CN108676865A - 一种儿童青光眼相关基因芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域,涉及一种筛查儿童青光眼致病基因突变的基因芯片杂交探针及其设计方法和应用。本发明提供了一种儿童青光眼致病基因突变所涉及的基因芯片及其杂交探针的制备方法，该基因芯片的杂交探针所针对的基因涵盖了与儿童青光眼高度关联的289个致病基因。该基因芯片杂交探针的设计方法包括：设计并合成儿童青光眼致病基因的杂交探针,并将其整合到基因芯片上；利用制备的基因芯片捕获基因组目标区域并进行深度测序；对测序数据进行生物信息学分析,筛选出候选致病基因及其突变。本发明通过设计儿童青光眼致病基因芯片杂交探针，建立了高效的儿童青光眼靶基因突变筛查技术,有助于临床确定儿童青光眼的突变基因。

Description

一种儿童青光眼相关基因芯片及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域,涉及一种筛查儿童青光眼致病基因突变的基因芯片、其杂交探针设计方法及其在儿童青光眼致病基因突变筛查中的应用。

背景技术

青光眼是一类与眼内压病理性增高相关的进展性视神经损害，进而影响视功能的不可逆性致盲眼病。通常青光眼是一种与年龄相关的疾病，40岁以后发病率显著增高。然而儿童青光眼，也称发育性青光眼、先天性青光眼，多在出生时已存在眼部异常，大多在儿童期即造成不可逆性视功能损害，成年以前病情变化显著，严重危害着婴幼儿及青少年的视力发育，这种缺陷可以导致终身视觉残疾。儿童青光眼在一般眼病患者中仅占到0.01％-0.04％，而在盲人中可占到2％-15％，是一种重要的致盲眼病。儿童青光眼具有多种临床表现和明显的遗传异质性，因此对于儿童青光眼的相关基因检测对临床诊断、治疗方案和预后评估都具有相当重要的意义。

儿童青光眼具有复杂的临床表现，并且所涉及到的各临床特征之间有交叉重叠，临床诊断和鉴别诊断存在一定的难度。因此，在精准医学时代来临之际，从遗传学角度去诠释疾病的分类和特征有望能使我们深入认识此类疾病，指导临床治疗。众多基因缺陷均可导致儿童青光眼的发生，其常见的遗传模式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及X连锁隐性遗传。迄今，全世界已鉴定出200多个与儿童青光眼相关的致病基因，且随着研究深入，该数目正逐年递增，但仍有60％以上的儿童青光眼患者的致病基因或突变尚未明确，提示儿童青光眼具有显著的遗传异质性，其致病基因和突变有待进一步挖掘。

二代测序技术是一种比较成熟的高通量测序技术，可一次性对海量基因进行平行测序，相比传统技术其效率得到极大的提高，成本大幅度下降，极大地缩短了试验周期。基于二代测序技术的目标序列捕获高通量测序技术是通过特异性基因捕获探针对多个相关基因目标区域DNA片段进行捕获，然后采用二代测序技术对捕获到的目标区域DNA序列进行测定，找出致病基因及突变位点，可同时检测多种疾病、多个基因、多个突变位点，具有快速高效、结果可靠、费用经济等优点，在各类遗传性疾病的诊断方面具有良好的应用前景。儿童青光眼是一类具有遗传异质性的先天发育性疾病，表现多样，病情复杂，预后不佳，急需设计一套能覆盖各种儿童青光眼病因的基因芯片杂交探针，用于快速准确的基因诊断。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是针对多种缺陷基因，提供一种以高通量测序为技术平台的筛查儿童青光眼致病基因突变的基因芯片杂交探针及其设计方法。

本发明要解决的第二个技术问题是提供所述的基因芯片用于以高通量测序为技术平台筛查儿童青光眼致病基因突变的方法中的用途。本发明中以高通量测序为技术平台筛查儿童青光眼致病基因突变，采用本发明的捕获探针设计捕获目标区域，能显著提高测序深度的同时大幅降低测序数据量要求，缩短了分析时间。

本发明要解决的第三个技术问题是提供新的儿童青光眼致病基因突变。

本发明提供了一种儿童青光眼致病基因突变所涉及的基因芯片的杂交探针及其制备方法，该基因芯片的杂交探针所针对的基因涵盖了与儿童青光眼高度关联的289个致病基因。

更具体的，本发明提供了一种儿童青光眼致病基因筛查芯片，所述的芯片含有针对儿童青光眼高度相关致病基因的探针；

所述的探针是针对上述289个中一个或者若干个儿童青光眼高度相关致病基因的探针；

较好的，所述的探针是针对所有289个儿童青光眼高度相关致病基因的探针。

本发明所述的一种以高通量测序为技术平台检测儿童青光眼致病基因突变所涉及的基因芯片杂交探针的设计方法，包括：候选致病基因的选择和杂交探针的组合，其中，基因捕获芯片包含3981个探针，该基因捕获芯片探针设计针对不同基因选择特定转录本，选择原则是：优先考虑拥有CCDS编码蛋白的转录本，若一个基因有多个转录本均编码蛋白，则所设计探针需包含所有转录本的可编码外显子。

