CN109609495B - 一种高纯度单链dna制备方法及其应用 - Google Patents

一种高纯度单链dna制备方法及其应用 Download PDF

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明提供了一种高纯度单链DNA制备方法及其应用，解决现有方法的不足，本发明在传统化学合成方法的基础上进行创新性的改进和扩展，既可以结合传统的化学合成法也可以独立于传统的化学合成法单独使用，即用dUTP代替dTTP扩增—UDG酶消化法提供了一种制备单链DNA的方法。本发明解决传统化学法合成单链DNA产物纯度低、产量低、单链DNA长度受限、成本高、平行性差的缺点。

Description

一种高纯度单链DNA制备方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及单链DNA的合成。
背景技术
单链DNA是分子生物学领域乃至整个生命科学领域的一个重要的研究对象，近年来，在生物医药研究和发展中取得了重大突破，反义单链DNA已经被开发为基因靶向治疗的药物，用于抗病毒，抗肿瘤以及遗传性疾病的治疗。同时，单链DNA也是生命科学领域的一个基本工具，如生物基因组快速扫描技术，二代测序技术，SELEX技术等方面均用到大量的单链DNA，因此，单链DNA的应用范围特别广泛，作为引物用到DNA测序和PCR扩增中；作为探针用于克隆杂交诊断杂交，作为药物用于反义疗法，还可以用于核磁共振以及X射线晶体分析法来进行生理学研究。
目前为止，单链DNA的主要获得途径还是化学合成，化学合成的方式主要有固相合成法和液相合成法，这两种方法均存在产物纯度低，纯化困难，合成的目标序列出错率高的缺点，尤其是需要大量的单链DNA时，其合成的价格十分昂贵，大大限制了寡核苷酸的研究和应用。
为了解决这些问题，芯片技术应运而生，这种技术虽然为大规模平行合成单链DNA提供了一种相对简单便捷的方法，但是由于受到DNA合成种类或实验室条件的限制而无法成为实验室生产单链DNA的常规方法。
发明内容
为了解决上述现有各种方法的不足，本发明在传统化学合成方法的基础上进行创新性的改进和扩展，既可以结合传统的化学合成法也可以独立于传统的化学合成法单独使用，即用dUTP代替dTTP扩增—UDG酶消化法提供了一种制备单链DNA的方法。
本发明解决传统化学法合成单链DNA产物纯度低、产量低、单链DNA长度受限、成本高、平行性差的缺点。
根据本发明技术方案的其中一方面，本发明提供了一种高纯度单链DNA制备方法，本发明高纯度单链DNA制备方法使用dUTP扩增-UDG酶消化法。
根据本发明技术方案的其中一方面，本发明提供了一种高纯度单链DNA制备方法，步骤为：
步骤1含dUTP模板的扩增
使用DNA模板，使用引物对，以dUTP进行DNA模板扩增；
步骤2单链DNA的扩增
以步骤1中以dUTP扩增获得的dsDNA为模板扩增获得单链DNA；
步骤3UDG酶消化
将步骤2的单链DNA的扩增产物加入UDG酶进行处理，获得目标单链DNA。
根据本发明技术方案的其中一方面，本发明提供了一种高纯度单链DNA制备方法，其中步骤1中DNA模板为λDNA，引物对为250-F和250-R。
根据本发明技术方案的其中一方面，本发明提供了一种高纯度单链DNA制备方法，其中250-F序列如SEQ ID No.1:
5’-GTTTAAACGGATCTCTAGCGAATTCGGCTCTGCTAACACGTTGCTC-3’；
250-R的序列如SEQ ID No.2：
5’-CATTACAAACGTCCTTCTCGGTGCAAGCTTGCTAGCGGCCGCTCGAGGC-3’。
根据本发明技术方案的其中一方面，本发明提供了一种高纯度单链DNA制备方法，步骤1使用PCR扩增，步骤1的PCR扩增的加样体系：
Figure BDA0001933103670000021
PCR反应程序：
Figure BDA0001933103670000022
根据本发明技术方案的其中一方面，本发明提供了一种高纯度单链DNA制备方法，上述步骤2为PCR扩增，
步骤2的PCR扩增的加样体系：
Figure BDA0001933103670000031
PCR反应程序：
Figure BDA0001933103670000032
根据本发明技术方案的其中一方面，本发明提供了一种高纯度单链DNA制备方法，上述步骤3的步骤为在步骤2的每50μL PCR产物中加1μL UDG(1U/μL)酶处理，50℃，1min；95℃，10min。
根据本发明技术方案的其中一方面，本发明提供了还一种高纯度单链DNA制备方法的应用，上述的任意一种高纯度单链DNA制备方法可以应用于实验室制备单链DNA中或DNA芯片技术中。
附图说明
图1、为本发明其一个实施例中含dUTP模板的扩增产物电泳图；
图2、为本发明其中一个实施例中单链DNA的扩增产物电泳图；
图3、为本发明其中一个实施例中UDG酶消化产物电泳图。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
长片段单链DNA制备实施例1:含dUTP模板的扩增
以λDNA为模板，以250-F
(5’-GTTTAAACGGATCTCTAGCGAATTCGGCTCTGCTAACACGTTGCTC-3’)和
250-R
(5’-CATTACAAACGTCCTTCTCGGTGCAAGCTTGCTAGCGGCCGCTCGAGGC-3’)为引物，为了能使双链的DNA模板可以被去除，因此以dUTP代替dTTP进行模板扩增，扩增体系如下：
PCR体系加样(50μL)：
Figure BDA0001933103670000033
Figure BDA0001933103670000041
PCR反应程序：
Figure BDA0001933103670000042
/>
扩增结果：如图1所示，获得含dUTP的双链DNA产物。
实施例2:单链DNA的扩增
以步骤1中以dUTP扩增获得的dsDNA为模板，单引物250-F扩增获得单链DNA
Figure BDA0001933103670000043
PCR反应程序：
Figure BDA0001933103670000044
扩增结果：图2所示，泳道1为步骤1扩增得到的含dUTP的dsDNA，泳道2和3中上面的一条链为加入的模板即含dUTP的dsDNA，下面的一条链为此步骤单引物250-F扩增获得的单链DNA。
图2中的dsDNA为含dUTP的dsDNA。
实施例3:UDG酶消化
在步骤2获得的每管PCR产物(50μL)中加1μL UDG(1U/μL)酶处理，50℃，1min；
95℃，10min，结果如图3所示，泳道1是含dUTP的dsDNA未加UDG酶处理的对照，泳道2和3是含dUTP的dsDNA加UDG酶处理后得到的单链DNA产物。
图3中泳道1：dsDNA对照泳道；2、3：UDG酶消化产物。
上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
序列表
<110> 吴江近岸蛋白质科技有限公司
<120> 一种高纯度单链DNA制备方法及其应用
<130> 2018
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> 人工设计
<400> 1
gtttaaacgg atctctagcg aattcggctc tgctaacacg ttgctc 46
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> 人工设计
<400> 2
cattacaaac gtccttctcg gtgcaagctt gctagcggcc gctcgaggc 49

