CN109609635A

CN109609635A - 多基因富集的探针库及与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法

Info

Publication number: CN109609635A
Application number: CN201811584036.3A
Authority: CN
Inventors: 许明炎; 陈实富; 张晓妮; 屈宏越
Original assignee: Shenzhen Haplox Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Haplox Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2018-12-24
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2038-12-24
Also published as: CN111187810B; CN111575380A; CN109609635B; CN111575380B; CN111187810A

Abstract

本发明提供了一种多基因富集的探针库，其包括针对与多种肿瘤治疗相关的多个基因而设计的多条捕获探针，其中，多个基因至少包括与化疗药物相关的单核苷酸多态链所在的基因、靶向药物相关基因、用于免疫治疗的微卫星稳定性相关的基因和病毒基因。在本发明中，多基因富集的探针库可以一次性富集并检测到多种癌症相关基因，能够评估包括化疗、靶向治疗和免疫治疗在内的多种病程管理方案，进而为癌种患者提供临床治疗的指导。此外，本发明还提供了一种与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法。

Description

多基因富集的探针库及与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法

技术领域

本发明属于基因检测领域，特别涉及一种多基因富集探针库及与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法。

背景技术

肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，是导致人类死亡的最主要原因之一。在中国，1/4的死亡者死于肿瘤，居死亡原因之首。根据2017 年2月，国家癌症中心发布的中国最新癌症数据显示，2013年我国新发病例368万例，占世界癌症新发病例的1/4，发病率186/10万人，死亡率109/10万人。

选择正确的治疗方式和药物对于肿瘤的治疗十分关键。美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)每年都会发布各种恶性肿瘤临床实践指南，得到了全球临床医师的认可和遵循。癌症的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、中医中药治疗等传统治疗手段，以及靶向治疗、免疫治疗等最新的治疗手段。靶向治疗，是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点(该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段)，来设计相应的治疗药物，药物进入体内特异性地与致癌位点相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。免疫治疗(immunotherapy)是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法。无论是靶向治疗还是免疫治疗，治疗方案的选择和预后，都与肿瘤患者基因变异的情况有显著关联。如NCCN发布的2018年第1版结肠癌治疗指南指出，患者具有已知的KRAS突变(外显子2,3,4)或NRAS突变 (外显子2,3,4)对西妥昔单抗和帕尼单抗无效。免疫治疗药物 Keytruda(帕姆单抗)可以用于治疗具有微卫星不稳定性高(MSI-H) 或错配修复缺陷(dMMR)的不可切除或转移性实体瘤的成人和儿童患者，是美国食品和药物管理局(FDA)批准的首款不依照肿瘤来源，而是依照生物标志物进行区分的抗肿瘤疗法。除了靶向治疗和免疫治疗等最新的肿瘤治疗手段，肿瘤患者基因变异的情况同样影响化疗的治疗效果。通过癌症患者单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphisms,SNP)的状态可以预测化疗药物的效果及毒副反应的程度，如ERCC1基因中的SNP，C/C基因型患者对铂类化疗敏感性高于 C/T或T/T型。因此，检测肿瘤患者基因变异情况是实现肿瘤精准治疗的基础。

二代测序(Next-generation sequencing，NGS)，也称为高通量测序，可以一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，可同步获得肿瘤患者个体样本中全部序列信息。利用二代测序技术可以更快捷、准确的了解肿瘤患者分子层面上基因变异的情况，从而进行精准治疗。随着精准治疗在肿瘤治疗中显示的优势，开发基于二代测序技术的用于泛癌种临床治疗指导的多基因富集和检测方法显得尤为重要。该方法可以通过一次检测，判断患者的基因变异情况，评估包括化疗、靶向治疗和免疫治疗在内的多种病程管理方案，为多种癌种患者提供临床治疗的指导，最大化提高治疗效果，延长患者生存期，提高患者生活质量。

发明内容

本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种多基因富集探针库及其应用，利用此探针库可以仅通过一次检测，评估多种病程管理方案，为多种癌种患者提供临床治疗的指导。

为此，本公开的一方面提供了一种多基因富集的探针库，其可以包括针对与多种肿瘤治疗相关的多个基因而设计的多条捕获探针，所述多个基因至少包括与化疗药物相关的单核苷酸多态链所在的基因、靶向药物相关基因、以及用于免疫治疗的微卫星稳定性相关的基因和病毒基因。在这种情况下，多基因富集的探针库可以一次性富集并检测到多种癌症相关基因，能够评估包括化疗、靶向治疗和免疫治疗在内的多种病程管理方案，进而为癌种患者提供临床治疗的指导。

