CN107236727A

CN107236727A - 多基因捕获测序的单链探针制备方法

Info

Publication number: CN107236727A
Application number: CN201710397693.6A
Authority: CN
Inventors: 王弢; 官民晓; 巴兆粉; 陆亚红
Original assignee: Jiangsu Is Real Biopharmaceutical Technology Ltd By Share Ltd
Current assignee: Jiangsu Is Real Biopharmaceutical Technology Ltd By Share Ltd
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2017-10-10
Anticipated expiration: 2037-05-31
Also published as: CN107236727B

Abstract

本发明公开了一种多基因捕获测序的单链探针制备方法，该方法包括如下步骤：1、芯片合成，2、芯片DNA洗脱，3、用含dUTP的PCR反应体系扩增芯片DNA，4、PCR产物用磁珠纯化，5、使用单引物偏向扩增，该引物5’端经生物素标记，得到含有生物素单链与含有dUTP的链的杂合双链DNA，6、加入能够识别并切除dUTP的酶，将5步中的含有dUTP的母链消化，7、消化后产物经纯化，得到含有生物素标记的单链探针，8、稀释至所需浓度并进行分装保存。与市售合成的探针相比，酶法反应条件温和，成本降低，易于推广。

Description

多基因捕获测序的单链探针制备方法

技术领域

本发明属于生物领域，特别涉及用于多基因捕获测序的单链探针制备方法。

背景技术

基于杂交的靶向序列捕获技术根据杂交时状态不同，主要分为固相杂交和液相杂交。固相杂交序列捕获技术是一种将寡核苷酸探针合成在芯片上，并在芯片上进行杂交的高通量序列捕获技术，可以在一个芯片上捕获整个外显子甚至更大的区域。但因为芯片上的寡核苷酸量较少，所以就需要较大的样本起始量来推动杂交的发生。而液相杂交是通过在溶液中，目标DNA片段和已带有生物素标记探针直接杂交，然后通过生物素亲和素的反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的微珠上，洗去非目标DNA，洗脱后，富集的DNA用于测序。与固相杂交相比，液相杂交在动力学上更具优势，杂交效率更高，能降低对于样品起始量的要求。此外，液相杂交更易于操作，时间短，便于自动化操作。相对于液相杂交而言，固相杂交已逐渐被淘汰，而液相杂交中的探针又可分为RNA探针和DNA探针。目前，市场上有代表性的提供探针的三家公司分别为安捷伦，罗氏和IDT，其中，安捷伦主要生产RNA探针，而罗氏和IDT主要生产DNA探针。与DNA探针相比，由于RNA探针的不稳定性，使其在运输、保存及应用等方面均不方便，成本更高。而罗氏和IDT的DNA探针的合成是通过柱式合成而后混合到一起的，而非芯片式合成的，相对与全外显子的量，合成的的代价也是极其昂贵的，是极不易于推广的。虽然市场上也有基于芯片式合成后通过PCR获得的DNA探针，但它们都是双链DNA探针。与安捷伦、罗氏和IDT的单链探针相比，杂交效率大大的降低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的：提供一种用于多基因捕获测序的单链探针制备方法，包括捕获目标基因的探针制备技术及其在二代测序中的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种多基因捕获测序的单链探针制备方法，方法至少包括如下步骤：

(1)芯片合成，合成不同寡核苷酸数量的芯片，所述的芯片包含能够与靶序列结合的80bp-120bp目标区域碱基，目标区域碱基两端分别连接15-20bp碱基末端；

(2)芯片DNA洗脱；

(3)用含dUTP的PCR反应体系扩增芯片DNA，dUTP摩尔浓度范围为5μM-750μM；

(4)PCR产物用磁珠纯化；

(5)将步骤(4)中纯化的PCR产物稀释，作为下一步PCR的模板，使用单引物偏向扩增，该引物5’端经生物素标记，得到含有生物素单链与含有dUTP的链的杂合双链DNA；

