活性を欠いているか、または実質的に欠いている。
いくつかの実施形態において、増幅鋳型を、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマー、およびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドと合わせ、増幅反応組成物が形成される。
用語「ＤＮＡポリメラーゼ」は、本明細書中で広い意味において使用され、鋳型依存的様式でデオキシリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのアナログを核酸ポリマーに付加すること（例えば、限定されないが、プライマー伸長反応中の、核酸鋳型にアニールされたプライマーの３’末端へのデオキシリボヌクレオチドの連続的な付加）を触媒することができる任意のポリペプチドのことを指す。典型的には、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素を含むＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの逆転写酵素は、ある特定の反応条件下においてＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、それらとしては、ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素が挙げられる。いくつかのＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼは、ある特定の反応条件下において逆転写酵素を有し、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼであるがこれに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼに関する説明は、とりわけ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｄ ｅｄ．，Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０００，特にＣｈａｐｔｅｒ２６および２９；Ｔｗｙｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５年５月までの増補を含む（本明細書中以後「Ａｕｓｕｂｅｌら」）；Ｌｉｎ ａｎｄ Ｊａｙｓｅｎａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１：１００−１１，１９９７；Ｐａｖｌｏｖら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２５３−６０，２００４；およびＥｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｇｕｉｄｅ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，１９９８，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩに見られる。明確に、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼという用語の意図される範囲内であるのは、様々な温度感受性特性を付与するように改変された酵素を含むその酵素的に活性な変異体またはバリアントである（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号；同第５，６７７，１５２号；および同第６，１８３，９９８号；ならびにＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄｅｍｉｄｏｖ ａｎｄ Ｂｒｏｕｄｅ，ｅｄｓ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，特にＣｈａｐｔｅｒ１．１を参照のこと）。
酵素の酵素的に活性な変異体またはバリアント：本教示の目的で、特定の酵素または酵素活性を含むポリペプチドが、記載されるかまたは特許請求されるとき、その酵素／ポリペプチドの酵素的に活性な変異体またはバリアントは、特に明確に述べられない限り、含められると意図される。限定としてではなく説明の目的で、用語「Ｒｎｌ２」または「Ｒｎｌ２リガーゼ」が、本明細書または添付の請求項において使用されるとき、天然に存在するかまたは野生型のＲｎｌ２リガーゼ、ならびにＲｎｌ２リガーゼのすべての酵素的に活性な変異体またはバリアントが、特に具体的に述べられない限り、含められると意図される。同様に、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼは、その酵素的に活性な変異体またはバリアントに対する等価物であると考えられる。用語「その酵素的に活性な変異体またはバリアント」とは、所望の酵素活性（例えば、連結、逆転写、消化、増幅またはそれらに見合ったもの）のうちの少なくとも一部を保持する対応する酵素から得られる１つ以上のポリペプチドのことを指す。この用語の範囲内であるのは、特に限定されないが、以下のものである：切断産物（例えば、限定されないが、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメントまたは対応する酵素よりも小さいサイズの組換え的に発現されたフラグメントおよび／もしくはポリペプチド）を含むがこれらに限定されない酵素的に活性なフラグメント；対応する酵素の変異型（天然に存在する変異体（例えば、「野生型」またはコンセンサスアミノ酸配列と異なるもの）、物理的および／または化学的な突然変異原を用いて生成された変異体、ならびに遺伝的に操作された変異体（例えば、限定されないが、ランダム突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発の技術）を含むがこれらに限定されない）；アミノ酸の挿入および欠失、切断型、ならびに核酸ナンセンス変異、ミスセンス変異およびフレームシフト変異に起因する変化（例えば、Ｓｒｉｓｋａｎｄａ ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６（２）：５２５−３１，１９９８；Ｏｄｅｌｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１７）：５０９０−５１００，２００３を参照のこと）；可逆的に改変されたヌクレアーゼ、リガーゼおよびポリメラーゼ（例えば、限定されないが、米国特許第５，７７３，２５８号に記載されているもの）；遺伝子シャフリング技術から得られる生物学的に活性なポリペプチド（例えば、米国特許第６，３１９，７１４号および同第６，１５９，６８８号を参照のこと）、スプライスバリアント、天然に存在するものと遺伝的に操作されたもの両方（但し、それらは１つ以上の対応する酵素に少なくとも部分的に由来する）；天然配列の１つ以上のアミノ酸への改変を含む１つ以上のそのような酵素に少なくとも部分的に対応するポリペプチド（そのような改変されたポリペプチドが、所望の触媒活性のうちの少なくとも一部を保持するという条件で、付加、除去またはグリコシル化の変更、ジスルフィド結合、ヒドロキシル側鎖およびホスフェート側鎖または架橋を含むがこれらに限定されない）；など。特定の酵素に対する言及において使用されるとき、明確に、用語「その酵素的に活性な変異体またはバリアント」の意味の範囲内であるのは、その酵素の酵素的に活性な変異体、その酵素の酵素的に活性なバリアント、またはその酵素の酵素的に活性な変異体およびその酵素の酵素的に活性なバリアントである。
当業者は、当該分野で公知の適切なアッセイを用いて酵素活性を容易に測定することができる。したがって、ポリメラーゼの触媒活性についての適切なアッセイは、例えば、バリアントが適切な条件下において、鋳型依存的様式でｒＮＴＰまたはｄＮＴＰを発生中のポリヌクレオチド鎖に組み込む能力を測定することを含み得る。同様に、リガーゼ触媒活性についての適切なアッセイは、例えば、本明細書中で開示される反応基などの適切な反応基を含む隣接してハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを連結する能力を含み得る。そのようなアッセイに対するプロトコルは、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（本明細書中以後「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ ３，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１），Ａｕｓｕｂｅｌら、およびＨｏｕｓｂｙ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：４２５９−６６，１９９８）ならびにＲｎｌ２リガーゼのファミリーについて以下で引用される参考文献に見られる。
増幅プライマー：用語「プライマー」とは、増幅鋳型、増幅産物またはその両方の、対応するプライマー結合部位に選択的にハイブリダイズし；そしてその対応するポリヌクレオチド鋳型に相補的な配列の合成をその３’末端から可能にする、ポリヌクレオチドのことを指す。「プライマー対」は、増幅産物の一方の鎖またはその相補物にアニールする順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。プライマー対は、ポリメラーゼ連鎖反応などのある特定の指数関数的な増幅技術において特に有用である。ある特定の実施形態において、プライマー対の順方向プライマーおよび対応する逆方向プライマーは、非同調性プライマーＰＣＲを可能にするために異なる融解温度（Ｔｍ）を有する。
本明細書中で使用されるとき、「順方向」および「逆方向」は、増幅鋳型または増幅産物などのポリヌクレオチド配列に対するプライマーの相対的な方向を示すために使用される。限定としてではなく説明の目的で、一本鎖ポリヌクレオチドは、その５’末端が左側で、水平の左から右の方向で描かれると考える。「逆方向」プライマーは、この例証となるポリヌクレオチドの「３’末端」またはその付近の下流のプライマー結合部位と、５’から３’方向に、すなわち右から左にアニールするように設計される。対応する「順方向」プライマーは、そのポリヌクレオチドの「５’末端」またはその付近の上流のプライマー結合部位の相補物と、５’から３’の「順方向」の方向に、すなわち左から右にアニールするように設計される。したがって、逆方向プライマーは、ポリヌクレオチドの「逆方向」または下流のプライマー結合部位に相補的な配列を含み、順方向プライマーは、順方向または上流のプライマー結合部位と同じ配列を含む。この段落において使用されるような用語「３末端」および「５’末端」は、単に例証であり、そのようなプライマー結合部位は、内部に位置し得るので、必ずしもそのポリヌクレオチドのそれぞれの末端のことを文字どおり指さないことが理解されるべきである。むしろ、この例示的なプライマー対の逆方向プライマーが、下流である逆方向プライマー結合部位または対応する順方向プライマーと同じ配列を含む順方向プライマー結合部位の右側とアニールすることは、単なる限定である。当業者によって認識されるように、これらの用語は、限定と意図されず、むしろ、所与の実施形態において例証となる方向を提供する。
プライマーは、アダプターオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列またはアダプターオリゴヌクレオチドに対応するヌクレオチド配列を含み得る。例えば、配列番号５を有する順方向プライマーは、配列番号１を有する第１オリゴヌクレオチドの配列を含む（Ｕの代わりにＴが用いられている）。プライマーとアダプター配列との関係性についてのいくつかの実施形態は、矢印が、順方向および逆方向ＰＣＲプライマーまたは順方向および逆方向ＳＹＢＲプライマーを様々に示している図１５の模式図によって理解され得る。Ｐ１およびＰ２は、プライマー部分のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「プライマー結合部位」とは、プライマーが、当該分野で公知の種々のプライマーヌクレオチド伸長反応のいずれか（例えば、ＰＣＲ）のためにアニールし得る鋳型として、直接またはその相補物によって働き得るポリヌクレオチド配列の領域のことを指す。２つのプライマー結合部位が、単一のポリヌクレオチド（例えば、限定されないが、第１伸長産物または第２伸長産物）上に存在するとき、通常、その２つのプライマー結合部位の方向は異なることが、当業者によって認識されるだろう。例えば、プライマー対の１つのプライマーが、第１プライマー結合部位に相補的であり、かつそれにハイブリダイズすることができつつ、そのプライマー対の対応するプライマーは、第２プライマー結合部位の相補物とハイブリダイズするように設計される。別の言い方をすれば、いくつかの実施形態において、第１プライマー結合部位は、センス方向であり得、そして第２プライマー結合部位は、アンチセンス方向であり得る。さらに、「ユニバーサル」プライマーおよびプライマー結合部位は、本明細書中で使用されるとき、通常、特定のアッセイおよび宿主ゲノムにおいてアッセイの特異性を保証するためにできるだけ独特であるように選択される。
いくつかの実施形態において、プライマーおよび／または増幅産物は、「プロモーター配列」を含み、その配列としては、適当なポリメラーゼ（例えば、限定されないが、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）を用いた転写の開始に適した配列が挙げられるが、これらに限定されない。本教示のいくつかの実施形態は、増幅産物にプロモーター配列を組み込む方法において「プロモーター−プライマー」を使用する。いくつかの実施形態において、プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼの結合に適した非常に多数の様々な配列を含み、その配列は、例えば、第１ＲＮＡポリメラーゼの結合に適した第１配列および第２ＲＮＡポリメラーゼの結合に適した第２配列であるが、これらに限定されない。プロモーター配列を含む増幅産物がある特定の増幅方法によって増幅されるとき、そのプロモーター配列の相補物は、相補的なアンプリコンにおいて合成され得ることを当業者は理解する。したがって、プロモーター配列の相補物は、本明細書中で使用されるとき、プロモーター配列という用語の意図される意味の範囲内に明確に含められることが理解されるべきである。開示される方法およびキットのいくつかの実施形態は、所望のプロモーター配列を増幅産物に組み込む方法において「プロモーター−プライマー」を使用する。
増幅産物が、ある特定の増幅方法によって増幅されるとき、プライマー結合部位の相補物は、相補的なアンプリコンにおいて合成されることを当業者は理解する。したがって、プライマー結合部位の相補物は、本明細書中で使用されるとき、プライマー結合部位という用語の意図される意味の範囲内に明確に含められることが理解されるべきである。
いくつかの実施形態において、本教示の増幅方法は、Ｑ−ＰＣＲ反応を含む。用語「定量的ＰＣＲ」、「リアルタイムＰＣＲ」または「Ｑ−ＰＣＲ」とは、特定の核酸配列に対するポリメラーゼ連鎖反応の結果を定量するために使用される種々の方法のことを指す。そのような方法は、通常、閾値サイクル（ＣＴ）の決定などの増幅因子を決定するかまたは比較する動力学ベースの系として、または通常、標的および標準的な鋳型の同時の増幅から生成される産物の量を比較する同時増幅方法として、典型的には分類される。多くのＱ−ＰＣＲ技術は、レポータープローブ、インターカレート剤またはその両方を含む。例えば、限定されないが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｉ−プローブ、分子ビーコン、Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ、スコーピオン（ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プライマー、ＬｕｘＴＭプライマー、ＦＲＥＴプライマー、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。いくつかの実施形態において、検出は、リアルタイム検出装置を含む。例示的なリアルタイム装置としては、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）；ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭＳｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）；Ｍｘ３０００ＰＴＭＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｘ３００５ＰＴＭＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＳｙｓｔｅｍおよびＭｘ４０００（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；ならびにＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ配給）が挙げられる。リアルタイム装置に関する説明は、とりわけ、それぞれの製造者のユーザーマニュアル；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ；ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄｅｍｉｄｏｖ ａｎｄ Ｂｒｏｕｄｅ，ｅｄｓ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４；および米国特許第６，８１４，９３４号に見られる。
ある特定の実施形態において、増幅反応は、多数の増幅を含み、ここで、多数の異なる増幅鋳型、多数の異なる増幅産物種またはその両方が、多数の異なるプライマー対を用いて同時に増幅される（例えば、Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：５０４−１１，１９９７；およびＲａｐｌｅｙ、特にＣｈａｐｔｅｒ７９を参照のこと）。開示される方法のある特定の実施形態は、シングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘ）増幅反応を含み、それには、平行して行われる多数のシングルプレックス増幅を含む増幅反応（例えば、限定されないが、ある特定のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｒｒａｙ配置（ここで、約１００ヌクレアーゼアッセイが、平行して行われることにより、特異的な増幅産物が存在するか否か、およびその量が決定される））が含まれるがこれに限定されない。
ある特定の実施形態において、増幅反応は、非対称性ＰＣＲを含む。ある特定の実施形態によると、非対称性ＰＣＲは、（ｉ）プライマー対の対応するプライマーに対して、１つのプライマーが過剰（例えば、限定されないが、５倍、１０倍または２０倍過剰）である少なくとも１つのプライマー対；（ｉｉ）順方向プライマーのみまたは逆方向プライマーのみを含む少なくとも１つのプライマー対；（ｉｉｉ）所与の増幅条件において、１つの鎖の増幅をもたらすプライマーおよび無能にされる対応するプライマーを含む少なくとも１つのプライマー対；または（ｉｖ）上記の（ｉ）と（ｉｉｉ）の両方の説明を満たす少なくとも１つのプライマー対を含む増幅組成物を含む。その結果として、増幅鋳型または増幅産物が増幅されるとき、その後の増幅産物の過剰な（その相補物に対して）１つの鎖が生成される。非対称性ＰＣＲに関する説明は、とりわけ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、特にＣｈａｐｔｅｒ ５；およびＲａｐｌｅｙ、特にＣｈａｐｔｅｒ６４に見られる。
ある特定の実施形態において、一方のプライマーの融解温度（Ｔｍ５０）が、他方のプライマーのＴｍ５０よりも高い、少なくとも１つのプライマー対が使用され得る（時折、非同調性プライマーＰＣＲと称される（Ａ−ＰＣＲ、例えば、米国特許第６，８８７，６６４号を参照のこと））。ある特定の実施形態において、順方向プライマーのＴｍ５０は、対応する逆方向プライマーのＴｍ５０と少なくとも４〜１５℃異なる。ある特定の実施形態において、順方向プライマーのＴｍ５０は、対応する逆方向プライマーのＴｍ５０と少なくとも８〜１５℃異なる。ある特定の実施形態において、順方向プライマーのＴｍ５０は、対応する逆方向プライマーのＴｍ５０と少なくとも１０〜１５℃異なる。ある特定の実施形態において、順方向プライマーのＴｍ５０は、対応する逆方向プライマーのＴｍ５０と少なくとも１０〜１２℃異なる。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのプライマー対において、順方向プライマーのＴｍ５０は、対応する逆方向プライマーのＴｍ５０と、少なくとも約４℃、少なくとも約８℃、少なくとも約１０℃または少なくとも約１２℃異なる。
ある特定の増幅の実施形態において、あるプライマー対のプライマーのＴｍ５０の相違に加えて、そのプライマー対における他方のプライマーに対して一方のプライマーが過剰でもある。ある特定の実施形態において、そのプライマー対における他方のプライマーに対して一方のプライマーが５〜２０倍過剰である。Ａ−ＰＣＲのある特定の実施形態において、プライマー濃度は、少なくとも５０ｎＭである。
ある特定の実施形態に従うＡ−ＰＣＲにおいて、増幅の第１サイクルにおいて従来のＰＣＲが使用され得、両方のプライマーがアニールし、そして二本鎖のアンプリコンの両方の鎖が増幅される。しかしながら、同じ増幅反応のその後のサイクルにおいて温度を上げることによって、より低いＴｍを有するプライマーが無能にされ得、一方の鎖だけが増幅される。したがって、より低いＴｍを有するプライマーが無能にされるＡ−ＰＣＲのその後のサイクルによって、非対称性増幅がもたらされる。その結果として、標的領域または増幅産物が増幅されるとき、その後の増幅産物の一方の鎖が過剰に（その相補物に対して）生成される。
Ａ−ＰＣＲのある特定の実施形態によると、増幅のレベルは、従来のＰＣＲサイクル反応の第１相におけるサイクルの回数を変更することによって制御され得る。そのような実施形態において、最初の従来のサイクルの回数を変更することにより、その後のより高い温度でのＰＣＲのサイクル（ここで、より低いＴｍを有するプライマーは無能になる）に供される二本鎖増幅産物の量が変動し得る。
