CN115927540A

CN115927540A - 一种基于夹板连接的小rna高通量测序文库的构建方法

Info

Publication number: CN115927540A
Application number: CN202211648335.5A
Authority: CN
Inventors: 苟德明; 王俊
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2022-12-21
Filing date: 2022-12-21
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明提供了一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法。本发明在一链cDNA合成后，提供了一种夹板接头，该接头具有互补的双链DNA结构且末端突出包含有6个兼并碱基，可以与逆转录产物一链cDNA的3'端以粘性方式进行高效连接。连接产物通过USER酶的处理会使夹板接头的双链结构打开，从而可以通过PCR技术对cDNA进行高效扩增而得到测序文库。本发明提供的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，可以显著的提高对低丰度RNA的检测，缩减文库构建的时间。本发明可以使小RNA的文库构建不再依赖于RNA‑RNA间的连接，或者仅需针对RNA的3'端进行RNA接头连接。

Description

一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术以及分子生物学领域，尤其涉及一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法。

背景技术

随着高通量测序技术的发展，越来越多的研究工作着重于RNA表达的分析。RNA的高通量测序已经成为一种常用手段。普通转录组的文库构建已经被广泛使用来研究mRNA基因的功能以及作用机制。但是对于短片段的小RNA，目前仍未有较为便捷的测序文库构建方法。现有技术中常用的小RNA文库构建的方法，首先主要依赖于利用RNA连接酶进行小RNA的5'端和3'端的RNA接头连接，而该种基于RNA-RNA连接的建库方式不仅连接效率低，且易导致RNA降解，通常仅能对表达丰度较高的部分RNA实现文库的构建。而且当前常用的方法需要经过多个繁琐的步骤。例如，NEBNext small RNA preparation kit需要对分离得到的小RNA进行5'端和3'端测序接头的连接，随后通过接头上已知序列进行逆转录得到一链cDNA，依赖于cDNA两端特异性序列进行PCR扩增得到高通量测序文库，最终进行测序鉴定各类小RNA的表达丰度和变化情况。

然而，通常情况下小RNA的表达丰度较低，因此大多数低丰度的RNA无法完成逆转录而形成测序文库。此外，基于RNA与RNA连接的方法，通常会采用过量的接头，从而导致连接体系中残留较多的接头，最终会使构建所得的文库质量大幅下降。因而，该传统方法并不适用于低丰度RNA建库。不仅如此，其操作繁琐，需要超过12个小时的连续实验操作，才能从RNA得到文库用于高通量测序。

因此，现有技术还有待改进。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，旨在解决现有技术中小RNA文库构建需要经过多个繁琐的步骤且依赖于效率较低的RNA-RNA连接的问题。

本发明的技术方案如下：

一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，包括步骤：

提供S6引物和S7引物，通过所述S6引物和S7引物退火形成夹板接头；

将待测的小RNA进行逆转录，获得一链cDNA；

将所述一链cDNA进行变性；

将变性后的一链cDNA与所述夹板接头混合于连接体系中进行反应，得到连接产物；

利用USER酶对所述连接产物进行消化，得到特定接头序列cDNA；

将所述特定接头序列cDNA与S4引物以及S19引物混合于扩增体系中进行反应，得到所述的小RNA高通量测序文库。

所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，所述夹板接头具有双链DNA结构且末端突出6个兼并碱基。

所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，所述S6引物的序列为：

CACCTCTCTAUACACUCTTUCCCUACACGACGCTCTUCCGATCUNNN NNN-invT；所述S7引物的序列为：

Phos-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTATAGAGAGGT G-invT。

所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，利用基于polyA加尾的小RNA逆转录体系对待测的小RNA进行逆转录。

所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，利用基于DNA-DNA连接的方式对待测的小RNA的逆转录一链cDNA连接接头，之后利用特异引物进行扩增得到测序文库。

所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，所述连接体系还包括DNA连接酶以及DNA连接酶缓冲液。

所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，所述扩增体系还包括DNA聚合酶、dNTP以及缓冲液。