Claims (1)

1.一种高纯度单链DNA制备方法，其特征在于，所述高纯度单链DNA制备方法步骤为：
步骤1含dUTP模板的扩增使用DNA模板，使用引物对，以dUTP进行DNA模板扩增，所述DNA模板为λDNA，所述引物对为250-F和250-R；
步骤2单链DNA的扩增以步骤1中以dUTP扩增获得的dsDNA为模板扩增获得单链DNA；
步骤3UDG酶消化将步骤2的单链DNA的扩增产物加入UDG酶进行处理，获得目标单链DNA；
所述250-F序列如SEQ ID No.1：
5’-GTTTAAACGGATCTCTAGCGAATTCGGCTCTGCTAACACGTTGCTC-3’；
所述250-R的序列如SEQ ID No.2：
5’-CATTACAAACGTCCTTCTCGGTGCAAGCTTGCTAGCGGCCGCTCGAGGC-3’；
所述步骤1使用PCR扩增，步骤1的PCR扩增的加样体系：
Figure FDA0004067287060000011
PCR反应程序：
预变性94℃，5min
变性94℃，20s
退火65℃，20s
延伸72℃，20s变性、退火、延伸30-50循环
终延伸72℃，5min；
所述步骤2为PCR扩增，
步骤2的PCR扩增的加样体系：
dsDNAdU100ng/μL 1μL
2×Taq Master Mix 25μL
250-F 1μL
ddH2O to 50μL
PCR反应程序：
预变性94℃，5min
变性94℃，20s
退火65℃，20s
延伸72℃，20s变性、退火、延伸30-50循环
终延伸72℃，5min；
所述步骤3的步骤为在步骤2的每50μL PCR产物中加1μL UDG1U/μL酶处理，50℃，1min；95℃，10min。
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