ある特定の実施形態において、増幅は、インビトロ転写を含む。いくつかの実施形態において、第１アダプター、第２アダプター、第１プライマー、第２プライマーまたはそれらの組み合わせは、プロモーター配列またはその相補物、例えば、限定されないが、プロモーター−プライマーを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターを含む逆転写産物またはプロモーターを含む増幅産物は、リボヌクレオチド三リン酸、適切な緩衝液系および適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えば、限定されないが、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼと混合され、そして増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）が、公知の方法に従って生成される。そのａＲＮＡは、マイクロアレイまたはビーズアレイ解析などのアレイ解析のために使用され得、ここで、そのａＲＮＡ種の配列および量が、決定され得る。したがって、ある特定の実施形態において、そのようなａＲＮＡは、対応するＲＮＡ分子に対する代用物として働く。
増幅反応を最適化するある特定の方法は、当業者に公知である。例えば、ＰＣＲは、アニール、重合および変性に対する時間および温度を変更すること、ならびに反応組成物中の緩衝液、塩および他の試薬を変えることによって、最適化され得ることが知られている。最適化は、使用されるプライマーの設計によっても影響され得る。例えば、プライマーの長さ、ならびにＧ−Ｃ：Ａ−Ｔ比は、プライマーのアニールの効率を変化させ得、したがって、増幅反応が変化し得る。増幅の最適化に関する説明は、とりわけ、Ｊａｍｅｓ Ｇ．Ｗｅｔｍｕｒ，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．６０５−８，（Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ ｅｄ．，１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，特に、Ｃｈａｐｔｅｒ ４；Ｒａｐｌｅｙ；およびＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ，ｒｅｖ．９／０４，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩに見られる。
本教示に従った増幅産物の精製は、増幅の少なくとも１回のサイクル後の、少なくとも一部の連結されていないアダプター、連結されていないＲＮＡ分子、副産物、プライマー、酵素、またはライゲーション反応組成物、増幅反応組成物もしくはその両方の他の成分を除去する任意のプロセスを含む。そのようなプロセスとしては、分子量／サイズ排除プロセス、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィまたは透析、配列特異的ハイブリダイゼーションベースの取り出し方法、親和性捕捉技術、沈殿、吸着、ゲル電気泳動、従来のクローニング、コンカテマー化（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を用いる従来のクローニング、または他の核酸精製技術が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、増幅産物の精製は、ゲル電気泳動（ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）および／またはアガロースゲル電気泳動を含むがこれらに限定されない）を含む。ある特定の実施形態において、増幅産物は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ；時折、高圧液体クロマトグラフィとも称される）を用いて精製される。
検出：目的のＲＮＡ分子は、連結産物またはその代用物を検出することによって検出される。いくつかの実施形態において、連結産物は、上に記載されたように逆転写され、そして、その逆転写産物は、アレイ上に置かれ、当業者に公知の標準的な方法を用いて検出される。いくつかの実施形態において、逆転写産物は、ビオチンで標識され、検出は、それに対するストレプトアビジン結合を用いることによる。いくつかの実施形態において、逆転写産物は、ガラス繊維フィルター、ビーズを用いて精製されるか、またはゲル精製される。いくつかの実施形態において、逆転写産物は、リボヌクレアーゼ活性を含むペプチドと混合されることにより、消化反応組成物が形成され、そしてその逆転写産物からリボヌクレオシドのうちの少なくとも一部を消化するのに適した条件下でインキュベートされることにより、増幅鋳型が形成される。
用語「検出する」および「検出」は、本明細書中で広い意味において使用され、特定のＲＮＡ分子、すなわち、目的のＲＮＡ分子がサンプル中に存在するか否かを判定することができる任意の技術を包含する。いくつかの実施形態において、代用物の存在が、直接または間接的に検出され、それにより、対応するＲＮＡ分子の存在または非存在の判定が可能になる。例えば、代用物の存在が、増幅産物または連結産物を鋳型として用いて得られた、標識されたシークエンシング産物のファミリーを検出すること；または増幅産物にアニールされたヌクレアーゼレポータープローブがポリメラーゼによって切断されるときに発生される蛍光を検出することによって検出される（ここで、検出可能なシグナルまたは検出可能なシグナルの変化は、対応する増幅産物および／または連結産物が増幅されていること、例えば、対応するＲＮＡ分子がそのサンプル中に存在することを示す）。いくつかの実施形態において、検出は、検出可能なシグナルの定量（定量的ＰＣＲ（「Ｑ−ＰＣＲ」）などのリアルタイム検出方法を含むが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態において、検出は、鋳型として増幅産物を用いて生成されるシークエンシング産物またはシークエンシング産物のファミリーの配列の決定を含み；いくつかの実施形態において、そのような検出は、シークエンシング産物のファミリーの配列を得ることを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子の検出は、例えば、限定されないが、Ｑ−ＰＣＲ反応組成物中の、核酸色素を含む。連結産物、逆転写産物、増幅鋳型および増幅された配列の各々が、直接または間接的に生成されたＲＮＡ分子に対する代用物として働くこと、およびこれらの産物のいずれかを検出することによって、対応するＲＮＡ分子が直接または間接的に検出されることを当業者は理解するだろう。
用語「レポータープローブ」とは、対応するアンプリコン（例えば、限定されないが、ＰＣＲ産物）と特異的にアニールし、そして、放出される波長の強度の変化またはその波長の変化（を含むがこれらに限定されない）が検出されるとき、対応するアンプリコン、例えば、対応するＲＮＡ分子の同定、検出および／または定量に使用される、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの配列のことを指す。したがって、そのアンプリコンを間接的に検出することによって、対応するＲＮＡ分子がサンプル中に存在することが判定され得る。ほとんどのレポータープローブが、その作用様式に基づいて分類され得、例えば、限定されないが：ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを含むがこれに限定されないヌクレアーゼプローブ；スコーピオンプライマー、ＬｕｘＴＭプライマー、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒｓなどを含むがこれらに限定されない伸長プローブ；および、分子ビーコン、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）プローブ、ライトアッププローブ、別々に標識されたレポータープローブの対、ハイブリダイゼーションプローブ対などを含むがこれらに限定されないハイブリダイゼーションプローブである。ある特定の実施形態において、レポータープローブは、アミド結合、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ユニバーサル塩基またはそれらの組み合わせを含み、そしてステムループおよびステムレスレポータープローブ構造を含み得る。ある特定のレポータープローブは、別々に標識されるが、他のレポータープローブは、二重標識される。隣接してハイブリダイズされるプローブ間のＦＲＥＴを含む二重プローブシステムは、レポータープローブという用語の意図される範囲内である。ある特定の実施形態において、レポータープローブは、蛍光レポーター基およびクエンチャー（ダーククエンチャーおよび蛍光クエンチャーを含むがこれらに限定されない）を含む。レポータープローブのいくつかの非限定的な例としては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ；Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ（スコーピオンプライマーとも称される）；ＬｕｘＴＭプライマー；ＦＲＥＴプライマー；Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）プローブ；ＦＲＥＴベースの分子ビーコン、多色分子ビーコン、アプタマービーコン、ＰＮＡビーコンおよび抗体ビーコンを含むがこれらに限定されない分子ビーコン；標識されたＰＮＡクランプ、標識されたＰＮＡオープナー、標識されたＬＮＡプローブ、ならびにナノ結晶、金属性ナノ粒子および同様のハイブリッドプローブを含むプローブ（例えば、Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３６５−７０，２００１；Ｚｅｌｐｈａｔｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２８：３０４−１５，２０００を参照のこと）が挙げられる。ある特定の実施形態において、レポータープローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢ−ＮＦＱプローブ（両方ともＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を含むがこれらに限定されない副溝結合剤をさらに含む。ある特定の実施形態において、レポータープローブ検出は、蛍光偏光検出を含む（例えば、Ｓｉｍｅｏｎｏｖ ａｎｄ Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ９１，２００２を参照のこと）。
用語「レポーター基」は、本明細書中で広い意味において使用され、任意の識別可能なタグ、標識または部分のことを指す。レポーター基の多くの異なる種が、個別に、または１つ以上の異なるレポーター基と組み合わせて、本教示において使用され得ることを当業者は認識するだろう。ある特定の実施形態において、レポーター基は、蛍光、化学発光、生物発光、リン光、または電気化学的発光シグナルを放射する。レポーター基のいくつかの非限定的な例としては、フルオロフォア、放射性同位体、色素原、酵素、エピトープタグを含むがこれに限定されない抗原、量子ドットなどの半導体ナノ結晶、重金属、色素、リン光基、化学発光基、電気化学的検出部分、結合タンパク質、リン光体、希土類キレート、遷移金属キレート、近赤外色素、電気化学発光標識および質量分析計に適合性のレポーター基（例えば、質量タグ、電荷タグおよび同位体）（例えば、Ｈａｆｆ ａｎｄ Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３７４９−５０，１９９７；Ｘｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：３５９５−３６０２，１９９７；Ｓａｕｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ６３，２００３を参照のこと）が挙げられる。
レポーター基という用語は、マルチエレメントレポーターシステム（ビオチン：アビジン、抗体：抗原などの親和性タグなどを含むが、これらに限定されない）のエレメントも包含し、ここで、検出可能なシグナルに対する可能性をもたらすために、１つのエレメントが、そのシステムの１つ以上の他のエレメントと相互作用する。マルチエレメントレポーターシステムのいくつかの非限定的な例としては、ビオチンレポーター基を含むオリゴヌクレオチドおよびストレプトアビジン結合体化フルオロフォアまたはその逆；ＤＮＰレポーター基を含むオリゴヌクレオチドおよびフルオロフォア標識された抗ＤＮＰ抗体；などが挙げられる。レポーター基を核酸に付着させるための詳細なプロトコルは、とりわけ、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅら、ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２０００），２００５年４月までの増補を含む；およびＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，９ｔｈ ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，２００２に見られる。
マルチエレメント相互作用レポーター基（例えば、蛍光クエンチャーおよびダーククエンチャー（非蛍光クエンチャーとしても知られる）を含むがこれに限定されないフルオロフォア−クエンチャー対）もまた、レポーター基という用語の意図される範囲内である。蛍光クエンチャーは、フルオロフォアから放射される蛍光シグナルを吸収し得、そして十分な蛍光エネルギーを吸収した後、その蛍光クエンチャーは、特徴的な波長において蛍光を放射し得る（例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ））。例えば、限定されないが、ＦＡＭＴＭ−ＴＡＭＲＡＴＭ色素対は、ＦＡＭＴＭ色素に対する励起ピークである４９２ｎｍにおいて照射され得、ＴＡＭＲＡＴＭ色素に対する放射ピークである５８０ｎｍにおいて蛍光を放射し得る。蛍光レポーター基と適切に対形成されたダーククエンチャーは、フルオロフォアからの蛍光エネルギーを吸収するが、それ自体の蛍光を吸収しない。むしろ、ダーククエンチャーは、吸収されたエネルギーを、典型的には、熱として散逸する。ダーククエンチャーまたは非蛍光クエンチャーのいくつかの非限定的な例としては、Ｄａｂｃｙｌ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ、ＱＳＹ−７、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）非蛍光クエンチャー、金属クラスター（例えば、金ナノ粒子）などが挙げられる。フルオロフォア−クエンチャー対を含むある特定の二重標識されたプローブは、その対のメンバーが物理的に分離されるときに蛍光を放射し得、それらは、例えば、限定されないが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブなどのヌクレアーゼプローブである。フルオロフォア−クエンチャー対を含む他の二重標識されたプローブは、その対のメンバーが空間的に分離されるとき、蛍光を放射し得、それらは、例えば、限定されないが、分子ビーコンなどのハイブリダイゼーションプローブまたはＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭプライマーなどの伸長プローブである。フルオロフォア−クエンチャー対は、当該分野で周知であり、種々のレポータープローブに対して広く使用される（例えば、Ｙｅｕｎｇら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３６：２６６−７５，２００４；Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３６５−７０，２００１；およびＴｙａｇｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１１９１−９６，２０００を参照のこと）。
用語「核酸色素」とは、本明細書中で使用されるとき、二本鎖ポリヌクレオチドに特異的であるか、または一本鎖ポリヌクレオチドよりも二本鎖ポリヌクレオチドと会合されたときに実質的に強い蛍光シグナルを放射する蛍光性分子のことを指す。典型的には、核酸色素分子は、二本鎖セグメントの主溝もしくは副溝またはその両方において結合することによって、二本鎖セグメントの塩基対の間にインターカレートすることによって、ポリヌクレオチドの二本鎖セグメントと会合する。核酸色素の非限定的な例としては、エチジウムブロマイド、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ誘導体（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含むがこれらに限定されない）、ランタニドキレートを含むインターカレーター（例えば、限定されないが、２つの蛍光性の四座配位子型β−ジケトン−Ｅｕ３＋キレートを有するナフタレンジイミド誘導体（ＮＤＩ−（ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋）２）、例えば、Ｎｏｊｉｍａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｎｏ．１，１０５−０６（２００１）を参照のこと）、エチジウムブロマイド、およびある特定の非対称性のシアニン色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）およびＢＯＸＴＯ）が挙げられる。
ある特定の実施形態において、検出は、装置、すなわち、コンピュータアルゴリズムを備え得るが備える必要はない、自動化または半自動化された検出デバイスを用いることを含む。ある特定の実施形態において、検出装置は、グラフ、モニター、電子的スクリーン、磁気媒体、スキャナープリントアウトまたは他の２次元もしくは３次元的ディスプレイ上に伸長産物もしくはその代用物の観察もしくは測定されたパラメータの強度を図画的に表示するため、および／または観察もしくは測定されたパラメータを記録するための、デバイスを備えるか、またはそのデバイスに連結されている。ある特定の実施形態において、検出工程は、少なくとも１つの分離工程と組み合わされるか、または少なくとも１つの分離工程の続きであり、例えば、限定されないが、少なくとも１つの蛍光スキャナー、および図示するか、記録するか、または読み出す、少なくとも１つのコンポーネントを備えたキャピラリー電気泳動装置；吸光度モニターまたは蛍光スキャナーおよびグラフレコーダーと連結されたクロマトグラフィカラム；記録コンポーネントおよび／もしくは検出コンポーネントを備えた質量分析計と連結されたクロマトグラフィカラム；またはスキャナーもしくはＣＣＤカメラなどのデータ記録デバイスを有するマイクロアレイである。ある特定の実施形態において、検出工程は、増幅工程、例えば、限定されないが、Ｑ−ＰＣＲなどのリアルタイム解析と組み合わされる。検出工程を行うための例示的なシステムとしては、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ装置シリーズ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ装置シリーズ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ装置シリーズおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置シリーズ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）；ならびにマイクロアレイおよび関連ソフトウェア（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓマイクロアレイおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ１７００ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ならびに、とりわけ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｇｉｌｅｎｔから入手可能な、他の市販のマイクロアレイおよび解析システム（Ｇｅｒｒｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：２５１−６２，１９９９；Ｄｅ Ｂｅｌｌｉｓら、Ｍｉｎｅｒｖａ Ｂｉｏｔｅｃ １４：２４７−５２，２００２；およびＳｔｅａｒｓら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４０−４５（増補を含む），２００３もまた参照のこと）またはビーズアレイプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））が挙げられる。例示的なソフトウェアとしては、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒＴＭＳｏｆｔｗａｒｅ、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ ＳｏｆｔｗａｒｅおよびＧｅｎｏｔｙｐｅｒ（登録商標）ソフトウェア（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）が挙げられる。
