CN110747270A

CN110747270A - 一种检测诊断青少年发病的成人型糖尿病致病基因的dna文库及其应用

Info

Publication number: CN110747270A
Application number: CN201911071151.5A
Authority: CN
Inventors: 王开宇
Original assignee: Fuzhou Furui Medical Laboratory Co Ltd
Current assignee: Fuzhou Furui Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2020-02-04

Abstract

本发明涉及一种通过靶向高通量测序技术检测诊断青少年发病的成人型糖尿病致病基因的DNA文库及其应用，该文库包括14个青少年发病的成人型糖尿病的致病基因。本发明优选14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因，设计探针池，建立针对14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的14个基因为目前已知的青少年发病的成人型糖尿病1型至14型的致病基因，对青少年发病的成人型糖尿病的诊断、鉴别诊断和精准治疗有着重要的意义和临床价值。

Description

一种检测诊断青少年发病的成人型糖尿病致病基因的DNA文库及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种通过靶向高通量测序技术检测诊断青少年发病的成人型糖尿病致病基因的DNA文库及其应用。

背景技术

青少年发病的成人型糖尿病(Maturity onset diabetes of the young,MODY)是一种由于单基因突变导致的特殊类型糖尿病。其特征性表现为：发病年龄早，常染色体显性遗传，存在β细胞功能缺陷，无自身免疫或胰岛素抵抗的相关证据。青少年发病的成人型糖尿病占糖尿病人群的1-2％。由于其与1型糖尿病和2型糖尿病存在重叠，当前大多数青少年发病的成人型糖尿病患者被误诊为1型糖尿病或2型糖尿病，导致实际患病率被低估。正确的分子诊断对于青少年发病的成人型糖尿病患者治疗方案的合理选择、预后判断及家系成员的风险评估均具有重要意义。

青少年发病的成人型糖尿病患者的正确诊断，对于其治疗方案的合理选择、预后判断及家系成员的危险性评估均具有至关重要的意义。首先，正确的诊断可以使患者得到更为合理的治疗，在确诊为青少年发病的成人型糖尿病1型或青少年发病的成人型糖尿病3型后转换为口服黄脲类药物治疗，不仅能改善患者的生活质量，而且可以显著改善患者的血糖控制。其次，分子学诊断可以帮助评价患者的预后。对于一个轻度高血糖的成人，如果确诊为青少年发病的成人型糖尿病2型、青少年发病的成人型糖尿病3型或1型糖尿病，其治疗和随访策略将将截然不同。第三，分子诊断可以促进伴随疾病的诊断和识别，如青少年发病的成人型糖尿病5型伴随的胰腺和泌尿生殖系统异常、青少年发病的成人型糖尿病8型伴随的胰腺外分泌功能障碍等。最后通过，通过诊断青少年发病的成人型糖尿病，可以进一步筛查家系成员的基因携带状态，避免误诊、漏诊。

目前，临床实验室检测基因突变大多采用传统的Sanger测序法，而如果对青少年发病的成人型糖尿病的众多致病基因同时检测，不仅工作量巨大，而且导致检测效率低，更重要的是浪费珍贵的DNA样本、明显增加基因诊断的检测成本，严重制约了其在临床分子诊断中的大规模应用。因此，有必要寻求一种新的检测青少年发病的成人型糖尿病致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种能够提高诊断准确率、降低成本和劳动强度的通过靶向高通量测序技术检测诊断青少年发病的成人型糖尿病致病基因的DNA文库。

本发明的目的之二在于提供所述DNA文库的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种基于高通量测序技术诊断青少年发病的成人型糖尿病的DNA文库，该文库包括14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因，其中，所述14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因如下表所示：

序号	基因	相关疾病
			1	ABCC8	青少年发病的成人型糖尿病12型
2	APPL1	青少年发病的成人型糖尿病14型
			3	BLK	青少年发病的成人型糖尿病11型
4	CEL	青少年发病的成人型糖尿病8型
			5	GCK	青少年发病的成人型糖尿病2型
6	HNF1A	青少年发病的成人型糖尿病3型
			7	HNF1B	青少年发病的成人型糖尿病5型
8	HNF4A	青少年发病的成人型糖尿病1型
			9	INS	青少年发病的成人型糖尿病10型
10	KCNJ11	青少年发病的成人型糖尿病13型
			11	KLF11	青少年发病的成人型糖尿病7型
12	NEUROD1	青少年发病的成人型糖尿病6型
			13	PAX4	青少年发病的成人型糖尿病9型
14	PDX1	青少年发病的成人型糖尿病4型

本发明提供的DNA文库覆盖青少年发病的成人型糖尿病1型至14型，包含14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因。这14个基因选择基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(OMIM数据库、HGMD数据库、ClinVar数据库)。这14个基因上的致病基因变异既可以单独致病，也可以联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序。

