CN107502654A - 用于实体瘤靶向用药指导的多基因富集和检测方法 - Google Patents

用于实体瘤靶向用药指导的多基因富集和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于实体瘤靶向用药指导的多基因富集和检测方法。该方法利用多探针靶向捕获技术结合二代测序技术，用于富集和检测实体瘤中76个基因的变异情况，如突变，缺失，插入，融合，拷贝数变化，从而准确快速达到检测用于实体瘤用药指导的基因变异的目的。

Description

用于实体瘤靶向用药指导的多基因富集和检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于多探针富集多基因用于高通量测序的方法，运用此方法可以为实体瘤患者提供用于用药指导的分子水平的信息，辅助医生的精准治疗。
背景技术
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。因此，从本质上来说肿瘤是一种基因病。二代测序(Next-generation sequencing，NGS)，也称为高通量测序，能一次对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定，可同步获得肿瘤患者个体特定样本中数以十亿计的DNA碱基序列信息，是发现已知和未知疾病相关基因变异的高效手段。因此，利用二代测序技术从基因水平上了解肿瘤患者其序列或结构的异常更有利于精准治疗。
2016年4月23日，中国临床肿瘤学会(CSCO)、中国肿瘤驱动基因分析联盟(CAGC)在北京发布《二代测序(NGS)技术应用于临床肿瘤精准诊治的共识》，以及后续《实验室自建分子诊断项目基本要求专家共识》、《临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识》的出台给NGS用于临床肿瘤基因检测提供了公认的指导规范。基因检测作为肿瘤精准治疗的基础，为临床用药提供了科学的依据。
2016年12月19日，美国食品和药物管理局(FDA)批准了Foundation Medicine公司的 FoundationFocus CDxBRCA产品，成为市场上第一个基于二代测序的伴随诊断试剂盒。该产品是基于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的卵巢肿瘤组织，采用NGS技术检测BRCA1和BRCA2的突变。如果患者具有BRCA1/2有害突变的阳性结果，更易对Clovis Oncology公司生产的PARP抑制剂Rubraca(rucaparib)有反应，从而接受Rubraca治疗。
实体瘤是当前癌症治疗中最具挑战的一类肿瘤，占据癌症约80％，源自上皮组织的实体瘤包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和卵巢癌等。近年来利用二代测序技术的研究表明同一肿瘤类型，基因变异类型也可能不完全一致；不同肿瘤类型，基因变异类型也可能一致，因此从分子层面对肿瘤进行分型是实现肿瘤精准治疗的基础。开发用于实体瘤靶向用药指导的多基因检测方法就显得尤为重要，根据检测到的基因分型，制定最佳治疗方案，以最大化药物的利用价值，突破传统治疗的局限性，避免患者通过以身试药的方式选择有效方案，也避免了不适用药物带来的严重毒副作用，提升患者的生存期和生活质量。
发明内容
本发明提供了用于实体瘤靶向用药指导的多基因富集和检测方法。该方法利用多探针靶向捕获技术结合二代测序技术，用于富集和检测实体瘤中多个基因的变异情况，即以下76个基因的变异情况(如突变，缺失，插入，融合，拷贝数变化)：ABL1、ABL2、AKT1、AKT3、ALK、APC、ARAF、ARID1A、ATM、BCL2L11(BIM)、BCR、BRAF、BRCA1、BRCA2、 CCND1、CD274(PD-L1)、CDH1、CDK4、CDK6、CDKN2A、CDKN2B、CTNNB1、DDR2、 EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ESR1、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、IDH1、 IDH2、JAK1、JAK2、KDR、KIT、KRAS、LRP1B、MAP2K1、MET、MLH1、MSH2、MSH6、 MTOR、NF1、NF2、NOTCH1、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PDCD1、PDGFRA、 PDGFRB、PIK3CA、PMS2、PTCH1、PTEN、RAF1、RARA、RB1、RET、ROS1、SMAD4、 SMO、SRC、STK11、TP53、TSC1、TSC2、VEGFA、VHL。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一方面，本发明提供了一种富集目标基因靶片段的方法，所述方法包括以下步骤：
1)DNA抽提：样本DNA抽提；
2)文库构建：将DNA样本进行片段化；片段化DNA末端修复和加碱基A，并与带有T碱基接头(Adaptor/Adapter)连接，使用接头相应的扩增引物对纯化后的连接产物进行PCR扩增；
3)文库捕获：将步骤2)获取的文库与DNA捕获探针进行杂交，去除未结合的DNA，获得的DNA即为富集的目标基因靶片段。
其中，所述步骤1)样本，优先为人，且来自其组织、细胞或者体液；所述步骤1)DNA，包括提取的全基因组DNA或者游离DNA；当提取的DNA为游离DNA时，步骤2)不需要进行片段化操作。
所述步骤2)进行片段化，优先地，使用超声破碎仪进行片段化。优先地，片段主峰大小(Peak size)为250bp。
所述步骤3)DNA捕获探针，是指能够与目标基因进行杂交的带有选择性标记的多个探针的混合物。优先地，选择性标记为生物素。所述探针通过以下方式获得：
3-1)将目标基因的DNA序列及其两侧的侧翼序列作为目标区域，设计多个能够与目标区域杂交的DNA探针；
3-2)DNA探针的长度限定为120个碱基，探针以叠瓦式设计，完整覆盖全部待测基因片段和两端50bp范围的序列，探针间重叠部分为12个碱基。