ある特定の実施形態において、ＲＮＡ分子は、増幅産物および／または連結産物の少なくとも一部の質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて検出および定量され得る。例えば、いくつかの実施形態において、プライマーまたはアダプターは、質量分析適合性のレポーター基（増幅産物に組み込まれ、そして質量分析計での検出に使用され得る、質量タグ、電荷タグ、切断可能な部分または同位体が挙げられるが、これらに限定されない）（例えば、Ｈａｆｆ ａｎｄ Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３７４９−５０，１９９７；およびＳａｕｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ６３，２００３を参照のこと）を含む。増幅産物は、対応するＲＮＡ分子の存在または非存在の判定を可能にする質量分析によって検出され得る。いくつかの実施形態において、プライマーまたはアダプターは、制限酵素部位、切断可能な部分などを含むことにより、検出のための、増幅産物の一部の放出が容易になる。ある特定の実施形態において、多数の増幅産物は、液体クロマトグラフィまたはキャピラリー電気泳動によって分離され、ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩに供され、そして質量分析によって検出される。質量分析に関する説明は、とりわけ、Ｔｈｅ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｙ Ｓｉｕｚｄａｋ，ＭＣＣ Ｐｒｅｓｓ，２００３に見られる。
ある特定の実施形態において、レポータープローブまたはレポータープローブの切断された一部などの代用物は、直接または間接的に検出される。例えば、限定されないが、クエンチャー（ステムループビーコンおよびステムフリーのビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブもしくは他のヌクレアーゼプローブを含む分子ビーコン、ＬｉｇｈｔＳｐｅｅｄＴＭＰＮＡプローブまたはマイクロアレイ捕捉プローブを含むが、これらに限定されない）を含むレポータープローブへの増幅産物のハイブリダイズ。ある特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、分子ビーコンおよび増幅産物が、溶液中に存在しないときに生じ、そして検出可能なシグナルまたは異なって検出可能なシグナルが放射される。他の実施形態において、増幅産物は、マイクロアレイなどの固体表面にハイブリダイズするか、または結合され、そして検出可能なシグナルまたは異なって検出可能なシグナルが、放射される（例えば、ＥｖｉＡｒｒａｙｓＴＭおよびＥｖｉＰｒｏｂｅｓＴＭ，Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照のこと）。
ある特定の実施形態において、検出は、レポーター基の検出可能なシグナルまたはレポーター基の検出可能なシグナルの変化（典型的には、増幅産物の存在に起因する）の測定または定量を含む。限定としてではなく説明の目的で、ハイブリダイズしていないレポータープローブは、低レベルで放出し得るが、増幅産物にハイブリダイズするとき、定量的に増加する検出可能なシグナルを放射し得、そのレポータープローブとしては、ある特定の分子ビーコン、ＬＮＡプローブ、ＰＮＡプローブおよびライトアッププローブが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｖａｎｉｋら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５，２０００；Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ ａｎｄ Ｊｅｏｎｇ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７５：２４８−５３，１９９９；およびＳｉｍｅｏｎｏｖ ａｎｄ Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ９１，２００２を参照のこと）。ある特定の実施形態において、検出は、蛍光偏光の測定を含む。
いくつかの実施形態において、特定のＲＮＡ分子がサンプル中に存在するか否かの判定は、内標準もしくはコントロール配列（例えば、対応する標的領域のための検量線）、内部サイズ標準またはそれらの組み合わせの評価を含む。いくつかの実施形態において、レーン間、キャピラリー間および／またはアッセイ間のばらつきを説明するために、コントロール配列または内部参照色素が使用される。ある特定の実施形態において、増幅反応または検出技術を検証するために、内部コントロール配列は、平行して増幅される無関係の核酸を含む。
用いられる検出技術が通常は限定されないことを当業者は理解するだろう。むしろ、サンプル中のＲＮＡ分子の存在または非存在の判定を可能にするという条件で、多岐にわたる検出方法が、開示される方法およびキットの範囲内である。
いくつかの実施形態において、開示される方法およびキットは、マイクロフルイディクスデバイス、「ラボオンチップ（ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ）」またはマイクロトータル分析システム（μＴＡＳ）を含む。いくつかの実施形態において、サンプル調製は、マイクロフルイディクスデバイスを用いて行われる。いくつかの実施形態において、増幅反応は、マイクロフルイディクスデバイスを用いて行われる。いくつかの実施形態において、配列決定またはＱ−ＰＣＲ反応は、マイクロ流体デバイスを用いて行われる。いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも一部のヌクレオチド配列は、マイクロフルイディクスデバイスを用いて得られる。いくつかの実施形態において、検出は、マイクロ流体デバイス（ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含むが、これに限定されない）を含む。例示的なマイクロ流体デバイスに関する説明は、とりわけ、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ／０１８５３４１およびＷＯ０４／０１１６６６；Ｋａｒｔａｌｏｖ ａｎｄ Ｑｕａｋｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：２８７３−７９，２００４；およびＦｉｏｒｉｎｉ ａｎｄ Ｃｈｉｕ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３８：４２９−４６，２００５に見られる。
配列決定：いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも一部の配列が決定されることにより、目的のＲＮＡ分子が検出される。用語「配列決定」は、本明細書中で広い意味において使用され、ＲＮＡの少なくとも一部（伸長産物またはベクターインサートの少なくとも一部を含むがこれに限定されない）における少なくとも一部の連続したヌクレオチドの順序を同定することを可能にする当該分野で公知の任意の技術のことを指す。配列決定技術のいくつかの非限定的な例としては、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシターミネーター法ならびにＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの化学的切断方法（それらの方法の変法を含む）；ハイブリダイゼーションによる配列決定、例えば、限定されないが、マイクロアレイまたはビーズへの増幅産物のハイブリダイゼーション（例えば、ビーズアレイ）；ピロシークエンシング（例えば、Ｒｏｎａｇｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３６３−６５，１９９８を参照のこと）；および制限酵素マッピングが挙げられる。いくつかの配列決定方法は、キャピラリー電気泳動およびゲル電気泳動を含むがこれに限定されない電気泳動；質量分析；および単分子検出を含む。いくつかの実施形態において、配列決定は、直接的な配列決定、二重鎖配列決定、サイクル配列決定、一塩基伸長配列決定（ＳＢＥ）、固相配列決定、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列決定は、装置、例えば、限定されないが、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０、３１００、３１００−Ａｖａｎｔ、３７３０もしくは３７３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＤＮＡ ＡｎａｌｙｚｅｒまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＯＬｉＤＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ２０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）あるいは質量分析計を用いるシークエンシング産物の検出を含む。ある特定の実施形態において、配列決定は、エマルジョンＰＣＲ（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ３（７）：５４５−５０，２００６を参照のこと）を含む。ある特定の実施形態において、配列決定は、ハイスループット配列決定技術、例えば、限定されないが、大規模平行シグネチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）を含む。ＭＰＳＳに関する説明は、とりわけ、Ｚｈｏｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３３１：２８５−３１１，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．；Ｒｅｉｎａｒｔｚら、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１：９５−１０４，２００２；Ｊｏｎｇｅｎｅｅｌら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：１００７−１４，２００５に見られる。いくつかの実施形態において、配列決定は、増幅産物へのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰまたはそれらの組み合わせを含むがこれに限定されず、また、ｄＮＴＰのジデオキシリボヌクレオチドバージョンを含む）の組み込みを含む。
核酸分子の少なくとも一部の配列の決定に有用なさらに例示的な技術としては、エマルジョンベースのＰＣＲ、それに続く、任意の適当な大規模平行配列決定または他のハイスループット技術が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、増幅産物の少なくとも一部の配列を決定することによる対応するＲＮＡ分子の検出は、増幅産物の定量を含む。いくつかの実施形態において、配列決定は、例えば、「Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｆｏｒ Ｂｅａｄ−Ｂａｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と題されるＰＣＴ特許出願公報ＷＯ０６／０８４１３２および「Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｌ−Ｆｒｅｅ Ｂｅａｄ−Ｂａｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と題されるＷＯ０７／１２１４８９に記載されているようなＳＯＬｉＤＴＭＳｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行われる。いくつかの実施形態において、増幅産物の定量は、リアルタイムもしくはエンドポイント定量的ＰＣＲまたはその両方を含む。いくつかの実施形態において、増幅産物の定量は、検出されるＲＮＡ分子の発現プロファイル（例えば、ｍＲＮＡ発現プロファイルまたはｍｉＲＮＡ発現プロファイル）の生成を含む。ある特定の実施形態において、増幅産物の定量は、１つ以上の５’−ヌクレアーゼアッセイ、例えば、限定されないが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＡｓｓａｙおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（マイクロフルイディクスデバイス（低密度アレイを含むが、これらに限定されない）を含み得る）を含む。当該分野で公知の任意の適当な発現プロファイリング技術は、開示される方法の様々な実施形態において使用され得る。
用いられる配列決定方法が、典型的には、本方法に限定されないことを当業者は認識するだろう。むしろ、検出される対応する増幅産物もしくはＲＮＡの少なくとも一部または増幅産物から得られるベクターインサートの少なくとも一部の少なくとも一部の連続したヌクレオチドの順序を提供する任意の配列決定技術が、典型的には、本方法において使用され得る。配列決定技術に関する説明は、とりわけ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，特に、Ｃｈａｐｔｅｒ５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ；Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｓｉｕｚｄａｋ，Ｔｈｅ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＣＣ Ｐｒｅｓｓ，２００３，特にＣｈａｐｔｅｒ７；およびＲａｐｌｅｙに見られる。いくつかの実施形態において、組み込まれていないプライマーおよび／またはｄＮＴＰは、エキソヌクレアーゼＩおよびエビアルカリホスファターゼ消化、例えば、限定されないが、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（登録商標）試薬（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含むがこれに限定されない酵素的分解によって、配列決定工程の前に除去される。いくつかの実施形態において、組み込まれていないプライマー、ｄＮＴＰおよび／またはｄｄＮＴＰは、必要に応じて、ゲル精製もしくはカラム精製、沈降、濾過、ビーズ、磁気分離またはハイブリダイゼーションベースの取り出しによって除去される（例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤｕｐｌｅｘＴＭ３８４Ｗｅｌｌ Ｆ／Ｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ４３０８０８２を参照のこと）。
ある特定の実施形態において、用いられる配列決定／再配列決定技術の読み出し長は、効率的に検出され得るＲＮＡ分子のサイズが一因であり得ることを当業者は認識するだろう（例えば、Ｋｌｉｎｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（１２）：１４２５−２７を参照のこと）。いくつかの実施形態において、第１サンプル由来のＲＮＡ分子から生成された増幅産物は、第１識別配列（時折、本明細書中で「バーコード」と称される）または他のマーカーで標識され、第２サンプル由来のＲＮＡ分子から生成された増幅産物は、第２識別配列または第２マーカーで標識され、そして第１識別配列を含む増幅産物および第２識別配列を含む増幅産物は、対応するサンプル中の対応するＲＮＡ分子の配列を決定する前にプールされる。ある特定の実施形態において、３つ以上の異なるＲＮＡライブラリー（各々が、そのライブラリーに特異的な識別子配列を含む）が組み合わされる。いくつかの実施形態において、第１アダプター、第２アダプター、順方向プライマー、逆方向プライマーまたはそれらの組み合わせは、識別配列または識別配列の相補物を含む。ある特定の実施形態において、識別配列は、（ｉ）５’−ＡＡＧＣＣＣ、（ｉｉ）５’−ＣＡＣＡＣＣ、（ｉｉｉ）５’−ＣＣＣＣＴＴ、（ｉｖ）５’−ＣＡＴＣＧＧ、（ｖ）５−ＴＣＧＴＴＧ、（ｖｉ）５’−ＧＧＧＣＡＣ、（ｖｉｉ）５’−ＣＣＡＧＡＣ、（ｖｉｉｉ）５’−ＣＴＣＣＧＴ、（ｉｘ）５’−ＣＣＣＴＴＣ、（ｘ）５’−ＧＣＧＧＴＣ、またはこれらの配列（ｉ）〜（ｘ）のいずれか１つの相補物のうちの１つを含む。いくつかの実施形態において、逆方向プライマーは、実施例１１に記載されるような配列番号６または配列番号１５〜配列番号２３の配列を含む。
ライブラリー：本教示は、ＲＮＡ分子を検出するための組成物、方法およびキットを提供する。ある特定の実施形態によると、多数の異なる増幅産物種を含むライブラリーが生成され、ここで、増幅産物の少なくとも１種が、サンプル中に存在する低分子ＲＮＡの１つの種に対応する。
本教示のある特定の例証となる実施形態によると、例えば、多数の低分子ＲＮＡ種、多数のｍＲＮＡ種またはその両方を含むサンプルは、多数の異なる第１アダプター種、多数の異なる第２アダプター種、および二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドと混合されることにより、ライゲーション反応組成物が形成される。いくつかの実施形態において、そのｍＲＮＡは、断片化されているか、望まれない核酸種（例えば、限定されないが、ｒＲＮＡ、高コピー数ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を枯渇しているか、または枯渇かつ断片化されている。そのライゲーション反応組成物は、アダプター種のうちの少なくとも一部が、対応するＲＮＡ分子とハイブリダイズするのに適した条件下で、インキュベートされる。特に明確に述べられない限り、（ｉ）アダプター種を、ＲＮＡを含むサンプルと混合し、（ｉｉ）そのアダプターと対応するＲＮＡ分子とのアニールが可能となるようにインキュベートし、次いで、（ｉｉｉ）その反応組成物にリガーゼを加えるというプロセスが、ライゲーション反応組成物の形成およびインキュベートの意図される範囲内であることが理解されるべきである。
多数の異なるアダプター種は、典型的には、一方の末端に一本鎖縮重配列、ならびにある特定の実施形態において、他方の末端またはその付近に、増幅プライマーもしくはレポータープローブのため、サンプル同定のため（例えば、限定されないが、様々な出発物質から生成されたライブラリーをプールし、続いて、増幅されるライブラリーの供給源を同定すること）、および／またはその後に生成される増幅産物の配列決定のための結合部位として働き得る確定した配列、を有するＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドのセットを含む。ある特定の実施形態において、サンプルをＡｄａｐｔｏｒ Ｍｉｘ Ａとハイブリダイズすることによって、増幅産物内のＲＮＡ分子に対応する配列の５’末端から、ＳＯＬｉＤＴＭ配列決定に適した増幅産物が得られる。逆に、Ａｄａｐｔｏｒ Ｍｉｘ Ｂとのハイブリダイゼーションによって、ＳＯＬｉＤＴＭ配列決定に適した増幅産物が３’末端から得られる。次いで、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドが、その混合物に加えられることにより、ハイブリダイズされたアダプターがその低分子ＲＮＡ分子に連結される。
ライゲーション反応組成物は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼと混合され、そして連結産物は、逆転写されることにより、ｃＤＮＡが生成される。この逆転写産物は、ＲＮａｓｅＨと混合されることにより、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖から低分子ＲＮＡまたは断片化されたｍＲＮＡのうちの少なくとも一部が消化され、それによって増幅鋳型が生成される。連結されていないアダプターおよびアダプター副産物の濃度もまた、リボヌクレアーゼ消化プロセス中に低下されることを当業者は認識するだろう。この時点で、反応物は、サンプル中にＲＮＡ分子のｃＤＮＡコピーを含む。ある特定の配列決定技術に対する増幅産物のインプットの必要条件を満たすために、およびいくつかの実施形態において、増幅産物に識別子配列を付加するために、適切なプライマーセット（ここで、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマーまたはその両方が、１つ以上の識別子配列を含み得る）、およびサイクル数に対してプロットされるとき検出が線形の範囲であるＰＣＲ増幅サイクルの回数（約１２〜１５または約１２〜１８サイクルのＰＣＲ）を用いて、逆転写産物が増幅され得る。サイクル数を限定することによって、偽のＰＣＲ産物の合成が最小になり、そしてサンプルのＲＮＡプロファイルの完全性が保護されることを当業者は認識するだろう。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマーまたは少なくとも１つの順方向および少なくとも１つの逆方向プライマーは、１つ以上の識別子配列を含む。ある特定の実施形態は、逆方向プライマー種に特異的な３’（逆方向）プライマー上の６ｂｐの「バーコード」識別子配列を除いて同じヌクレオチド配列を有する１０セットのＰＣＲプライマーの使用を含む。
ある特定の実施形態において、増幅反応産物は、サイズ分離、例えば、限定されないが、ゲル電気泳動に供されることにより、増幅産物が所望のサイズ範囲に濃縮され、そしてＰＣＲ副産物が除去される。適切にサイズ選択された増幅産物は、エマルジョンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）工程におけるＳＯＬｉＤＴＭＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ワークフローにおいて使用され得、ここで、その増幅産物は、ビーズに付着され、ｅＰＣＲを用いてさらに増幅され、最終的に配列決定され、それにより、そのサンプル中の様々なＲＮＡ分子の存在、非存在および／または量の決定が可能になる。
ある特定の状況において、増幅産物および／または連結産物は、対応するＲＮＡ分子に対する代用物として働き得ること、およびその増幅産物、連結産物またはその両方を検出することによってＲＮＡ分子が間接的に検出されること、およびそのような検出は、本教示の範囲内であることを当業者は認識するだろう。
キット：ある特定の本方法を行うためのキットもまた開示される。ある特定のキット実施形態は、第１アダプター、第２アダプター、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチド、逆転写酵素、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーまたはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＲＮＡから５’ホスフェートを除去するための薬剤、例えば、限定されないが、タバコ酸性ピロホスファターゼをさらに備える。