所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其中，所述S4引物的序列如SEQ.ID.NO 1所示；所述S19引物的序列如SEQ.ID.NO 2所示。

一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法的应用，其中，将如上任一所述的构建方法应用于小RNA测序文库的构建或者qRT-PCR的检测。

所述的应用，其中，所述小RNA包括microRNA、piRNA、siRNA、tRNA以及rRNA。

有益效果：本发明提供了一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法。本发明在一链cDNA合成后，提供了一种夹板接头，该接头具有互补的双链DNA结构且末端突出包含有6个兼并碱基，可以对一链cDNA以模拟粘性末端的连接方式进行DNA-DNA间的连接，因而可以识别并连接所有类型一链cDNA的3'端。连接产物通过USER酶的处理会使夹板接头的双链结构打开，从而可以通过PCR扩增对cDNA进行富集而得到测序文库。本发明提供的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，可以显著的提高对低丰度RNA的检测，缩减文库构建的时间。本发明的改善可以使小RNA的文库构建不再依赖于RNA-RNA间的连接，或者仅需针对RNA的3'端进行RNA接头连接。此外，传统的基于RNA-RNA连接的文库构建方法需保证RNA的5'端未磷酸化修饰，而本发明的方法基于DNA-DNA连接方式，因而对RNA5'端的修饰没有特殊要求，因而可以检测更多种类不同的RNA。

附图说明

图1为本发明实施例提供的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法的原理示意图。

图2为本发明实施例中夹板接头在琼脂糖凝胶电泳的结果示意图。

图3为本发明实施例中传统方法与基于夹板连接方法检测小RNA的异同。

图4为本发明实施例中基于夹板连接对微量血浆的小RNA进行文库构建结果示意图。

图5为本发明实施例中基于夹板连接的小RNA文库构建中USER酶消化的影响评估结果。

具体实施方式

本发明提供一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，包括步骤：

S100、提供S6引物和S7引物，通过两条引物退火形成夹板接头；

S200、将待测的小RNA利用逆转录引物S25进行逆转录，获得一链cDNA(1st cDNA)；

S300、将逆转录得到的所述一链cDNA在95℃孵育5分钟进行变性；

S400、将变性后的所述一链cDNA与所述夹板接头混合，在连接体系中进行反应，得到连接产物；

S500、利用USER酶对所述连接产物进行消化，得到特定接头序列cDNA；

S600、将所述特定接头序列cDNA与S4引物以及S19引物混合，在扩增体系中进行反应，得到所述的小RNA高通量测序文库。

在一些实施方式中，所述夹板接头具有双链DNA结构且末端突出6个兼并碱基。

针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明实施例提供了一种基于夹板连接的小RNA文库构建方法，其技术原理图如图1所示。利用该方法，可以显著的提高对低丰度RNA的检测，缩减文库构建的时间。本发明的改善可以使小RNA的文库构建不再依赖于RNA-RNA间的连接，或者仅需针对RNA的3’端进行RNA接头连接。在cDNA第一链合成后，本发明提供了一种夹板接头，该接头具有互补的双链DNA结构且末端突出包含有6个兼并碱基，可以对cDNA第一链模拟粘性末端的连接方式进行DNA-DNA间的连接，因而可以识别所有类型cDNA第一链3’端，并直接连接于cDNA第一链上。连接产物通过USER酶的处理会使夹板接头的双链结构打开，从而可以通过PCR扩增对cDNA进行富集而得到测序文库。此外，传统的基于RNA-RNA连接的文库构建方法需保证RNA的5'端未磷酸化修饰，而本发明的方法基于DNA-DNA连接方式，因而对RNA5’端的修饰没有特殊要求，因而可以检测更多种类不同的RNA。

在一些实施方式中，所述S6引物的序列为：(5'-3')

CACCTCTCTAUACACUCTTUCCCUACACGACGCTCTUCCGATCUNNN NNN-invT(50nt)；所述S7引物的序列为：(5'-3')