所述步骤3)去除未结合的DNA，是指通过DNA捕获探针上的选择性标记分离杂交产物。优先地，当选择性标记为生物素时，利用链霉亲和素与生物素的亲和作用分离杂交产物。
另一方面，本发明还提供一种检测目标基因变异的方法，所述方法包括以下步骤：
1)根据上述方法富集目标基因靶片段，使用接头相应的扩增引物对其进行PCR扩增；
2)经纯化后，通过二代测序技术对扩增产物进行基因变异的检测。
优先地，所述基因变异包括以下一种或几种：点突变，小片段插入/缺失，拷贝数变化，融合/基因组重排，包含大片段插入/缺失(大于100bp)。
本发明的主要优点在于：对实体瘤中经常变异的76个基因同时进行捕获探针设计试验优化，获得了用于富集这些基因的探针混合物。利用这些探针混合物仅通过一次富集患者样本 DNA，结合二代测序技术，就能准确快速达到检测用于实体瘤用药指导的基因变异的目的。
附图说明
图1是本发明技术方案的流程图；
图2A是本发明实施例2构建文库LabChip检测图(All Peaks)；
图2B是本发明实施例2构建文库LabChip检测图(Sample Peaks)；
图3A是本发明实施例3捕获文库LabChip检测图(All Peaks)；
图3B是本发明实施例3捕获文库LabChip检测图(Sample Peaks)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件中所述的方法进行。
按照图1的技术方案流程图具体如下：
实施例1 DNA样本库准备
1.全基因组DNA(gDNA)抽提
以FFPE样本gDNA抽提为例，步骤如下：
采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen，货号：56404)提取FFPE样本gDNA。按照说明书要求进行操作。
使用NanoDrop(Thermo Fisher，货号：ND-2000)和dsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher，货号：Q32854)检测DNA的质量和浓度。按照说明书要求进行操作。
2.DNA片段化
取适量gDNA样本，利用Covaris M220(Covaris，货号：500330)进行DNA片段化，按照说明书要求进行操作。
3.DNA样本库质量检测
通过琼脂糖凝胶电泳，观察打断结果片段分布是否符合预期。预期片段主峰大小(Peak size)为250bp。
实施例2 文库构建
文库构建使用商业化试剂盒，按照说明书要求进行操作。
1.末端修复和加A
1.1取40μl打断后的DNA样本至0.2ml PCR管，用Nuclease-Free Water补齐至50μl，按下表加入反应体系：
组分 体积(μl)
片段化的dsDNA 50
End Repair&A-Tailing Buffer 7
End Repair&A-Tailing Enzyme Mix 3
总体积 60
1.2涡旋混匀，微离心，放置于PCR仪中，反应程序如下：
2.接头连接
2.1按下表向上述反应管中加入相应试剂：
组分 体积(μl)
End repair and A-tailing reaction product 60
Adapter stock 2
Nuclease-Free Water 8
Ligation Buffer 30
DNA Ligase 10
总体积 110
2.2涡旋混匀，微离心，放置于PCR仪中，反应程序如下：
步骤 温度 时间(分钟)
Adapter Ligation 20℃ 15
HOLD 4℃ ∞
3.连接后纯化
利用Agencourt AMPure XP试剂盒(Beckman，货号：A63882)进行纯化，按照说明书要求进行操作。
4.文库扩增
4.1按下表加入反应体系：
组分 体积(μl)
2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25
10X KAPA Library Amplification Primer Mix 5
Adapter-ligated library 20
总体积 50
4.2涡旋混匀，微离心，放置于PCR仪中，反应程序如下：
5.扩增后纯化
利用Agencourt AMPure XP试剂盒进行纯化，按照说明书要求进行操作。
最后加入32μl Nuclease-Free Water，涡旋混匀，室温孵育2min，微离心后置于磁力架，待溶液完全澄清后转移30μl上清至新的已标记好的1.5ml DNA LoBind Tubes。
6.文库质检
使用dsDNA HS Assay Kit检测DNA的浓度。使用LabChip GXII Touch(PerkinElmer，货号：CLSl37031)检测DNA文库片段大小，按照说明书要求进行操作。结果如图2A2B。
DNA的总量应大于等于500ng；片段主峰大小(Peak size)为300-500bp。
实施例3 文库捕获
利用本发明靶向76个基因的生物素化的DNA捕获探针，使用商业化试剂盒进行文库捕获，按照说明书要求进行操作。
1.加入Human Cot-1 DNA(Invitrogen，货号：15279-011)、Blocking Oligos(IDT，货号： 1016184与1016186)与文库混合，置于真空浓缩仪中抽干。
2.文库与生物素化的DNA捕获探针杂交
2.1向上步含文库等干粉中加入下列反应体系，涡旋混匀，室温孵育10min；
组分 体积(μl)
xGen 2×Hybridization Buffer 8.5
xGen Hybridization Buffer Enhancer 2.7
Nuclease-Free Water 1.8
总体积 13
2.2将重溶后的溶液转移至0.2ml PCR管，95℃变性10min；
2.3将95℃变性后的0.2ml PCR管转移至65℃的PCR仪(热盖设为75℃)中，向PCR管中加入4μl捕获探针，涡旋大约3sec后低速离心将Mix收集到管底，然后65℃孵育4h。
3.准备链霉亲和素磁珠(streptavidin beads)
使用M-270Streptavidin beads(Invitrogen，货号：65306)进行洗涤，按照说明书要求进行操作。
4.将杂交液加入到streptavidin beads