本教示は、開示されるある特定の方法の実施を促進するように設計されたキットもまた提供する。キットは、開示されるある特定の方法を行うために必要な２つ以上の構成要素を集めることによって、その方法の実施を促進するように働き得る。ある特定の実施形態において、キットは、エンドユーザーによる測定の必要性を最小にするために予め測定された単位量で構成要素を備える。いくつかの実施形態において、キットは、開示される方法の１つ以上を行うための指示書を備える。いくつかの実施形態において、キットの構成要素は、互いと共に機能するように最適化される。
ある特定の実施形態において、キットは、少なくとも１つの第１アダプター種、少なくとも１つの第２アダプター種、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性とＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を含むＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない）、リボヌクレアーゼＨまたはそれらの組み合わせを備える。ある特定の実施形態において、リガーゼは、バクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）またはＲｎｌ２ファミリー由来のリガーゼを含む。いくつかの実施形態において、第１アダプター、第２アダプターまたは第１アダプターと第２アダプターの両方は、縮重配列を含む一本鎖部分を含む。
ある特定の実施形態において、キットは、複数の第１アダプター種（ここで、各第１アダプター種は、異なる縮重配列含む）、複数の第２アダプター種（ここで、各第２アダプター種は、異なる縮重配列を含む）、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、複数の異なる第１プライマー種、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅＨ（ＥＣ３．１．２６．４）を備える。いくつかの実施形態において、キットは、タバコ酸性ピロホスファターゼをさらに備える。
ある特定の実施形態において、キットは、複数の第１アダプター種（ここで、第１アダプター種のうちの少なくとも一部は、縮重配列を含む）、複数の第２アダプター種（ここで、第２アダプター種のうちの少なくとも一部は、縮重配列を含む）、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー種およびリボヌクレアーゼを備える。いくつかの実施形態において、キットのＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。さらに、キットは、タバコ酸性ピロホスファターゼを備え得る。
ある特定の実施形態において、キットは、順方向増幅プライマーおよび逆方向増幅プライマーをさらに備える。いくつかの実施形態において、順方向プライマー、逆方向プライマーまたは順方向プライマーと逆方向プライマーの両方は、ユニバーサルプライミング配列またはユニバーサルプライミング配列の相補物を含む。いくつかの実施形態において、キットは、順方向プライマー、逆方向プライマー、またはレポーター基をさらに含む順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかのそのような実施形態において、プライマー対の順方向プライマーのレポーター基は、そのプライマー対の逆方向プライマーのレポーター基と異なる。いくつかの実施形態において、キットは、レポータープローブ、核酸色素、レポーター基またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つをさらに備える。いくつかの実施形態において、キットは、コントロール配列、例えば、限定されないが、ハウスキーピング遺伝子などの内標準配列、または分子サイズ標準もしくは分子量標準を含むポリヌクレオチドラダーをさらに備える。
ある特定のキット実施形態において、第１アダプター、第２アダプター、順方向プライマー、逆方向プライマーまたはそれらの組み合わせは、識別配列または識別配列の相補物を含む。ある特定の実施形態において、識別配列は、（ｉ）５’−ＡＡＧＣＣＣ、（ｉｉ）５’−ＣＡＣＡＣＣ、（ｉｉｉ）５’−ＣＣＣＣＴＴ、（ｉｖ）５’−ＣＡＴＣＧＧ、（ｖ）５−ＴＣＧＴＴＧ、（ｖｉ）５’−ＧＧＧＣＡＣ、（ｖｉｉ）５’−ＣＣＡＧＡＣ、（ｖｉｉｉ）５’−ＣＴＣＣＧＴ、（ｉｘ）５’−ＣＣＣＴＴＣ、（ｘ）５’−ＧＣＧＧＴＣ、またはこれらの配列（ｉ）〜（ｘ）のいずれか１つの相補物のうちの１つを含む。いくつかの実施形態において、逆方向プライマーは、配列番号６および配列番号１５〜配列番号２３のうちの１つの配列を含む。いくつかのキット実施形態において、順方向プライマーと逆方向プライマーとの混合物が提供される。いくつかの実施形態において、キットは、複数のプライマー混合物、例えば、限定されないが、（ｉ）第１順方向プライマーおよび第１逆方向プライマーを含むプライマー混合物（ここで、第１逆方向プライマーは、第１識別配列を含む）；（ｉｉ）第１順方向プライマーおよび第２逆方向プライマーを含むプライマー混合物（ここで、第２逆方向プライマーは、第２識別配列を含む）；（ｉｉｉ）第１順方向プライマーおよび第３逆方向プライマーを含むプライマー混合物（ここで、第３逆方向プライマーは、第３識別配列を含む）；（ｉｖ）第１順方向プライマーおよび第４逆方向プライマーを含むプライマー混合物（ここで、第４逆方向プライマーは、第４識別配列を含む）；（ｖ）第１順方向プライマーおよび第５逆方向プライマーを含むプライマー混合物（ここで、第５逆方向プライマーは、第５識別配列を含む）；（ｖｉ）第１順方向プライマーおよび第６逆方向プライマーを含むプライマー混合物（ここで、第６逆方向プライマーは、第６識別配列を含む）；（ｖｉｉ）第１順方向プライマーおよび第７逆方向プライマーを含むプライマー混合物（ここで、第７逆方向プライマーは、第７識別配列を含む）；（ｖｉｉｉ）第１順方向プライマーおよび第８逆方向プライマーを含むプライマー混合物（ここで、第８逆方向プライマーは、第８識別配列を含む）；（ｉｘ）第１順方向プライマーおよび第９逆方向プライマーを含むプライマー混合物（ここで、第９逆方向プライマーは、第９識別配列を含む）；および（ｘ）第１順方向プライマーおよび第１０逆方向プライマーを含むプライマー混合物（ここで、第１０逆方向プライマーは、第１０識別配列を含む）のうちの少なくとも２つを提供する。
いくつかのキット実施形態は、少なくとも１つのアダプター混合物を含み、ここで、各アダプター混合物は、第１アダプターおよび第２アダプター；二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含む少なくとも１つのポリペプチド；逆転写酵素（ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ）；ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ）；リボヌクレアーゼ；デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物；および少なくとも１つの増幅プライマー混合物を含み、ここで、各増幅プライマー混合物は、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼは、ある特定の反応条件下においてＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、またはある特定の反応条件下においてＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、限定されないが、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよびＣａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ由来のＤＮＡポリメラーゼＩを含む。いくつかのキット実施形態において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（その酵素的に活性な変異体およびバリアントを含む）、例えば、限定されないが、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼおよびＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含む。いくつかの実施形態において、リボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を含む。いくつかのキット実施形態は、少なくとも１つのコントロールＲＮＡ分子、例えば、限定されないが、少なくとも１つのポジティブコントロールＲＮＡ分子、少なくとも１つのネガティブコントロールＲＮＡ分子またはその両方を含む。
固体支持体：ある特定の実施形態において、開示される方法およびキットは、固体支持体を含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、例えば、限定されないが、増幅産物を精製するためおよび／または解析するための、分離工程および／または検出工程において使用される。固体支持体の非限定的な例としては、アガロース、セファロース、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ガラス、メンブレン、シリカ、半導体材料、ケイ素、有機ポリマー；光学的に識別可能なマイクロシリンダー；トランスデューサーを備えたバイオセンサー；適切に処理またはコーティングされた反応容器および表面、例えば、限定されないが、微量遠心チューブまたは反応チューブ、マルチウェルマイクロプレートのウェルならびにガラス、石英またはプラスチックスライドおよび／もしくはカバーガラス；ならびにビーズ、例えば、限定されないが、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、ポリマービーズ、金属性ビーズ、色素含浸ビーズまたは色素標識ビーズ、コーティングされたビーズ、ガラスビーズ、ミクロスフェアおよびナノスフェアが挙げられる。任意の数の固体支持体が、開示される方法およびキットにおいて使用され得ること、および固体支持体の形状および組成は、通常限定されないことを当業者は認識するだろう。
上に記載してきた本教示は、実施例を参照することによって、よりよく理解され得る。以下の実施例は、説明するだけの目的のために意図されるものであり、本明細書中の教示の範囲を限定すると決して解釈してはならない。
（実施例１）
（二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼＲｎｌ２を用いた増幅産物の生成）
３つのＲＮＡサンプルの各々：
ヒト胎盤由来の全ＲＮＡ（１００μｇ，Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ７９５０）、
合成ｍｉＲＮＡ分子（ｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ ｖ．９．１、１００ｆｍｏｌ、Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ４３８８８９１、ｍｉＲＢａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ９．１におけるヒト、マウスおよびラットｍｉＲＮＡ配列の大部分に相当する合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドの等モルのプール）および
ｆｌａｓｈＰＡＧＥＴＭＦｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて５μｇの全ＲＮＡから精製された全ＲＮＡ（ヒト胎盤）
を３μＬのハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ）、および以下のとおりオリゴヌクレオチドを含む２μＬのアダプターオリゴ混合物と混合した：
３．１μＭ（５’−上側、すなわち、第１オリゴヌクレオチド）５’−ＣＣＵＣＵＣＵＡＵＧＧＧＣＡＧＵＣＧＧＵＧＡＵ−３’、配列番号１；
６．１μＭ（５’−下側、すなわち、第２オリゴヌクレオチド）５’−ＮＮＮＮＮＮＡＴＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣＣＣＡＴＡＧＡＧＡＧＧ−３’、配列番号２；
３．１μＭ（３’−上側、すなわち、第３オリゴヌクレオチド）５’−ＰＯ４−ＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＧＴＡＣＡＧＣＡＧ−３’、配列番号３；および
６．１μＭ（３’−下側、すなわち、第４オリゴヌクレオチド）５’−ＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＧＮＮＮＮＮＮ−３’；配列番号４）
ここで、「Ｎ」は、２５：２５：２５：２５という比で混合された縮重塩基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）を表す。
その凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ９９３７）に１００μＭという原液濃度に再懸濁し、しかるべく希釈した。そのＲＮＡ混合物を６５℃で１０分間加熱した後、１６℃で５分間加熱することにより、アダプターをサンプル中の低分子ＲＮＡにハイブリダイズさせた。
次いで、そのハイブリダイズしたＲＮＡ／アダプターを１０μＬのライゲーション緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭ ＡＴＰおよび４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８０００）と混合し、合計２０μＬにおいて２０単位のＴ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、１６℃において１６時間連結した。さらに、リガーゼ酵素の代わりにヌクレアーゼフリー水を用いて、全ＲＮＡサンプルに対してリガーゼ非含有コントロールを調製した。
その連結産物を、総体積４０μＬにおいて、２００単位のＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ２０４８）、４μＬの１０×ＲＴ緩衝液（ＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔＴＭ酵素とともに提供されるもの）および２μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ８２２８Ｇ）とともに４２℃において３０分間インキュベートすることによって逆転写した。その逆転写酵素の代わりにヌクレアーゼフリー水を用いて、全ＲＮＡサンプルに対してＲＴ非含有コントロールを含めた。
そのサンプルの１０μＬのアリコートを１０単位のＲＮａｓｅＨ（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ２２９２）とともに３７℃で３０分間インキュベートすることによって、過剰量のＲＮＡ副産物を除去し、そしてＲＮａｓｅ処理されたｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。その５０μＬのＰＣＲ反応物は、以下を含んでいた：
３８．５μＬのヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ９９３７）、
５μＬのＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）１０×ＰＣＲ緩衝液Ｉ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ Ｎ８０８０２４６）、
４μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ８２２８Ｇ）、
０．５μＬの５０μＭ順方向ＰＣＲプライマー：（５’−ＣＣＡＣＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴ−３’（配列番号５）、
０．５μＬの５０μＭ逆方向ＰＣＲプライマー：（５’−ＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＧ−３’）（配列番号６）、
１μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ Ｎ８０８０２４６）および
０．５μＬのｃＤＮＡサンプル。
ＰＣＲ条件は、以下のとおりだった：９５℃において５分間の最初の変性の後、９５℃３０秒（変性）、６２℃３０秒（アニーリング）および７２℃３０秒（伸長）を１５サイクル。続いて、７２℃において７分間、最後の伸長を行った。
１０μＬの各サンプルを、Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ８５４７）と１：１で混合し、全体積を１．０ｍｍの６％ポリアクリルアミドゲル上に充填し、１×ｔｒｉｓ−ホウ酸ＥＤＴＡ泳動緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ９８６３）中、１８０ボルト一定において約４５分間電気泳動した。そのゲルをカセットから取り出し、１×ＴＢＥ中において５分間、１×ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ／Ｎ Ｓ１１４９４）において染色した。そのゲルを、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ ＳＰ撮像装置を用いて撮像し、そしてその像を、ＡｌｐｈａＥａｓｅ（登録商標）ＦＣソフトウェアバージョン６．０．０を用いて処理した。
図５に見られるように、増幅されたライゲーション産物（増幅産物）は、括弧Ａによって示されており；矢印Ｂは、その増幅反応において増幅されたその反応の望まれない副産物を示しており；括弧Ｃは、増幅反応組成物中の連結されていない残留アダプターおよびプライマーを示している。
順方向ＰＣＲプライマー配列が、順方向プライマーのヌクレオチド１９から開始する、第１オリゴヌクレオチドの配列である配列番号１（ＵがＴに置き換わっている）を含むことに注意すること。また、逆方向プライマー配列が、逆方向プライマーのヌクレオチド３０から開始する第４オリゴヌクレオチドの配列である配列番号４（ＵがＴに置き換わっている）を含むことに注意すること。ゆえに、この構築物を用いるとき、検出される低分子ＲＮＡは、図５に見られるようなゲルフラグメントサイズと等しい長さ、例えば、プライマーの長さの合計よりも短い長さを有する。
（実施例２）
（様々な二本鎖特異的リガーゼを用いた増幅産物の生成）
ヒト胎盤由来の全ＲＮＡ（５００ｎｇ，Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ７９５０）を３μＬのハイブリダイゼーション溶液および２μＬのアダプターオリゴ混合物と混合し、実施例１におけるようにハイブリダイズさせた。次いで、そのハイブリダイズしたＲＮＡ／アダプターを１０μＬのライゲーション緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭ ＡＴＰおよび４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８０００）と混合し、１０単位のバクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ２、バクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ１（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ２１４０）、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ２１３４）またはＴ４ＲＮＡリガーゼＩとＴ４ＤＮＡリガーゼとの１：１混合物のいずれかを用いて、合計２０μＬ中、１６℃において１６時間連結した。さらに、そのリガーゼ酵素の代わりにヌクレアーゼフリー水を用いて、リガーゼ非含有コントロールを調製した。
その連結産物を、実施例１におけるように逆転写し、ＲＮａｓｅＨで処理し、増幅した。１０μＬの各サンプルを、Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ８５４７）と１：１で混合し、全体積を１．０ｍｍの６％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ／Ｎ ＥＣ６２６５ＢＯＸ）上に充填し、１×ｔｒｉｓ−ホウ酸ＥＤＴＡ泳動緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ Ｐ／Ｎ ＡＭ９８６３）中、１８０ボルト一定において約４５分間電気泳動した。そのゲルをカセットから取り出し、１×ＴＢＥ中において５分間、１×ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ／Ｎ Ｓ１１４９４）において染色した。そのゲルを、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ ＳＰ撮像装置を用いて撮像し、そしてその像を、ＡｌｐｈａＥａｓｅ（登録商標）ＦＣソフトウェアｖｅｒ．６．０．０を用いて処理した。バンドを、１０ｂｐＤＮＡラダー（１００ｎｇ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ／Ｎ１０８２１−０１５）と比較した。
