CN108004300A - 一种短片段核酸链检测方法和预扩增方法 - Google Patents
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Abstract
一种短片段核酸链检测方法和预扩增方法，反转录时通过TSO序列模板转换加长目标序列5’端，通过反转录引物识别目标序列并加长目标序列3’端；核酸扩增时为反转录产物设计5’和3’专一性引物，5’专一性引物跨越TSO序列和目标序列衔接部分，3’专一性引物跨越目标序列和反转录引物衔接部分，即可准确地扩增和检测短片段核酸序列；核酸扩增时为反转录产物设计5’和3’通用引物，5’通用引物设计在TSO序列内部，3’通用引物设计在反转录引物内部，即可同时获得多个短片段核酸序列预扩增产物。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学核酸检测领域，具体涉及一种短片段核酸链检测方法和预扩增方法。
背景技术
近年来热点的生命科学研究常常需要对短片段核酸链进行扩增和检测，例如对生物生长发育具有调控作用的短片段核酸链检测、或对高度降解的遗传物质的检测。一般的核酸片段如DNA和mRNA可以通过核酸扩增如PCR来进行检测和定量，需要对目标片段两端分别设计长度20个碱基左右的引物来对目标片段进行扩增；但由于一些短片段核酸链序列的长度不足以设计上下游引物，或虽然长度足够但其序列特性导致很难设计上下游引物，无法进行核酸扩增检测。
例如microRNA的扩增和检测，microRNA简称miRNA，是生物体内一类小分子单链RNA，一些非编码的DNA转录后，经过一定的剪切、拼接形成长度约为22个碱基的成熟microRNA，microRNA虽然不编码蛋白质，但能够通过与靶基因的目标区域结合来调控靶基因的表达，在细胞的发育，分化，生长等生命活动中起着重要调控作用，因此近年来成为基因领域的研究热点。
最早的miRNA定量检测方法采用polyA加尾法，即在反转录前为miRNA加上一串几十个碱基的A序列和一个3’通用引物结合区域，PCR时加入5’端特异性引物和3’端通用引物即可扩增目标片段。但是这种方法特异性很差，即使扩增出结果，也不能确定是否就是目标miRNA。
2005年，chen等(Caifu Chenet al.,Real-time quantification of microRNAsby stem-loop RT-PCR，Nucleic Acids Research,2005,Vol.33,No.20e179背景文献1)提出了茎环引物作为反转录引物。由于茎环引物的结构特性，其在反转录效率和特异性方面比polyA加尾更好。茎环引物的设计要点是：
1.茎环结构的引物序列是头尾有一段互补的序列，能够自身头尾结合形成“茎”区域；
2.茎环结构的中间区域是一段不互补序列，在引物头尾结合后形成“环”区域，环区通常是一段通用序列，方便设计3’通用引物；
3.引物末端有6-8个碱基与目标miRNA互补,反转录时可以与目标miRNA结合从而得到反转录产物cDNA。
如图1所示，理想情况下在cDNA进行PCR扩增时，已经加了茎环结构的cDNA互补序列3’端c-d区域采用通用引物，5’端引物采用miRNA特异性引物(绝大部分序列与目标miRNA序列是一致的)进行扩增。但由于茎环引物末端与目标miRNA互补，也与5’引物互补，因此反转录后多余的茎环引物可以直接与5’引物结合，加上3’通用引物，形成了茎环引物的本底扩增。在采用单个茎环引物反转录miRNA时，这个问题还可能通过各种手段来避免，在多重反转录miRNA时，这个问题尤其突出。
2010年，Wan等(GUOQIANG WAN et al.,High-performance quantification ofmature microRNAs by real-time RT-PCR using deoxyuridine-incorporatedoligonucleotides and hemi-nested primers,RNA(2010),Vol.16,1436-1445，背景文献2)提出采用半巢式PCR的方法扩增miRNA。这种方法是在反转录时采用茎环引物的基础上，在PCR扩增时设计特殊的引物，具体原则是：
1.5’引物5’端(约10个碱基)为人为设计序列，不与目标miRNA互补；5’引物3’端十几个碱基与miRNA互补。这种做法的目的是为了提高引物的Tm值，使引物能够在Taq酶需求的温度下扩增。
2.3’引物不设计在茎环结构的环区域上，而是设计在茎环引物茎区域的末端：3’引物5’端碱基与茎环引物末端互补，3’引物3’端几个碱基与miRNA3’末端互补。
这种方法的优点是利用双专一性引物提高了特异性，但有一个致命的弱点-5’引物只有十几个碱基与目标miRNA互补，PCR第一步很难与目标miRNA的cDNA结合，导致引物设计有很大的局限性：一是与模板互补的十几个碱基的Tm值不能太低，否则无论在5’端人为引入多少碱基，都无法将Tm值提高到合适温度，引物将无法工作；二是在PCR的第一个循环时，人为引入的碱基不与模板互补，会降低核酸扩增效率。只有在第一个循环低效率引入到模板后，在随后的扩增循环中，引物中人为引入的碱基才参与互补，引物才正常工作。
由于这种缺陷，背景文献2的方法尽管有其独特优点，但没有被大众所接受，目前主流方法仍然是使用polyA加尾法或者背景文献1的通用茎环引物法。
发明内容