本发明根据14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻±20bp内含子区域的探针池，利用探针靶向捕获建立含有14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确青少年发病的成人型糖尿病的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。

本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断青少年发病的成人型糖尿病的致病基因。

进一步，所述应用包括下列步骤：

1)收集青少年发病的成人型糖尿病患者的临床资料及临床生物样本，优选的，所述的临床生物样本是指来源于人体的各类样本，包括但不限于来自受检者的外周血、体液、组织器官样本，如受检者的唾液、毛发或口腔黏膜等。

2)提取样本的基因组DNA，优选的，提取方法包括DNA提取试剂盒或各种手工提取方法；

3)对提取的基因组DNA进行定量，并构建文库，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；其中，构建文库包括如下步骤：

a)将基因组DNA进行片段化，优选的，所述片段化方法包括但不限于超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切；

b)将片段化的基因组DNA进行末端修复的同时进行3'末端加A；

c)将3'末端加A的产物连接接头，以便进行有效连接产物的扩增，优选的，所述链接接头来自于高通量测序建库试剂盒；

d)将连接产物利用通用引物进行PCR扩增，加上完整的接头，优选的，所述通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；

e)使用针对上述14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因的探针靶向捕获目标区域，优选的，所述捕获方法包括但不限于液相探针捕获和固相芯片杂交捕获；

f)将未捕获的文库清洗掉，仅保留目标区域文库；

j)获得目标区域捕获文库。

4)对文库进行定量操作，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；

5)利用测序设备对文库进行高通量测序，优选的，所述测序设备包括但不限于Novaseq系列、Hiseq系列、Nexeseq系列、BGIseq系列第二代核酸测序仪；

6)将得到的测序数据进行生物信息学比对，并通过变异解读得到致病位点相关信息。

一种诊断试剂盒，所述试剂盒包括所述的DNA文库。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1.青少年发病的成人型糖尿病是一种由于单基因突变的遗传性糖尿病。由于症状与1型糖尿病和2型糖尿病相似，当前大多数青少年发病的成人型糖尿病患者被误诊为被误诊为1型糖尿病或2型糖尿病，确定致病基因是青少年发病的成人型糖尿病临床正确诊断的关键。本发明旨在建立一种快速、准确、高通量检测青少年发病的成人型糖尿病致病基因的新方法，从而帮助了解发病机制，辅助临床诊断、预后判断、产前诊断和精准治疗奠定基础。

2.基因诊断有助于临床遗传咨询和产前诊断等。因青少年发病的成人型糖尿病对人体的长期危害巨大，且疾病临床表现缺乏特异性，容易误诊，基因检测可为患者家属提供更多的遗传信息。通过临床遗传咨询，家属可了解自身的患病可能；患者父母或本人可通过基因检测指导生育，确保将来下一胎的健康。青少年发病的成人型糖尿病为常染色显性遗传，只有进行基因检测才能够提供准确的健康和生殖指导。发现家系中尚无症状的年幼致病基因携带者也有助于更早制定家庭医疗和康复计划。

3.本申请的DNA文库是发明人在多年开展高通量基因检测服务积累大量中国青少年发病的成人型糖尿病临床病例的基础上，查阅大量文献，并采用ClinGen等权威数据库提供的疾病-基因相关性筛选方法，最终优选的14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因，兼顾了全面性、准确性和科学性。本发明优选14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因，设计探针池，建立针对14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的14个基因检测区域能够检测青少年发病的成人型糖尿病1型至14型，共14个基因型，对青少年发病的成人型糖尿病的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。

4.本发明中采用高通量测序技术对目标区域捕获文库进行测序，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因的全部外显子及其毗邻区域。与传统测序技术相比，本发明的检测效率显著提高、成本显著降低，在青少年发病的成人型糖尿病基因挖掘和致病基因筛查方面具有巨大优势，是高效、可信、经济的青少年发病的成人型糖尿病致病基因检测技术。

5.综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对青少年发病的成人型糖尿病具有很好的辅助诊断价值。

附图说明

图1是实施例1中对先证者样本的14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因建立目标区域靶向DNA文库的质控信息。

图2是实施例1中对先证者样本的14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因的目标区域进行测序的数据覆盖信息。

图3是实施例1中对先证者样本的14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因的目标区域进行测序的数据量信息。

图4是实施例1中所述的青少年发病的成人型糖尿病家系的家系图谱，图中箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体。

具体实施方式

本发明提供了一种检测诊断青少年发病的成人型糖尿病致病基因的DNA文库及其应用，下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，根据本发明的一个实施例，通过高通量测序平台进行测序，优选Illumina Hiseq平台，并进行数据分析，通过确定青少年发病的成人型糖尿病表现者是否携带致病基因，判断其是否为青少年发病的成人型糖尿病患者。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第四版或者相关资料进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：