另外，在本公开的一方面所涉及的探针库中，所述病毒基因为引起癌症发生相关的病毒的基因。在这种情况下，多基因富集的探针库能够富集并检测到病毒癌基因，进而判断肿瘤是否由病毒癌基因感染引起，从而能够帮助医师选择适当的治疗方案。

另外，在本公开的一方面所涉及的探针库中，所述多条捕获探针可以包括：序列SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:19。由此能够捕获导致肿瘤的基因，从而对其进行病程管理方案评估，进而指导临床治疗。

另外，在本公开的一方面所涉及的探针库中，所述多条捕获探针的3’端具有生物素的标记。由此，能够方便地进行DNA的纯化。

另外，在本公开的一方面所涉及的探针库中，所述生物素的标记可以在3’端末端倒数的第1位至第5位的至少任意一个位置。在这种情况下，能够减少生物素的标记对探针的影响。

另外，在本公开的一方面所涉及的探针库中，可以包括与目标区域杂交的DNA探针，所述目标区域为所述多个基因的DNA序列以及在所述DNA序列的两侧的侧翼序列。在这种情况下，能够提高DNA 探针的特异性及准确度。

另外，在本公开的一方面所涉及的探针库中，所述多条捕获探针的各条探针的长度可以为50bp-300bp。在这种情况下，多条捕获探针的探针长度能够与所需要捕获的基因长度相适宜，有利于探针更好地捕获基因。

另外，在本公开的一方面所涉及的探针库中，所述侧翼序列可以为所述DNA序列的两端5bp-50bp范围的序列。在这种情况下，能够提高捕获探针的特异性。

另外，在本公开的一方面所涉及的探针库中，所述多条捕获探针可以以叠瓦式设计，并且所述多条捕获探针的各条探针之间具有重叠部分。由此，能够改善捕获探针的覆盖度，从而有效地检测基因变异。

另外，在本公开的一方面所涉及的探针库中，所述多条捕获探针的各条探针之间的重叠部分可以为5至20个碱基。由此，能够进一步改善捕获探针的覆盖度，从而更有效地检测基因变异。

本公开的另一方面提供一种与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法，可以包括：(a)从样本中提取DNA；(b)基于步骤(a)的DNA构建DNA文库；(c)将所述DNA文库与权利要求1至10中任一项所述的探针库进行杂交，并对杂交后的文库进行纯化；并且(d) 将步骤(c)所获得的DNA结果进行测序，检测基因变异。

另外，在本公开的另一方面所涉及的检测方法中，步骤(b)中，可以对从步骤(a)所提取的DNA进行片段化，并且将片段化后的DNA 片段进行末端修复和加A尾，连接测序接头并进行纯化，从而进行PCR 扩增以获得所述DNA文库。

另外，在本公开的另一方面所涉及的检测方法中，所述样本可以为人源样本。由此，能够适用于人体基因的检测。

另外，在本公开的另一方面所涉及的检测方法中，在步骤(c)中，可以利用亲和素处理的磁珠对杂交后的文库进行纯化。在这种情况下，亲和素能与生物素专一结合，从而达到纯化作用。

另外，在本公开的另一方面所涉及的检测方法中，所述基因变异可以包括点突变、基因片段插入/缺失、拷贝数变化、和融合/基因重排的基因变异中的至少一种。

另外，在本公开的另一方面所涉及的检测方法中，在步骤(d)中，还可以检测至少包括微卫星不稳定性和肿瘤负荷突变的肿瘤相关标签。

另外，在本公开的另一方面所涉及的检测方法中，在步骤(d)中，可以对所述测序的结果进行数据分析，以检测基因变异。在这种情况下，可以获得更准确的基因变异情况，进而评估病程管理方案，从而为癌种患者提供临床治疗的指导。

另外，在本公开的另一方面所涉及的检测方法中，所述数据分析可以包括对所述测序的结果去除不合格数据、并且对去除后的数据结果进行剪裁。在这种情况下，能够保证测序结果最终的准确性。

另外，在本公开的另一方面所涉及检测方法中，所述不合格数据可以包括映射质量(mapping quality)质量小于或等于Q10的数据。在这种情况下，去除错误率较高的数据，可以保证结果的准确性。