鉴于上述现有技术不足，发明人对此进行了深入研究，经过反复考虑和多种方法尝试，引入了TSO序列(template switching Oligonucleotide)实现“模板转换”，原理是利用一些具有模板转换特性的反转录酶在反转录达到模板的5’末端时，会在反转录产物5’端引入若干个C碱基的特性，在反转录时加入一段人工合成的十几个碱基的序列，其末端为若干个G碱基，能够与反转录产物互补从而加长反转录产物，增加了可用来设计5’专一性引物的序列长度。
本发明的方法适用于15个以上碱基的核酸链检测，尤其15-50个左右碱基的短片段核酸链，对于长度在200个碱基以下，难以设计引物的短片段核酸链也同样适用，包含但不限于miRNA、piRNA、siRNA、降解的RNA或DNA小片段。反转录引物设计成茎环结构有利于提高引物的结合专一性和结合效率，但一般的线性引物也可以作为本发明的反转录引物。
本发明的一个方面提供一种短片段核酸链检测方法，该方法包括反转录步骤和核酸扩增步骤，其中，反转录时通过TSO序列模板转换加长目标序列5’端，通过反转录引物识别目标序列并加长目标序列3’端，从而加长了检测模板的两端能够用来设计专一性引物的序列长度；核酸扩增时为反转录产物设计5’和3’专一性引物，5’专一性引物跨越TSO序列和目标序列衔接部分，3’专一性引物跨越目标序列和反转录引物衔接部分。
进一步地，反转录引物为茎环结构或线性结构，长度大于15个碱基，其3’端引入与目标序列3’端互补的4-8个碱基，尤其是6-8个碱基。
进一步地，人工合成TSO序列可以是DNA、RNA或DNA-RNA的杂合序列，长度大于6个碱基，其3’末端为若干个(例如3个)G碱基；TSO序列5’末端可以加入终止基团，如生物素，以避免反转录酶在加长反转录产物上继续生成CCC造成的多次模板转换；TSO序列可以引入修饰碱基如LNA以提高TSO序列的熔解温度。
在一个具体实施方式中，本发明的一种短片段核糖核酸链(例如miRNA)检测方法包括以下步骤：
任选的第一步：提取样本RNA或裂解样本，可按照实验室常规方法提取样本总RNA；在一些实验中也可以将样本裂解后不经提取RNA直接进行反转录。
第二步：样本RNA反转录，所使用的反转录组分包括适当浓度的茎环结构且其3’端有4-8个碱基与目标miRNA互补的反转录引物、TSO序列：6个碱基以上的TSO序列(例如其5’末端包括一个生物素基团)、具有模板转换特性的反转录酶、dNTP(其中含或不含dUTP)、RNA酶抑制剂、缓冲液；
第三步：cDNA扩增，所使用的cDNA扩增组分包括适当浓度的成对专一性引物、第二步反转录产物、DNA聚合酶、dNTP(其中含或不含dUTP)、镁离子、缓冲液，其中所述专一性引物对应目标miRNA反转录产物，5’专一性引物跨越TSO序列和目标序列衔接部分，3’专一性引物跨越目标序列和反转录引物衔接部分。
第二步的反转录条件可以根据核酸扩增方法确定、第三步的扩增条件如扩增温度、扩增时间可以利用现有公式进行计算，均在本领域研究人员的能力范围内。
第二步使用具有模板转换特性的反转录酶(例如上海闪晶生物、Takara、Qiagen、Thermofisher、Promega公司生产的反转录酶)，第三步则是一般的DNA聚合酶或热启动DNA聚合酶。
进一步地，反转录步骤可以在反转录引物上引入dU，反转录后添加UNG酶裂解反转录引物。
采用一个兼具模板转换、反转录和DNA聚合酶特性的酶或将具有模板转换特性的反转录酶和DNA聚合酶混合在一个体系中，第二步反转录和第三步cDNA扩增可以在同一个体系、同一步反应内进行。
优选的，核酸扩增步骤在一般实验要求的范围内，可以作适当优化，如降低变性温度使长链非特异性产物无法解链；缩短延伸时间使长链非特异性产物无法延伸，进一步减少非特异性产物。
上述实施方式在同时检测多个miRNA时，可以通过为不同的miRNA设计完全不同的茎环引物，使得相同温度条件下的反转录效率基本一致，同时避免相似序列的相互干扰，实现多个miRNA预扩增或一管内多重检测。
上述核酸扩增体系可以是PCR扩增体系、等温扩增体系。
在另一个具体实施方式中，本发明的一种短片段脱氧核糖核酸链(DNA)检测方法包括以下步骤：
第一步：提取样本DNA或裂解样本，可按照实验室常规方法提取样本DNA，在一些实验中，也可裂解样本后不提取DNA直接进行核酸扩增；
第二步：样本DNA预扩增，所使用的扩增组分包括适当浓度的一个或多个预扩增引物：3’端有4-8个碱基与目标DNA的一条链互补、TSO序列：6个碱基以上的TSO序列(例如其5’末端包括一个生物素基团)、具有模板转换特性的DNA聚合酶、dNTP(其中含或不含dUTP)、缓冲液；
第三步：样本DNA正式扩增，所使用的DNA扩增组分包括适当浓度的一对或多对专一性引物、第二步预扩增产物、DNA聚合酶、dNTP(其中含或不含dUTP)、镁离子、缓冲液，其中所述专一性引物对应预扩增产物，5’专一性引物跨越TSO序列和目标序列衔接部分，3’专一性引物跨越目标序列和预扩增引物衔接部分。
第二步的反转录条件可以根据核酸扩增方法确定、第三步的扩增条件如扩增温度、扩增时间可以利用现有公式进行计算，均在本领域研究人员的能力范围内。
第二步使用具有模板转换特性的DNA聚合酶(例如上海闪晶生物、Takara、Qiagen、Thermofisher、Promega公司生产的反转录酶，兼具反转录酶和DNA聚合酶活性)，第三步则是一般的DNA聚合酶或热启动DNA聚合酶。
进一步地，预扩增步骤可以在预扩增引物上引入dU，预扩增后添加UNG酶裂解预扩增引物。
采用一个兼具模板转换和DNA聚合酶特性的酶或将具有模板转换特性的反转录酶和DNA聚合酶混合在一个体系中，第二步反预扩增和第三步正式扩增可以在同一个体系、同一步反应内进行。
优选的，核酸扩增步骤在一般实验要求的范围内，可以作适当优化，如降低变性温度使长链非特异性产物无法解链；缩短延伸时间使长链非特异性产物无法延伸，进一步减少非特异性产物。