Phos-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTATAGAGAGGT G-invT(44nt)。但不限于此，所使用到的引物在不影响其夹板连接功能的情况下可以进行适当的修改/替换。

本发明通过将S6引物和S7引物退火生成具有双链DNA结构且末端突出6个兼并碱基的夹板接头，所述夹板接头的序列是基于dUTP进行封闭的夹板接头序列，本发明首次提出用于单链cDNA的连接。但不限于此，在不影响最终文库结构的情况下，可对夹板接头序列进行微调，从而得到同样的测序文库。

在一些实施方式中，步骤S100具体包括：

S101、将5μl的100μM S6引物和5μl的100μM S7引物进行混合，同时添加5μl的10×NEBbuffer 2.1，35μl的H₂O；

S102、升温至95℃后孵育5min，之后自95℃至25℃进行梯度降温，保持每分钟降温1℃；至温度降至25℃后孵育5min，加入450μl的H₂O即得到10μM的夹板接头。

在一些实施方式中，将待测的小RNA进行逆转录反应的体系包括polyA加尾酶、逆转录酶、逆转录引物S25以及逆转录缓冲液。

具体的，所述逆转录酶为MMLV逆转录酶，但不限于此。也可以采用具有相同功能的酶替代，例如AMV逆转录酶。同样的，polyA酶也可以用具有相同功能的酶替代。

具体的，所述逆转录引物S25的序列为S25(5'-3')：TACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTTTT TTTTTTTTTTTTVN。但不限于此，所使用到的逆转录引物在不影响其功能的情况下可以进行适当的修改/替换。

在一些实施方式中，利用基于polyA加尾的小RNA逆转录体系对待测的小RNA进行逆转录。

在另一些实施方式中，利用基于DNA-DNA连接的方式对待测的小RNA的逆转录一链cDNA连接接头，之后利用特异引物进行扩增得到测序文库。

本发明可使用基于polyA加尾的小RNA逆转录体系获得cDNA第一链，之后扩增得到测序文库；也可以利用基于DNA-DNA连接的方式对待测的小RNA的逆转录一链cDNA连接接头，之后利用特异引物进行扩增得到测序文库。本发明基于一链cDNA进行接头连接的实验原理与技术路线，其原理基于模拟的DNA粘性末端连接，因此可以大大提高对低丰度RNA的检出率，因而能够实现微量小RNA的文库构建；此外由于对cDNA的连接完全不依赖RNA5’端的修饰，因而可以大幅度提高对不同类型小RNA的检出率。

在一些实施方式中，步骤S200中，对基于polyA加尾的小RNA逆转录体系进行优化，使用polyA加尾酶、MMLV逆转录酶、逆转录引物、逆转录缓冲液的混合物对RNA进行逆转录生成一链cDNA，包括以下步骤：1)在70℃下，处理RNA 5分钟使RNA的二级结构打开；2)温度降低至25℃时，将逆转录所需的混合物和RNA混合在一起；3)将上述体系于37℃孵育15min，42℃孵育30min，得到一链cDNA。

该步骤操作过程中，需要使用到的逆转录引物序列如下：

S25(5’-3’)

5’-TACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTT TTTTTTTTTTTTTTVN-3’。该操作过程中需要对逆转录体系中的缓冲液成分、酶的加入量进行调整优化来兼容下一步核酸外切酶的使用，需要使用到的逆转录缓冲液(10×)配比如下：100-300mM Tris-HCl；1-2M NaCl；500-800mM MgCl2；500-700mM KCl；150-200mM DTT。逆转录的反应体系如下：1μl逆转录缓冲液(10×)，0.5μl polyA加尾酶(300个单位)，1μlMMLV逆转录酶(200个单位)，1μl逆转录引物(1μM)，6.5μl RNA。

在一些实施方式中，步骤S400中，对逆转录得到的一链cDNA首先进行95℃变性孵育5分钟后，迅速置于冰上后进行一链cDNA与夹板接头的连接。连接反应的配比如下：10μl步骤S300得到的一链cDNA，2μl T4 DNA Ligase Buffer(10×)，2μl 50％的PEG4000，1μl步骤S100得到的夹板接头(10μM)，1μl T4 DNA ligase，4μl H₂O。将连接反应置于20℃孵育60分钟后，立即在65℃继续孵育10分钟。