杂交探针的设计原则为：①探针覆盖所有候选基因的外显子区域及外显子和内含子拼接处；所述的外显子和内含子拼接处是指外显子上下游至少各10个bp；②去除在人类基因组中出现的高度重复序列以减少非特异性捕获；③探针通过叠瓦式设计覆盖，且探针密度可以确保每条待检测区域的DNA模板都有对应的探针与之结合，探针覆盖度可达100％；④捕获的探针为混合探针，探针平均长度为120bp左右。

所述的候选基因涵盖了全部由PUBMED文献报导的与儿童青光眼相关的致病基因及高度怀疑可能与儿童青光眼相关的289个基因。

1.候选基因的选择：

本发明将与儿童青光眼相关的289个基因整合为一个基因组进行检测，见下表1：

表1

注：基因名称，转录本编号及基因全称来源于NCBI。

2.候选基因杂交探针组的设计：

1)转录本的选择：探针设计针对不同基因选择特定转录本，优先考虑拥有CCDS编码蛋白的转录本，若一个基因有多个转录本，则所设计探针需包含所有转录本的可编码外显子；

2)探针覆盖所有候选基因的可编码外显子区域及外显子和内含子拼接处10bp；

3)去除在人类基因组中出现的高度重复序列以减少非特异性捕获；

4)探针通过叠瓦式设计覆盖，且探针密度可以确保每条待检测区域的DNA模板都有对应的探针与之结合，探针覆盖度可达100％；

5)捕获的探针为混合探针，探针平均长度为120bp左右，以确保杂交温度均一；

6)探针的覆盖区域见探针序列位置表.

另一方面，本发明提供了一种该基因芯片杂交探针系统的应用方法，包括：(1)设计并合成儿童青光眼致病基因的杂交探针,并将其整合到基因芯片上；(2)利用制备的基因芯片捕获基因组目标区域并进行深度测序；(3)对测序数据进行生物信息学分析,筛选出候选致病基因及其突变：

该应用方法包括以下步骤：

1)建立儿童青光眼遗传资源库，收集此类病人的临床资料及血液标本，提取基因组DNA；

2)对检测对象的基因组DNA进行定量，并构建文库；

3)对文库进行定量操作；

4)高通量测序；

5)数据分析得到致病位点相关信息。

其中，所述步骤2)中的建立文库的具体步骤如下：

a)将基因组DNA进行片段化；

b)将片段化的基因组DNA进行末端修复的同时进行3'末端加A；

c)将3'末端加A的产物连接接头，以便进行有效连接产物的扩增；

d)将连接产物进行PCR扩增，加上完整的接头获得全基因组文库；

e)使用探针对全基因组文库中的目标区域文库进行捕获；

f)将未捕获的文库清洗掉，仅保留目标区域文库；

j)获得目标区域捕获文库。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

所述步骤1)中的提取方法包括纯化柱纯化、磁珠纯化或酚氯仿提取。

所述步骤2)中的定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和电泳。

所述步骤2a)中对DNA进行片段化的方法包括超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切。

所述步骤2b)中末端修复和3’末端加A在同一个反应中进行。

所述步骤2b)和2c)之间不需要进行纯化。

所述步骤2e)中的捕获方法包括液相探针捕获、固相芯片杂交捕获和PCR富集。

所述步骤3)中的定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和毛细管电泳定量。

所述步骤4)中的文库测序通过高通量测序平台进行。

所述步骤5)的具体操作如下：通过对所得测序数据与人类基因组的参考序列进行对比，最终对所测基因的每个突变位点情况进行分析，得到致病基因突变相关信息。

有益效果：

1.儿童青光眼一类是严重危害儿童视觉健康的遗传性致盲疾病，挖掘儿童青光眼的新的致病基因突变有利于进一步探索儿童青光眼的分子遗传学病因，是充分利用我国的眼科遗传病资源，造福儿童青光眼患者的现实需要，是后基因组时代最重要的研究方向之一。本发明旨在探索儿童青光眼的遗传学病因，从而帮助了解发病机制，辅助临床诊断、产前诊断和为今后的基因治疗奠定基础。

2.儿童青光眼临床表现复杂多变，不同类型疾病的基因型和临床表型均存在交叉，低龄患儿的临床检查和操作困难，因此诊断和鉴别诊断存在一定的难度，及时正确的诊断和治疗对患儿的一生及所在的家庭都有着深远的影响，本发明可以快速高效的提供儿童青光眼的基因诊断和遗传咨询，同时明确这些基因与各种儿童青光眼的临床表现之间的关系，提高医生的临床医疗水平，提高儿童青光眼的确诊率，减少漏诊误诊，改善预后。

