CN108486100A - 一种dna长度可控片段化方法及其在构建文库中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA长度可控片段化方法及其在构建文库中的应用，可用于cDNA与双链DNA的可控片段化，及其文库的构建。在单链cDNA分子片段化中，通过向合成与RNA模板互补的cDNA链的反转录反应中加入dUTP，得到含有dU碱基的cDNA；在双链DNA分子的片段化中，通过向合成双链DNA的PCR反应中加入dUTP，得到含有dU碱基的双链DNA；在所述cDNA与双链DNA上的dU碱基处进行酶处理，断裂DNA分子，生成片段化的cDNA与双链DNA；将片段化的cDNA与双链DNA进行末端补平处理。通过上述方式，本发明能够制备长度可调的片段化DNA，便于提高cDNA与双链DNA文库的建库效率，同时能消除长片段DNA不能有效测通的缺陷，并为长片段DNA序列的拼接提供校正序列。本方法可用于基于DNA扩增反应的测序文库构建。

Description

一种DNA长度可控片段化方法及其在构建文库中的应用
技术领域
本发明涉及精准医疗与核酸测序领域，特别是涉及一种DNA长度可控片段化方法及其在构建文库中的应用。
背景技术
核酸体外扩增与序列测定在现代生物医药与疾病诊治、生物环境检测、微生物污染检测等方面有着重要应用，现在临床上的各种分子诊断试剂盒也是基于核酸扩增与检测的疾病诊断技术。二代测序技术是在一代测序技术的基础上发展起来的高通量测序技术，广泛应用于精准医疗、环境基因组测序、转录组测序等方面中。目前二代测序是致病基因发现、疾病诊断等的基础。尽管二代测序应用广泛，但二代测序中核酸样本(DNA、cDNA)的质量、浓度、分子特征等决定了二代测序的成功率、测序质量及测序成本。
进行二代测序之前，首先要构建核酸样本文库。核酸样本文库的质量与特征决定了后续测序反应的结果及测序成本。目前采用的建库方法在构建DNA文库方面存在一些问题，例如文库的DNA分子长度涵盖的范围大，特别是cDNA文库的cDNA分子从几百到上万碱基对。由于长cDNA分子比短cDNA的建库效率低上百倍，因此长度不均一的cDNA分子会导致文库的分子丰度大大降低，导致原始样本中的长cDNA分子会被人为的丢失。这种缺陷型文库的测序结果会丢失大量珍贵的cDNA分子的测序信息。另一方面，由于二代测序的读长较短，一般在100-200碱基对之间，而99％的cDNA分子都在200碱基对以上，因此目前技术构建的cDNA文库的二代测序结果只能测定cDNA分子两端的序列，不能够获得cDNA分子的全序列信息。cDNA文库构建技术的这些缺点大大的限制了精准医疗的准确度。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种DNA长度可控片段化方法及构建文库的方法，本发明能提高建库效率，方便文库构建。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种DNA长度可控片段化方法，包括步骤为：(1)通过向合成与RNA模板互补的cDNA单链的RT反应中加入dUTP，得到含有dU碱基的cDNA单链；在合成双链DNA的PCR反应中加入dUTP，得到含有dU碱基的双链DNA；(2)在所述cDNA单链和/或所述双链DNA上的dU碱基处进行UDG酶处理后，再进行酶处理法断裂DNA，生成片段化的单链cDNA和/或片段化的双链DNA。
在本发明实施例中，步骤(1)中所述cDNA单链的反转录合成反应和双链DNA的PCR合成反应中掺入了dU碱基。
在本发明实施例中，步骤(1)中所述cDNA单链和双链DNA的合成反应体系过程中有加入dUTP。
在本发明实施例中，步骤(1)中所述cDNA单链和双链DNA的片段长度是通过cDNA单链与双链DNA的合成反应中加入所述dUTP的相对含量控制的。
在本发明实施例中，所述双链DNA的长度为50-500bp，若所述双链DNA的片段长度短，则降低所述dUTP的浓度；若所述所述双链DNA的片段长度长，则提高所述dUTP的浓度。
在本发明实施例中，步骤(2)中所述断裂处理是通过UDG酶、内切核酸酶IV、内切核酸酶III处理实现的。
提供一种构建文库的方法，包括步骤为：将权利要求1-6任一所述的片段化的单链cDNA和/或片段化的双链DNA进行处理构建文库。
在本发明实施例中，所述构建的文库能用于核酸测序、目的基因筛选中。
本发明的有益效果是：本发明的DNA长度可控片段化方法及其在构建文库中的应用，能够制备长度可调的片段化DNA，便于提高文库构建效率，方便构建适合于各种高通量测序反应的cDNA、基因组DNA文库，能消除DNA片段的不能有效测通之缺点。同时由于来自于同一种DNA分子的片段化后的DNA片段间的末端存在交叉重叠现象，因此，本方法建立的测序文库还可以为测序数据的拼接提供校正参考序列。本方法还可用于单细胞测序或其它基于DNA扩增反应的测序文库构建。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明的可控片段化基因组DNA制备及其文库构建原理图。