(6)加入能够识别并切除dUTP的酶，将(5)步中的含有dUTP的母链消化；

(7)消化后产物经纯化，得到含有生物素标记的单链探针；

(8)对制备的单链探针进行电泳检测和浓度测定，得到每种单链探针物质的量为nmol级别，将质检合格的探针稀释保存。

优选的，所述的芯片序列如下：

5′-...GACGCGTGGATCATCT(N)nTGCATTGCGTGTAGCGA...-3′,

注：虚线“...”代表可延伸的碱基末端,N选自A、C、T、G；n表示80～120的正整数。

优选的，所述的步骤(2)中芯片DNA洗脱包括：将芯片上合成的寡核酸库洗脱，并溶于10mM Tris-HCL，0.1mM EDTA，PH＝8.0，每个寡核苷酸的浓度为fmol级别，扩增得到nmol级别。

优选的，所述的步骤(3)中PCR扩增所需引物序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4或者SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6。

优选的，所述的步骤(3)中PCR反应体系扩增条件为：

优选的，所述的步骤(4)中磁珠为1.3×至1.8×AMPure磁珠。

优选的，所述的步骤(5)中生物素标记的单引物偏向扩增具体序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5。

根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述的步骤(5)中单引物偏向扩增，50μLPCR反应体系下：

PCR反应条件，如下：

根据所述优选实施方案进一步的特征，所述的步骤(6)中能够识别并切除dUTP的酶为UDG酶，加入量为1U-5U，在37℃下，作用30-60min。

根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述的步骤(8)中制备的单链探针用4％的琼脂糖电泳验证产物，目的条带在120-160bp左右；得到每种单链探针物质的量为nmol级别，探针总质量为3-4微克，用Nanodrop测定探针产物浓度为150-200ng/μL，将质检合格的探针，稀释至浓度为20ng/μL，进行分装保存，保存条件为-20℃。

本发明的有益效果：

(1)制备的探针为DNA探针，相比较RNA探针，解决了保存不稳定性，在运输、保存及应用等方面不方便等问题。

(2)制备的探针为DNA单链探针，相比较罗氏NimbleGen探针市场上的单链探针，具有一致的杂交驱动力，但是在制备的成本与价格上具有较大的优势，我们的探针单次捕获的成本低于100元。

(3)独创的单链DNA获得方式：在探针的扩增过程，底物包含dUTP，获得含有dUTP的双链产物；再利用含有生物素标记的引物，进行偏向扩增，底物为普通的dNTPs，获得中间产物：含有生物素单链与含有dUTP的链的杂合双链DNA，制备方法简单且成本较低。

(4)在制备DNA单链探针时，由于与生物素的单链探针互补的DNA单链中含有dUTP，利用UDG酶将与生物素的单链探针互补的DNA单链消化，通过生物酶切的方法制备单链探针，代替了使用强碱解开DNA双链、通过蛋白变性使探针与链霉亲分离，对DNA的损害小，且单链探针的得率高。

一般对于核酸而言，文中所提及的“富集”是指增加样本中特定核酸种类的相对浓度。

偏向扩增文中指PCR使用单引物扩增。术语“靶序列”通常是指具有特定科学、医学或农学相关性的核酸中感兴趣的区域。靶序列可以是全部核酸分子或部分核酸分子。靶序列可包括但不限于人、动物、植物、微生物的基因组或外显子序列中的一个或多个、突变周围的一小段核酸序列、一个或多个重复序列、cDNA序列、内含子序列和调控序列。

一个酶活单位(U)的定义：1分钟内，从双链DNA中降解60pmol的尿嘧啶所需的酶量。酶活测定条件：50μl反应体系，37℃30min内，测定0.2μg DNA(104-105cpm/μg)释放的含有[3H]标记的尿嘧啶。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为捕获前ACTB与EGFR的扩增情况；其中1为：ACTB扩增曲线；2为EGFR扩增曲线图

