CN105734679A - 核酸靶序列捕获测序文库的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了核酸靶序列捕获测序文库的制备方法；a)根据目标靶序列设计并合成捕获探针A和B溶液；b)在待测DNA或RNA样品中加入探针A溶液，同时加入DNA聚合酶或逆转录酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液,延伸探针A；c)再加入链霉亲合素包被的磁珠与探针A结合并洗涤磁珠；d)在含有磁珠的缓冲液中再添加探针B溶液；e)在缓冲液中加入DNA聚合酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液延伸探针B；f)洗涤磁珠，通过加热变性使捕获探针B延伸产物从磁珠上解离洗脱下来；g)以捕获探针B延伸产物为模板，用公共引物a和b进行文库PCR扩增，本发明具有高通量、高特异性、高灵敏度、操作方便、操作成本低、适用范围广。

Description

核酸靶序列捕获测序文库的制备方法

技术领域

本发明属于核酸测定或检验方法的技术领域，具体是涉及一种基于引物延伸的核酸靶序列捕获测序文库的制备方法。

背景技术

近年来崛起的新一代高通量DNA测序技术能够并行地对数十亿的DNA片段进行序列测定以及量化，为基础生物医学研究和临床检测提供了一个强大的工具；高通量DNA测序技术的发展也带动了另一项重要的技术的兴起——靶序列捕获测序；靶序列捕获测序是首先通过一些靶向方法提取我们所关心目标基因的DNA片段制备成靶序列测序文库，然后通过高通量测序对其进行分析，例如外显子组(Exome)捕获测序捕获和测定占大约30Mb的全部外显子序列；因为这种测序并不是该物种基因组的首次测序，故称为靶向重测序(Targetedresequencing)；靶向测序技术对于庞大的人类或高等生物的基因组，可以成千上万倍地提高测序的效率，极大地提高样本的通量，使高通量测序更加有效地用于生物医学领域；目前已经发展了多种靶序列捕获策略，主要包括固相芯片捕获、液相探针捕获、分子倒置探针(Molecularinversionprobes)以及乳液PCR(Raindance)等。

固相芯片捕获方法是先将靶序列探针(50-70mer)用DNA芯片平行合成技术原位合成在玻璃片上，然后将制备好的测序文库杂交到芯片上；经过条件严谨洗涤，所得到的捕获产物经PCR扩增后测序；通常经过固相芯片捕获，大概50％-60％的序列可以比对到靶序列区域。

液相捕获方法是先用原位芯片或常规方法合成超长的靶探针(150-210mer)，然后将其通过T7RNA启动子进行体外转录扩增，产生生物素化的RNA探针；该探针可以在试管中进行杂交和富集，相对固相捕获要方便的多；目前这两个方法已被广泛地应用于连锁分析或关联分析所需的大样本研究。

固相芯片捕获和液相捕获是目前最主要的靶序列测序文库制备方法，但是它们在技术上仍然存在一定的局限性；首先，无论是固相芯片捕获还是液相捕获都需要首先将样品DNA通过连接法制备成测序文库，测序文库制备的步骤繁琐难以自动化、耗时耗力。测序文库制备的步骤主要包括：将基因组DNA片段化，将片段化的DNA末端修补齐，在DNA聚合酶的作用下在3’末端加上一个腺苷酸，然后通过DNA连接酶在DNA片段的两端连接含有通用引物序列的接头序列，最后通过一对通用引物扩增DNA片段；然后将制备好的测序文库和靶序列探针杂交，捕获出靶序列。同时，由于测序文库制备的步骤多并且每一步反应后都需要进行纯化，测序文库的制备依赖于起始DNA的量，通常需要100ng以上。然而，目前的研究或诊断常常需要分析极少量的细胞甚至单个细胞或者游离DNA，例如分析循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA需要灵敏度更高的靶向测序文库制备方法。