上述实施方式在同时检测多个DNA片段时，可以通过为不同的DNA片段设计完全不同的预扩增引物，使得相同温度条件下的预扩增效率基本一致，同时避免相似序列的相互干扰，实现多个DNA预扩增或一管内多重检测。
上述核酸扩增体系可以是PCR扩增体系或等温扩增体系。
本领域技术人员公知，DNA或RNA形成单链的分子结构不同(脱氧核糖或核糖)，而形成互补键的分子结构是相同的(碱基A,T/U,C,G)，因此本发明既可以用于短片段RNA检测，也可以用于短片段DNA检测，只是检测步骤中的叫法不同。上述两个具体实施方式中，RNA单链反转录成反转录产物的过程，和将DNA变性成单链后的预扩增成预扩增产物的过程是一致的，所使用的组份也是基本一致的(RNA检测要用RNA酶抑制剂，DNA不用；RNA反转录使用反转录酶，DNA预扩增可以使用反转录酶也可以使用DNA聚合酶，因为反转录酶具有DNA聚合酶活性)，只有组份浓度和反应条件根据DNA和RNA的特性作了调整，都属于本领域技术人员能力范围内。
本发明的另一个目的是提供一种样本预扩增方法。在探索本发明的过程中，我们意识到，人工合成的TSO序列具有通用性，如果其长度足够在其起始端或中间端开始设计5’引物，那么只要针对反转录引物设计3’通用引物，就可以利用这两条引物对低丰度样品中一个或多个短片段核酸链进行简单的预扩增。
本发明的另一个方面提供了短片段核酸链预扩增方法，该方法包括反转录和预扩增步骤，其中反转录时通过TSO序列模板转换统一加长不同目标序列5’端，通过不同的反转录引物识别不同目标序列并统一加长目标序列3’端，从而在目标序列的两端加上了用来设计通用引物的序列；核酸预扩增时为反转录产物设计5’和3’通用引物，5’通用引物设计在TSO序列内部，3’通用引物设计在反转录引物通用序列内部。
进一步地，反转录引物为茎环结构或线性结构，长度大于20个碱基，其3’端引入与目标序列3’端互补的4-8个碱基，尤其是6-8个碱基。
进一步地，人工合成TSO序列可以是DNA、RNA或DNA-RNA的杂合序列，长度大于20个碱基，其3’末端为若干个(例如3个)G碱基；TSO序列5’末端可以加入终止基团，如生物素，以避免反转录酶在加长反转录产物上继续生成CCC造成的多次模板转换；TSO序列可以引入修饰碱基如LNA以提高TSO序列的熔解温度。
在一个具体实施方式中，本发明的短片段核酸链的预扩增方法包括：
第一步：提取样本RNA或裂解样本，可按照实验室常规方法提取样本总RNA，在一些实验中也可以将样本裂解后不经提取RNA直接进行反转录；
第二步：样本RNA反转录，使用的反转录组分包括适当浓度的反转录引物：茎环结构且其3’端有4-8个碱基分别与目标miRNA互补、至少一种TSO序列：(5’末端包括了一个生物素的)20个碱基以上的TSO序列、反转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂、缓冲液；
第三步：cDNA预扩增，使用的cDNA预扩增组分包括适当浓度的通用引物、第二步反转录的cDNA、DNA聚合酶、dNTP、镁离子、缓冲液，所述5’通用引物设计在TSO序列内部，3’通用引物设计在反转录引物通用序列内部。
反转录和预扩增条件例如预扩增温度和时间可以根据核酸扩增方法，利用现有公式进行计算，预扩增循环数通常在10-30个循环。
预扩增产物可根据实验需要使用，例如：用于cDNA扩增。cDNA扩增组分：包括适当浓度的特异性核酸扩增引物、预扩增的cDNA、DNA聚合酶、dNTP、镁离子、缓冲液。cDNA扩增条件可以根据不同的核酸扩增方法，利用现有公式进行计算，这均是在本领域技术人员的能力范围内。
本发明的优点和效果
基于本发明的检测方法，在目标序列5’端和3’端各延长了序列，并针对该延长序列及其反义链设计5’和3’专一性引物，在检测短片段核酸链时，可以更好地避免非特异性产物的产生，提高目标片段检测的专一性和灵敏度。
基于本发明的检测方法，目标序列5’端通过模板转换增加了可用于设计5’专一性引物的序列长度，使得引物设计更容易，增强了5’引物设计灵活性。
基于本发明的检测方法，目标序列5’端延长的序列是统一的，可以减少5’引物的Tm值偏差，利于统一不同目标序列的核酸扩增条件，实用性强。
基于本发明的检测方法，目标序列3’端增加了反转录引物序列，增加了可用于设计3’专一性引物的序列长度。
基于本发明的检测方法，目标序列3’端延长的序列一部分是专一性识别目标序列的，另一部分可以根据需要，使用统一的序列或不同的序列：使用统一的序列减少3’引物的Tm值偏差，利于统一不同目标序列的核酸扩增条件或实现预扩增等；使用不同的序列利于实现一管内多重检测。
在同时检测多个短片段核酸链时，可以通过为不同的短片段核酸链设计完全不同的反转录引物，来尽量保持反转录效率一致、避免相似序列的相互干扰，提高检测的准确性；还有利于实现多个目标序列的多重检测。
本发明还可以降低变性温度、缩短延伸时间、添加dUTP等方法，进一步提高检测的专一性和灵敏度。
同时在反转录引物和TSO序列中引入通用序列，可以实现样本的预扩增，提高低丰度样本中目标序列的检测灵敏度。
附图说明
图1：茎环引物法原理和缺陷说明：茎环引物分成a-g区域，其中a-b和e-f区域互补形成“茎”，b-e区域不互补形成“环”，b-e区域中的c-d区域为通用3’引物结合区域，f-g区域为与目标互补的碱基。
图2：本发明miRNA扩增原理，其中，茎环引物1分区与附图1对应，c-d区域不起作用；线性引物分成a’-g区，其中，a’-f区域不与模板互补，f-g区域为与目标互补的碱基。