另外，在本公开的另一方面所涉及检测方法中，所述不合格数据还可以包括连续20个以上同一碱基的polyN数据。在这种情况下，可以剔除产生错误的数据，进一步提高结果的准确性。

根据本公开，能够提供一种多基因富集探针库及其应用，利用此探针库可以仅通过一次检测，评估多种病程管理方案，为多种癌种患者提供临床治疗的指导。

附图说明

图1是示出了本发明的实施方式所涉及的与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法的流程图。

图2是示出了本发明的实施方式所涉及的DNA文库构建的流程图。

具体实施方式

以下，参考附图，详细地说明本公开的优选实施方式。在下面的说明中，对于相同的部件赋予相同的符号，省略重复的说明。另外，附图只是示意性的图，部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。

本公开所涉及的多基因富集的探针库可以包括针对与多种肿瘤治疗相关的多个基因而设计的多条捕获探针，多个基因至少包括与化疗药物相关的单核苷酸多态链所在的基因、靶向药物相关基因、以及用于免疫治疗的微卫星稳定性相关的基因和病毒基因。在这种情况下，多基因富集的探针库可以一次性富集并检测到多种癌症相关基因，能够评估包括化疗、靶向治疗和免疫治疗在内的多种病程管理方案，进而为癌种患者提供临床治疗的指导。

在本实施方式中，在与肿瘤治疗相关的多个基因中，与化疗药物相关的单核苷酸多态链(SNP)所在的基因可用于判断化疗药物的敏感性和毒副作用，从而进行化疗方案的选择。另外，与靶向药物相关的基因可以用于靶向药物的选择及预测靶向治疗的效果。另外，与微卫星稳定性相关的基因可以用于判断免疫治疗药物的效果，还可以用于判断肿瘤患者肿瘤突变负荷(Tumor mutation burden，TMB)即每百万碱基中被检测出的体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数。此外，与病毒相关基因可以用于确定肿瘤是否由病毒感染引起，从而能够帮助医师选择适当的治疗方案。

在一些示例中，优选地，与肿瘤治疗相关的多个基因不低于200 个；更优选地，与肿瘤治疗相关的基因不低于400个；进一步优选地，与肿瘤治疗相关的基因不低于600个。另外，在一些示例中，与肿瘤治疗相关的基因为600至800个。

另外，在一些示例中，针对与化疗药物相关的单核苷酸多态链所在的基因而设计的探针可以包括SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5。针对与靶向药物相关基因而设计的探针可以包括SEQ ID NO:6-SEQ ID NO 10。针对用于免疫治疗的微卫星稳定性相关的基因而设计的探针可以包括SEQ ID NO:11-SEQ ID NO 15。针对病毒基因而设计的探针可以包括SEQ IDNO:16-SEQ ID NO 19。

另外，在一些示例中，病毒基因可以是能够引发癌症的病毒的基因。在这种情况下，多基因富集的探针库能够富集并检测到病毒癌基因，进而判断肿瘤是否由病毒基因感染引起，从而能够帮助医师选择适当的治疗方案。例如，在一些示例中，病毒基因可以是与鼻咽癌发生相关的EBV病毒，与宫颈癌发生相关的HPV病毒，与肝癌发生相关的HBV、HCV病毒当中的至少一种。

另外，在本实施方式中，探针库中的捕获探针可以包括：序列SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:19。由此能够捕获与癌症治疗相关的基因，从而对其进行病程管理方案评估，进而指导临床治疗。

另外，在本实施方式中，多条捕获探针的3’端可以有生物素的标记。生物素与亲和素能够快速、专一地结合，由此，能够方便地进行 DNA的纯化。

另外，在本实施方式中，生物素可以标记在3’端末端起数第1到5 位的至少任意一个位置。在这种情况下，能够减少生物素的标记对探针的影响。例如，在一个示例中，生物素可以标记在3’端末起数第2 位。在另一个示例中，生物素可以标记在3’端末起数第4位。另外，在又一个示例中，生物素可以标记在3’端末起数第3位。

另外，在本实施方式中，可以包括与目标区域杂交的DNA探针，目标区域可以为多个基因的DNA序列以及在DNA序列的两侧的侧翼序列。在这种情况下，能够提高DNA探针的特异性及准确度。

在一些示例中，多条捕获探针的各条探针的长度可以为50bp -300bp。在这种情况下，多条捕获探针的探针长度能够与所需要捕获的基因长度相适宜，有利于探针更好地捕获基因。例如，在一个示例中，多条捕获探针的各条探针的长度可以为50bp。在另一个示例中，多条捕获探针的各条探针的长度可以为200bp。另外，在又一个示例中，探针的长度可以为300bp。