本实施例是采用Illumina公司的Hiseq测序平台对受检人外周血基因组DNA进行检测，具体实施步骤如下：

1.样本来源

来自中国福建省的一名12岁女性患儿，患儿在体检时发现空腹血升高(6.7mmol/L)，体检发现BMI值为17.1kg/m²，外观正常且无既往相关病史，实验室检测结果为口服糖耐量实验(OGTT)结果显示1h血糖水平从空腹时的6.7mmol/L增加到9.7mmol/L，2h血糖水平为6.9mmol/L；糖化血红蛋白为5.8％，胰岛素自身抗体阴性，肝功和肾功指标未见异常，患者的父亲、爷爷均有糖尿病史，初次诊断时间分别为23岁和35岁。该患者的家系谱如图4所示，箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体。获得所有参与者的知情同意书，从该实施例家系成员的肘静脉采集静脉血10mL(EDTA抗凝处理)，用于检测。

2.标本基因组DNA的提取：

按照商家提供的说明书操作，使用Magen公司的基因组DNA提取试剂盒(HiPureBlood&Tissue DNA Kit)从外周血样本中提取基因组DNA，使用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得基因组DNA的OD_260nm/OD_280nm均位于1.7-2.0之间，使用Nanodrop one测量DNA的浓度，所得基因组DNA的浓度为50-100ng/μL，总量为5-10μg。

3.基因组扩增文库的建立：

按照商家提供的说明书操作，使用KAPA公司的试剂盒(KAPA HyperPlus LibraryPreparation Kit)对基因组DNA进行酶切片段化、末端修复、3'末端加A、链接接头和PCR扩增，最后对获得文库进行定量和质检，具体实施步骤如下：

1)基因组DNA片段化反应，反应体系如下：

试剂名称	用量(μL)
		基因组DNA(100ng)	2
NF H<sub>2</sub>O	15.5
		KAPA Frag Buffer	2.5
KAPA Frag Enzyme	5
		总体积	25

反应条件：37℃反应12min。

2)末端修复和3'末端加A反应，反应体系如下：

反应条件：20℃反应1min；65℃反应30min；20℃恒温

3)接头链接反应，反应体系如下：

试剂名称	用量(μL)
		步骤2)获得的DNA	30
NF H<sub>2</sub>O	2.5
		KAPA Ligation Buffer	15
Adaptor(15μM)	2.5
		KAPA DNA Ligase	5
总体积	55

反应条件：20℃反应20min。

4)第一次PCR扩增反应，反应体系如下：

试剂名称	用量(μL)
		步骤3)获得的DNA	16
KAPA HiFi HotStart Ready Mix(2×)	20
		T5*Primer(10μM)	1.5
T8*Primer(10μM)	1.5
		总体积	39

反应条件：98℃45s；(98℃15s，60℃30s，72℃30s)×6cycles；72℃1min；12℃保存。

5)DNA定量和质检：

使用Nanodrop one测量PCR扩增产物的浓度和条带分布情况；配置2％琼脂糖凝胶，将获得PCR扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200-800bp之间为合格。

4.基于探针杂交捕获构建目标区域靶向DNA文库：

按照商家提供的说明书操作，文库的构建采用IGT公司的文库构建试剂盒，探针根据候选的14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因序列设计，合成并生物素标记，具体实施步骤如下：

1)探针杂交：

将步骤3获得PCR产物5μg与5μL Cot-1human DNA混合，涡旋振荡；根据总体积，加入2.5×Ampure XP beads，混匀离心，室温静置5min；上述磁珠用80％的乙醇离心清洗2次，用杂交液洗脱并进行杂交反应，杂交液的体系如下：

试剂名称	用量(μL)
		IDT 2×Hybridization Buffer	8.5
Hybridization Enhancer	2.75
		NF H<sub>2</sub>O	1.75
Universal Blockers-TS Mix	2
		生物素标记的探针(14个基因)	4
总体积	19

杂交条件：95℃反应10min；65℃过夜

2)使用80μL链霉亲和素标记的磁珠(M-270Streptavidin beads)，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。利用200μL的1×Bead WashBuffer依次在65℃和室温洗涤三次，每次3min，最后磁珠用20μL NF H₂O重悬。

3)对捕获到的目标序列进行第二次PCR扩增反应，反应体系如下：

试剂名称	用量(μL)
		KAPA HiFi Hot start Readymix(2×)	25
X Gen Library Amplification primer-Ts Mix	5
		步骤2)获得的带磁珠DNA	20
总体积	50