图3：本发明样本预扩增原理图，其中，茎环引物分区与附图1，2对应，3’预扩增引物结合区域可以在a-f区域内部的任意位置。线性引物分成a’-g区，通用3’预扩增引物结合区域可以在a’-f区域内部的任意位置。
具体实施方式
以下结合附图来进一步说明本发明。
如图2所示，本发明提供一种短片段核酸链检测方法，该方法包括以下步骤：
(A)反转录引物为茎环结构1或线性结构2，长度大于15个碱基，其3’端有4-8个碱基(尤其是6-8个碱基)f-g与目标序列0互补，以识别目标序列；反转录后，反转录引物本身加长了目标序列反义链的5’端，形成中间产物3或4，相当于其反义链加长了目标序列0的3’端；
(B)反转录之前需要加入具有模板转换特性的反转录酶和至少一种6个碱基以上的人工合成TSO序列7，其3’末端为若干个(例如3个)G碱基7‐1，以结合中间产物3或4 3’端生成的若干个(通常是3个)C碱基，中间产物3或4以TSO序列7‐2部分为模板继续延长，TSO序列7‐2部分的反义链加长了3或4的3’端，形成了两端加长的反转录产物5或6，相当于TSO序列本身加长了目标序列0的5’端；
(C)核酸扩增的上下游引物均为序列专一性引物，5’引物专一性8跨越TSO序列和目标序列衔接部分，结合两端加长的反转录产物5，6，核酸扩增第一个循环后生成了反转录产物5，6的反义链5R,6R，即两端加长后的目标序列cDNA，随后3’引物专一性引物9跨越目标序列和反转录引物衔接部分，结合两端加长后的目标序列cDNA 5R,6R，上下游引物从第二个循环开始进行指数扩增。
5’引物8扩增反转录产物5、6，5’引物序列从5’到3’由3部分组成：
①5’端有一部分8-1(例如2-12个碱基)与反转录之前加入的人工合成TSO序列7的3’端(例如2-12个连续碱基)一致，即与反转录产物5,6互补；
②紧接着是3个G碱基8-2,与模板转换时反转录产物5,6的3’端生成的3个C碱基互补；
③随后的碱基8-3(例如10-15碱基)与目标序列0的5’端一致(U碱基要替换成T碱基)，即与目标序列反转录产物5,6互补。
3’引物9扩增两端加长后的目标序列cDNA 5R或6R，3’引物序列从5’到3’由2部分组成：
①5’端有一部分9-1(例如13-18个)碱基分别与各自的反转录引物1,2的3’端一致，即两端加长后的目标序列cDNA 5R，6R互补，其中包括了反转录引物与目标序列互补的g-f区域；
②随后的9-2(例如3-6个碱基)与目标序列中间的h-g区域互补，即与反转录产物5,6的部分碱基h-g相同，与两端加长后的目标序列cDNA 5R,6R互补。
最后获得核酸扩增产物10。
模板转换时为了避免继续加长模板，TSO序列5’末端可以包括一个终止基团，如生物素7-3；为了提高TSO序列的熔解温度可以加上修饰碱基，如序列表seq no.7。
如图3所示，本发明提供一种短片段核酸链的预扩增方法，该方法包括反转录和预扩增，其中：
(A)反转录引物为茎环结构1或线性结构2，长度大于20个碱基，其3’端有4‐8个碱基f‐g区域分别与目标序列0互补，以识别目标序列；反转录后，反转录引物本身加长了目标序列反义链的5’端，形成中间产物3或4，相当于其反义链加长了目标序列0的3’端；
(B)反转录之前加入具有模板转换特性的反转录酶和至少一种20个碱基以上的人工合成TSO序列7，其3’末端为若干个(例如3个)G碱基7-1，以结合中间产物3或4 3’端生成的若干个(通常是3个)C碱基，3或4以TSO序列7-2部分为模板继续延长，TSO序列的反义链加长了3或4的3’端，形成了两端加长的反转录产物5或6，相当于TSO序列本身加长了目标序列0的5’端；
(C)核酸预扩增时使用一对通用的预扩增引物11,12，5’引物11的15-25个连续碱基与人工合成TSO序列7中的15-25个碱基完全相同，即与反转录产物5或6的15-25个碱基互补，结合一个或多个反转录产物5，6，核酸扩增第一个循环后生成了反转录产物5，6的反义链5R,6R，即两端加长后的目标序列cDNA；随后3’引物12的15-25个连续碱基与反转录引物通用序列a-f区域中的15-25个连续碱基完全相同，即与两端加长后的目标序列cDNA 5R,6R互补，3’引物12结合一个或多个两端加长后的目标序列cDNA 5R,6R，上下游引物从第二个循环开始进行指数扩增。预扩增后获得预扩增产物13。
模板转换时为了避免继续加长模板，TSO序列5’末端可以包括一个终止基团，如生物素7-3；为了提高TSO序列的熔解温度可以加上修饰碱基，如序列表seq no.7。
预扩增产物可根据实验需要使用，例如：用于cDNA扩增，获得核酸扩增产物16。cDNA扩增组分：包括适当浓度的特异性核酸扩增引物14、15(相当于图2的专一性引物8,9)、预扩增的cDNA、DNA聚合酶、dNTP、镁离子、缓冲液。
实施例1 miRNA定量检测-实时荧光PCR法
实验目的：比较根据本发明思路设计的miRNA定量检测方法与通用3’茎环引物法的本底扩增
实验设计思路：选取3个miRNA设计通用茎环引物(末端4个碱基不同，分别与目标miRNA结合，茎环结构通用),设计4组实验，分别是：
A组：通用3’引物实验组，以RNA为模板，反转录引物：茎环引物，PCR引物：5’专一性引物，3’通用引物；
B组：通用3’引物对照组，不加RNA模板，用A组PCR引物进行PCR；
C组：本发明实验组，以RNA为模板，反转录引物：茎环引物，加入TSO序列，PCR引物：按本发明设计原则设计的引物；
D组：本发明对照组，不加RNA模板，用C组PCR引物进行PCR
具体的miRNA序列，以及针对设计的引物序列，包括反转录引物序列、TSO序列、cDNA扩增引物序列在序列表中的编号如下：