在一些示例中，侧翼序列可以为DNA序列的两端5bp-30bp范围的序列。在这种情况下，能够提高捕获探针的特异性。例如，在一个示例中，侧翼序列可以为DNA序列的两端5bp范围的序列。在另一个示例中，侧翼序列可以为DNA序列的两端20bp范围的序列。另外，在又一个示例中，侧翼序列可以为DNA序列的两端30bp范围的序列。

另外，在本实施方式中，多条捕获探针可以以叠瓦式设计，并且多条捕获探针的各条探针之间具有重叠部分。由此，能够改善捕获探针的覆盖度，从而有效地检测基因变异。

在一些示例中，多条捕获探针的各条探针之间的重叠部分可以为5 至20个碱基。这个范围的重叠部分不会在探针捕获基因时造成不利影响。例如，在一个示例中，多条捕获探针的各条探针之间的重叠部分可以为5个碱基。在另一个示例中，多条捕获探针的各条探针之间的重叠部分可以为15个碱基。另外，在又一个示例中，多条捕获探针的各条探针之间的重叠部分可以为20个碱基。

以下，结合图1和图2详细地描述多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法。图1是示出了本发明的实施方式所涉及的与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法的流程图。图2是示出了本发明的实施方式所涉及的DNA文库构建的流程图。

在本公开所涉及的与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法中，可以包括如下步骤：从样本中提取DNA(步骤S10)；基于步骤 S10所获得的DNA构建DNA文库(步骤S20)；将DNA文库与本公开中的多基因富集的探针库进行杂交，并对杂交后的文库进行纯化(步骤S30)；步骤S30所获得的DNA结果进行测序，检测基因变异(步骤S40)。

另外，在本实施方式中，在步骤S20中，对从步骤S10所提取的 DNA进行片段化(步骤S21)，并且将片段化后的DNA片段进行末端修复和加A尾(步骤S22)，接着连接测序接头并进行纯化(步骤 S23)，然后进行PCR扩增以获得DNA文库(步骤S24)。

在一些示例中，提取DNA的样本可以为人源样本。可选地，该人源样本可以包括从活检组织、石蜡包埋组织和血细胞等组织或细胞提取的全基因组DNA，或者从体液、血液提取的游离DNA。在一些示例中，若步骤S10中提取DNA的样本为体液、血液提取的游离DNA，则可以不需要进行步骤S21，即不需要对所提取的DNA进行片段化。

另外，在一些示例中，在步骤S21中，可以采用现有技术中的标准手段来进行DNA片段化，例如可以采用物理方法如超声破碎仪进行 DNA片段化，或生物方法如片段化酶进行DNA片段化。在本实施方式中，优选采用片段化酶来进行DNA片段化。

另外，在本实施方式中，在步骤S30中，可以利用亲和素处理的磁珠对杂交后的文库进行纯化。在这种情况下，通过利用亲和素与生物素等标记快速、专一结合的特性，能够提高纯化效率。在一些示例中，亲和素可以是链霉亲和素、卵白亲和素中的至少一种。在一些示例中，亲和素优选为链霉亲和素。

另外，在一些示例中，基因变异包括点突变、基因片段插入/缺失、拷贝数变化、以及融合/基因重排的基因变异中的至少一种。

另外，在本实施方式中，在步骤S40中，还可以检测至少包括微卫星不稳定性和肿瘤负荷突变的肿瘤相关标签。

另外，在本实施方式中，在步骤S40中，对测序的结果进行数据分析，以检测基因变异。在这种情况下，可以获得更准确的基因变异情况，进而评估病程管理方案，从而为癌种患者提供临床治疗的指导。

另外，在本实施方式中，数据分析可以包括对测序的结果去除不合格数据、并且对去除后的数据结果进行剪裁。优选地，剪裁去除reads 最后8-10nt。在这种情况下，能够保证测序结果最终的准确性。