图2为捕获后ACTB与EGFR的扩增情况；其中1为：ACTB扩增曲线；2为EGFR扩增曲线图

图3为捕获靶区域的测序深度图

图4为捕获前GAPDH与KRAS的扩增情况；其中1为：GAPDH扩增曲线；2为KRAS扩增曲线图

图5为捕获后GAPDH与KRAS的扩增情况；其中1为：GAPDH扩增曲线；2为KRAS扩增曲线图

图6为捕获靶区域的测序深度图

图7为捕获前RNA28SN5与BRAF的扩增情况；其中1为：RNA28SN5扩增曲线；2为BRAF扩增曲线图

图8为捕获后RNA28SN5与BRAF的扩增情况；其中1为：RNA28SN5扩增曲线；2为BRAF扩增曲线图

图9为捕获靶区域的测序深度图

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

材料：合成芯片(Custom Array公司)、待测的DNA(打断的组织样本DNA)

仪器：普通PCR仪(MG96G)、磁力架(BioMag)、电泳仪、Nanodrop分光光度计、二代测序仪(illumina)

试剂：DNA聚合酶(罗氏公司)、10×PCR Buffer(罗氏公司)、MgCl2(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、dUTP(TaKaRa)、UDG酶(NEB)、纯化水。

单链探针制备过程：

(1)芯片合成:合成12K的寡核苷酸数量的芯片，所述的芯片包含80bp-120bp目标区域和两端通用的碱基末端：其中5′端连接16个碱基，3′端连接17个碱基，该芯片为目标区域含EGFR基因的芯片，具体序列如SEQ ID NO.7：

5′-GACGCGTGGATCATCTGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATTGCATTGCGTGTAGCGA-3′；

(2)芯片DNA洗脱：将芯片上合成的寡核酸库洗脱，并溶于80μL的缓冲液中，缓冲液为TE缓冲液，其组成为10mM Tris-HCL，0.1mM EDTA，调节PH＝8.0，每个寡核苷酸的浓度为fmol级别，扩增得到所需浓度。

(3)芯片DNA扩增：PCR反应中所需引物的具体序列为：

引物F SEQ ID NO.1：5′-GACGCGTGGATCATCT-3′，

引物R SEQ ID NO.2：5′-TCGCTACACGCAATGCA-3′；

PCR反应体系中加入dUTP，PCR反应体系和反应条件分别见表1和表2。

表1：PCR反应体系

表2：PCR反应件

(4)PCR产物的纯化：用1.8×AMPure磁珠对PCR产物进行纯化

1)将PCR产物转移到1.5mL的离心管中，取90μL磁珠加入PCR产物中，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。室温静置5min；

2)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清约5分钟，小心移除上清；

3)保持离心管始终处于磁力架中，用新配置的80％的乙醇清洗2次。

4)保持离心管置于磁力架上并开盖，室温2min，保证乙醇挥发完全。

5)将离心管从磁力架上移走，加入22.5μL的ddH₂0加入进行洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。室温静置2min。

6)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清约5分钟，小心将上清移至一个新的离心管。

注意：保证磁珠置于室温半个小时，平衡至室温后才可使用。在使用前确保将磁珠混匀。

(5)将第(4)步纯化的PCR产物稀释100倍后，作为下一步PCR的模板。该PCR反应为偏向扩增，使用的引物为单引物，该引物为5′端生物素标记，具体序列如下：

SEQ ID NO.1：5′Biotin-GACGCGTGGATCATCT-3′；

PCR反应体系和反应条件见表3和表4。

表3：PCR反应体系

10×PCR Buffer	稀释至1×
		MgCl₂	3.5mM
生物素标记的引物	0.2μM
		dNTPs	0.5mM
Taq酶	5U
		模板	1μL
补ddH₂0至	50μL