注：由于所选择的目标序列相差很小，所以在引物设计过程中会出现某些引物相同的情况，为避免混淆，实验中全部一对一合成、编号，不作合并统计。例如：seq No.4和5是一样的序列，但是针对不同的目标，所以分开合成、分开编号。实施例2和例3同样是分开编号。
总RNA：人工合成的miRNA，加入人海拉细胞总RNA，浓度：4×106拷贝数/ul。
反转录和PCR组分终浓度/添加量、反应条件：
3次重复的实验结果：
实验结果分析：
1.A组和B组对照，B组3个指标均产生了本底扩增，本底扩增产物的Tm值与目标产物完全一致，难以区分，因此A组的扩增结果不完全可信。
2.C组和D组对照，可见D组仅有1个指标有本底扩增且Ct值大于38，该本底基本可以忽略，C组扩增结果可靠性强。
3.B组和D组对照，B组未加TSO序列其本底仍比D组加了TSO序列强，说明TSO序列对本底没有影响。
实施例2 miRNA定量检测-实时荧光PCR法
实验目的：比较根据本发明思路设计的miRNA定量检测方法与半巢式PCR法的扩增效率
实验设计思路：针对8个miRNA,设计2组实验，分别是：
E组：反转录引物：专用茎环引物；PCR引物：按背景文献2原则设计的5’和3’特异性引物
F组：反转录引物：专用茎环引物+TSO序列；PCR引物：按本发明设计原则设计的5’和3’特异性引物
具体的miRNA、反转录引物序列、TSO序列、cDNA扩增引物序列在序列表中的编号如下：
总RNA：人工合成的上述8个miRNA，每个miRNA浓度为4×106拷贝/ul。
反转录和PCR组分终浓度/添加量、反应条件：
3次重复的实验结果：
实验结果比较：
实验结果分析：
1.F组8个指标全部检出，E组检出7个；F组灵敏度/检出率高。
2.除7g外，F组7个指标3个重复的平均Ct值比E组低7.7-9.26，扩增效率高2^7.7-2^9.26倍，即208-613倍；F组扩增效率高。
3.除7g外，F组7个指标的3个重复的ct值标准差(SD)明显比E组低，F组准确性高。
4.E组与F组的扩增产物不完全相同，Tm值没有可比性，但除7g外，E组和F组7个指标的3个重复的Tm值标准差均小于0.1，说明两组均为特异性扩增，特异性都非常好。
5.除7g外，F组Tm值标准差为0.01-0.03，平均0.015，E组Tm值标准差为0.01-0.06，平均0.0329，F组特异性比E组更高。
实施例3 低丰度样品预扩增
实验目的：测试本发明思路设计的样本预扩增方法灵敏度/检出率和特异性/专一性
实验设计思路：采用低丰度样本，分成预扩增组和未预扩增组，测试实施实例1中3个miRNA的表达定量结果。
G组：未预扩增组，反转录后将预扩增组分加齐，置于4℃下直至B组完成预扩增，与B组同时进行PCR扩增。
H组：预扩增组。
反转录引物、TSO序列、PCR引物均采用实施实例1C组引物，预扩增引物序列：5’引物SEQ No.71,3’引物SEQ ID No.8。
样本来源：3个人外泌体miRNA浓度：均为约20ng/ul。
反应终浓度/添加量、反应条件：
三个样本实验结果：
实验结果说明：
1.H组3个样本3个指标ct值全部在30以下，Tm值正常，检出率9/9；G组绝大部分ct值大于35，但Tm值正常，其中7i有2个样本检测结果为40，检出率7/9。
2.除7i外，两组各指标Tm值相差均不大，都为专一性/特异性产物，且G组检出的2个指标和H组产物相同，检测专一性/特异性不受影响。
综上，本发明的预扩增方法可以大大提升低丰度样品的目标miRNA含量，提高低丰度样品的灵敏度/检出率，检测专一性/特异性不受影响。
上述实施实例仅为说明本发明的实施效果，不能以此限定本发明的范围。
序列表
<110> 上海境象生物科技有限公司
<120> 一种短片段核酸链检测方法和预扩增方法
<130> 1709825F
<160> 71
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
ugagguagua gauuguauag uu 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
ugagguagua guuugugcug uu 22
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctactcgtc ctgtcacagt aggaactat 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctactcgtc ctgtcacagt aggaactat 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctactcgtc ctgtcacagt aggaacagc 29
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagcagtggt atcaacgcag agtacatrgr grg 33
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctactcgtc ctgtcacagt agg 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgaggtagta ggttgtatag tt 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acatgggtga ggtagtaggt 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcctgtcaca gtaggaacta taca 24