转移捕获完成后杂交样本至准备好的磁珠中，涡旋混匀，65℃孵育45min，每12min混匀一次。
5.去除streptavidin beads中未结合的DNA
利用xGen Wash Buffer进行洗涤，按照说明书要求进行操作。
最后加入18μl Nuclease-Free Water重悬磁珠，转移到0.2ml PCR管中备用。
6.捕获后PCR
6.1按下表加入反应体系：
组分 体积(μl)
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25
10μM Illumina P5primer 2.5
10μM Illumina P7primer 2.5
Beads with captured DNA 20
总体积 50
6.2涡旋混匀，微离心，放置于PCR仪中，反应程序如下：
7.PCR后纯化
利用Agencourt AMPure XP试剂盒进行纯化，按照说明书要求进行操作。
最后加入22μl Nuclease-Free Water，涡旋混匀，室温孵育2min，微离心置于磁力架，待溶液完全澄清后转移20μl上清至新的已标记好的1.5ml DNA LoBind Tubes。
8.捕获文库质检
使用dsDNA HS Assay Kit检测DNA的浓度。使用LabChip GXII Touch检测捕获文库片段大小，按照说明书要求进行操作。结果如图3A3B。
DNA的总量应大于等于0.5ng/μl；片段无明显引物二聚体和接头二聚体；片段主峰大小 (Peak size)为300-500bp。
实施例4上机测序
捕获文库质检通过后，上机进行测序和数据分析。
测序结果表明，目标区域的平均有效深度大于700×，目标区域reads占比大于60％，通过质检。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种富集实体瘤76个目标基因靶片段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)DNA抽提：样本DNA抽提；
其中，所述步骤1)中的样本为来自人的组织、细胞或者体液。
2)文库构建：将DNA样本进行片段化；片段化DNA末端修复和加碱基A，并与带有T碱基接头(Adaptor/Adapter)连接，使用接头相应的扩增引物对纯化后的连接产物进行PCR扩增；
其中，所述步骤2)中的进行片段化是使用超声破碎仪进行片段化。
3)文库捕获：将步骤2)获取的文库与DNA捕获探针进行杂交，去除未结合的DNA，获得的DNA即为富集的目标基因靶片段。
其中，所述步骤3)中的DNA捕获探针，是指能够与目标基因进行杂交的带有选择性标记的多个探针的混合物。所述探针通过以下方式获得：
3-1)将目标基因的DNA序列及其两侧的侧翼序列作为目标区域，设计多个能够与目标区域杂交的DNA探针；
3-2)DNA探针的长度限定为120个碱基，探针以叠瓦式设计，完整覆盖全部待测基因片段和两端50bp范围的序列，探针间重叠部分为12个碱基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的DNA，包括提取的全基因组DNA或者游离DNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的DNA为提取的游离DNA，所述步骤2)不需要进行片段化操作。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的进行片段化，片段主峰大小(Peak size)为250bp。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的选择性标记为生物素。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的选择性标记为生物素，所述步骤3)中的去除未结合的DNA是利用链霉亲和素与生物素的亲和作用分离出杂交产物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述76个目标基因包含：ABL1、ABL2、AKT1、AKT3、ALK、APC、ARAF、ARID1A、ATM、BCL2L11(BIM)、BCR、BRAF、BRCA1、BRCA2、CCND1、CD274(PD-L1)、CDH1、CDK4、CDK6、CDKN2A、CDKN2B、CTNNB1、DDR2、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ESR1、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、IDH1、IDH2、JAK1、JAK2、KDR、KIT、KRAS、LRP1B、MAP2K1、MET、MLH1、MSH2、MSH6、MTOR、NF1、NF2、NOTCH1、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PDCD 1、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、PMS2、PTCH1、PTEN、RAF1、RARA、RB1、RET、ROS1、SMAD4、SMO、SRC、STK11、TP53、TSC1、TSC2、VEGFA、VHL。
8.一种检测目标基因变异的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)根据权利要求1至7中任一项所述的方法富集目标基因靶片段，使用接头相应的扩增引物对其进行PCR扩增；
2)经纯化后，通过二代测序技术对扩增产物进行基因变异的检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述基因变异包括以下一种或几种：点突变，小片段插入/缺失，拷贝数变化，融合/基因组重排，包含大片段插入/缺失(大于100bp)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法应用于实体瘤的精准用药指导。
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