另外，靶序列的捕获探针昂贵，杂交捕获的效率有限(通常50％-60％的捕获效率)；因此该方法的通量低、灵敏度受到一定程度的限制，对于需要高通量的大规模基因组计划或诊疗测序来说不是最适宜的方法。

随着基因高通量测序在生命医药领域中迅速发展，其高通量检测的优点被广泛应用，但是目前仍然缺乏一种高通量、高灵敏度、高特异性、低成本的靶序列文库制备方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，该核酸靶序列捕获测序文库的制备方法通过利用两组捕获探针引物序列，通过两次DNA延伸反应，将样品DNA或RNA中的靶基因序列通过DNA合成复制到探针引物上；然后通过探针引物上的公共测序引物区域，用一对公共引物将复制有靶序列的探针进行PCR扩增，获得靶序列的DNA或RNA测序文库。

为了达到上述目的，本发明提出了一种核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其步骤如下：

a)根据目标靶序列设计并合成两组捕获探针A和B溶液；捕获探针A溶液中捕获探针A(1,2,3…n)的结构从5’到3’端分别是：生物素标记、公共序列P1和与靶序列一侧互补的特异性捕获引物序列a(1,2,3…n)；捕获探针B溶液中捕获探针B(1,2,3…n)的结构从5’到3’端分别是：公共序列P2和与靶序列一侧相同的特异性引物序列b(1,2,3…n)；

b)在待测的DNA或RNA样品中首先加入捕获探针A溶液，同时加入DNA延伸所需的DNA聚合酶或逆转录酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，捕获探针A通过其3’端的靶特异性序列a(1,2,3…n)和待测样品中的互补DNA或RNA链杂交，并且探针的3’末端在DNA聚合酶或逆转录酶的作用下以靶序列为模板进行DNA合成，将靶序列复制到捕获探针A上，形成有靶序列的捕获探针A单链，捕获探针A单链的结构为：从5’到3’端分别是生物素标记、公共引物序列P1、特异性引物序列、目标靶序列；

c)再加入链霉亲合素包被的磁珠，捕获探针A通过其5’末端的生物素标记结合到链霉亲合素包被的磁珠上，然后分离磁珠，将反应液去除，洗涤磁珠，去除非特异性吸附；将结合有捕获探针A延伸产物的磁珠重新悬浮在缓冲液中；

d)在含有磁珠的缓冲液中再添加捕获探针B溶液，捕获探针B通过其3’末端的靶特异性序列与捕获探针A上复制的目标靶序列单链互补区域杂交，然后洗涤磁珠去除非特异性吸附，将磁珠重新悬浮在缓冲液中；

E)在缓冲液中加入DNA聚合酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，杂交的捕获探针B的3’末端以捕获探针A延伸产物为模板进行DNA合成，捕获探针B延伸产物的结构为：公共引物序列P2-B组特异性引物序列-目标靶序列-A组特异性引物序列-公共引物序列P1；

F)洗涤磁珠，通过加热变性使捕获探针B延伸产物从磁珠上解离洗脱下来；收集捕获探针B延伸产物；

G)以捕获探针B延伸产物为模板，用公共引物a和b进行文库PCR扩增；扩增产物即为靶序列捕获测序文库。

进一步，所述待测的DNA或RNA样品设置为基因组DNA、线粒体DNA、游离DNA、cDNA、总RNA、信使RNA、长非编码RNA、小RNA和RNA逆转录产物。

进一步，针对所有目标靶序列设计并合成两组捕获探针A和B溶液对应的目标靶序列数目设置为不少1个。

进一步，1个所述捕获探针A可以对应设置有不少于1个捕获探针B或者1个所述捕获探针B可以对应设置有不少于1个捕获探针A。

进一步，所述探针A和探针B上的公共引物区域和特异性引物区域都可以设置有简并性碱基。

进一步，所述DNA聚合酶或逆转录酶包括各种DNA聚合酶和逆转录酶，如高保真DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、Klenow聚合酶、II反转录酶、ThermoScript^TM酶等。