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaggtagta gattgtatag tt 22
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagtacatgg gtgaggtagt agat 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcctgtcaca gtaggaacta taca 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgaggtagta gtttgtgctg tt 22
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agtacatggg tgaggtagta gtt 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgtcacagta ggaacagcac a 21
<210> 18
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
ugagguagua gguuguaugg uu 22
<210> 20
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
agagguagua gguugcauag uu 22
<210> 21
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
ugagguagga gguuguauag uu 22
<210> 22
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
ugagguagua guuuguacag uu 22
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tttcgaggac taaagccgaa aaactat 27
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgatattaca gtagcttatc gaaccac 27
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgttggctcc gagattcaac aaaccat 27
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tttcgaggac taaagccgaa aaactat 27
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgtgtaccca ttcaccacac aaactat 27
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgtgtaccca ttcaccacac aaactat 27
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acatctgcct caatacgatg taactgt 27
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttggtatctg tattatgtac caaaacagc 29
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cctactcgtc ctgtcacagt aggaactat 29
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cctactcgtc ctgtcacagt aggaaccac 29
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cctactcgtc ctgtcacagt aggaaccat 29
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cctactcgtc ctgtcacagt aggaactat 29
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cctactcgtc ctgtcacagt aggaactat 29
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cctactcgtc ctgtcacagt aggaactat 29
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cctactcgtc ctgtcacagt aggaactgt 29
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cctactcgtc ctgtcacagt aggaacagc 29
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gcggctgagg tagtaggt 18
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aggactaaag ccgaaaaact ataca 25