在一些实施方式中，所述连接体系包括DNA连接酶以及DNA连接酶缓冲液。

具体的，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶，但不限于此。也可以采用具有相同功能的酶替代。

在一些实施方式中，步骤S500中，利用USER酶对所述连接产物进行消化，得到特定接头序列cDNA。反应配比如下：20μl上述连接反应的产物，1μl USER酶。将消化反应在37℃孵育15分钟。本发明利用优化过后的夹板连接接头及随后的USER酶切体系，利用该夹板接头连接结合USER酶的消化，可以完全消化夹板接头的封闭链，从而使连接了特定接头序列的单链cDNA暴露，从而不影响下一步的PCR过程，能够得到高质量的测序文库。

在一些实施方式中，步骤S600中，所述扩增体系包括DNA聚合酶、dNTP以及缓冲液。

在一些实施方式中，所述S4引物的序列如SEQ.ID.NO 1所示：

SEQ.ID.NO 1：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATACACTCTT；所述S19引物的序列如SEQ.ID.NO 2所示：

SEQ.ID.NO 2：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTT。

但不限于此，所使用到的扩增引物在不影响其功能的情况下可以做适当的修改/替换。

本发明实施例中，对所述特定接头序列cDNA进行PCR扩增，最终生成小RNA的测序文库。扩增反应的配比如下：15μl所述特定接头序列cDNA，1μl S4引物(10μM)，1μl S19引物(10μM)，25μl 2×Kapa hifi ready mix，8μl H₂O。将扩增反应置于PCR仪器后，运行如下反应程序：95℃，3min，16个如下循环(98℃，20sec；60℃，30sec；72℃，30sec)，72℃，1min。反应结束后即得到通过对一链cDNA进行夹板连接所得的小RNA测序文库。

本发明实施例中，所使用到的酶都可以用具有相同功能的酶替代，包括但不限于RNA连接酶、USER酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶等。

在不影响结果的前提下，本发明实施例中每一步所使用到的处理条件可以进行适当修改，例如适当改变温度和孵育时间。同时，在不影响其功能的情况下，还可对发明中所使用到的PCR扩增引物进行修改/替换后使用。

本发明实施例还提供一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法的应用，将上述的构建方法应用于小RNA测序文库的构建或者qRT-PCR的检测。

在一些实施方式中，所述小RNA包括microRNA、piRNA、siRNA、tRNA以及rRNA。

本发明在RNA逆转录发生后进行夹板接头的连接，这样的实验原理基于DNA-DNA之间的粘性末端连接，可以大大改善传统的基于RNA-RNA之间连接接头的连接效率低下的问题，因而能够实现对微量小RNA的文库构建与检测。不仅如此，本发明在逆转录结束后即对残留逆转录引物进行去除，更早的去除体系内的干扰因素，还可以达到更快更准确的文库扩增以及RNA的检测。而且，本发明的夹板连接方法由于不依懒于RNA的5'端磷酸化修饰，因此可以检测到更多不同类型的RNA，种类远高于传统的小RNA检测方法，在各类RNA中均显示检测种类增多。在对tRNA的检测中，明显观测到了3’-tRFs的增多，说明了夹板连接对该类RNA检测具有重要影响。此外，各种tRNA也发生了显著变化。

下面通过具体实施例对本发明一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法做进一步的解释说明。

实施例1夹板接头的制备

通过退火生成具有双链DNA结构且末端突出6个兼并碱基的夹板接头。退火体系如下：5μl S6引物(100μM)，5μl S7引物(100μM)，5μl NEB buffer2.1(10×)，35μl H₂O。

S6(5’-3’):

CACCTCTCTAUACACUCTTUCCCUACACGACGCTCTUCCGATCUNNN NNN-invT(50nt)

S7(5’-3’):

Phos-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTATAGAGAGGT G-invT(44nt)