本发明的有益效果在于：

1、本发明核酸靶序列捕获测序文库的制备方法通过利用两组捕获探针引物序列，通过两次DNA延伸反应，将样品DNA或RNA中的靶基因序列通过DNA合成复制到探针引物上；然后通过探针引物上的公共测序引物区域，用一对公共引物将复制有靶序列的探针进行PCR扩增，获得靶序列的DNA或RNA测序文库；

2、本发明核酸靶序列捕获测序文库的制备方法具有以下优点：

1)高通量：可以同时对上千个不同的基因进行定向的靶测序；

2)高特异性：非常高的靶向捕获特异性，可以高达98％以上，接近PCR；

3)高灵敏度：起始DNA的量仅需要10ng甚至更低；

4)操作方便：实现了靶向捕获和测序文库制备的同步进行，极大地简化了实验过程，在人力物力上都大大地降低了单个样品的测序成本，极大地提高了检测样品的通量，在大样品量的临床医学研究和新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断检测上有着极大优势和应用前景；

5)操作成本低：不需要进行单独的测序文库制备，一次合成的捕获探针可用于上千个样品；

6)适用范围广：适用于几个到几千个靶基因。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明核酸靶序列捕获测序文库的制备方法中捕获探针的结构示意图；

图2为本发明核酸靶序列捕获测序文库的制备方法中核酸靶向测序文库的制备流程图。

序列表的序列描述：

SEQIDNo.1～50：捕获探针A1～A50的序列：

Biotin-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-specific_forward_primer；

SEQIDNo.51～100：捕获探针B1～B50序列：

CGTAATCGGGAAGCTGAAGNNNNNNNN-specific_reverse_primer；

SEQIDNo.101：捕获探针B延伸产物序列：

SEQIDNo.102：公共引物a序列：

5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

SEQIDNo.103：公共引物b序列：

5'AAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT。

具体实施方式

如图1所示为本发明核酸靶序列捕获测序文库的制备方法中捕获探针的结构示意图；如图2所示为本发明核酸靶序列捕获测序文库的制备方法中核酸靶向测序文库的制备流程图；本发明提出了一种核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其步骤如下：

a)根据目标靶序列设计并合成两组捕获探针A和B溶液；捕获探针A和B溶液分别由捕获探针A1、A2、A3、…、An和B1、B2、B3、…、Bn合并形成的；捕获探针A溶液中捕获探针A的结构从5’到3’端分别是：生物素标记、公共序列P1和与靶序列一侧互补的特异性捕获引物序列a；捕获探针B溶液中捕获探针B的结构从5’到3’端分别是：公共序列P2和与靶序列相同的特异性引物序列b；本实施例中捕获探针A和B溶液分别由捕获探针A1、A2、A3、…、A50和B1、B2、B3、…、B50合并形成的；

b)在待测的DNA样品中首先加入捕获探针A溶液，然后同时加入捕获探针A延伸所需的DNA聚合酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，捕获探针A通过其3’端的靶特异性序列a(1,2,3…50)和待测样品中的互补DNA链杂交，并且探针的3’末端在DNA聚合酶的作用下以靶序列为模板进行DNA合成，将靶序列复制到捕获探针A上，形成有靶序列的捕获探针A单链，捕获探针A单链的结构为：从5’到3’端分别是生物素标记，公共引物序列P1，特异性引物序列，目标靶序列；本实施例采用天根血液提取试剂盒从外周血提取DNA，加入TaqDNA聚合酶反应缓冲液、dNTP、H₂O、捕获探针A溶液，然后置于PCR仪上，利用升温使DNA变性，在聚合酶的作用下使单链复制成双链，在反应液温度升到80℃以上时，加入TaqDNA聚合酶，在反应液温度升到94℃时保温5分钟，然后温度降至58℃保温10分钟，加入EDTA终止合成反应；