表4：PCR反应条件

(6)加入UDG酶，将第(5)步中的含有dUTP的母链消化。具体操作如下：

将第(5)步的PCR产物中，加入1U的UDG酶，在37℃下，作用45min。

(7)酶消化后的产物的纯化：用1.8×AMPure磁珠对PCR产物进行纯化，最后洗脱于22.5μL水中，洗脱取上清可得20μL。具体步骤详见(4)。纯化的产物即为带有生物素的单链探针。

(8)对制备的单链探针进行电泳检测和浓度测定，并进行稀释进行分装保存，

用4％胶跑PCR产物，目的条带在120-160bp左右，

用Nanodrop测定产物浓度，浓度为：176ng/μL，

将质检合格的探针稀释至浓度为20ng/μL，进行分装保存，保存条件为-20℃。

单链探针的应用

1、基因组DNA片段化

采用超声仪和设定的程序，将组织样本DNA打断成约200bp。

2、添加测序接头

打断后的DNA用KAPA试剂盒进行测序接头的添加；

3、杂交与富集

将添加接头后的DNA片段与合成的探针进行液相杂交24h，用链霉亲和素包被的磁珠进行回收，随后进行PCR扩增建立文库。

4、测序及数据分析

将靶向富集前的文库和靶向富集后的文库分别利用illumana高通量测序仪进行测序，将测序数据利用Bowtie软件与NCBI的人类基因组数据库(hg19)进行比对得到初步的测序结果。

结果分析

靶序列片段的富集效率比较

靶序列片段的富集效率通过定量PCR的比较进行验证，如表所示，对于样本在杂交捕获富集前，取1ng片段化的DNA，选择探针覆盖的EGFR基因和探针未覆盖的ACTB基因进行Ct值比较，Ct值分别为31和29。经过杂交捕获富集后，同样取1ng模板，EGFR基因的Ct值下降到16，而ACTB基因的Ct值则增加至40左右。候选区域的目的基因EGFR的Ct值减少了15，表明其富集效率高达2¹⁵(约32768)倍，非候选区域的基因ACTB的Ct值增加了11，表明被稀释了2¹¹(约2048)倍。捕获富集前后的CP值对比详见表5。捕获富集前的扩增见图1，捕获富集后的扩增见图2。

表5：捕获富集前后的CP值对比

测序数据分析

靶序列片段的富集效率通过测序结果的比较进行验证，如表所示，对于样本在杂交捕获富集前后，同样获得约30G的数据量，捕获富集前测序50个基因panel(共658个区域，558,934bp)的平均深度仅为约9.9X，50个基因panel内的数据占比仅为1.86X10^-4，而通过捕获后测序50个基因panel的平均深度为约45,729X，50个基因panel内的数据占比约79.1％，富集效率约4246倍。捕获富集前后的数据对比见表6。捕获富集的上机深度见图3。

表6：捕获富集前后的数据对比

肿瘤突变热点基因PANEL，见表7。

表7：panel中的基因列表

ABL1	EGFR	GNAQ	KRAS	PTPN11
					AKT1	ERBB3	HER2	MET	RB1
ALK	ERBB4	HNF1A	MLH1	RET
					APC	FBXW7	HRAS	MPL	SMAD4
ATM	FGFR1	IDH1	NOTCH1	SMARCB1
					BRAF	FGFR2	JAK2	NPM1	SMO
CDH1	FGFR3	JAK3	NRAS	SRC
					CDKN2A	FLT3	IDH2	PDGFRA	STK11
CSF1R	GNA11	KDR	PIK3CA	TP53
					CTNNB1	GNAS	KIT	PTEN	VHL

实施例2

材料、仪器、试剂同实施例1

单链探针制备过程：

(1)芯片合成:合成60K的寡核苷酸数量的芯片，所述的芯片包含80bp-120bp目标区域和两端通用的碱基末端：其中5′端连接16个碱基，3′端连接17个碱基，该芯片为目标区域含KRAS基因的芯片，具体序列如SEQ ID NO.8：

5′-GACGCCGTGTAGCGATCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTTATTGCATCGAGTGCACGG-3′；

(2)芯片DNA洗脱：将芯片上合成的寡核酸库洗脱，并溶于80μL的TE中，每个寡核苷酸的浓度为fmol级别，扩增得到所需浓度。

(3)芯片DNA扩增：PCR反应中所需引物的具体序列为：

引物F SEQ ID NO.3：5′-GACGCCGTGTAGCGAT-3′，

引物R SEQ ID NO.4：5′-CCGTGCACTCGATGCA-3′；

PCR反应中加入dUTP，PCR反应体系和条件分别见表8和表9。

表8：PCR反应体系

10×PCR Buffer	稀释至1×
		MgCl₂	3.5mM
引物F	0.2μM
		引物R	0.2μM
dNTPs	0.5mM
		dUTP	0.1mM
Taq酶	5U
		模板	1μL
补ddH₂0至	50μL

表9：PCR反应条件

(4)PCR产物的纯化：用1.8×AMPure磁珠对PCR产物进行纯化

(5)将第(4)步纯化的PCR产物稀释100倍后，作为下一步PCR的模板。该PCR反应为偏向扩增，使用的引物为单引物，该引物为5端生物素标记，具体序列如下：

SEQ ID NO.3：5′Biotin-GACGCCGTGTAGCGAT-3′；

PCR反应体系和反应条件分别见表10和表11。

表10：PCR反应条件

表11：PCR反应条件:

将第(5)步的PCR产物中，加入3U的UDG酶，在37℃下，作用45min。

(8)对制备的单链探针进行电泳检测和浓度测定，并进行稀释进行分装保存。

用4％胶跑PCR产物，目的条带在120-160bp左右

用Nanodrop测定产物浓度，浓度为172ng/μL。

将质检合格的探针，稀释至浓度为20ng/μL，进行分装保存，保存条件为-20℃。

单链探针的应用

1、基因组DNA片段化

采用超声仪和设定的程序，将组织样本DNA打断成约200bp。

2、添加测序接头

打断后的DNA用KAPA试剂盒进行测序接头的添加。

3、杂交与富集

4、测序及数据分析

结果分析：

靶序列片段的富集效率比较

靶序列片段的富集效率通过定量PCR的比较进行验证，如表所示，对于样本在杂交捕获富集前，取1ng片段化的DNA，选择探针覆盖的KRAS基因和探针未覆盖的GAPDH基因进行Ct值比较，Ct值分别为29和27。经过杂交捕获富集后，同样取1ng模板，KRAS基因的Ct值下降到16，而GAPDH基因值则增加至41左右。候选区域的目的基因KRAS的Ct值减少了13，表明其富集效率高达2¹³(约8192)倍，非候选区域的基因GAPDH的Ct值增加了14，表明被稀释了2¹⁴(约16384)倍。捕获富集前后的CP值比较见表12。捕获富集前的扩增见图4；捕获富集后的扩增见图5。

表12：捕获富集前后的CP值对比

测序数据分析

靶序列片段的富集效率通过测序结果的比较进行验证，如表所示，对于样本在杂交捕获富集前后，同样获得约30G的数据量，捕获富集前测序50个基因panel(共658个区域，558,934bp)的平均深度仅为约9.8X，50个基因panel内的数据占比仅为1.86X10^-4，而通过捕获后测序50个基因panel的平均深度为约45,729X，50个基因panel内的数据占比约88.3％，富集效率约4739倍。捕获富集前后的数据对比见表13。捕获富集的上机深度见图6。