3.本申请的所有候选基因均是由申请人在多年从事青光眼遗传学研究的基础上查阅大量文献所筛选出的，涵盖了目前PUBMED文献报导的所有与儿童青光眼的相关的基因，本申请所设计的杂交探针覆盖所有已知致病基因的外显子区域及外显子和内含子拼接处，并根据不同的转录本设计相应的探针，剔除了目标区域中所含有的高度重复序列，从而使筛查效益达到最高，致病位点筛查面达到最广，假阳性率降到最低。

4.儿童青光眼具有显著的遗传异质性，仍存在大量未知的致病基因和致病突变，应用传统的测序技术研究存在效率低、成本高的局限性。二代测序技术，可以一次性对海量基因进行平行测序，在遗传性疾病的基因挖掘和致病基因筛查方面具有巨大优势，在该领域的应用已趋成熟，将二代测序技术应用于我国儿童青光眼的研究既是非常必要的，也是可行的。我们所申请的专利将以高通量测序为手段，设计一基因芯片杂交探针组，用于建立高效、可信、经济的儿童青光眼靶基因捕获测序技术和基因诊断流程。

附图说明

图1.一个AR家系图。

图2.先证者III:5双眼眼前节图。

图3.先证者III:5双眼眼底图。

图4.超声生物显微镜检查图。

图5.测序图。

具体实施方式：

实施例1

本实施例是采用Hiseq测序技术对受检人血浆中的基因组DNA进行检测，具体操作步骤如下:

1、按照说明书操作，使用Roche的High Pure PCR Template Preparation Kit提取受检人的血浆中的基因组DNA。

2、使用超声破碎仪将基因组DNA破碎成500bp左右的小片段。

本实施例中，使用Covaris超声破碎仪，按照标准操作，将3μg DNA片段化。

3、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.8:1，用50μl去核酸酶水洗脱，具体操作如下：

4、使用End Prep Enzyme Mix(包含T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T4PNK、TaqDNA聚合酶、Klenowexo-)进行末端修复和3’末端加A。反应条件为：37℃，30min；72℃，30min。反应体系如下：

成份	体积(μl)
		DNA sample	48
10×End Repair Buffer	6.5
		End Prep Enzyme Mix	2
Nuclease-Free water	To 65

5、使用TA DNA连接酶在模板两端加接头序列，向上述反应液中加入如下成分，反应条件为：22℃，15min。

成份	体积(μl)
		T4 DNA Ligase Buffer	14
Adaptor Mix	2.5
		T4 DNA Ligase	2

6、使用Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化样品和片段分选，用32μl洗脱，具体操作如下：

7、对连接产物进行扩增，PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共循环6次；最终72℃延伸5min。由此，获得PCR产物。反应体系如下：

成份	体积(μl)
		Indexing Adaptor-ligated library	23
Univesial primer	1
		Index Primer	1
2×HiFid elity PCR Mix	25

其中：PCR引物序列如下：

Univesial primer:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO.1)

Index primer:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO.2)

8、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用30μl洗脱，具体操作如下：

9、使用生物素标记的探针与样品杂交，反应条件为：95℃，5min变性，之后保持在65℃，16-24h。反应如下体系：

成份	体积(μl)
		library	3.4
Hybridization buffer	13
		Capture Liprary	7
Block Buffer	5.6

10、使用链霉亲和素标记的磁珠，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。步骤如下：

11、使用DNA聚合酶对捕获到的目标序列进行扩增。PCR反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共循环12次；最终72℃延伸10min。由此，获得PCR产物，反应体系如下：

成份	体积(μl)
		Capture on DNA	14
Nuclease-Free water	22.5
		5×PCR Buffer	10
Universal Primer	1
		Index Primer	1
100mM dNTP Mix	0.5
		DNA Polymerase	1

备注：PCR引物序列同上。

12、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.8:1，用30μl去核酸酶水洗脱，具体操作如下：

13、文库质检定量

将上一步得到的文库2.0(Invitrogen)进行定量，使用安捷伦2100生物分析仪进行质检；

14、上机测序及数据分析

将样本使用Illumina Hiseq X-10程序进行双末端测序，以便获得测序结果，具体操作流程详见Hiseq X-10操作说明书；

15、数据分析

Hiseq产出的测序结果是fastq形式的DNA序列，对于illumina Hiseq产生的原始数据进行质控以获得高质量DNA序列数据，将reads在人类基因组上进行定位，根据reads定位信息获取原始变异信息，对原始变异信息进行质控以获得高质量的变异位点，利用多个数据库对产生的高质量变异位点进行注释，将注释过的变异位点信息更新到ADMD(Amplicongene Diabetes Mellitus Database)中，并使用ADMD对变异位点进行进一步注释，配合临床表现对可疑位点进行筛选，对于未找到可疑位点的样本进行CNV(拷贝数据变异)筛选，整理诊断报告，经Sanger测序验证，鉴定致病基因；