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acatgggtga ggtagtaggt 20
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tcctgtcaca gtaggaacta taca 24
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gcggctgagg tagtaggt 18
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cagtagctta tcgaaccaca ca 22
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
acatgggtga ggtagtaggt 20
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tgtcacagta ggaaccacac a 21
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gcggctgagg tagtaggt 18
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tccgagattc aacaaaccat aca 23
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
acatgggtga ggtagtaggt 20
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cctgtcacag taggaaccat aca 23
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gcggcagagg tagtaggt 18
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gactaaagcc gaaaaactat gca 23
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
acatgggaga ggtagtaggt 20
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ctgtcacagt aggaactatg ca 22
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gcggctgagg taggaggt 18
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cccattcacc acacaaacta taca 24
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
acatgggtga ggtaggaggt 20
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tcctgtcaca gtaggaacta taca 24
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cgcggctgag gtagtagat 19
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cccattcacc acacaaacta taca 24
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gagtacatgg gtgaggtagt agat 24
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tcctgtcaca gtaggaacta taca 24
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cgcggctgag gtagtagtt 19
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gcctcaatac gatgtaactg taca 24
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acatgggtga ggtagtagtt 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gtcacagtag gaactgtaca 20
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
cgcggctgag gtagtagtt 19
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
tctgtattat gtaccaaaac agcaca 26
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
agtacatggg tgaggtagta gtt 23
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
tgtcacagta ggaacagcac a 21