図６に見られるように、増幅されたライゲーション産物（増幅産物）は、括弧Ａによって示されており；矢印Ｂは、増幅された反応物の望まれない副産物を示しており；括弧Ｃは、増幅反応組成物中の連結されていない残留アダプターおよびプライマーを示している。驚いたことに、リガーゼＲｎｌ２（レーン２）、リガーゼＲｎｌ１（レーン４）、リガーゼＤｎｌ（レーン６）またはＲｎｌ１とＤｎｌの両方の組み合わせ（レーン８）を用いて生成された増幅産物を比較すると、異なる増幅産物プロファイルが観察される。Ｒｎｌ２リガーゼを用いたときは、この例証となる実施形態において増幅ｍｉＲＮＡに対して予想されるサイズ範囲内である１１０塩基対（ｂｐ）〜１３０ｂｐのサイズ範囲（矢印Ａ）における増幅産物が観察されるが、Ｒｎｌ１またはＤｎｌを、単独または組み合わせて用いたときは、観察されない。さらに、約１００ｂｐの増幅産物の顕著なバンド（図６におけるＢの少し上に移動する）が、Ｒｎｌ１、Ｄｎｌまたはその両方に対応するすべてのレーン（逆転写酵素有りおよび無し）において出現しているが、このバンドは、Ｒｎｌ２を用いたときは観察されない。平行した反応において単独または組み合わせで２つの異なるリガーゼを用いて生成される増幅産物と比較して、Ｒｎｌ２を用いて生成される増幅産物におけるこの差は、驚くべきことであり、予想外のことである。
（実施例３）
（配列決定のためのバーコード増幅産物の生成）
低分子ＲＮＡは、全ＲＮＡ単離のための手順の後に、ｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＭ１５６０，Ａｍｂｉｏｎ）を製造者の取扱説明書に従って使用して、ＨｅＬａ細胞から得られる。
ライゲーション反応組成物を、以下のとおり調製した。ハイブリダイゼーション混合物を、各反応物について：２μＬのアダプター混合物（第１アダプターおよび第２アダプター）、３μＬの２×ハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、最終ｐＨ８．０）、ｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔからの１〜３μＬのＲＮＡ分子溶液（１０００ナノグラム（ｎｇ）のＲＮＡを含む）または１０００ｎｇのポジティブコントロール（ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）全ＲＮＡ：ヒト胎盤；ＡＭ７９５０，Ａｍｂｉｏｎ）、および０〜２μＬのヌクレアーゼフリー（ＮＦ）水（ＮＦ水の体積は合計８μＬ／反応物が得られるように調整される）ＲＮａｓｅフリーの０．２ｍＬ薄壁ＰＣＲチューブにおいて調製した。ハイブリダイゼーション混合物を含むチューブを、穏やかに混合し、そして６５℃１０分、次いで、１６℃５分にプログラムされたサーマルサイクラーに入れる。そのチューブを１６℃で維持し、そして各反応物について最終体積２０μＬになるように、熱サイクル反応に供した８μＬのハイブリダイゼーション混合物、１０μＬの２×ライゲーション緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ、４０％ＰＥＧ８０００，ｐＨ７．０）および２μＬのリガーゼ混合物（１０Ｕ／μＬのバクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）、２Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビタータンパク質）をこの順序で混合することによって、ライゲーション反応組成物を調製した。上下にピペッティングすることによってそのチューブを混合し、次いで、サーマルサイクラー内、１６℃において１６時間インキュベートした。典型的には、２時間のインキュベートが、第１アダプターおよび第２アダプターがＲＮＡ分子とアニールし、そしてライゲーションが生じることにより連結産物が生成されるのに十分な時間である（例えば、図３における３４を参照のこと）。
連結産物を含むチューブを氷上に置き、そして逆転写マスターミックス（ＲＴＭＭ）を以下のとおり調製した。連結産物の各チューブについて、１３μＬのＮＦ水、４μＬの１０×ＲＴ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、７５０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ、最終ｐＨ８．２５）、２μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物および１μＬのＲＴ酵素混合物（２００Ｕ／μＬのＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ）を混合することにより、ＲＴＭＭを形成した。２０μＬのＲＴＭＭを、３〜５回、上下にピペッティングすることによって混合しながら各連結産物チューブに加えた後、４２℃において３０分間インキュベートすることにより、逆転写産物を生成した（例えば、図３における３６を参照のこと）。このインキュベートの後、逆転写産物を含む溶液の１０μＬのアリコートを新しい０．２ｍＬのチューブに移し、それに１μＬのＲＮａｓｅＨ酵素（１０Ｕ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ）を加えた。そのチューブを穏やかに混合し、３７℃において３０分間インキュベートし、その間に、逆転写産物が消化され、増幅鋳型（例えば、図３における３８を参照のこと）が形成された。
３８．５μＬのＮＦ水、５μＬのＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ緩衝液Ｉ、１μＬのＰＣＲプライマー混合物（２５μＭ順方向プライマー、２５μＭ逆方向バーコードプライマー）、４μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物および１μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ；ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ）を含むＰＣＲマスターミックス（１増幅反応あたり合計４９．５μＬで行われる）を調製した。この例示的なＰＣＲプライマー混合物は、１つの順方向プライマーおよびバーコード逆方向プライマーを含む。
増幅産物を含む所与の溶液とともに使用するＰＣＲサイクルの適切な回数を決定するために、スモールスケール（すなわち、５０μＬ）のＰＣＲ反応が推奨される。４９．５μＬのこのＰＣＲマスターミックスを、増幅鋳型を含む０．５μＬの溶液と、ＲＮａｓｅフリーの０．２ｍＬ薄壁ＰＣＲチューブ内において混合することによって、スモールスケールの増幅反応組成物を調製した。その増幅反応組成物を、加熱された蓋を備えたサーマルサイクラーに置き、９５℃において５分間加熱し、次いで、９５℃３０秒−６２℃３０秒−７２℃３０秒のプロファイルを用いる１２〜１５サイクルのサイクル反応に供し；次いで、最終伸長工程を７２℃において７分間行う。増幅サイクルの最適な回数は、出発増幅反応組成物中の増幅産物の量に依存する。増幅産物を含む増幅反応組成物の５〜１０μＬのアリコートを、６％未変性ｔｒｉｓ−ホウ酸ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）アクリルアミドゲルを用いる電気泳動によって解析することにより、増幅サイクルの最適な回数を決定した。そのような決定の後、ラージスケールの増幅を行う。
配列決定および／または他の下流のプロセス用の十分な量の増幅産物を生成するために、よりラージスケールの増幅反応をＰＣＲによって行った。行われる各反応に対して、７７μＬのＮＦ水（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ９９２２）、１０×ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（または１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ Ｎ８０８０１６０）、２μＬのバーコードＰＣＲプライマー（順方向および対象のバーコード逆方向プライマーの混合物）、８μＬのｄＮＴＰ混合物および２μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ Ｎ８０８０１６０）を混合することによって、マスターミックスを調製した。このマスターミックスの９９μＬのアリコートおよび増幅鋳型を含む１μＬの溶液を、ＲＮａｓｅフリーのＰＣＲプレートの３つの別個のウェルにおいて混合することにより（すなわち、３つ組）、増幅反応組成物を形成した。そのＰＣＲプレートを９５℃において５分間加熱することにより、核酸を変性し、前述の温度プロファイル（９５℃３０秒−６２℃３０秒−７２℃３０秒）に従って、予め決定されたサイクル数のサイクル反応に供し、そして最後にそのＰＣＲ反応容器を７２℃において７分間維持することにより、その増幅反応組成物において増幅産物を生成した。その増幅産物をプールし、５〜１０μＬのプールされた増幅反応組成物を、前述のように６％未変性ＴＢＥアクリルアミドゲル上で電気泳動することによって解析した。
２５０（２５０）μＬのプールされた増幅産物を、ＲＮａｓｅフリーの１．５ｍＬポリプロピレン微量遠心チューブ内で２５０μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１，ｐＨ７．９）と混合し、ボルテックスすることによって混合した。そのチューブを、室温で１２，０００ｒｐｍにおいて５分間、卓上遠心機を用いて遠心した。水相を計量し、新しいＲＮａｓｅフリーの１．５ｍｌポリプロピレン微量遠心チューブに移し、そしてそのチューブに、等体積の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを、１／１００体積のグリコーゲン（またはＧｌｙｃｏＢｌｕｅＴＭＣｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ）および０．７体積のイソプロパノールとともに加えた。そのチューブの内容物を完全に混合し、室温において５分間インキュベートし、次いで、室温で１２，０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心した。得られた上清を取り出して廃棄し、ペレットを１ｍＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールで３回洗浄した。ペレットを風乾し、次いで、１８μＬのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、それに２μＬの１０×未変性ゲルローディング色素を加える。この懸濁液の１０μＬを、未変性ＴＢＥ ＰＡＧＥゲルの２ウェルの各々に加えた（そのゲルは、他のウェルの１つにマーカーとして１０塩基対（ｂｐ）分子量のラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１０８２１−０１５）を含む）。色素の前線が、そのゲルの下端から流出しそうになるまで（１．０ｍｍ、８ｃｍ×８ｃｍゲルの場合約３０分）、そのゲルにおいて増幅産物を約１４０Ｖで電気泳動する。そのゲルにおける核酸バンドを、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って使用して染色し、紫外光源を用いて照射した。約１００〜１５０ｂｐのサイズ範囲の核酸を得るために、清浄なかみそりの刃を用いて、そのゲルの増幅産物を含むレーンをスライスした。１００ｂｐにおける明確なバンドは、おそらく望まれない副産物であり、ゲルから切り取ったスライス内に含めなかった。同様に、ある特定の配列決定方法（例えば、限定されないが、ＳＯＬｉＤＴＭＳｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるエマルジョンＰＣＲ配列決定）を用いるときは、約２００ｂｐより大きい核酸も避けた。
２１ゲージの針を用いて、ＲＮａｓｅフリーの０．５ｍＬポリプロピレン微量遠心チューブの底に穴を開け、そして切り取ったゲル片をそのチューブに移す。次いで、この０．５ｍＬチューブをＲＮａｓｅフリーの１．５ｍＬポリプロピレン微量遠心チューブの内側に置き、そして１２，０００ｒｐｍにおいて３分間遠心することにより、ゲルを粉砕した。その０．５ｍＬチューブを取り出して廃棄し、そしてゲルフラグメントを含む外側の１．５ｍＬチューブを氷上に置く。２００（２００）μＬのＰＡＧＥ溶出緩衝液（１×ＴＥ緩衝液ｐＨ７．０中の１．５Ｍ酢酸アンモニウム）をチューブに加え、次いで、それを室温において２０分間インキュベートした。この第１インキュベートの後、上清を取り出し、ＲＮａｓｅフリーの清浄な１．５ｍＬポリプロピレン微量遠心チューブに移し、そしてさらなる２５０μｌのＰＡＧＥ溶出緩衝液をその第１チューブ（ゲルフラグメントを含む）に加え、３７℃においてさらに４０分間インキュベートした。第２インキュベートの後、第２上清を回収し、第１に加えた。残留していたゲル片を、製造者の指示書に従ってスピンカラム（Ａｍｂｉｏｎ Ｃａｔ＃１００６５）および遠心分離を用いて、プールされた上清から除去した。
得られた液体を、ＲＮａｓｅフリーの１．５ｍＬポリプロピレン微量遠心チューブ内で等体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１，ｐＨ７．９）と混合し、ボルテックスすることによって混合した。そのチューブを、卓上遠心機を用いて室温で１２，０００ｒｐｍにおいて５分間遠心した。水相を計量し、そしてＲＮａｓｅフリーの新しい１．５ｍｌポリプロピレン微量遠心チューブに移し、そしてそのチューブに、１／１００体積のグリコーゲン（ＡＭ９５１０，Ａｍｂｉｏｎ；またはＧｌｙｃｏＢｌｕｅＴＭＣｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ ＡＭ９５１５，Ａｍｂｉｏｎ）および０．７体積のイソプロパノールとともに等体積の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加えた。そのチューブの内容物を完全に混合し、室温において５分間インキュベートし、次いで、室温で１２，０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心した。生じた上清を取り出して廃棄し、ペレットを１ｍＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールで３回洗浄した。ペレットを風乾し、次いで、２０μＬのＮＦ水に再懸濁した。分光光度計を用いてＡ２６０を測定することによって、または上に記載されたように６％未変性ＰＡＧＥゲルにおいて解析することによって、増幅産物を含むＤＮＡを定量した。
増幅産物の配列を決定するために、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＯＬｉＤＴＭＳｙｓｔｅｍにおいてＵｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐ／Ｎ４３９１５７８；「Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ」）に従ってエマルジョンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）を行った。ＳＯＬｉＤＴＭＳｙｓｔｅｍにおける最大規模のｅＰＣＲにおいて最も良好な配列決定結果をもたらす増幅産物の濃度を評価するために、製造者の指示書に従って、０．２ｐｇ／μＬ、０．４ｐｇ／μＬ、０．６ｐｇ／μＬおよび０．８ｐｇ／μＬという増幅産物濃度において４つの別個のｅＰＣＲ反応を行った後、滴定／ＱＣランを行った（特に、Ｕｓｅｒ ＧｕｉｄｅのＣｈａｐｔｅｒ３および４を参照のこと）。最適な増幅産物濃度が決定したら、「最大規模」のｅＰＣＲ反応を行った（Ｕｓｅｒ ＧｕｉｄｅのＳｅｃｔｉｏｎ３．１，Ｃｈａｐｔｅｒ３を参照のこと）。増幅産物の少なくとも一部の配列を決定することによって、増幅産物が由来するＲＮＡ分子を直接または生物情報学的に同定することができ、それによって、そのＲＮＡ分子が検出される。そのような配列情報を用いることにより、新規ＲＮＡ分子（低分子ＲＮＡ発見を含むがこれに限定されない）が同定され得；そのような配列情報を用いることにより、別の検出されたＲＮＡ種の量に対して、出発サンプル中の１つの検出されるＲＮＡ分子種の量が定量され得、そしてそのような情報が、とりわけ、目的のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡ分子の発現プロファイリングに有用であり得ることを当業者は認識するだろう。
（実施例４）
（アダプターのオーバーハング長の評価）
アダプターの複雑性を最小限にしつつライゲーション効率を最大にするために、様々なオーバーハング長を有する第１および第２アダプターを合成し、評価した。
例示的な第１アダプターは、図７Ｂにおいて「Ｔ３」と示されている第１オリゴヌクレオチド（ここで、その第１オリゴヌクレオチドは、バクテリオファージＴ３由来のＤＮＡ配列および３’末端に２リボヌクレオチドを含んでいた）および図７Ｂにおいて「２７Ｎ」と示されている第２オリゴヌクレオチド（ここで、その第２オリゴヌクレオチドは、バクテリオファージＴ３由来の相補的なデオキシリボヌクレオチド配列および５’末端に４、６または８個の縮重デオキシリボヌクレオチド「Ｎ」のオーバーハングを含んでいた）を含んでいた。例証となる第１アダプターの上側の鎖（第１オリゴヌクレオチド）は、図７Ｂにおいて「Ｔ３」と示されているバクテリオファージＴ３プロモーター由来の２７ヌクレオチド配列５’−ＣＵＣＧＡＧＡＡＵＵＡＡＣＣＣＵＣＡＣＵＡＡＡＧＧＧＡ−３’（配列番号７）を含んでいた。下側の鎖（第２オリゴヌクレオチド）は、下側の鎖の５’末端に４、６または８個の縮重ヌクレオチド（図７Ｂにおいて説明の目的で「Ｎ」と示されている）を有する、図７Ｂにおいて説明の目的で「２７Ｎ」と示されている、上側の鎖の相補的配列５’−（Ｎ）４，６，８ＴＣＣＣＴＴＴＡＧＴＧＡＧＧＧＴＴＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号８（Ｎ＝８）；２または４個の５’−Ｎを欠く配列番号８（すなわち、Ｎは、６または４である））を含んでいた。
例示的な第２アダプターは、図７Ｂにおいて「Ｔ７」と示されている第３オリゴヌクレオチド（ここで、その第３オリゴヌクレオチドは、バクテリオファージＴ７由来のＤＮＡ配列を含んでいた）および図７Ｂにおいて「Ｎ２８」と示されている第４オリゴヌクレオチド（ここで、その第４オリゴヌクレオチドは、バクテリオファージＴ７由来の相補的なデオキシリボヌクレオチド配列および３’末端に４、６または８個の縮重デオキシリボヌクレオチド「Ｎ」のオーバーハングを含んでいた）を含んでいた。例証となる第２アダプターの上側の鎖（第３オリゴヌクレオチドは、５’ホスフェート基（ＰＯ４として示されている）を含む、図７Ｂにおいて「Ｔ７」と示されているバクテリオファージＴ７プロモーター由来の２８ヌクレオチド配列５’−ＰＯ４−ＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣ−３’（配列番号９）を含んでいた。下側の鎖（第４オリゴヌクレオチド）は、下側の鎖の３’末端に４、６または８個の縮重ヌクレオチド（図７Ｂにおいて説明の目的で「Ｎ」と示されている）を有する、図７Ｂにおいて説明の目的で「Ｎ２８」と示されている、上側の鎖の相補的配列５’−ＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ（Ｎ）４，６，８−３’（配列番号１０（Ｎ＝８）；２または４個の３’−Ｎを欠く配列番号１０（すなわち、Ｎは、６または４である））を含んでいた。
２μＬの水中の、５０ピコモル（ｐｍｏｌ）の「Ｔ３」第１アダプター（図７Ｂを参照のこと）、「Ｔ７」第２アダプター（図７Ｂを参照のこと）または、Ｔ３第１アダプターとＴ７第２アダプターの両方（両方が同じ数の縮重ヌクレオチドを有する）を、３μＬの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ）とともに９５℃において３分間インキュベートし、次いで、２２℃に冷却した。温度が２２℃に達したら、１μＬの０．１３μＭの５’３２Ｐ標識合成マイクロＲＮＡプール（ｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ ９．０、等モルの濃度のＳａｎｇｅｒ ｍｉＲＢａｓｅ９．０データベース（ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）由来の約５００個の合成ｍｉＲＮＡ配列のプール）を各反応チューブに加え、そのチューブを６５℃において１０分間インキュベートし、次いで、２２℃に冷却した。
次いで、反応混合物を１６℃において３０分間インキュベートし、次いで、１４μＬのライゲーション酵素混合物（０．５μＬのＲＮＡリガーゼ２（１０μＭ）、２μＬの１０×Ｒｎｌ２緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭジチオトレイトール、２０ｍＭ ＡＴＰ）、１μＬのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２６８２，４０Ｕ／μＬ）、１０μＬの４０％ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ２０２４５２）および０．５μＬのＲＮａｓｅフリー水）を各チューブに加えた。その反応混合物を、１６℃においてさらに１６時間インキュベートした。次いで、２０μＬのＧｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ８５４６Ｇ）を各反応物に加え、９５℃において５分間加熱した。３２Ｐ−標識産物を、１０％変性ＰＡＧＥによって分離し、そしてオートラジオグラフィによって可視化した。（ｉ）ＲＮＡリガーゼ２とアダプターの両方、または（ｉｉ）アダプターだけを欠くコントロール反応物が、図７Ａの最初の２レーンに示されている。図７Ａに示されるように、第１アダプターと第２アダプターの両方を含むライゲーション反応混合物に対応するゲルのレーンにおいて、相当量の二重ライゲーション産物（連結産物）（すなわち、Ｔ３−４＋Ｔ７−４；Ｔ３−６＋Ｔ７−６；およびＴ３−８＋Ｔ７−８）が観察された。ゆえに、４、６および８ヌクレオチドのアダプターオーバーハング長が、低分子ＲＮＡの検出をもたらす。
（実施例５）
（アダプター構造）
ｄｓＤＮＡ（５’（第１）アダプターの上側の鎖（第１オリゴヌクレオチド）上の２つの３’末端ＲＮＡ塩基を除く（例えば、図８ＢにおけるＴ３ｒ２：２７ ６ＮおよびＴ７：６Ｎ ２８（数字２７および２８は、それぞれ、実施例４におけるような第１および第３オリゴヌクレオチドの長さを指す）およびｄｓＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド（両方のアダプターに対する、上側（第１および第３オリゴヌクレオチドはＲＮＡである）−下側（第２および第４オリゴヌクレオチドはＤＮＡである）（例えば、図８ＢにおけるｒＴ３：２７ ６ＮおよびｒＴ７：６Ｎ２８）を含む、６−ヌクレオチド縮重オーバーハングを有する異なる構造の５’（第１）および３’（第２）アダプターを試験した。