目前通过本发明所述的方法已获得的儿童青光眼相关致病基因突变详见下表2，所有突变均被一代测序(Sanger测序)结果验证：

表2

注：以上突变位点的碱基位置均以UCSC(hg19)数据库中基因的cDNA序列为参照。

具体实验结果如下：

以PITX2基因在一个儿童青光眼家系中的基因突变检测和验证为例，详细阐述基因突变检测和验证的相关实验结果。

1.临床资料

1.1家系图：如图1所示；

1.2家族中先证者(III:5)的临床资料：

视力：

右眼指数10cm，矫正：-15.75DS/-0.75DS*30＝0.15；

左眼指数20cm，矫正：-16.75DS/-1.75DS*95＝0.05；

眼内压：

右眼39.2mmHg；左眼34.5mmHg；

辅助检查：

眼前节照相：如图2所示；

眼底照相：如图3所示；

超声生物显微镜图片：如图4所示。

2.家系验证结果

本申请从先证者(III:5)及相关家庭成员(I:1，I:2，II:1，II:3，II:5)的血液中提取基因组DNA，通过应用本申请设计的杂交探针组所包含基因的芯片对先证者III:5进行二代测序，结果发现了PITX2基因上的p.P64A突变，应用Sanger一代测序验证此突变位点，并在其他家系成员I:2，II:3，II:5中发现此突变，而I:1，II:1未发现此突变，证实该基因突变与此家系表型共分离，该基因突变从未在儿童青光眼患者中发现；Sanger测序验证结果如图5所示。

根据所设计的流程，借助所设计的基因芯片杂交探针及高通量测序技术，证实PITX2基因的突变位点p.P64A为该儿童青光眼家系的致病位点。

表3为探针序列位置表(3981个)。

表3

注：以上碱基位点为在UCSC(hg19)数据库中对应的物理位置。

序列表

<110> 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院

<120> 一种儿童青光眼相关基因芯片及其制备方法和应用

<130> 20180301

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial(Artificial)

<400> 2

caagcagaag acggcatacg agattggtca gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

atct 64

Claims (8)

1.一种儿童青光眼致病基因筛查芯片，其特征在于，所述的芯片含有针对儿童青光眼高度相关致病基因的探针；

所述的探针是针对表1中一个或者若干个儿童青光眼高度相关致病基因的探针，

表1

2.如权利要求1所述的儿童青光眼致病基因筛查芯片，其特征在于，所述的探针是针对权利要求1中所有289个儿童青光眼高度相关致病基因的探针。

3.如权利要求1所述的儿童青光眼致病基因筛查芯片的制备方法，其特征在于，所述的基因芯片的杂交探针其设计原则为：①探针覆盖所有候选基因的外显子区域及外显子和内含子拼接处；所述的外显子和内含子拼接处是指外显子上下游至少各10个bp；②去除在人类基因组中出现的高度重复序列；③探针通过叠瓦式设计覆盖，且探针密度可以确保每条待检测区域的DNA模板都有对应的探针与之结合，探针覆盖度达100％；④捕获的探针为混合探针，探针平均长度为120bp。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的基因芯片的杂交探针所针对的基因涵盖与儿童青光眼高度关联的289个致病基因。

5.权利要求1所述的针对儿童青光眼高度相关致病基因的探针在用于检测儿童青光眼致病位点方法中的用途，其中，所述方法包括以下步骤：

1)收集儿童青光眼患者的临床资料及血液标本，提取基因组DNA；

2)对检测对象的基因组DNA进行定量，并构建文库；

3)对文库进行定量操作；

4)高通量测序；

5)数据分析得到致病位点相关信息。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述步骤2)中的建立文库包括如下步骤：

a)将基因组DNA进行片段化；

b)将片段化的基因组DNA进行末端修复的同时进行3'末端加A；

c)将3'末端加A的产物连接接头，以便进行有效连接产物的扩增；

d)将连接产物进行PCR扩增，加上完整的接头获得全基因组文库；

e)使用探针对全基因组文库中的目标区域文库进行捕获；

f)将未捕获的文库清洗掉，仅保留目标区域文库；

j)获得目标区域捕获文库。

7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述步骤5)中，包括：通过对所得测序数据与人类基因组的参考序列进行对比，最终对所测基因的每个突变位点情况进行分析，得到致病基因的突变信息。

8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述步骤e)中的捕获方法包括液相探针捕获、固相芯片杂交捕获或者PCR富集中的一种或者几种。