在PCR仪器下进行如下的反应：95℃孵育5min，95℃至25℃梯度降温，保持每分钟降温1℃。利用琼脂糖凝胶电泳评估夹板接头质量，结果如图2所示，其中A泳道为DNA分子marker；B泳道为退火前的S6引物；C泳道为退火前的S7引物；D引物为S6和S7退火后生成的高质量夹板接头。

实施例2小RNA文库的构建

1、将待测的小RNA进行逆转录，获得一链cDNA(1st cDNA)；

1)在70℃下，处理RNA 5分钟使小RNA的二级结构打开；2)温度降低至25℃时，将逆转录所需的混合物和小RNA混合在一起；3)将上述体系于37℃孵育15min，42℃孵育30min，得到一链cDNA；

逆转录的反应体系如下：1μl逆转录缓冲液(10×)，0.5μl polyA加尾酶(300个单位)，1μl MMLV逆转录酶(200个单位)，1μl逆转录引物(1μM)，6.5μl RNA。

2、将逆转录得到的一链cDNA进行变性，在95℃孵育5分钟后，迅速置于冰上备用；

3、建立针对一链cDNA的连接体系：1μl夹板接头(10μM)，10μlcDNA，1μl T4DNAligase，2μl T4 DNA Ligase Buffer(10×)，2μl 50％PEG4000，4μl H₂O。将连接反应置于20℃孵育60分钟后，立即在65℃继续孵育10分钟，得到连接产物；

4、利用USER酶对所述连接产物进行消化，得到特定接头序列cDNA。反应配比如下：20μl上述连接反应的产物，1μl USER酶。反应在37℃孵育15分钟，得到完全为单链且两头连接上了特定接头序列接头的cDNA；

5、对所述特定接头序列cDNA进行PCR扩增，最终生成小RNA的测序文库。扩增反应的配比如下：15μl所述特定接头序列cDNA，1μl S4引物(10μM)，1μl S19引物(10μM)，25μl 2×Kapa hifi ready mix，8μl H₂O。所述S4引物的序列如SEQ.ID.NO 1所示，所述S19引物的序列如SEQ.ID.NO 2所示。将扩增反应置于PCR仪器后，运行如下反应程序：95℃，3min，16个如下循环(98℃，20sec；60℃，30sec；72℃，30sec)，72℃，1min。反应结束后即得到通过对一链cDNA进行夹板连接所得的小RNA测序文库。

实施例3

利用实施例1中的夹板接头，以及实施例2中的构建方法，进行血浆中的小RNA文库构建。若使用传统的基于RNA-RNA连接的方法对小RNA进行文库构建，通常效率较低，无法检测到多种不同类型的RNA，并且需要大量的起始RNA。而利用本发明的方法首先对小RNA进行3'端加入polyA结构后，利用含有polyT的S25逆转录引物进行逆转录后产生一链cDNA，利用夹板接头对一链cDNA进行连接并且通过扩增获得小RNA文库后进行高通量测序检测。表1显示了传统的方法与基于夹板连接的方法所得到的各种不同类型小RNA的占比变化情况。图3所示即为传统方法与基于夹板连接方法检测小RNA的异同，其中，A、B、C、D、E、F、G分别代表基于传统的RNA-RNA连接的小RNA文库构建方法与基于夹板连接的小RNA文库构建方法所检测到的rsRNA、ysRNA、tRFs、miRNA、piRNA、mRNA、lncRNA之间的差异。可以明显看到对于不同的小RNA，虽然两者检测到的RNA有重叠，但本发明的方法均可以检测到更多种类，覆盖度显著提高。