c)再加入链霉亲合素包被的磁珠，捕获探针A延生产物通过其5’末端的生物素标记结合到链霉亲合素包被的磁珠上，然后分离磁珠，将反应液去除，洗涤磁珠，去除非特异性吸附，将结合有捕获探针A延伸产物的磁珠重新悬浮在缓冲液中；本实施例加入DynalMyoOneC1链霉亲和素包被的磁珠，室温下旋转孵育30分钟，用磁铁收集磁珠，弃上清，加入0.1MNaOH，室温下旋转孵育10分钟，收集磁珠，弃上清，用pH为8.0磁珠洗涤缓冲液(Tris-HCl：100mM；EDTA：10mM和NaCl：1M)洗涤2次，然后用1倍的TaqDNA聚合酶反应缓冲液洗涤1次，弃上清；

d)在含有磁珠的缓冲液中再添加捕获探针B溶液，捕获探针B通过其3’末端的靶特异性序列与捕获探针A上复制的DNA靶序列单链互补区域杂交，然后洗涤磁珠去除非特异性吸附，将磁珠重新悬浮在缓冲液中；本实施例将结合有捕获探针A延生产物的DynalMyoOneC1磁珠悬浮在1倍的TaqDNA聚合酶反应缓冲液中，加入捕获探针B溶液、在37℃杂交1小时，然后洗涤磁珠去除非特异性吸附，将磁珠重新悬浮在1倍的TaqDNA聚合酶反应缓冲液中；

E)在上述缓冲液中加入DNA聚合酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，杂交的捕获探针B的3’末端以捕获探针A延伸产物为模板进行DNA合成，捕获探针B延伸产物的结构为：公共引物序列P2-B组特异性引物序列-目标靶序列-A组特异性引物序列-公共引物序列P1；本实施例在上述步骤杂交1小时后，加入dNTP和TaqDNA聚合酶，在42℃时进行DNA合成反应，反应时间为10分钟；

F)洗涤磁珠，然后通过加热变性使捕获探针B延伸产物从磁珠上解离洗脱下来，收集探针B延伸产物；本实施例将上述反应后的磁珠悬浮在超纯水中，并升温到95℃，快速收集上清液；

G)以捕获探针B延伸产物为模板，用公共引物a和b进行文库PCR扩增，扩增产物即为靶序列捕获测序文库；本实施例以上述收集的25ul上清液做为模板进行PCR扩增，反应体系为：PhusionDNA聚合酶反应缓冲液、洗脱的DNA、公共引物a、公共引物b、dNTP、H₂O和PhusionDNA聚合酶，PCR循环条件为：98℃，2分钟；98℃，20秒，58℃，20秒，72℃，30秒；循环30-33个循环，然后在72℃延伸7分钟，不同的样品按以上条件进行靶向目标序列扩增，扩增的PCR产物被不同的样品编码序列所编码；合并不同的样品扩增产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳分离目标PCR产物(280-300bp)，用手术刀割取280-300bp条带的PCR产物，再用QIAquickGelExtractionKit回收和纯化目标DNA；以胶回收的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增反应为：PhusionDNA聚合酶反应缓冲液、胶回收的DNA、公共引物a、公共引物b、dNTP、H₂O和PhusionDNA聚合酶；PCR循环条件：98℃，2分钟；98℃，20秒，65℃，30秒，72℃，30秒；循环10-13个循环，然后在72℃延伸7分钟；反应完毕用Qiagen公司的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物；在纯化的最后一步中用去离子水代替洗脱液；用2％的琼脂糖凝胶进行电泳进行检测。