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
Claims (13)
1.一种短片段核酸链检测方法，该方法包括反转录步骤和核酸扩增步骤，其特征是，反转录时通过TSO序列模板转换加长目标序列5’端，通过反转录引物识别目标序列并加长目标序列3’端，从而加长了检测模板的两端能够用来设计专一性引物的序列长度；核酸扩增时为反转录产物设计5’和3’专一性引物，5’专一性引物跨越TSO序列和目标序列衔接部分，3’专一性引物跨越目标序列和反转录引物衔接部分。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，反转录引物为茎环结构或线性结构，长度大于15个碱基，其3’端引入与目标序列互补的4-8个碱基，尤其是6-8个碱基，另外，目标序列5’端通过具有模板转换特性的反转录酶引入至少一种6个碱基以上的人工合成TSO序列。
3.一种短片段核糖核酸链检测方法，包括以下步骤：
第一步：提取样本RNA或裂解样本；
第二步：样本RNA反转录，所使用的反转录组分包括适当浓度的茎环结构或线性反转录引物，其3’端有4-8个碱基与目标序列互补、TSO序列：6个碱基以上的TSO序列(例如其5’末端包括一个生物素基团)、具有模板转换特性的反转录酶、dNTP(其中含或不含dUTP)、RNA酶抑制剂、缓冲液；
第三步：cDNA扩增，所使用的cDNA扩增组分包括适当浓度的成对专一性引物、第二步反转录产物、DNA聚合酶、dNTP(其中含或不含dUTP)、镁离子、缓冲液，其中所述专一性引物对应目标序列反转录产物，5’专一性引物跨越TSO序列和目标序列衔接部分，3’专一性引物跨越目标序列和反转录引物衔接部分。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，反转录步骤在反转录引物上引入dU，反转录后添加UNG酶裂解反转录引物。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其中，采用一个兼具模板转换、反转录和DNA聚合酶特性的酶或将反转录酶和DNA聚合酶混合在一个体系中，第二步反转录和第三步cDNA扩增在同一个体系、同一步反应内进行。
6.一种短片段脱氧核糖核酸链(DNA)检测方法，包括以下步骤：
第一步：提取样本DNA或裂解样本；
第二步：样本DNA预扩增，所使用的扩增组分包括适当浓度的一个或多个预扩增引物：3’端有4-8个碱基与目标DNA的一条链互补、TSO序列：6个碱基以上的TSO序列(例如其5’末端包括一个生物素基团)、具有模板转换特性的DNA聚合酶、dNTP(其中含或不含dUTP)、缓冲液；
第三步：样本DNA正式扩增，所使用的DNA扩增组分包括适当浓度的一对或多对专一性引物、第二步预扩增产物、DNA聚合酶、dNTP(其中含或不含dUTP)、镁离子、缓冲液，其中所述专一性引物对应预扩增产物，5’专一性引物跨越TSO序列和目标序列衔接部分，3’专一性引物跨越目标序列和预扩增引物衔接部分。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其中，第二步使用具有模板转换特性的DNA聚合酶是反转录酶，第三步是普通DNA聚合酶或热启动DNA聚合酶。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其中，预扩增步骤在预扩增引物上引入dU，预扩增后添加UNG酶裂解预扩增引物。
9.一种短片段核酸链预扩增方法，该方法包括反转录和预扩增步骤，其中反转录时通过TSO序列模板转换统一加长不同目标序列5’端，通过不同的反转录引物识别不同目标序列并统一加长目标序列3’端，从而在目标序列的两端加上了用来设计通用引物的序列；核酸预扩增时为反转录产物设计5’和3’通用引物，5’通用引物设计在TSO序列内部，3’通用引物设计在反转录引物通用序列内部。
10.根据权利要求9所述的预扩增方法，其中，反转录引物为茎环结构或线性结构，长度大于20个碱基，其3’端引入与目标序列互补的4-8个碱基，尤其是6-8个碱基，另外，目标序列5’端通过具有模板转换特性的反转录酶引入至少一种20个碱基以上的人工合成TSO序列。
11.一种短片段核酸链的预扩增方法，包括以下步骤：
第一步：提取样本RNA或裂解样本；
第二步：样本RNA反转录，使用的反转录组分包括适当浓度的反转录引物：茎环结构且其3’端有4-8个碱基分别与目标miRNA互补、至少一种TSO序列(例如5’末端包括了一个生物素的20个碱基以上的TSO序列)、反转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂、缓冲液；
第三步：cDNA预扩增，使用的cDNA预扩增组分包括适当浓度的通用引物、第二步反转录的cDNA、DNA聚合酶、dNTP、镁离子、缓冲液，所述通用引物的5’引物设计在人工合成TSO序列内部，3’引物设计在反转录引物通用序列内部。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的检测方法和预扩增方法，其中，TSO序列其5’末端包括一个可避免多次模板转换的终止基团，如生物素；3’末端为若干个G碱基。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的检测方法和预扩增方法，其中，TSO序列可引入修饰碱基如LNA，以提高其熔解温度。
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