在一些示例中，不合格数据可以包括基因组映射(mapping)质量小于或等于Q10的数据。在这种情况下，可以剔除产生错误的数据，进一步提高结果的准确性。

在一些示例中，不合格数据还可以包括连续20个以上同一碱基的 polyN数据。在这种情况下，可以剔除产生错误的数据，进一步提高结果的准确性。

如上所述，在本实施方式中，能够提供一种多基因富集探针库及其应用，利用此探针库可以仅通过一次检测，评估多种病程管理方案，为多种癌种患者提供临床治疗的指导。

以下，结合具体的实施例对本发明的实施方式进一步详细说明。

【实施例1】

本实施例利用探针设计软件进行探针设计及合成：

(1)肿瘤治疗相关基因筛选：整合美国FDA批准的药物信息，美国NCCN发布的恶性肿瘤临床实践指南，癌症体细胞突变目录(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer，COSMIC)涵盖的与癌症相关的体细胞突变，PharmGKB数据库提供的基因和药物间的关联及基因SNP与化疗药物的关联信息以及针对癌症治疗的文献和报道，将与癌症治疗相关的基因进行整合和筛选，一共获得605条基因。

(2)根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的人类全基因组序列为参考，使用Primer Premier 5.0设计探针；将目标基因的DNA 序列及其两侧的侧翼序列作为目标区域，设计多个能够与目标区域杂交的DNA探针；DNA探针的长度限定为120个碱基，探针以叠瓦式设计，完整覆盖全部待测基因全外显子和两端10bp范围的序列，探针间重叠部分为12个碱基。

(3)获得包括根据605个基因设计的探针，部分探针如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:19所示。

(4)探针合成：由罗氏诊断产品有限公司合成探针。

【实施例2】

本实施例利用多基因富集的探针库进行杂交捕获，然后对被捕序列进行测序。

(a)从样本中提取DNA：所有样本的DNA提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行。本实施例中的样品DNA为1例乳腺癌患者的穿刺石蜡切片样本HP201701，采用德国QIAGEN公司的 GeneRead DNA FFPE Kit试剂盒进行提取。

(b)DNA片段化：将步骤(a)中从样本中提取的DNA进行片段化，可以采用现有技术中的标准手段来进行。本实施例中的样品DNA 采用NEB公司的NEBNext dsDNA Fragments酶切打断，然后经过 OMEGA公司的Gel Extraction Kit试剂盒回收纯化，收集100-250bp 左右的片段。经Qubit 2.0测定回收的片段化DNA的浓度为3.68ng/μL。

(c)构建文库：片段化后的DNA片段进行末端修复和加A尾；连接测序接头；对纯化后的连接产物进行PCR扩增。本实施例中采用 Kapa Biosystems公司KAPA HTP LibraryPerparation Kit试剂盒进行文库构建。具体步骤如下：

(c-1)按表1所示配制末端修复反应体系，向每个1.5mL样本管内加入20μL末端修复反应体系，混匀后，在20℃孵育30min。

表1末端修复反应体系

(c-2)配制80％乙醇(40mL乙醇+10mLddH2O)，80％乙醇应现用现配。

(c-3)末端修复完成后，开始DNA纯化，具体步骤如下：首先，将每个1.5mL样本管内加入120μL混合均匀的磁珠，将反应体系涡旋混匀，置于室温10min，使DNA与磁珠充分结合；接着，将1.5mL 样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清(一般等待1-2 min)；然后，小心移除上清液(为避免吸入磁珠，可以在管底留存20 uL上清液)，再加入500μL 80％乙醇，180度旋转离心管使磁珠穿过溶液吸至另一侧管壁，旋转2-3次，或上下颠倒混匀6-8次，静置15s 后弃上清液，在此过程中，离心管一直保持在磁力架上；重复步骤上一个步骤一次；最后，将离心管自磁力架上取下，快速离心，然后置于磁力架上再次分离、移除残留的酒精溶液。将离心管自磁力架上取下，打开管盖，常温下干燥磁珠，挥发乙醇，以免过多乙醇影响后续反应体系中酶的效果。这里，磁珠的干燥在室温下进行，一般等到磁珠表面无反光或是裂开一两条缝即可，此过程需等待2-3min；应避免磁珠过干，磁珠过干会导致DNA回收损失极大。

(c-4)从-20℃冰箱内取出KAPA A-tailing buffer和KAPA A-tailingenzyme试剂，置于冰盒上解冻，待用。将金属浴从4℃冰箱取出，温度调至30℃，待用。然后按表2配制尾端加A反应体系。每个样本管中加入50μL A-Tailing master mix重悬磁珠，充分混匀后，在30℃孵育30min。尾端加A反应结束后，开始DNA纯化，具体操作同步骤(c-3)。