反应条件：98℃45s；(98℃15s,60℃30s,72℃30s)×7cycles；72℃1min；4℃保存。

5)PCR产物定量和质检：

5.测序数据的生信分析和变异解读：

使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScanmpileup2indel检测确定14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因区域的变异。利用Remove Run Common Variants和Remove Global Common Variants软件去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等，并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT、PROVEAN、SIFT软件进行变异功能预测。根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》，分析得到对青少年发病的成人型糖尿病诊断有意义的突变位点。

6.测序结果说明及分析

通过本发明中提供的一种检测诊断青少年发病的成人型糖尿病致病基因的DNA文库，一次性对5个受检者的14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因进行测序。以先证者为例，经质控分析，所得DNA文库大小主要分布在200-800bp，平均长度为370bp，浓度和片段大小符合测序要求，提示文库构建质量合格(如图1)。DNA文库包括14个基因的编码区长度为23847bp，非编码区长度为9487bp，共计33334bp。其中编码区的10×覆盖度为99.5％，20×覆盖度为98.86％，50×覆盖度为98.05％(如图2)。总共获得165037个片段读长数据(TotalReads)，匹配率(Aligned)为88.33％(如图3)。以上测序结果满足变异解读的数据要求。经过对测序数据的分析，发现与受检者临床表型相关的，青少年发病的成人型糖尿病(青少年发病的成人型糖尿病2型)的致病基因变异，如下表所示：

经过本实施例，在先证者的外周血基因组DNA中检出GCK基因的NM_033507.3:c.1166dupG(p.Val390ArgfsTer70)杂合致病变异，即编码区第1166位碱基G发生重复，该变异导致编码蛋白的氨基酸从第390位发生移码突变(缬氨酸变成精氨酸)，在移码突变69个新氨基酸后，翻译终止。该变异可能引起蛋白截短或激活无义介导的mRNA降解，从而影响GCK基因编码蛋白产物的功能。该变异在先证者父亲、爷爷外周血DNA中被检出，在先证者母亲、奶奶外周血DNA中未被检出，提示该变异在该家系中与临床表型共分离。该致病变异提示先证者患有青少年发病的成人型糖尿病2型，为临床诊断提供了依据。青少年发病的成人型糖尿病2型患者的病情没有显著进展，很少会出现微血管并发症。治疗建议是通过饮食、运动调整即可控制血糖水平。无需使用胰岛素类药物。由于先证者父亲和爷爷都是该类型青少年发病的成人型糖尿病患者，可以参考相关治疗措施。先证者为女性，其子女有1/2几率同为青少年发病的成人型糖尿病2型患者，且先证者在妊娠时患妊娠糖尿病的风险显著增高。(如图4)

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“该实施例”、“实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中，且不做特定指代。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims

1.一种基于高通量测序技术诊断青少年发病的成人型糖尿病的DNA文库，其特征在于，该文库包括14个青少年发病的成人型糖尿病的致病基因，其中所述14个青少年发病的成人型糖尿病的致病基因如下表所示：

序号基因相关疾病 1 ABCC8 青少年发病的成人型糖尿病12型 2 APPL1 青少年发病的成人型糖尿病14型 3 BLK 青少年发病的成人型糖尿病11型 4 CEL 青少年发病的成人型糖尿病8型 5 GCK 青少年发病的成人型糖尿病2型 6 HNF1A 青少年发病的成人型糖尿病3型 7 HNF1B 青少年发病的成人型糖尿病5型 8 HNF4A 青少年发病的成人型糖尿病1型 9 INS 青少年发病的成人型糖尿病10型 10 KCNJ11 青少年发病的成人型糖尿病13型 11 KLF11 青少年发病的成人型糖尿病7型 12 NEUROD1 青少年发病的成人型糖尿病6型 13 PAX4 青少年发病的成人型糖尿病9型 14 PDX1 青少年发病的成人型糖尿病4型

。

2.如权利要求1所述的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒用于诊断发现青少年发病的成人型糖尿病的致病基因。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括下列步骤：

1)提取受检者样本的基因组DNA；

2)对提取的基因组DNA进行定量，并按以下步骤构建文库：

a)将基因组DNA进行片段化；

b)将片段化的基因组DNA进行末端修复的同时进行3'末端添加碱基A；

c)将3'末端添加碱基A的产物连接接头；

d)将连接产物进行PCR扩增，加上完整的接头；

e)使用针对权利要求1所述的14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因的探针靶向捕获目标区域；

f)将未捕获的文库清洗掉，仅保留目标区域文库；

j)获得目标区域捕获文库；

3)对文库进行定量操作；

4)高通量测序；

5)数据分析得到致病位点相关信息。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤1)中所述样本来自受检者的外周血、体液、组织器官样本。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤2)中所述定量的方法包括荧光定量方法和电泳。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤a)中片段化方法包括超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤3)中所述定量的方法包括荧光定量方法和电泳。

8.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的DNA文库。