図８Ｂのこの例証となる実施形態において、上部の第１アダプター（ｒＴ３：２７ ６Ｎ）は、すべてのヌクレオシドがリボヌクレオシドを含むＴ３配列（配列番号７）を含む上側の鎖（第１オリゴヌクレオチド）（相補的配列および下側の鎖の５’末端に６つの縮重ヌクレオチドを含む下側の鎖（第２オリゴヌクレオチド）（配列番号８、Ｎは６である）（説明の目的で「２７ ６Ｎ」と示されている）にアニールしている「ｒＴ３」と示されている）を含み；そして他の例証となる第１アダプター（Ｔ３ｒ２：２７ ６Ｎ）は、リボースを含む最も３’側の２つのヌクレオシドを除いて、すべてのヌクレオシドがデオキシリボヌクレオシドを含むＴ３配列を含む上側の鎖（２７ ６Ｎと示されている上部の第１アダプターと同じ下側の鎖（配列番号８、Ｎは６である）にアニールされている「Ｔ３ｒ２」と示されている）（３’末端に２つのリボヌクレオチドを有する配列番号７）を含む。
再度、図８Ｂを参照すると、上部の例証となる第２アダプター（ｒＴ７：６Ｎ ２８）は、説明の目的で「６Ｎ ２８」と示される下側の鎖（配列番号１０、Ｎは６である）の５’末端に６つの縮重ヌクレオチドを有する相補的配列を含む下側の鎖にアニールされている、説明の目的で「ｒＴ７」と示される、Ｔ７配列（配列番号９）を含む上側の鎖（第３オリゴヌクレオチド）（ここで、それらのヌクレオシドのすべてがリボヌクレオシドを含み、その配列は、５’ホスフェート基を含む）を含む。他の例証となる第２アダプター（Ｔ７：６Ｎ ２８）は、６Ｎ ２８と示されている上部の第２アダプターと同じ下側の鎖（配列番号１０、Ｎは６である）にアニールされている説明の目的で「Ｔ７」と示されるＴ７配列（配列番号９）を含む上側の鎖（ここで、それらのヌクレオシドのすべてが、デオキシリボヌクレオシドを含み、その配列は、５’ホスフェート基を含む）を含む。
２μＬの水中の、５０ｐｍｏｌの第１アダプター、第２アダプターまたは第１アダプターと第２アダプターの両方を、３μＬの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ）とともに９５℃において３分間インキュベートし、２２℃に冷却した。１（１）μＬの０．１３μＭ ５’３２Ｐ−標識ｍｉＲＮＡプール（上で言及したようなｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ）を各反応物に加え、次いで、６５℃において１０分間インキュベートし、２２℃に冷却した。
反応混合物を１６℃において３０分間インキュベートし、次いで、１４μＬのライゲーション酵素混合物（０．５μＬのＲＮＡリガーゼ２（１０μＭ）、２μＬの１０×Ｒｎｌ２緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭジチオトレイトール、２０ｍＭ ＡＴＰ）、１μＬのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２６８２，４０Ｕ／μＬ）、１０μＬの４０％ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ２０２４５２）および０．５μＬのＲＮａｓｅフリー水）を各チューブに加えた。その反応混合物を１６℃においてさらに１６時間インキュベートした。次いで、Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（２０μＬ，Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ８５４６Ｇ）を各反応物に加え、９５℃において５分間加熱した。３２Ｐ−標識された産物を１０％変性ＰＡＧＥによって分離し、そしてオートラジオグラフィによって可視化した。図８Ａに示されるように、ライゲーション反応混合物が、第１アダプターと第２アダプターの両方を含む（Ｔ３ｒ２−６＋Ｔ７−６；およびｒＴ３−６＋ｒＴ７−６）が、より多くの望まれない反応副産物（＊によって示されている）が、混合されたＴ３ｒ２−６＋Ｔ７−６アダプターと比べて、混合されたｒＴ３−６＋ｒＴ７−６アダプターにおいて見られるときにだけ、相当量の連結産物（矢印によって示されている）が観察される。
（実施例６）
（アダプターの組み合わせ）
第１アダプターと第２アダプターとの３つの異なる組み合わせを、二重ライゲーション効率について試験した。これらの組み合わせは、上側の鎖の両方ともがＤＮＡである（すなわち、第１および第３オリゴヌクレオチドは、第１オリゴヌクレオチドが２つの３’リボヌクレオチドを有することを除いて、ＤＮＡである）か、上側の鎖の両方とも（すなわち、第１および第３オリゴヌクレオチド）がＲＮＡであるか、または５’（第１）アダプター上の上側の鎖（すなわち、第１オリゴヌクレオチド）がＲＮＡであり、かつ３’（第２）アダプター上の上側の鎖（すなわち、第３オリゴヌクレオチド）がＤＮＡである、第１アダプターおよび第２アダプターを含んでいた（後者のアダプター構造の実施形態の概略図について図９Ｃを参照のこと）。１（１）μＬの各アダプター（各々５０μＭ）を混合し、そして３μＬの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ）と９５℃において３分間インキュベートし、そして２２℃に冷却した。１（１）μＬの０．１３μＭの５’３２Ｐ−標識合成ｍｉＲＮＡプール（上で言及したもの）を各５μＬの反応物に加え、次いで、その反応物を６５℃において１０分間インキュベートし、次いで、２２℃に冷却した。
次いで、反応混合物を１６℃において３０分間インキュベートした後、１４μＬのライゲーション酵素混合物を各チューブに加えた。０．５μＬのＲＮＡリガーゼ２（１０μＭ）、２μＬの１０×Ｒｎｌ２緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭジチオトレイトール、２０ｍＭ ＡＴＰ）、１μＬのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２６８２，４０Ｕ／μＬ）、１０μＬの４０％ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ２０２４５２）および０．５μＬのＲＮａｓｅフリー水を混合することによって、ライゲーション混合物を調製した。その反応混合物を１６℃においてさらに１６時間インキュベートした。次いで、２０（２０）μＬのＧｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ８５４６Ｇ）を各反応物に加え、９５℃において５分間加熱した。３２Ｐ−標識された産物を１０％変性ＰＡＧＥによって分離し、そしてオートラジオグラフィによって可視化した。図９Ａおよび図９Ｂは、連結産物の得られた電気泳動図を示している。上側の鎖がＤＮＡまたはＲＮＡであるアダプターは、二重に連結されて、図９Ａに示されるように「連結産物」を生成する。
リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）の消化有りおよび無しで、様々な比のアダプター（上側の鎖 対 下側の鎖、すなわち、第１オリゴヌクレオチド 対 第２オリゴヌクレオチドおよび第３オリゴヌクレオチド 対 第４オリゴヌクレオチド）を評価することにより、５’（第１）アダプターと３’（第２）アダプターとの間の直接的なライゲーションによって生成される望まれない副産物を最小限にしつつ二重ライゲーション産物が最大になった（図１０Ａにおける「連結されたアダプター」）。図１０Ａの表に示されるように様々な上側／下側の鎖の比を有するアダプターを、６μＬの反応混合物中において０．２または２ｐｍｏｌのｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ（上で言及したもの）および３μＬの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合した後、６５℃において１５分間インキュベートし、１６℃において４５分間インキュベートした。１μＬのＲＮＡリガーゼ２（１０μＭ）、１μＬのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２６８２，４０Ｕ／μＬ）、２μＬの１０×Ｒｎｌ２緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭジチオトレイトール、２０ｍＭ ＡＴＰ）および１０μＬの４０％ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ２０２４５２）を混合することによって、ライゲーション混合物を調製した。ライゲーション混合物（１４μＬ）を各チューブに加え、１６℃において１６時間インキュベートした。
１６時間のインキュベートの後、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ ＤＴＴを含む４μＬの１０×ＲＴ緩衝液を、２μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬのＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（２００Ｕ／μＬ、Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２０４８）、１μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ−ＩｎＴＭＲＮａｓｅインヒビター（２０Ｕ／μＬ、Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２６９４）および１２μＬのＲＮａｓｅフリー水と混合し、次いで、合計４０μＬのＲＴ混合物になるように、２０μＬのライゲーション反応物に加えた。その逆転写（ＲＴ）反応混合物を４２℃において３０分間インキュベートした。
図１０Ａ中のゲルにおいて示されるレーン１〜６のサンプルについて、以下のとおりＰＣＲを行った。そのＲＴ混合物からの１（１）μＬのサンプルを、１０μＬの１０×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２０５０）、１μＬのｄＮＴＰ（２５ｍＭ）、０．５μＬの５’プライマーおよび０．５μＬの３’プライマー（各５０μＭ）、１μＬのＳｕｐｅｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ，Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２０５０）ならびに８６μＬのＲＮａｓｅフリー水と混合した。９５℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃３０秒の２０サイクルを用いて、ＰＣＲを行った。５（５）μＬのＰＣＲ産物を、１０％未変性ＰＡＧＥゲルに充填し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１４９４）染色によって可視化した。
図１０Ａ中のゲルに示されるレーン７〜１２のサンプルについては、ＲＮａｓｅＨ消化反応を以下のとおり行った後、ＰＣＲを行った。５μＬのＲＴ反応物を清浄なチューブに移し、０．５μＬのリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ，１０Ｕ／μＬ，Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２２９２）と混合し、３７℃において３０分間インキュベートした。１（１）μＬのＲＮａｓｅＨ処理サンプルを、先に記載したのと同じ条件におけるＰＣＲ反応のために使用した。これらの増幅産物のすべて（ＲＮａｓｅＨ消化有りと無しの両方）を、図１０Ａに示されるように、１０％未変性ＰＡＧＥゲルに充填し、電気泳動し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１４９４）染色によって可視化した。
図１０Ｂに示されている表に示されるような様々な上側／下側の鎖の比を有するアダプターを、６μＬの反応混合物中において２ｐｍｏｌの合成ｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ（上で言及したもの）および３μＬの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合した後、６５℃において１５分間、そして１６℃において１時間インキュベートした。そのライゲーション、ＲＴおよびＲＮａｓｅＨ処理は、先に記載したように行った。１（１）μＬのＲＮａｓｅＨ処理サンプルを、前に記載したように２０サイクルの、ＳｕｐｅｒＴａｑＴＭポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２０５０）を用いるＰＣＲ増幅のために使用した。５μＬの各ＰＣＲ産物を、図１０Ｂに示されるように、１０％未変性ＰＡＧＥゲルに充填し、電気泳動し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１４９４）染色によって可視化した。１／５０、５／５０、１０／５０、２５／５０および５／１００という上側と下側の鎖のピコモル比を有するアダプターのすべてが、＞５０ｂｐに移動する所望の産物を生成するのに適格であった。対照的に、５／５００というアダプター比の使用は、所望の産物を効率的に生成しなかった。
（実施例７）
（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイと本方法の比較；ＲＮＡ含有量が変動するサンプル）
本実施例は、ＲＴ−ＰＣＲ ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイと比較した、本方法の定量的な確認を提供する。図１２は、５’ヌクレアーゼアッセイを用いて、ヒト胎盤ＲＮＡおよびヒト肺ＲＮＡから得られたｍｉＲＮＡの定量結果の相対的な倍率変化（ＦＣ）比較を示している散布図を示している（配列決定結果は、本教示のある特定の実施形態に従って得られる）。ｘ軸は、５’ヌクレアーゼアッセイ結果の−ΔΔＣＴのｌｏｇ２倍率変化（（本質的に製造者のプロトコルに従って行われる、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｒｒａｙ ｖ１．０（Ｐ／Ｎ４３８４７９２；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ用のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ（Ｐ／Ｎ４３８３４０３、４３８３４０２、４３８３４０１、４３８３３９９、４３８４７９１、４３８２８９８、４３８３４０５、４３８３４００および４３８３４０４；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて生成される）を示しており、ｙ軸は、本教示の実施形態に記載の配列決定データ（ＳＯＬｉＤＴＭＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を本質的に製造者のプロトコルに従って用いて生成される）のｌｏｇ２倍率変化を示している。３５より高いＣＴ値を生成したＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を陰性であると推定し、解析に含めなかった。ＳＯＬｉＤＴＭ配列決定データの場合、対応する配列が「観察された」と見なされるためには、少なくとも３つの配列タグからのデータが必要だった。このアプローチを用いて、０．８８というＲ値を得た。
本実施例は、いくつかのサンプルタイプが最小の低分子ＲＮＡを含むので、全ＲＮＡの投入量も提供する。本方法の１つの実施形態を、図に示される量のヒト胎盤（図１３Ａ）またはマウス肝臓（図１３Ｂ）由来の全ＲＮＡを用いて行った。通常、５’（第１）アダプターとして、２５ｐｍｏｌのＲＮＡの上側の鎖（第１オリゴヌクレオチド）、および５’末端にオーバーハングを形成する６つの縮重ＤＮＡヌクレオチドを有する５０ｐｍｏｌのＤＮＡの下側の鎖（第２オリゴヌクレオチド）、ならびに３’（第２）アダプターとして、２５ｐｍｏｌの５’−リン酸化されたＤＮＡの上側の鎖（第３オリゴヌクレオチド）、および３’末端にオーバーハングを形成する６つの縮重ＤＮＡヌクレオチドを有する５０ｐｍｏｌのＤＮＡの下側の鎖（第４オリゴヌクレオチド）を含むアダプター混合物Ａ（２μｌ）（ＳＯＬｉＤＴＭアダプター混合物Ａ）を、３μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２ｍＭ ＥＤＴＡ）および示される量を含む１μｌの全ＲＮＡとともに６５℃において１０分間、そして１６℃において５分間インキュベートした。
１μＬのＲＮＡリガーゼ２（１０μＭ）、１μｌのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２６８２、４０Ｕ／μＬ）、２μＬの１０×Ｒｎｌ２緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭジチオトレイトール、２０ｍＭ ＡＴＰ）および１０μＬの４０％ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ２０２４５２）を混合することによって、ライゲーション混合物を調製した。ライゲーション反応混合物を１６℃において１６時間インキュベートした。
１６時間のインキュベートの後、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ ＤＴＴを含む４μＬの１０×ＲＴ緩衝液を、２μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬのＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（２００Ｕ／μＬ，Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２０４８）および１３μＬのＲＮａｓｅフリー水と混合し、次いで、２０μＬのライゲーション反応組成物に加えた。その逆転写（ＲＴ）反応混合物を４２℃において３０分間インキュベートした。
次いで、５μＬのＲＴ反応物を清浄なチューブに移し、０．５μＬのリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ，１０Ｕ／μＬ，Ａｍｂｉｏｎ ＡＭ２２９２）と混合し、３７℃において３０分間インキュベートした。次いで、０．５μＬのＲＮａｓｅＨ処理サンプルを５μＬの１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｎ８０８０１７１）、４μＬのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）、０．５μＬの５’プライマーおよび０．５μＬの３’プライマー（各５０μＭ）、１μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｎ８０８０１７１）および３８．５μＬのＲＮａｓｅフリー水と混合した。９５℃３０秒、６２℃３０秒および７２℃３０秒の１６サイクルを用いてＰＣＲを行った。５（５）μＬのＰＣＲ産物を１０％未変性ＰＡＧＥゲルに充填し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１４９４）染色によって可視化した。図１３Ａによって示されるように、胎盤サンプルは、低分子ＲＮＡがかなり豊富であり、本明細書中に示される方法は、≦２５ｎｇの全ＲＮＡから低分子ＲＮＡ産物を生成することができることに注意すること。対照的に、図１３Ｂに示されるようなマウス肝臓サンプルは、比べると低分子ＲＮＡが非常に少なく、ゆえに、本教示のある特定の実施形態によると、そのようなサンプルを濃縮することによって、よりよい結果がもたらされ得る。
アダプター混合物Ａに対する配列は、実施例１の配列番号１〜配列番号４に対するものとおりである。
（実施例８）
（リアルタイムＰＣＲは、動的範囲の低分子ＲＮＡライブラリー構築を証明する）
５’−ＰＯ４を含む４つの合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド（スパイクインコントロール、ＳＩＣ；以下に示される配列）を、１０００倍の投入量範囲（１０００×混合物において１０００、１００、１０および１ｐｇ）にわたる様々な濃度で混合し、そしてその混合物を１×まで段階希釈した。混合物をバックグラウンドとして５００ｎｇの胎盤全ＲＮＡに加え（図１４、図１６Ａ）、ライゲーション反応組成物を１６℃において２時間（１６時間の代わりに）インキュベートしたことを除いて先に記載したように、ライゲーション反応を４つのサンプルに対して行った。
次いで、そのサンプルを、上に記載されたようにＲＮａｓｅＨで処理し、次いで、０．５μＬのＲＮａｓｅＨ処理サンプルを５μＬの１０×ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｎ８０８０１７１）、４μＬのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）、０．５μＬの５’プライマーおよび０．５μＬの３’プライマー（各５０μＭ）、１μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｎ８０８０１７１）および３８．５μＬのＲＮａｓｅフリー水と混合した。９５℃３０秒、６２℃３０秒および７２℃３０秒の１５サイクルを用いて、ＰＣＲを行った。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ ２８１０４）によるＰＣＲクリーンアップの後、サンプルを３０μＬの水に溶出し、さらに１：４００比で希釈した。次いで、２μＬの希釈サンプルを、１２．５μＬの２×ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０９１５５）、１μｌのプライマー混合物（各１μＭ）および９．５μＬの水と混合した（図１５に模式的に示されている）。９５℃１０分間、９５℃１５秒および６８℃１分の後、９５℃１５秒、６０℃１分および９５℃１５秒の４０サイクルを用いて、ＡＢＩ７５００Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３５１１０４）においてリアルタイムＰＣＲを行った。