表13：捕获富集前后的数据对比

肿瘤突变热点基因PANEL，见表14。

表14：panel中的基因列表

APC

BRCA1

EGFR

FRFR2

KIT

NTRK2

ROS1

ARID1A

BRCA2

ERBB2

FGFR3

KRAS

NTRK3

SMO

AKT1

CCND1

ERBB3

FLT3

MAP2K1

PDGFRA

STK11

ALK

CDK4

ERBB4

HRAS

MYC

PIK3CA

TP53

ARAF

CDK6

FGF19

JAK1

MET

PTCH1

TSC1

ATM

CDKN2A

FGF3

JAK2

MTOR

PTEN

TSC2

BIM

CTNNB1

FGF4

JAK3

NRAS

RAF1

RET

BRAF

DDR2

FGFR1

KDR

NTRK1

实施例3

材料、仪器、试剂同实施例1

单链探针制备过程：

(1)芯片合成:合成90K的寡核苷酸数量的芯片，所述的芯片包含80bp-120bp目标区域和两端通用的碱基末端，其中5′端连接18个碱基，3′端连接16个碱基，该芯片为目标区域含BRAF基因的芯片，具体序列如SEQ ID NO.9：

5′-GCTCGCGAGCACGATCTATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAACGTACGTGTGTACGA-3′；

(3)芯片DNA扩增：PCR反应中所需引物的具体序列为：

引物F SEQ ID NO.5：5′-GCTCGCGAGCACGATCT-3′，

引物R SEQ ID NO.6：5′-TCGTACACACGTACGT-3′；

PCR反应中加入dUTP，PCR反应体系和条件见表15和表16。

表15：PCR反应体系

10×PCR Buffer	稀释至1×
		MgCl₂	3.5mM
引物F	0.2μM
		引物R	0.2μM
dNTPs	1.5mM
		dUTP	0.75mM
Taq酶	5U
		模板	1μL
补ddH₂0至	50μL

表16：PCR反应条件

(4)PCR产物的纯化：用1.8×AMPure磁珠对PCR产物进行纯化

3)保持离心管始终处于磁力架中，用新配置的80％的乙醇清洗2次；

5)将离心管从磁力架上移走，加入22.5μL的ddH₂0加入进行洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。室温静置2min；

SEQ ID NO.5：5′Biotin-GCTCGCGAGCACGATCT-3′；

PCR反应体系和反应条件见表17和表18。

表17：PCR反应体系

表18：PCR反应条件

将第(5)步的PCR产物中，加入5U的UDG酶，在37℃下，作用45min。

用4％胶跑PCR产物，目的条带在120-160bp左右

用Nanodrop测定产物浓度，浓度为：182ng/μL。

单链探针的应用

1、基因组DNA片段化

采用超声仪和设定的程序，将组织样本DNA打断成约200bp。

2、添加测序接头

打断后的DNA用KAPA试剂盒进行测序接头的添加；

3、杂交与富集

4、测序及数据分析

结果分析：

靶序列片段的富集效率比较

靶序列片段的富集效率通过定量PCR的比较进行验证，如表所示，对于样本在杂交捕获富集前，取1ng片段化的DNA，选择探针覆盖的BRAF基因和探针未覆盖的RNA28SN5基因进行Ct值比较，Ct值均为31。经过杂交捕获富集后，同样取1ng模板，BRAF基因的Ct值下降到17，而RNA28SN5基因值则增加至42左右。候选区域的目的基因BRAF的Ct值减少了14，表明其富集效率高达2¹⁴(约16384)倍，非候选区域的基因RNA28SN5的Ct值增加了11，表明被稀释了2¹¹(2048)倍。捕获富集前后的CP值比较见表19。捕获富集前的扩增见图7；捕获富集后的扩增见图8。

表19：捕获富集前后的CP值对比

测序数据分析

靶序列片段的富集效率通过测序结果的比较进行验证，如表所示，对于样本在杂交捕获

富集前后，同样获得约30G的数据量，捕获富集前测序50个基因panel(共658个区域，558,934bp)的平均深度仅为约10.2X，50个基因panel内的数据占比仅为1.99X10^-4，而通过捕获后测序50个基因panel的平均深度为约47,521X，50个基因panel内的数据占比约87.9％，富集效率约4410倍。捕获富集前后的数据对比见表20。捕获富集的上机深度见图9。