表2尾端加A反应体系

(c-5)将步骤(c-4)所获得的DNA片段两端连接测序接头，反应体系如表3所示。

表3接头连接反应体系

首先，从-20℃冰箱内取出5×KAPA Ligation buffer和KAPA T4 DNA Ligase试剂，置于冰盒上解冻，待用。将金属浴置于4℃冰箱内，温度调至20，℃待用。接着，每个样本管内加入45μL接头连接反应体系，重悬浮磁珠，充分混匀。然后，根据上机安排，在实验记录本上对应着样本记录相对应的接头信息。取出2-8℃暂存的接头试剂。这里，接头加入量不足5μL需要再用Nuclease-Free water补齐体积至5 μL。充分涡旋混匀，20℃反应15min。在接头连接反应结束后，开始 DNA纯化，具体操作同步骤(c-3)。

(c-6)双筛步骤：在每个样本管内加入100μL TE缓冲液，涡旋混匀，室温静置5min。每个样本管内再加入60μL KAPA PEG/NaCl SPRI solution，室温静置10min。使大于450bp的DNA片段吸附于磁珠之上。准备一批新的1.5mL离心管，管盖管壁标注相对应的编号，加入20μL混合均匀的磁珠。将样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清(一般等待1-2min)。小心取出155μL上清液，移至对应编号的含磁珠的1.5mL离心管中，充分涡旋混匀，室温静置10min。将大于250bp的DNA片段进行吸附。

(c-7)双筛结束后，开始进行DNA纯化，具体步骤同上述DNA 纯化步骤。每个样本管内加入22μL Nuclease-Free water，重悬浮磁珠，充分混匀后室温静置5min。c-6-8：准备一批新的0.2mLPCR管，管盖管壁标注对应的样本编号。将样本管置于磁力架，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应编号的PCR管中，作为PCR实验的模板。配置QubitBuffer 199μL，加入1μL DNA样本，涡旋混匀, 避光静置2min，测试浓度为0.19ng/μL。

(c-8)PCR扩增文库：以获得的完整双链DNA接头连接产物为模板，进行PCR扩增。首先，在每个0.2mL样本管内加入30μL如表4所示PCR扩增反应体系，涡旋混匀。

在PCR反应结束后，开始进行DNA纯化，具体操作同步骤(c-3)。然后，按照表5所示设置PCR扩增过程温度和时间参数。在每个1.5mL 样本管内加入22μL Nuclease-Freewater(无核酸酶水)，充分混匀后室温静置5min。准备一批新的离心管，管盖上标注信息。将1.5mL 样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应的新的写有样本信息的1.5mL离心管，配置Qubit Buffer 199 μL，加入1μL DNA样本，涡旋混匀,避光静置2min，测试浓度为 32.2ng/μL。利用Agilent 2100检测DNA文库的片段大小为315bp。文库符合质量合格标准，进入杂交捕获环节。

表4 PCR扩增反应体系

表5 PCR扩增过程温度和时间参数

(d)杂交捕获：将步骤c构建的DNA文库与探针进行杂交，去除未结合的DNA，富集目标基因DNA片段。需要注意的是，其中DNA 目标片段的捕获探针为本发明中的探针。本实施例中采用Roche公司的杂交试剂盒SeqCap EZ Library Kit进行，具体流程参照说明书的标准流程。

(e)文库测序与数据分析：

(e-1)将步骤(d)中所捕获的DNA文库进行二代测序，并对测序结果进行生物信息学分析，分析目标基因的变异情况，包括点突变，基因片段插入/缺失，拷贝数变化，融合/基因重排。本实施例采用 Illumina公司Nextseq 500/550Kits v2试剂盒，在Nextseq 500测序平台完成测序，具体流程参照说明书的标准流程。

(e-2)数据分析包括去除低质量数据、对数据进行剪裁以及去除polyN误差信息。去除低质量数据包括去除mapping质量为Q10的数据；对数据进行剪裁包括剪裁去除reads最后8-10nt；去除polyN误差信息包括去除数据中连续20个以上的polyN数据。

最终结果如表6和表7所示，结果表明，本实施例所制备的探针库能够同时捕获与化疗药物相关的单核苷酸多态链所在的基因、靶向药物相关基因、以及用于免疫治疗的微卫星稳定性相关的基因以及病毒基因，从而能够评估多种病程管理方案，为患者提供临床治疗的指导。

表6 HP201701样本检测到的部分基因变异情况

表7与HP201701样本检测到的基因变异相关的药物

虽然以上结合附图和实施方式对本发明进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本发明。本领域技术人员在不偏离本发明的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本发明进行变形和变化，这些变形和变化均落入本发明的范围内。