各標的配列に対するサイクル閾値（Ｃｔｓ）（図１６Ａ，ｙ軸：平均Ｃｔ）を、４つのサンプルインプット（ｘ軸：ｌｏｇ（混合物濃度）１０００×から１×、図１６Ａ）であるｌｏｇ１０値に対してプロットした。図１６Ｂに見られるように、バックグラウンドＲＮＡにおける２つの内在性ｍｉＲＮＡコントロール配列（ｍｉＲ−１６およびｍｉＲ−２１）に対するＣｔは、サンプル間にわたってかなり一定であった。
「スパイクインコントロール」（ＳＩＣ）としてこの実施例において使用された４つの合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドは：（１）ＳＩＣ８：５’−ＰｈｏｓＧＣＧＡＡＵＵＡＡＵＧＡＡＡＧＵＧＧＧＣＡ（配列番号１１；図１６Ａにおいて三角を用いて示されるデータ）；（２）ＳＩＣ３４：５’−ＰｈｏｓＡＣＣＣＧＡＣＡＵＵＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＵ（配列番号１２；図１６Ａにおいて丸を用いて示されるデータ）；（３）ＳＩＣ３６：５’−ＰｈｏｓＣＵＣＡＣＡＵＵＵＣＧＧＡＡＣＵＧＡＵＧＣ（配列番号１３；図１６Ａにおいて菱形を用いて示されるデータ）；および（４）ＳＩＣ３７：５’−ＰｈｏｓＡＣＧＧＡＣＣＵＣＧＡＡＣＵＵＣＡＣＣＣＡ（配列番号１４；図１６Ａにおいて四角を用いて示されるデータ）だった。ゆえに、スパイクインコントロールアッセイは、少なくとも１０００倍にわたる動的範囲において低分子ＲＮＡを検出する本方法の能力を証明する。
（実施例９）
（１工程ＲＴ−ＰＣＲ）
本実施例は、増幅鋳型および増幅産物を生成するための例示的な方法を提供し、ここで、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼが、逆転写反応組成物に存在する。
ライゲーション反応の後、適切な緩衝液、ｄＮＴＰ、ＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼおよび順方向と逆方向ＰＣＲプライマーの両方を含む混合物をライゲーション反応物に直接加え、上下に穏やかに数回（３〜４×）ピペッティングすることによって混合した。次いで、その反応混合物を、サーマルサイクラー内で４２℃において３０分間インキュベートすることにより、逆転写を可能にし、増幅鋳型を生成した。次いで、ＲＮａｓｅＨを反応混合物に加え、サーマルサイクラー内で３７℃において３０分間インキュベートした。次いで、反応温度を９５℃まで上げ、そして５分間保持した後、標準的な増幅サイクル、すなわち、実施例１に記載されているように６２℃３０秒および７２℃３０秒を行うことにより、増幅産物を生成した。
（実施例１０）
（１つのＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅鋳型および増幅産物の生成）
ライゲーション反応の後、適切な緩衝液（最適化された濃度のマンガンとマグネシウムの両方を含む）、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を含むＤＮＡポリメラーゼ、および順方向と逆方向ＰＣＲプライマーの両方を含む混合物をライゲーション反応組成物に加え、そして上下に穏やかに数回（３〜４×）ピペッティングすることによって混合して、逆転写組成物を形成する。その逆転写組成物をサーマルサイクラー内で４２℃において３０分間インキュベートすることにより、逆転写酵素活性を可能にして増幅鋳型を生成する。次いで、その反応混合物にＲＮａｓｅＨを加え、サーマルサイクラー内で３７℃において３０分間インキュベートする。次いで、反応温度を９５℃まで上げ、５分間保持した後、標準的な増幅サイクル、すなわち、実施例１に記載されているように６２℃３０秒および７２℃３０秒を行うことにより、増幅産物を生成する。
（実施例１１）
（低分子ＲＮＡライブラリーを生成するための例示的な方法）
本実施例は、図１７に示されるような低分子ＲＮＡライブラリーを生成するための例示的な方法を提供する。目的のＲＮＡ分子が、低分子ＲＮＡであるとき、出発物質は、低分子ＲＮＡ画分を含むべきである。ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ（登録商標）で調製された全ＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ｍｉＲＮＡおよび他の低分子ＲＮＡを含むと確証されている。あるいは、サンプルの低分子ＲＮＡ画分を含む全ＲＮＡは、全ＲＮＡを単離するための手順の後に、ｍｉｒＶａｎａＴＭｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＫｉｔまたはｍｉｒＶａｎａＴＭＰＡＲＩＳＴＭＫｉｔを、ユーザーマニュアルに従って使用することにより、得てもよい。
ＲＮＡサンプルの低分子ＲＮＡ含有量は、その起源およびＲＮＡ単離方法に基づいて大きく変動し得るので、反応において全ＲＮＡを使用するか、サイズ選択されたＲＮＡを使用するかを判定するためのサンプルの低分子ＲＮＡ含有量の評価（例えば、限定されないが、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｃｈｉｐを備えたＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いる）が、望ましいことがある。
０．５％より多い低分子ＲＮＡ（約１０〜４０ｎｔのサイズ範囲内）を含む全ＲＮＡサンプルは、サイズ選択することなく使用され得る。全ＲＮＡがその手順において使用されるとき、得られる反応産物は、ＰＡＧＥ精製された低分子ＲＮＡサンプルから生成された反応産物よりも大きいサイズ範囲である。さらに、全ＲＮＡサンプルからのＳＯＬｉＤＴＭ配列決定結果は、典型的には、わずかに多いｒＲＮＡおよびｔＲＮＡの読み出しを含む。
０．５％未満の低分子ＲＮＡ含有量を含むＲＮＡサンプルは、約１８〜４０ｎｔのＲＮＡ画分について、例えば、限定されないが、ＰＡＧＥおよび溶出、ｆｌａｓｈＰＡＧＥＴＭＦｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒおよびｆｌａｓｈＰＡＧＥＴＭＲｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、濃縮されるべきである。
様々なサンプルタイプ中の低分子ＲＮＡの相対量は、実施例７に記載されたように大きく変動する。例えば、組織サンプル由来のＲＮＡは、典型的には、低分子ＲＮＡの豊富に有するのに対し、培養細胞株由来のＲＮＡは、非常に少ない低分子ＲＮＡを有することが多い。
推奨される投入ＲＮＡ量としては：
ＲＮＡ供給源 量
組織から単離された全ＲＮＡ １０〜５００ｎｇ
培養細胞から単離された全ＲＮＡ １００〜５００ｎｇ
ＰＡＧＥを用いてサイズ選択された低分子ＲＮＡ １〜２００ｎｇ
コントロールＲＮＡ（ヒト胎盤全ＲＮＡ） １００ｎｇ
が挙げられる。
ハイブリダイゼーションおよびライゲーション：ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを以下のとおり行う。アダプター混合物Ａを、例えば、低分子ＲＮＡの５’末端からのＳＯＬｉＤＴＭ配列決定のために設計し、アダプター混合物Ｂを、３’末端からのＳＯＬｉＤＴＭ配列決定のために設計する。サンプル中の低分子ＲＮＡを５’と３’末端の両方から配列決定するために、２つのライゲーションを設定し、１つを各アダプター混合物と共に用いる。各アダプター混合物は、第１、第２、第３および第４オリゴヌクレオチドを含む。アダプター混合物Ｂは、アダプター混合物Ａに対して逆相補方向であり、その結果、増幅産物の各鎖が検出され得る。氷上において、ハイブリダイゼーション混合物を、以下のとおり０．２ｍＬＰＣＲチューブ内で調製する。
ハイブリダイゼーション混合物（８μＬの総体積）
量 成分
２μＬ アダプター混合物ＡまたはＢ
３μＬ ハイブリダイゼーション溶液
１〜３μＬ ＲＮＡサンプル（１〜５００ｎｇ）
８μＬとなるように ヌクレアーゼフリー水 。
その内容物を、穏やかに数回上下にピペッティングすることによって十分に混合し、次いで、軽く遠心することにより、チューブの底に溶液を集めた。その反応物を、加熱された蓋を備え、以下のとおりプログラムされたサーマルサイクラー内に置いた。
アダプターハイブリダイゼーションのインキュベート
温度 時間
６５℃ １０分
１６℃ 保持 。
そのサンプルを１６℃において５分間インキュベートした。その反応物を１６℃に維持しつつ、ＲＮＡライゲーション試薬を、示される順序で各サンプルに加える。
ライゲーション反応混合物（２０μＬの最終体積）
量 成分（示される順序で加える）
１０μＬ ２×ライゲーション緩衝液
２μＬ ライゲーション酵素混合物 。
その混合物を、１６℃に設定されたサーマルサイクラー内で１６時間インキュベートした。一般に、２時間のインキュベートが、ライゲーションにとって十分であるが、しかしながら、一晩のインキュベートが、わずかに多い量の連結産物をもたらす。
逆転写およびＲＮａｓｅＨ消化：上記サンプルを氷上に置き、以下の試薬を混合することによって、逆転写（ＲＴ）マスターミックスを氷上で調製した。ピペッティング誤差を補うために、余分な５〜１０％の体積をそのマスターミックスに含めた。
ＲＴマスターミックス（１サンプルあたり２０μＬ）
量 成分
１３μＬ ヌクレアーゼフリー水
４μＬ １０×ＲＴ緩衝液
２μＬ ｄＮＴＰ
１μＬ ＡｒｒａｙＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素
２０μＬ １反応あたりの総体積 。
ＲＴマスターミックス（２０μＬ）を各サンプルに加え、そのサンプルを穏やかにボルテックスすることにより、完全に混合し、そして軽く微量遠心することにより、混合物をチューブの底に集めた。次いで、そのサンプルを４２℃において３０分間インキュベートすることにより、ｃＤＮＡを合成した。
そのｃＤＮＡを−２０Ｃにおいて数週間、長期間貯蔵のために−８０℃において保存し得るか、または直ちにＲＮａｓｅＨ消化（次）に使用し得る。
ＲＮａｓｅＨインキュベートを以下のとおり行った。ある体積（１０μＬ）のＲＴ反応混合物を前の工程（ｃＤＮＡ）から新しいチューブに移した。ＲＮａｓｅＨ（１μＬ）を加えた。その混合物を穏やかにボルテックスすることによって混合し、軽く微量遠心することによって、その混合物をチューブの底に集め、そして３７℃において３０分間インキュベートした。
ＲＮａｓｅＨ処理の後、サンプルを−２０℃において一晩保存し得るか、または直ちにＰＣＲに使用し得る。
低分子ＲＮＡライブラリーの増幅：パイロットＰＣＲおよびラージスケールＰＣＲ：異なるサンプルタイプが、実質的に異なる量の低分子ＲＮＡを含み得るので、ＳＯＬｉＤＴＭ配列決定のために十分なＤＮＡを得るために必要なＰＣＲサイクル数も変動する。５０μＬの試験的ＰＣＲを行うことにより、所与のサンプルタイプに必要なＰＣＲサイクル数を決定した後、３つ以上の複製物の１００μＬの反応物（ラージスケールＰＣＲ）のセットを用いて、ＳＯＬｉＤＴＭ配列決定サンプル調製の次の工程のための鋳型の合成に進んだ。
ほとんどのサンプルが、１２〜１５サイクルで増幅されるはずである。パイロット実験の場合、比較的多い量の低分子ＲＮＡを含む出発物質からのサンプル（すなわち、約２００〜５００ｎｇの組織由来の全ＲＮＡまたは約５０〜２００ｎｇのサイズ選択された低分子ＲＮＡ）に対して、１２ＰＣＲサイクルが推奨され、比較的少ない低分子ＲＮＡを含むサンプル（すなわち、組織由来の約１〜２００ｎｇの全ＲＮＡもしくは培養細胞由来の約１００〜５００ｎｇの全ＲＮＡ、またはサイズ選択された１〜５０ｎｇの低分子ＲＮＡに対しては１５サイクルが推奨される。
低分子ＲＮＡ ＰＣＲプライマーセット：ＳＯＬｉＤＴＭ配列決定鋳型の合成のための１０個の異なるＰＣＲプライマーセットは、ＳＯＬｉＤＴＭＳｍａｌｌ ＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともに提供される。そのプライマーセットは、プライマーの中央付近に位置する６ｂｐのバーコードを除いて同一である。そのＰＣＲプライマーのこのバーコードの特徴によって、多重サンプルの配列決定および解析が可能になる。すなわち、単一のＳＯＬｉＤＴＭシークエンシング反応物中において最大１０個の異なるサンプル（供給されるＳＯＬｉＤＴＭＳｍａｌｌ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔｓの各々を用いて増幅される）を配列決定することができる。いずれのプライマーセットも使用することができるが、サンプルは、この時点で混合されない。
例示的なＰＣＲプライマーとしては、以下に示される順方向プライマーおよびバーコード逆方向プライマーが挙げられるが、これらに限定されない（個別のバーコード配列に下線が付されている）。
Figure 2011509660
 １つの５０μＬの試験的ＰＣＲまたは１００μＬのラージスケールＰＣＲのために以下のとおり試薬を混合することによって、ＰＣＲマスターミックスを氷上で調製した。
Figure 2011509660
 その混合物を穏やかにボルテックスすることにより、完全に混合し、そして軽く微量遠心することにより、混合物をチューブの底に集めた（いったん、そのサンプルタイプに対する適切なＰＣＲサイクル数が決定されたら、３つ以上の複製のラージスケールＰＣＲを各サンプルについて行う。反応産物をプールすることにより、ゲル精製およびその後のＳＯＬｉＤＴＭ配列決定サンプル調製のための材料を十分生成する）。
１つの反応のためのＰＣＲマスターミックスを、ＰＣＲプレートのウェルまたは０．２ｍＬ ＰＣＲチューブにピペットを用いて入れた。試験的ＰＣＲ（５０μＬ）については、ＰＣＲマスターミックスの各アリコートに０．５μＬのＲＮａｓｅＨ処理ｃＤＮＡを加えた。ラージスケールＰＣＲ（１００μＬ）については、ＰＣＲマスターミックスの各アリコートに１μＬのＲＮａｓｅＨ処理ｃＤＮＡを加えた。反応が阻害され得るので、５０μＬのＰＣＲにおける１μＬ超のｃＤＮＡは推奨されない。
加熱された蓋を備えたサーマルサイクラー内にサンプルを置き、以下に示される熱的プロファイルを行った。
ＰＣＲサイクル条件
Figure 2011509660
 ＰＣＲ産物（５〜１０μＬ）を未変性６％ポリアクリルアミドゲルにおいて泳動し、そのゲルを製造者の指示書に従ってＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色する。
図５は、適切なＰＣＲサイクル数を用いて増幅された反応の結果を示している。結果は、実施例１において述べられており、本明細書中では説明のために一般化されている。
低分子ＲＮＡから得られた増幅産物は、約１０８〜１３０ｂｐに移動する（プライマーの全長は、約８９ｂｐであるので、約１９〜４１ｂｐのＲＮＡが、前述の範囲内で移動する）。
約１５０および２００ｂｐにおけるより大きい分子量バンドが、インプットとして全ＲＮＡを用いる反応から予想されるのに対し、これらのより大きい産物は、サイズ選択された低分子ＲＮＡをインプットとして用いる反応からは予想されないことに注意すること（図５を参照のこと）。
セルフ連結したアダプターおよびその増幅産物は、８９ｂｐのバンドを形成する。このバンドは、典型的には、すべての反応に存在する。さらなる副産物が、約１００ｂｐに移動する。不十分に増幅されたサンプルは、約１０８〜１３０ｂｐのサイズ範囲において非常に少ない材料を示す。逆に、過剰に増幅されたサンプルは、典型的には、約１４０〜１５０ｂｐより大きい反応産物のスメアに加えて、約１０８〜１３０ｂｐのサイズ範囲にかなりの量を示す。全ＲＮＡインプットから過剰に増幅されたサンプルは、連鎖状のＰＣＲ産物を表すより大きい分子量ラダーのバンドも有し得る。
増幅された低分子ＲＮＡライブラリーの精製：次いで、低分子ＲＮＡから得られたＰＣＲ産物を、以下のとおり、ゲルから切り出し、アクリルアミドから溶出し、精製し、そして濃縮した。ＤＮＡ二重鎖が、アニールしたままであり、かつその後のゲル精製中にそのサイズに従って移動するように、この精製のいずれの工程でもサンプルを加熱しなかった。
等体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１，ｐＨ７．９）を各サンプルに加えた。サンプルをボルテックスすることにより混合し、次いで、室温において５分間、１３，０００×ｇで遠心した。水（上）相を、新しい１．５ｍＬチューブに移し、移す際に体積を計量した。等体積の５Ｍ酢酸アンモニウムを各サンプルに加えた。ある量（１／１００体積）のグリコーゲンおよび０．７体積イソプロパノールを加えた（酢酸アンモニウムを加えた後のサンプルの体積をベースラインとして使用する）。その混合物を完全に混合し、室温において５分間インキュベートし、室温において２０分間、１３，０００×ｇで遠心した。その上清を慎重に取り出し、廃棄した。ＤＮＡペレットを、各回１ｍＬの７０％エタノールで３回洗浄し、約１５分間または目に見えるエタノールの液滴が蒸発するまで、風乾させた。
ＰＡＧＥゲル、例えば、０．７５ｍｍの未変性ＴＢＥ、６％ポリアクリルアミドゲルを調製した。そのゲルのサイズは重要ではない；ミニゲル（約６０〜１００ｃｍ２）が典型的には、最も簡便である。使用する数時間以内に室内で成形されたゲルのほうが、購入されるプレキャストゲルよりも良好な分解能を提供する。ＰＡＧＥ溶出緩衝液も調製する。例えば、１０ｍＬの溶出緩衝液の場合、５ｍＬのＴＥ緩衝液ｐＨ８（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を５ｍＬの５Ｍ酢酸アンモニウム（２．５Ｍ最終濃度）と混合する；各サンプルについて約４５０μＬが必要である。
針（例えば、２１ゲージ）を用いて、各サンプルに対する０．５ｍＬ微量遠心管の底の中央に穴を開けた。上で切り出されたゲル片をこれらのチューブ内に入れ、そしてその後の工程における遠心分離によって、ＤＮＡを溶出するためにＤＮＡ含有ゲル片を粉砕した。２０μＬの１×非変性ゲルローディング緩衝液中の上記からのＤＮＡペレットを６％未変性ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上に充填した。ＤＮＡラダーまたは同様のラダーをマーカーとして別個のレーンに充填した。そのゲルを約１４０Ｖで（ミニゲルの場合、約３０分間）または先導する色素の前線がゲルから出そうになるまで泳動し、そして製造者の指示書に従ってＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色した。１０５〜１５０ｂｐのＤＮＡを含むゲル片を、清浄なかみそり刃を用いて切り出し、そして底に穴が開けられた０．５ｍＬチューブの中に入れた（その０．５ｍＬのチューブは、それより大きい１．５ｍＬチューブの内側に入れられている）。１３，０００×ｇにおいて３分間微量遠心することによって、そのゲル片を粉砕した。粉砕されたゲル片に、ある量（２００μＬ）のＰＡＧＥ溶出緩衝液を加え；その混合物を室温において１時間インキュベートし、ゲルフラグメントを放置して、その緩衝液を新しいチューブに移した。その粉砕されたゲル片を、今回は３７℃で再度抽出し、その溶出緩衝液を混合した。その混合物をスピンカラムに移し、そして最高速度で５分間遠心することにより、ゲル片を除去する。そのＤＮＡは、流動性だった。
ある量（１／１００体積）のグリコーゲンおよび０．７体積イソプロパノールを各サンプルに加えた。そのサンプルを完全に混合し、室温において５分間インキュベートし、そして室温において２０分間１３，０００×ｇで遠心した。その上清を慎重に取り出して廃棄し、ペレットを風乾し、次いで、２０μＬのヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。
各サンプル中のＤＮＡを、分光光度計においてＡ２６０を測定することによって定量し（１Ａ２６０＝５０μｇＤＮＡ／ｍＬ）、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーまたは６％未変性ＰＡＧＥを用いて、サイズおよび質を確認した。ＳＯＬｉＤＴＭ配列決定に使用され得る最小量のＤＮＡは、２０ｎｇ／Ｌにおいて２００ｎｇであるが、より多いＤＮＡが好ましい。ＳＯＬｉＤＴＭＳｍａｌｌ ＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔの反応産物は、「ＳＯＬｉＤＴＭＳｙｓｔｅｍ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｂｅａｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」ステージのＳＯＬｉＤＴＭサンプル調製ワークフローに入り、ここで、エマルジョンＰＣＲを用いることにより、分子をビーズに接着させる。ＳＯＬｉＤＴＭ配列決定およびエマルジョンＰＣＲは、例えば、公開されているＰＣＴ出願の“Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｆｏｒ Ｂｅａｄ−Ｂａｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇと題されるＷＯ０６／０８４１３２および“Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｌ−Ｆｒｅｅ Ｂｅａｄ−Ｂａｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”と題されるＷＯ０７／１２１４８９に記載されている。
（実施例１２）
（マッピングおよび転写物のカバー範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）に対する本方法の確証）
本実施例は、本方法が、ヒトゲノムまたは他のデータベースに対する配列の短い（２５〜７０塩基）タグをマッピングするために有用であることを証明することによって本方法の確証を提供し、そして一様な転写物のカバー範囲を提供する。
例えば、異なる条件を試験する少なくとも１５個のライブラリーを別々に作製し、プールし、次いで、１回のランで配列決定した。相対的に等しい数のｍｉＲＮＡ配列が、それらのライブラリー間に見られた；検出される等しい数からの任意の偏差は、おそらくプールする工程におけるピペッティングの誤差を表すものである。単一サンプルにおいて、５５５個のｍｉＲＮＡ中３８９個が検出された（７０％）。検出されなかったｍｉＲＮＡは、主に、サンプル中に存在しないＲＮＡ分子である。