图2是本发明的可控片段化双链cDNA制备及其文库构建原理图。
图3是本发明的可控片段化单链cDNA制备原理图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1:长度可控的基因组DNA文库的构建及其在序列测定中的应用
请参阅图1，提供一种基因组DNA长度可控片段化方法，可用于文库构建，包括步骤为：
(1)PCR随机扩增基因组DNA。在PCR反应体系中加入基因组DNA、随机引物链、热稳定性DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶、dU耐受型Pfu DN A聚合酶)、dNTP、dUTP，其中dTTP/dUTP的质量比为2-20：1，进行20-40轮循环的PCR扩增反应，随机扩增基因组DNA。
(2)双链DNA的片段化。在制备的双链DNA反应体系中，加入UDG酶、内切核酸酶IV、内切核酸酶III、37℃下反应30分钟，进行双链DNA片段化；然后升温至50-70度，利用步骤(1)中加入的热稳定性Pfu DNA聚合酶将片段化DNA的粘性末端处理成平末端。
(3)片段化平末端双链DNA的回收与长度检测。将步骤(2)的反应产物用PCR产物纯化试剂盒或乙醇沉淀方法进行纯化。纯化后通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的长度，确保DNA长度在50-500bp范围内。若DNA太短则增高步骤(1)中dTTP/dUTP的比值(即降低dUTP浓度)；若DNA太长则降低步骤(1)中dTTP/dUTP的比值(即增加dUTP浓度)。
(4)平末端双链DNA加adaptor接头。adaptor接头含有限制性酶切位点。在DNA连接酶反应体系中，加入adaptor、DNA连接酶，16℃或37℃下反应15分钟至8小时。
(5)adaptor接头化双链DNA的纯化。将步骤(4)的反应产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化或用乙醇沉淀方法去除没有反应的adaptor。
(6)双链DNA的限制性酶切与纯化。将步骤(5)的反应产物与克隆载体用限制性内切酶进行消化，生成粘性末端，用于将双链DNA片段与克隆载体进行连接反应，制备文库。酶切反应结束后，加热失活限制性内切酶，并用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。
(7)DNA文库构建。将步骤(6)限制性内切酶消化好并纯化的双链DNA与克隆载体进行连接反应，构建DNA文库。在DNA连接酶反应体系中，加入双链DNA，克隆载体，T4DNA连接酶，16℃反应8小时。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，文库构建成功。
(8)DNA文库进行二代测序，或进行其他生物学应用。
实施例2:长度可控的cDNA文库的构建及其在序列测定中的应用
请参阅图2，提供一种双链cDNA长度可控片段化方法，可用于文库构建，包括步骤为：
(1)合成第一链cDNA。在反转录酶的反应体系中加入RNA模板、互补引物链、反转录酶、dNTP、dUTP，其中dTTP/dUTP的质量比为2-20：1，在40-50℃时反应30分钟，合成与RNA模板互补的第一链cDNA。
(2)PCR扩增cDNA。在PCR反应体系中加入步骤(1)的第一链cDNA、上下游引物链(若为随机扩增，则用随机引物链)、热稳定性DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶、dU耐受型PfuDNA聚合酶)、dNTP、dUTP，其中dTTP/dUTP的质量比为2-20：1，进行10-40轮循环的PCR扩增反应，合成双链DN A。
(3)双链DNA的片段化。在制备的双链DNA反应体系中，加入UDG酶、内切核酸酶IV、内切核酸酶III、37℃下反应30分钟，进行双链DNA片段化；然后升温至50-70度，利用步骤(2)中加入的热稳定性Pfu DNA聚合酶将片段化DNA的粘性末端处理成平末端。
(4)片段化平末端双链DNA的回收与长度检测。将步骤(3)的反应产物用PCR产物纯化试剂盒或乙醇沉淀方法进行纯化。纯化后通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的长度，确保DNA长度在50-500bp范围内。若DNA太短则增高步骤(1)与(2)中dTTP/dUTP的比值(即降低dUTP浓度)；若DNA太长则降低步骤(1)与(2)中dTTP/dUTP的比值(即增加dUTP浓度)。
(5)平末端双链DNA加adaptor接头。adaptor接头含有限制性酶切位点。在DNA连接酶反应体系中，加入adaptor、DNA连接酶，16℃或37℃下反应15分钟至8小时。
(6)adaptor接头化双链DNA的纯化。将步骤(5)的反应产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化或用乙醇沉淀方法去除没有反应的adaptor。