表20：捕获富集前后的数据对比

肿瘤突变热点基因PANEL，见表21。

表21：panel中的基因列表

<110> 江苏为真生物医药技术股份有限公司

<120> 多基因捕获测序的单链探针制备方法

<160> 9

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 1

gacgcgtgga tcatct 16

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 2

tcgctacacg caatgca 17

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 3

gacgccgtgt agcgat 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 4

ccgtgcactc gatgca 16

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 5

gctcgcgagc acgatct 17

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 6

tcgtacacac gtacgt 16

<210> 7

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 7

gacgcgtgga tcatctgaac gtactggtga aaacaccgca gcatgtcaag atcacagatt 60

ttgggctggc caaactgctg ggtgcggaag agaaagaata ccattgcatt gcgtgtagcg 120

a 121

<210> 8

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 8

gacgccgtgt agcgatctga attagctgta tcgtcaaggc actcttgcct acgccaccag 60

ctccaactac cacaagttta tattcagtca ttttcagcag gccttattgc atcgagtgca 120

cgg 123

<210> 9

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 9

gctcgcgagc acgatctatg gatccagaca actgttcaaa ctgatgggac ccactccatc 60

gagatttcac tgtagctaga ccaaaatcac ctatttttac tgtgaggtct tcatgaagaa 120

cgtacgtgtg tacga 135

Claims

1.一种多基因捕获测序的单链探针制备方法，其特征在于：该方法至少包括如下步骤：

(1)芯片合成，合成不同寡核苷酸的芯片，所述的芯片包含能够与靶序列结合的80bp-120bp目标区域碱基，目标区域碱基两端分别连接15-20bp碱基末端；

(2)芯片DNA洗脱；

(4)PCR产物用磁珠纯化；

(7)消化后产物经纯化，得到含有生物素标记的单链探针；

2.根据权利要求1所述的多基因捕获测序的单链探针制备方法，其特征在于，所述的芯片序列如下：5′-...GACGCGTGGATCATCT(N)nTGCATTGCGTGTAGCGA...-3′,

3.根据权利要求1所述的多基因捕获测序的单链探针制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中芯片DNA洗脱包括：将芯片上合成的寡核酸库洗脱，并溶于10mM Tris-HCL，0.1mMEDTA，pH＝8.0，每个寡核苷酸的物质的量为fmol级别，扩增得到nmol级别。

4.根据权利要求1所述的多基因捕获测序的单链探针制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中PCR扩增所需引物序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4或者SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6。

5.根据权利要求1所述的多基因捕获测序的单链探针制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中PCR反应体系扩增条件为：

6.根据权利要求1所述的多基因捕获测序的单链探针制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中磁珠为1.3×至1.8×AMPure磁珠。

7.根据权利要求1所述的多基因捕获测序的单链探针制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中生物素标记的单引物偏向扩增具体序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.5。

8.根据权利要求1所述的多基因捕获测序的单链探针制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中单引物偏向扩增，50μLPCR反应体系下：

PCR反应条件，如下：

9.根据权利要求1所述的多基因捕获测序的单链探针制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中能够识别并切除dUTP的酶为UDG酶，加入量为1U-5U，在37℃下，作用30-60min。

10.根据权利要求1所述的多基因捕获测序的单链探针制备方法，其特征在于，所述的步骤(8)中制备的单链探针用4％的琼脂糖电泳验证产物，目的条带在120bp-160bp左右；得到每种单链探针物质的量为nmol级别，探针总质量为3-4微克，将质检合格的探针，稀释至浓度为20ng/μL，进行分装保存，保存条件为-20℃。