序列表

<110> 深圳市海普洛斯生物科技有限公司

<120> 多基因富集的探针库及与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcacgtgac acagtcaaac attaacttgg tgtatcgatt ggtttttgcc atatatatat 60

atataagtag gagagggcga acctctggca ggagcaaagg cgccatggct gtgga 115

<210> 2

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aattcagagt ctggggagga ggctcccaca ggccgggaca agaagcggaa gcagcagcag 60

cagcagcctg tgtagtctgc ccccgggaaa ctgaggaact aa 102

<210> 3

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcttgcccag actcaacatg gcggctacac gtcgcctgtc agtctgtgaa gcctaccccg 60

ggcgtgggcc gcagcgtcga gtaacgtcat tcgaaccccg tc 102

<210> 4

<211> 157

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcggagcgc gggacggccg cgggaaaagg cgcgcggaag gggtcctgcc accgcgccac 60

ttggcctgcc tccgtcccgc cgcgccactt ggcctgcctc cgtcccgccg cgccacttcg 120

cctgcctccg tcccccgccc gccgcgccat gcctgtg 157

<210> 5

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcagtccatg cctccacaga ggctatgcca gctgtaggcc agaccctggc aagatctggg 60

tggataatca gactgactgg tcccactctt cccacaggcc tc 102

<210> 6

<211> 137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaattgtat ttacataatt acacactttg tctttgactt ctttttcttc tttttaccat 60

ctttgctcat cttttcttta tgttttcgaa tttctcgaac taatgtatag aaggcatcat 120

caacaccctg aaataca 137

<210> 7

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggagcagcg atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc 60

gctctgcccg gcgagtcggg ctctggagga aaagaaaggt aagggcgt 108

<210> 8

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctgacttac catgtgtctg ttttagaagt gaatattcct tccatgaagg cctctggggg 60

catccactta actggcagca tggcacagcc tccctttcta tagtagctcg ccctgtgggg 120

<210> 9

<211> 152

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaatatttac ctggtccctg ttgttgatgt ttgaataagg taactgtcca gtcatcaatt 60

catacagaac aattccaaat gcatatacat ctgactgaaa gctgtatgga tttttatctt 120

gcattctgat gacttctggt gcctgttaga ac 152

<210> 10

<211> 181

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtccttgtag gttttcccaa atagtgcacc ccttgaagga gggacaaggc tgaccatatg 60

tggctgggac tttggatttc ggaggaataa taaatttgat ttaaagaaaa ctagagttct 120

ccttggaaat gagagctgca ccttgacttt aagtgagagc acgatgaata cgtaaggatc 180

t 181

<210> 11

<211> 265

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atccacagct aacatcatac tcaataatga atgaccaaaa gcatttctct tatgataatg 60

gacaaaaaca ggatgcctgc ctttaacact gctattcaac attgctggaa gttctggcca 120

gagaaattag acacagtgat acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 180

acatatttta tagatagata gatggtatcc aagtcagaaa gggagaagta aaactatccc 240

tattgtagat gacacagtcc catag 265

<210> 12

<211> 214

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgtgaaaat atttagtgcc actgaattat gcaataaaaa tggttaaaat gatatatttt 60

atattttgcc acaaaaatta ccaataacta gagacaggca gaaaaaacta cacacacaca 120

cacacacaca cacacacagt tgtgccagtg ccgatttcct gatttggatg tgctgtagtt 180

acatcagatg tgaccacggt gggaaactgg gtga 214

<210> 13

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtgtaagcat ctgtgtatac tacgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 60

tgtgtgccac gtgtctccat ctggggtcgg catcagcacc tctgtgttac ttgcccagat 120

gagaatatgc atgccctgtg acactcttcc tagaccagg 159

<210> 14

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acagaaatca tatttaccag gacacatctg ttaaataaaa gcattgtttc atgttggtgt 60

acgtctatac agggctatgt ataaccgact cctgtttctc ctccctgcaa ccacagaacc 120

atcacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 180

cacacacgga tacacgcaca gatacgctcc tttccacaaa tgcacgcaaa ccgggacgca 240

aacccacaac tcgagggctt agaccttcac tgctg 275

<210> 15

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctctaaaaaa ggcaagcaga taaaagagaa cacgaaaaat attcctactc cgcattcaca 60

ctttctggtc actcgcgttt acaaacaaga aaagtgttgc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