表1传统方法与夹板连接法构建的小RNA文库中不同类型小RNA占比

实施例4

利用实施例1中的夹板接头，以及实施例2中的构建方法，进行不同量血浆中小RNA进行文库构建并测序。同时对测序后不同血浆投入量的结果进行评估，分析测序得到可用于下游分析的clean reads占原始测序得到的raw reads的比例。图4所示即为基于夹板连接对微量血浆的小RNA进行文库构建结果示意图。其中，A为不同血浆投入量时(400μl，200μl，100μl，50μl，25μl，12.5μl)的基于夹板连接所构建的小RNA文库琼脂糖凝胶电泳图；B为不同血浆投入量时(400μl，200μl，100μl，50μl，25μl，12.5μl)，测序结果中显示的cleanreads占比的变化情况。结果显示，基于夹板连接的小RNA文库构建方法至低可对仅12.5μl的血浆成功进行文库构建。

实施例5

利用实施例1中的夹板接头，以及实施例2中的构建方法，对200μl血浆中的小RNA进行文库构建，在文库构建过程中首先对小RNA进行逆转录生成一链cDNA，然后进行夹板连接，最后进行是否加入USER酶消化的测试。图5即为基于夹板连接的小RNA文库构建中USER酶消化的影响评估。其中，A为是否加入USER酶消化对最终产生的小RNA文库的影响；B为是否加入USER酶进行消化对最终产生测序文库所需要最少扩增循环数的影响。结果显示，若不加入USER酶消化，将导致需要更多的扩增循环数才能达到测序所需要的文库最低浓度，进一步说明了在基于夹板连接的反应体系中USER酶消化的关键作用。

综上所述，本发明提供了一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法。本发明在一链cDNA合成后，提供了一种夹板接头，该接头具有互补的双链DNA结构且末端突出包含有6个兼并碱基，可以对一链cDNA模拟粘性末端的连接方式进行DNA-DNA间的连接，因而可以识别所有类型一链cDNA 3'端，并直接连接于一链cDNA上。连接产物通过USER酶的处理会使夹板接头的双链结构打开，从而可以通过PCR扩增对cDNA进行富集而得到测序文库。本发明提供的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，可以显著的提高对低丰度RNA的检测，缩减文库构建的时间。本发明的改善可以使小RNA的文库构建不再依赖于RNA-RNA间的连接，或者仅需针对RNA的3'端进行RNA接头连接。不仅如此，本发明中优化过后的夹板连接接头及随后的USER酶切体系，利用该夹板接头连接结合USER酶的消化，可以完全消化夹板接头的封闭链，从而使连接了特定接头序列的单链cDNA暴露，从而不影响下一步的PCR过程，能够得到高质量的测序文库。此外，传统的基于RNA-RNA连接的文库构建方法需保证RNA的5'端未磷酸化修饰，而本发明的方法基于DNA-DNA连接方式，因而对RNA 5'端的修饰没有特殊要求，因而可以检测更多种类不同的RNA。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括步骤：

将待测的小RNA进行逆转录，获得一链cDNA；

将所述一链cDNA进行变性；

2.根据权利要求1所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述夹板接头具有双链DNA结构且末端突出6个兼并碱基。

3.根据权利要求1所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述S6引物的序列为：

CACCTCTCTAUACACUCTTUCCCUACACGACGCTCTUCCGATCUNNN NNN-invT；

所述S7引物的序列为：

Phos-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTATAGAGAGGT G-invT。

4.根据权利要求1所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，利用基于polyA加尾的小RNA逆转录体系对待测的小RNA进行逆转录。

5.根据权利要求1所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，利用基于DNA-DNA连接的方式对待测的小RNA的逆转录一链cDNA连接接头，之后利用特异引物进行扩增得到测序文库。

6.根据权利要求1所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述连接体系包括DNA连接酶以及DNA连接酶缓冲液。

7.根据权利要求1所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述扩增体系包括DNA聚合酶、dNTP以及缓冲液。

8.根据权利要求1所述的基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，所述S4引物的序列如SEQ.ID.NO 1所示；所述S19引物的序列如SEQ.ID.NO 2所示。

9.一种基于夹板连接的小RNA高通量测序文库的构建方法的应用，其特征在于，将如权利要求1-8任一所述的构建方法应用于小RNA测序文库的构建或者qRT-PCR的检测。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述小RNA包括microRNA、piRNA、siRNA、tRNA以及rRNA。