进一步，优选的所述待测的DNA样品设置为基因组DNA、cDNA、血液游离DNA和RNA逆转录产物。

进一步，优选的针对所有目标靶序列设计并合成两组捕获探针A和B溶液对应的目标靶序列数目设置为不少1个。

进一步，优选的1个所述捕获探针A可以对应设置有不少于1个捕获探针B或者1个所述捕获探针B可以对应设置有不少于1个捕获探针A。

进一步，优选的所述探针A和探针B上的特异性引物区域可以设置有简并性碱基。

进一步，优选的所述DNA聚合酶包括高保真DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、高保真TaqDNA聚合酶和Klenow聚合酶。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其特征在于：其步骤如下：

a)根据目标靶序列设计并合成两组捕获探针A和B溶液；捕获探针A溶液中捕获探针A(1,2,3…n)的结构从5’到3’端分别是：生物素标记、公共序列P1和与靶序列一侧互补的特异性捕获引物序列a(1,2,3…n)；捕获探针B溶液中捕获探针B(1,2,3…n)的结构从5’到3’端分别是：公共序列P2和与靶序列一侧相同的特异性引物序列b(1,2,3…n)；

b)在待测的DNA或RNA样品中首先加入捕获探针A溶液，然后同时加入DNA延伸所需的DNA聚合酶或逆转录酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，捕获探针A通过其3’端的靶特异性序列a(1,2,3…n)和待测样品中的互补DNA或RNA链杂交，并且探针的3’末端在DNA聚合酶或逆转录酶的作用下以靶序列为模板进行DNA合成，将靶序列复制到捕获探针A上，形成有靶序列的捕获探针A单链，捕获探针A单链的结构为：从5’到3’端分别是生物素标记，公共引物序列P1，特异性引物序列，目标靶序列；

c)再加入链霉亲合素包被的磁珠，捕获探针A通过其5’末端的生物素标记结合到链霉亲合素包被的磁珠上，然后分离磁珠，将反应液去除，洗涤磁珠，去除非特异性吸附；将结合有捕获探针A延伸产物的磁珠重新悬浮在缓冲液中；

d)在含有磁珠的缓冲液中再添加捕获探针B溶液，捕获探针B通过其3’末端的靶特异性序列与捕获探针A上复制的目标靶序列单链互补区域杂交，然后洗涤磁珠去除非特异性吸附，将磁珠重新悬浮在缓冲液中；

E)在缓冲液中加入DNA聚合酶、dNTP和含Mg2+的缓冲液，杂交的捕获探针B的3’末端以捕获探针A延伸产物为模板进行DNA合成，捕获探针B延伸产物的结构为：公共引物序列P2-B组特异性引物序列-目标靶序列-A组特异性引物序列-公共引物序列P1；

F)洗涤磁珠，通过加热变性使捕获探针B延伸产物从磁珠上解离洗脱下来；收集捕获探针B延伸产物；

G)以捕获探针B延伸产物为模板，用公共引物a和b进行文库PCR扩增；扩增产物即为靶序列捕获测序文库。

2.根据权利要求1所述的核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其特征在于:所述待测的DNA或RNA样品设置为基因组DNA、线粒体DNA、游离DNA、cDNA、总RNA、信使RNA、长非编码RNA、小RNA和RNA逆转录产物。

3.根据权利要求1所述的核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其特征在于：针对所有目标靶序列设计并合成两组捕获探针A和B溶液对应的目标靶序列数目设置为不少1个。

4.根据权利要求1所述的核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其特征在于：1个所述捕获探针A可以对应设置有不少于1个捕获探针B或者1个所述捕获探针B可以对应设置有不少于1个捕获探针A。

5.根据权利要求1所述的核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其特征在于：所述探针A和探针B上的公共引物区域和特异性引物区域都可以设置有简并性碱基。

6.根据权利要求1所述的核酸靶序列捕获测序文库的制备方法，其特征在于：所述DNA聚合酶或逆转录酶包括各种DNA聚合酶和逆转录酶，如高保真DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、Klenow聚合酶、II反转录酶、ThermoScript^TM酶等。