(7)双链DNA的限制性酶切与纯化。将步骤(6)的反应产物与克隆载体用限制性内切酶进行消化，生成粘性末端，用于将双链cDNA片段与克隆载体进行连接反应，制备文库。酶切反应结束后，加热失活限制性内切酶，并用PC R产物纯化试剂盒进行纯化。
(8)cDNA文库构建。将步骤(7)限制性内切酶消化好并纯化的双链DN A与克隆载体进行连接反应，构建cDNA文库。在DNA连接酶反应体系中，加入双链DNA，克隆载体，T4DNA连接酶，16℃反应8小时。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，文库构建成功。
(9)cDNA文库进行二代测序，或进行其他生物学应用。
实施例3:单链cDNA的可控片段化
请参阅图3，提供一种单链cDNA长度可控片段化方法，包括步骤为：
(1)合成第一链cDNA。在反转录酶的反应体系中加入RNA模板、互补引物链、反转录酶、dNTP、dUTP，其中dTTP/dUTP的质量比为2-20：1，在40-50℃时反应30分钟，合成与RNA模板互补的第一链cDNA。
(2)在步骤(1)的反应体系中，加入UDG酶、内切核酸酶III，在37℃下反应30分钟，进行双链DNA片段化。
(3)片段化平末端单链DNA的回收与长度检测。将步骤(2)的反应产物用PCR产物纯化试剂盒或乙醇沉淀方法进行纯化。纯化后通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的长度，确保cDNA单链长度在50-500nt范围内。若DNA太短则增高步骤(1)中dTTP/dUTP的比值(即降低dUTP浓度)；若DNA太长则降低步骤(1)中dTTP/dUTP的比值(即增加dUTP浓度)。
(4)片段化cDNA分子可用于单链DNA文库构建，钓取目标分子等生物学应用。
本发明能够制备长度可调的片段化DNA，使得后续双链DNA的建库效率大大提高，因短片段的建库效率远低于长片段DNA。由于DNA片段的长度可自由调控，可以方便地构建适合于各种高通量测序反应(例如二代测序反应)的c DNA与基因组DNA文库，使测序反应能够测通文库中的克隆的DNA片段，消除cDNA与基因组DNA片段不能有效测通的难题。由于片段间的末端存在交叉重叠现象，本方法建立的测序文库还可以为测序数据的拼接提供了校正参考序列。除了cDNA文库外，本方法也可用于单细胞测序或其它基于DNA扩增反应的测序文库构建，获得目的DNA片段长度可控的测序用文库。
通过将全长cDNA分子或基因组DNA的PCR扩增片段进行片断化，获得全覆盖长度范围内的较均一长度的DNA片段，构建DNA片段长度可控的文库，用于二代测序。
由于DNA片段长度大大缩短，且长度在二代测序的有效读长范围内，能够获得整条DNA分子的全部碱基序列，极大地节约了测序成本，并提高了目标核酸序列的测序信息量。
本发明能用于精准医疗与核酸测序领域，特别是在cDNA文库、基因组随机扩增文库构建方面有巨大作用。同时本发明也可用于单细胞测序或其它基于DN A扩增反应的测序文库的构建。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种DNA长度可控片段化方法，其特征在于，包括步骤为：(1)通过向合成与RNA模板互补的cDNA单链的RT反应中加入dUTP，得到含有dU碱基的cDNA单链；在合成双链DNA的PCR反应中加入dUTP，得到含有dU碱基的双链DNA；(2)在所述cDNA单链和/或所述双链DNA上的dU碱基处进行UDG酶处理后，再进行酶处理法断裂DNA，生成片段化的单链cDNA和/或片段化的双链DNA。
2.根据权利要求1所述的DNA长度可控片段化方法，其特征在于，步骤(1)中所述cDNA单链的反转录合成反应和双链DNA的PCR合成反应中掺入了dU碱基。
3.根据权利要求1所述的DNA长度可控片段化方法，其特征在于，步骤(1)中所述cDNA单链和双链DNA的合成反应体系过程中有加入dUTP。
4.根据权利要求1-3任一所述的DNA长度可控片段化方法，其特征在于，步骤(1)中所述cDNA单链和双链DNA的片段长度是通过cDNA单链与双链DNA的合成反应中加入所述dUTP的相对含量控制的。
5.根据权利要求4所述的DNA长度可控片段化方法，其特征在于，所述双链DNA的长度为50-500bp，若所述双链DNA的片段长度短，则降低所述dUTP的浓度；若所述所述双链DNA的片段长度长，则提高所述dUTP的浓度。
6.根据权利要求1所述的DNA长度可控片段化方法，其特征在于，步骤(2)中所述断裂处理是通过UDG酶、内切核酸酶IV、内切核酸酶III处理实现的。
7.一种构建文库的方法，其特征在于，包括步骤为：将权利要求1-6任一所述的片段化的单链cDNA和/或片段化的双链DNA进行处理构建文库。
8.根据权利要求7所述的构建文库的方法，其特征在于，所述构建的文库能用于核酸测序、目的基因筛选中。
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