aaggccaggg gagacataca tttaaatata aaaatagaac tgtgccagcg actccggctg 180

gaattctgct gaaagggatg t 201

<210> 16

<211> 176

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gccagccccc tgatgggggc gacactccac catgaatcac tcccctgtga ggaactactg 60

tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac 120

cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattg 176

<210> 17

<211> 173

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggctgatc ctgcaggtac caatggggaa gagggtacgg gatgtaatgg atggttttat 60

gtagaggctg tagtggaaaa aaaaacaggg gatgctatat cagatgacga gaacgaaaat 120

gacagtgata caggtgaaga tttggtagat tttatagtaa atgataatga tta 173

<210> 18

<211> 142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agaattcgtc ttgctctatt cacccttact tttcttcttg cccgttctct ttcttagtat 60

gaatccagta tgcctgcctg taattgttgc gccctacctc ttttggctgg cggctattgc 120

cgcctcgtgt ttcacggcct ca 142

<210> 19

<211> 147

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctccaccacg ttccaccaaa ctcttcaaga tcccagagtc agggctctgt actttcctgc 60

tggtggctcc agttcaggaa cagtgaaccc tgttcagaac actgcctctt ccatatcgtc 120

aatcttatcg aagactgggg accctgt 147

Claims

1.一种多基因富集的探针库，其特征在于，

包括针对与多种肿瘤治疗相关的多个基因而设计的多条捕获探针，

所述多个基因至少包括与化疗药物相关的单核苷酸多态链所在的基因、靶向药物相关基因、以及用于免疫治疗的微卫星稳定性相关的基因和病毒基因。

2.如权利要求1所述的探针库，其特征在于，

所述病毒基因为能够引发癌症的病毒的基因。

3.如权利要求1所述的探针库，其特征在于，

所述多条捕获探针包括：

序列SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:19。

4.如权利要求1所述的探针库，其特征在于，

所述多条捕获探针的3’端具有生物素的标记。

5.如权利要求5所述的探针库，其特征在于，

所述生物素的标记配置在3’端末端倒数的第1位至第5位的至少任意一个位置。

6.如权利要求1或2所述的探针库，其特征在于，

包括与目标区域杂交的DNA探针，所述目标区域为所述多个基因的DNA序列以及在所述DNA序列的两侧的侧翼序列。

7.如权利要求1所述的探针，其特征在于，

所述多条捕获探针的各条探针的长度为50bp-300bp。

8.如权利要求6所述的探针库，其特征在于，

所述侧翼序列为所述DNA序列的两端5bp-50bp范围的序列。

9.如权利要求6所述的探针库，其特征在于，

所述多条捕获探针以叠瓦式设计，并且所述多条捕获探针的各条探针之间具有重叠部分。

10.如权利要求9所述的探针库，其特征在于，

所述多条捕获探针的各条探针之间的重叠部分为5至20个碱基。

11.一种与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法，其特征在于，

包括：

(a)从样本中提取DNA；

(b)基于步骤(a)的DNA构建DNA文库；

(c)将所述DNA文库与权利要求1至10中任一项所述的探针库进行杂交，并对杂交后的文库进行纯化；并且

(d)将步骤(c)所获得的DNA结果进行测序，检测基因变异。

12.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于，

在步骤(b)中，对从步骤(a)所提取的DNA进行片段化，并且将片段化后的DNA片段进行末端修复和加A尾，连接测序接头并进行纯化，从而进行PCR扩增以获得所述DNA文库。

13.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于，

所述样本为人源样本。

14.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于，

在步骤(c)中，利用亲和素处理的磁珠对杂交后的文库进行纯化。

15.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于，

所述基因变异包括点突变、基因片段插入/缺失、拷贝数变化、和融合/基因重排的基因变异中的至少一种。

16.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于，

在步骤(d)中，还检测至少包括微卫星不稳定性和肿瘤负荷突变的肿瘤相关标签。

17.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于，

在步骤(d)中，对所述测序的结果进行数据分析，以检测基因变异。

18.如权利要求17所述的检测方法，其特征在于，

所述数据分析包括对所述测序的结果去除不合格数据、并且对去除后的数据结果进行剪裁。

19.如权利要求18所述的检测方法，其特征在于，

所述不合格数据包括映射质量(mapping quality)小于或等于Q10的数据。

20.如权利要求18或19所述的检测方法，其特征在于，

所述不合格数据还包括连续20个以上相同碱基的polyN数据。