ＳＯＬｉＤＴＭ装置において生成された配列読みだしのｃｓ．ｆａｓｔａファイルを、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、Ｒｅｆｓｅｑｓおよびゲノムのデータベースに対してマッピングした。１７７０万個の読み出しのうち、５５％がゲノムに、１２％がＲｅｆＳｅｑ配列に、１％がｒＲＮＡに、０．５％がｔＲＮＡに、８．２５％がｍｉＲＮＡにマッピングされ、そして２３％がマッピングされなかった。一意的にゲノムにマッピングされた読み出しは、クラスター化されていることが見出され、すなわち、約３０００個が、少なくとも２つの読み出しおよび＜７０塩基のサイズを有する。これらの配列は、新規ｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡに対する候補である。
１５個のバーコードライブラリーおよびプールライブラリーのＳＯＬｉＤＴＭＳｙｓｔｅｍを用いて配列決定するトランスクリプトームの解析によって、約５９１６万個の読み出しのうち、３６．２２％がゲノムに、６．９８％がＲｅｆＳｅｑ配列に、０．３２％がｒＲＮＡに、そして０．０１％がｔＲＮＡにマッピングされたことが見出された。
ＲＮＡ検出は、再現性があると証明された。同一の条件下ではなく同様の条件下において生成された胎盤ポリ（Ａ）ＲＮａｓｅ ＩＩＩ断片化ライブラリーが、良好な再現性（０．９７というＲ２値）および少なくとも５ｌｏｇｓにわたる動的範囲の検出を有することが見出された。
ＳＯＬｉＤＴＭＳｙｓｔｅｍを用いて全体の転写物解析を行い、脳特異的血管新生インヒビター２（ＢＡＩ２）に対するｍＲＮＡに対するカバー範囲が、５’から３’まで均一であることが見出された。そのｍＲＮＡのほぼ全長を表す重複する個別の５０塩基のタグが観察された。複数回表される特異的なタグは、サンプル内に含まれるｍＲＮＡの相対量（すなわち、サンプル中に存在するＲＮＡ分子が多いほど、同じ配列タグを捕捉する確率が高くなる）、断片化ＲＮＡの切断部位の偏り、またはおそらくＰＣＲ増幅アーチファクトを反映し得る。
配列決定タグに対する開始点の密度を、解析されるＲＮＡ転写物の長さに対してプロットした。その結果から、タグ密度が、転写物本体にわたって均一であり、５’および３’末端のいちばん端から外れることが示唆される。ＲＮＡの末端におけるこの捕捉タグの減少は、すべてのＲＮＡポリメラーゼＩＩによって生成されるＲＮＡ転写物上に含まれる５’キャップに対する連結の非効率を表す。典型的にはポリＡテイルを含むｍＲＮＡの３’末端に関して、この材料を捕捉および増幅する能力が、妨げられているようであり、そのテイルのホモポリマーの性質におそらく起因して、タグの割合が低い。
本教示の組成物、方法およびキットは、本明細書中で広く、かつ一般的に説明されてきた。一般的な開示の範囲内に入るより狭い種および亜属の分類の各々もまた、本教示の一部を形成する。これは、本教示の一般的な説明を含むが、但しまたは消極的な限定で、取り上げられるものが本明細書中で明示的に列挙されているかいないかに関係なく、その類概念から任意の対象物が除かれる。
開示された教示は、様々な適用法、方法および組成物に関して説明されてきたが、本明細書中の教示から逸脱することなく、様々な変更および改変がなされ得ることが認識されるだろう。前述の実施例は、本教示をよりよく説明するために提供されたものであり、本明細書中の教示の範囲を限定すると意図されない。本教示のある特定の局面は、以下の請求項に照らしてさらに理解され得る。

Claims (38)

  1. サンプル中のＲＮＡ分子を検出するための方法であって、該方法は：
    該サンプルを、少なくとも１つの第１アダプター、少なくとも１つの第２アダプター、および二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチドと合わせ、ライゲーション反応組成物を形成する工程であって、ここで、該少なくとも１つの第１アダプターおよび該少なくとも１つの第２アダプターは、該サンプルの該ＲＮＡ分子に連結されて、同じライゲーション反応組成物中において連結産物を形成し、
    ここで、該少なくとも１つの第１アダプターは：
    １０から６０ヌクレオチドの長さを有し、かつ３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む、第１オリゴヌクレオチド、および
    該第１オリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ該第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが二重鎖形成するときに１から８ヌクレオチドの一本鎖５’部分をさらに含む、第２オリゴヌクレオチド
    を含み、
    ここで、該少なくとも１つの第２アダプターは：
    １０から６０ヌクレオチドの長さを有し、かつ５’ホスフェート基を含む、第３オリゴヌクレオチド、および
    該第３オリゴヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ該第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとが二重鎖形成するときに１から８ヌクレオチドの一本鎖３’部分をさらに含む、第４オリゴヌクレオチド
    を含み、
    ここで、該一本鎖部分は、独立して、縮重ヌクレオチド配列または該ＲＮＡ分子の一部に相補的な配列を有し、
    ここで、該第１オリゴヌクレオチドと該第３オリゴヌクレオチドとは、異なるヌクレオチド配列を有し；
    ここで、該ＲＮＡ分子は、該少なくとも１つの第１アダプターの該一本鎖部分および該少なくとも１つの第２アダプターの該一本鎖部分とハイブリダイズする、
    工程；ならびに
    該連結産物の該ＲＮＡ分子またはその代用物を検出する工程、
    を包含する、方法。
  2. 前記ＲＮＡ分子またはその代用物を検出する工程が：
    前記連結産物を、
    ｉ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、
    ｉｉ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼ、または
    ｉｉｉ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ
    と合わせる工程、
    該連結産物を逆転写することにより、逆転写産物を形成する工程、
    リボヌクレアーゼＨを用いて、該逆転写産物から前記リボヌクレオシドのうちの少なくとも一部を消化することにより、増幅鋳型を形成する工程、
    該増幅鋳型を、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマー、および該連結産物がｉ）におけるように合わせられるときはＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせることにより、増幅反応組成物を形成する工程、
    該増幅反応組成物をサイクル反応に供することにより、少なくとも１つの増幅産物を形成する工程、および
    該増幅産物の少なくとも一部の配列を決定することによって該ＲＮＡ分子を検出する工程
    を包含する、請求項１に記載の方法。
  3. 二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含む前記ポリペプチドが、Ｒｎｌ２ファミリーリガーゼを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含む前記ポリペプチドが、バクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記第１アダプターの前記一本鎖部分、前記第２アダプターの前記一本鎖部分、または該第１アダプターの該一本鎖部分および該第２アダプターの該一本鎖部分が、縮重配列を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記第１オリゴヌクレオチドが、少なくとも１５リボヌクレオシドを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記第２アダプターが、少なくとも１つのレポーター基を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記少なくとも１つの増幅産物が、識別配列を含む、請求項２に記載の方法。
  9. 前記少なくとも１つの順方向プライマーのうちの少なくとも１つ、前記少なくとも１つの逆方向プライマーのうちの少なくとも１つ、またはその両方が、識別配列を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 少なくとも１つの第１アダプター、少なくとも１つの第２アダプターまたは少なくとも１つの第１アダプターおよび少なくとも１つの第２アダプターが、識別配列を含む、請求項８に記載の方法。
  11. 前記ＲＮＡ分子が、低分子非コードＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  12. 前記サンプルが、複数のＲＮＡフラグメントを含み、そして前記検出工程が、発現プロファイルを測定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  13. 少なくとも１種のＲＮＡ分子の濃度が、前記連結産物を形成する前に枯渇されている、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記サンプルが、複数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）フラグメントを含み、そして前記検出工程が、発現プロファイルを測定する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記検出工程が、増幅産物の少なくとも一部を配列決定する工程を含み、ここで、該配列決定工程は、大規模平行シグネチャー配列決定反応（ｍａｓｓｉｖｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、少なくとも１つの増幅産物をマイクロアレイにハイブリダイズさせる工程、または少なくとも１つの増幅産物を配列決定ベクターにクローニングする工程を含む、請求項１に記載の方法。
  16. 前記第１アダプターの前記一本鎖部分、前記第２アダプターの前記一本鎖部分、または該第１アダプターの該一本鎖部分および該第２アダプターの該一本鎖部分が、対応するＲＮＡ分子と選択的にハイブリダイズする配列特異的領域を含む、請求項１に記載の方法。
  17. ＲＮＡ分子を検出するための方法であって、該方法は：
    該ＲＮＡ分子を、少なくとも１つの第１アダプター、少なくとも１つの第２アダプターおよび二本鎖特異的リガーゼと合わせることにより、ライゲーション反応組成物を形成する工程であって、ここで、該少なくとも１つの第１アダプターは、３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む第１オリゴヌクレオチド、および該第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第２オリゴヌクレオチドを含み、ここで、該少なくとも１つの第２アダプターは、５’ホスフェート基を含む第３オリゴヌクレオチド、および該第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第４オリゴヌクレオチドを含む、工程、
    該少なくとも１つの第１アダプターおよび該少なくとも１つの第２アダプターを、該ＲＮＡ分子に連結することにより、連結産物を形成する工程であって、ここで、該第１アダプターおよび該第２アダプターは、同じライゲーション反応組成物中の該ＲＮＡ分子に連結される、工程、
    該連結産物をＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせる工程、
    該連結産物を逆転写することにより、逆転写産物を形成する工程、
    リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を用いて該逆転写産物から該リボヌクレオシドのうちの少なくとも一部を消化することにより、増幅鋳型を形成する工程、
    該増幅鋳型を、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマーおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせることにより、増幅反応組成物を形成する工程、
    該増幅反応組成物をサイクル反応に供することにより、増幅産物を形成する工程、ならびに
    該増幅産物の少なくとも一部の配列を決定することによって該ＲＮＡ分子を検出する工程
    を包含する、方法。
  18. 前記第１アダプターの前記一本鎖部分、前記第２アダプターの前記一本鎖部分、または該第１アダプターの該一本鎖部分および該第２アダプターの該一本鎖部分が、縮重配列を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記第１オリゴヌクレオチドの少なくとも２つのリボヌクレオシドが、少なくとも１５リボヌクレオシドを含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記第２アダプターが、少なくとも１つのレポーター基を含む、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記増幅産物の少なくとも１つが、識別配列を含む、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記少なくとも１つの順方向プライマーの少なくとも１つ、前記少なくとも１つの逆方向プライマーの少なくとも１つ、またはその両方が、識別配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 少なくとも１つの第１アダプター、少なくとも１つの第２アダプター、または少なくとも１つの第１アダプターおよび少なくとも１つの第２アダプターが、識別配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記ＲＮＡ分子が、低分子非コードＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
  25. 前記ＲＮＡ分子が、複数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）フラグメントを含み、そして前記検出工程が、発現プロファイルを測定する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
  26. 少なくとも１種のＲＮＡ分子の濃度が、前記連結産物を形成する前に枯渇されている、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記測定工程が、前記増幅産物の少なくとも一部を配列決定する工程を含み、ここで、該配列決定工程が、大規模平行シグネチャー配列決定反応、少なくとも１つの増幅産物をマイクロアレイにハイブリダイズさせる工程、または少なくとも１つの増幅産物を配列決定ベクターにクローニングする工程を含む、請求項１７に記載の方法。
  28. 前記二本鎖特異的リガーゼが、Ｒｎｌ２ファミリーリガーゼを含む、請求項１７に記載の方法。
  29. 二本鎖特異的リガーゼが、バクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記第１アダプターの前記一本鎖部分、前記第２アダプターの前記一本鎖部分、または該第１アダプターの該一本鎖部分および該第２アダプターの該一本鎖部分が、対応するＲＮＡ分子と選択的にハイブリダイズする配列特異的領域を含む、請求項１７に記載の方法。
  31. ＲＮＡ分子を検出するための方法であって、該方法は：
    該ＲＮＡ分子を、少なくとも１つの第１アダプター、少なくとも１つの第２アダプターおよび二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼと合わせることにより、ライゲーション反応組成物を形成する工程であって、ここで、該少なくとも１つの第１アダプターは、３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む第１オリゴヌクレオチド、および該第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第２オリゴヌクレオチドを含み、ここで、該少なくとも１つの第２アダプターは、５’ホスフェート基を含む第３オリゴヌクレオチド、および該第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第４オリゴヌクレオチドを含む、工程、
    該少なくとも１つの第１アダプターおよび該少なくとも１つの第２アダプターを該ＲＮＡ分子に連結することにより、連結産物を形成する工程であって、ここで、該第１アダプターおよび該第２アダプターが、同じライゲーション反応組成物中の該ＲＮＡ分子に連結される、工程、
    該連結産物をＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせる工程、
    該連結産物を逆転写することにより、逆転写産物を形成する工程、
    リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を用いて該逆転写産物から該リボヌクレオシドのうちの少なくとも一部を消化することにより、増幅鋳型を形成する工程、
    該増幅鋳型を、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマーおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせることにより、増幅反応組成物を形成する工程、
    該増幅反応組成物をサイクル反応に供することにより、増幅産物を形成する工程であって、ここで、該増幅反応組成物は、レポータープローブ、核酸色素またはレポータープローブおよび核酸色素をさらに含む、工程、ならびに
    該増幅産物を検出することによって、該ＲＮＡ分子を検出する工程
    を包含する、方法。
  32. ＲＮＡライブラリーを生成するための方法であって、該方法は、
    多数の異なるＲＮＡ分子を、多数の第１アダプター種、多数の第２アダプター種および二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼと合わせることにより、ライゲーション反応組成物を形成する工程であって、ここで、該少なくとも１つの第１アダプターは、３’末端上に少なくとも２つのリボヌクレオシドを含む第１オリゴヌクレオチド、および該第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第２オリゴヌクレオチドを含み、ここで、該少なくとも１つの第２アダプターは、５’ホスフェート基を含む第３オリゴヌクレオチド、および該第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドとが共にハイブリダイズするときに一本鎖部分を含む第４オリゴヌクレオチドを含む、工程、
    該少なくとも１つの第１アダプターおよび該少なくとも１つの第２アダプターを該ＲＮＡ分子に連結することにより、多数の異なる連結産物種を形成する工程であって、ここで、該第１アダプターおよび該第２アダプターは、同じライゲーション反応組成物中の該ＲＮＡ分子に連結される、工程、
    該多数の連結産物種をＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせる工程、
    該多数の連結産物種のうちの少なくとも一部を逆転写することにより、多数の逆転写産物種を形成する工程、
    リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を用いて該多数の逆転写産物のうちの少なくとも一部から該リボヌクレオシドのうちの少なくとも一部を消化することにより、多数の増幅鋳型種を形成する工程、
    該多数の増幅鋳型種を、少なくとも１つの順方向プライマー、少なくとも１つの逆方向プライマーおよびＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼと合わせることにより、増幅反応組成物を形成する工程、
    該増幅反応組成物をサイクル反応に供することにより、多数の増幅産物種を含むライブラリーを形成する工程であって、ここで、該増幅産物種のうちの少なくとも一部は、該ライブラリー中の他の増幅産物種のうちの少なくとも一部と共通の識別配列を含む、工程
    を包含する、方法。
  33. 前記順方向プライマーのうちの少なくとも一部、前記逆方向プライマーのうちの少なくとも一部、または該順方向プライマーのうちの少なくとも一部および該逆方向プライマーのうちの少なくとも一部が、識別配列または識別配列の相補物を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 複数の第１アダプター種、複数の第２アダプター種、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、複数の異なる第１プライマー種、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅＨ（ＥＣ３．１．２６．４）を備えるキットであって、ここで、各第１アダプター種は異なる縮重配列を含み、各第２アダプター種は異なる縮重配列を含む、キット。
  35. タバコ酸性ピロホスファターゼをさらに備える、請求項３４に記載のキット。
  36. 複数の第１アダプター種、複数の第２アダプター種、二本鎖特異的ＲＮＡリガーゼ活性を含むポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー種およびリボヌクレアーゼＨを備えるキットであって、ここで、該第１アダプター種のうちの少なくとも一部は縮重配列を含み、該第２アダプター種のうちの少なくとも一部は縮重配列を含む、キット。
  37. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項３７に記載のキット。
  38. タバコ酸性ピロホスファターゼをさらに備える、請求項３７に記載のキット。
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