TWI535851B - Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) integrated gene detection method and its detection kit, primer group - Google Patents

Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) integrated gene detection method and its detection kit, primer group Download PDF

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自體顯性多囊性腎臟疾病(Autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)之整合式基因檢測方法及其檢測套組、引子組
本發明係關於一種基因檢測方法，尤指一種自體顯性多囊性腎臟病基因群組之檢測方法。本發明亦有關於用於檢驗自體顯性多囊性腎臟病基因的引子組與套組。
自體顯性多囊性腎臟疾病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)為一種常見的腎臟遺傳疾病，盛行率約1/400~1/1000，約佔末期腎臟病(end-stage renal disease,ESRD)之5%，此疾病任何年齡都可發病，發病的危險期多數在40至60歲之間。
由多囊性腎臟病腎臟患者之腎臟切面可觀察到，腎臟呈現海綿狀，具有有很多大小不一致、呈圓形或不規則形狀的囊泡。在初期，病患不一定會有明顯症狀，但當水泡越來越多、越來越大並壓迫到腎臟組織時，可能會出現腰痛、血尿、尿路感染以及尿路結石之症狀，最後大部分的腎臟組織均被囊腫佔據，腎臟明顯變大，導致腎功能惡化，甚至導致腎衰竭及尿毒症而需終身洗腎或換腎。常見併發症為高血壓、高血壓引起心臟血管疾病，或腎衰竭。患者除了腎臟之外，在肝臟、卵巢、胰臟、脾臟等器官也可能有囊腫出現。約25%患者可能合併心臟僧帽辦脫垂，5至10%患者可能合併腦內血管瘤，腦內血管瘤若破裂則造成腦出血。
自體顯性多囊性腎臟病目前已發現與兩個基因的突變有密切關係，分別是PKD1及PKD2基因。PKD1基因位於染色體16p13.3，有46個外顯子(exon)，而PKD2基因位於染色體4q21，有15個外顯子。約有85%的自體顯性多囊性腎臟病病患具有PKD1的基因突變，其易導致嚴重的疾病病程，ESRD發生之平均年齡約為53歲，約有15%的自體顯性多囊性腎臟病病患具有PKD2的基因突變，ESRD發生之平均年齡約69歲。
目前臨床上最常使用的檢查的方法為影像學檢查，影像學檢查雖可診斷此症，但無法提供早期確診，若懷疑自己是否可能患病的民眾，只能要求定期做尿液和影像學檢查，早點發現異常情形，就可以早點控制，避免腎衰竭的發生。由於無法提供早期確診，所以目前的檢測方法還是有其不足的地方。
此外，由於PKD1與PKD2基因相當龐大且複雜，所以基因突變分析對於這類基因是相當困難。PKD1基因具有46個外顯子，大小超過50Kb，而PKD2基因具有15個外顯子，其中最特殊的是，在PKD1基因所在的第16對染色體上另存有與一部分PKD1基因外顯子(亦即exon 1-33)相似的序列，所以無法專一性的以聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增標的基因片段。
再者，即使目前已有論文發表可用長程聚合酶鏈鎖反應(long range PCR)擴增PKD1基因序列，然而由於PKD基因的突變並無明顯熱點(hot spot)，因此通常每個病例基因異常的部位不同，因此若不針對特定已知之PKD區域進行檢測，通常需做整段基因的定序分析才可查到異常。
除了從整段基因序列定序分析外，過去自體顯性多囊性腎臟疾病基因分析尚有cDNA之序列分析，由於其敏感度及操作複雜耗時之問題，無法符合現今常規基因檢測之需要。此外，傳統之基因連鎖分析(Linkage analysis)雖然可能應用在自體顯性多囊性腎臟疾病基因分析，藉以達到診斷之目的，但是其受限於必須在擁有多位自體顯性多囊性腎臟疾病病患成員之龐大家族才可能進行分析，所以發展直接之基因診斷方式來進行自體顯性多囊性腎臟疾病檢測是非常重要的。
自體顯性多囊性腎臟病患者的腎功能係逐步緩慢惡化，最後進展到需要透析治療，平均開始透析的年齡約53至56歲之間，約佔我國所有透析病人的2%，於歐美國家則為8至10%；其中若60至75歲才發現，則洗腎的機會增加為50至75%。綜言之，年紀越大才被診斷出多囊腎病的病人，未來進入洗腎的機會也越高，造成嚴重的健康問題及社會照料問題。因此，如能有快速、準確，且具效率之檢測技術，得以檢驗出自體顯性多囊性腎臟病相關基因之變異，將有助於盡早發現具有罹患此病之風險，及早預防，以節省醫療成本。另外，所述的技術亦可提供患者優生保健服務，檢測出基因異常位置作為帶有遺傳疾病的家庭進行懷孕規劃之依據，將可避免產下患有疾病的新生兒。
基於現有技術缺乏有效早期確診自體顯性多囊性腎臟病之臨床診斷方法，又因為PKD1與PKD2基因相當龐大且複雜，而使得其基因突變分析困難，導致檢測流程過於繁雜等缺點，本發明係提供一種有效可應用於檢驗自體顯性多囊性腎臟病基因的基因檢測方法以及其檢驗套組與引子組，藉以於自體顯性多囊性腎臟病發病之前，透過對PKD1和/或PKD2基因之突變分析結果，作為診斷自體顯性多囊性腎臟病之依據，以達到預防以及提早治療之目的。
本發明提供一種自體顯性多囊性腎臟疾病之整合式基因檢測方法，其包含：提供一基因組核苷酸樣品；以基因組核苷酸樣品為模板並且使用至少一PKD1長片段引子組進行聚合酶鏈鎖反應，以擴增出至少一長片段產物；以長片段產物為模板並且使用至少一PKD1短片段引子組進行聚合酶鏈鎖反應，以擴增出至少一PKD1短片段產物，該PKD1短片段產物具有一核酸序列與該PKD1長片段產物之部分序列實質上相同；以及以變性高效能液相層析(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)分析該至少一PKD1短片段產物，將該至少一PKD1短片段產物的DHPLC分析結果和一正常檢體之結果比較，藉以判定該至少一PKD1短片段產物是否具有具有變異。
依據本發明，該至少一PKD1短片段引子組與該至少一PKD1短片段引子組與SEQ ID NO: 1進行序列排序(sequence alignment)時，係位於該至少一PKD1短片段引子組之下游，亦即核酸序列之3’端之一側，藉此於以長片段產物為模板並且使用至少一PKD1短片段引子組進行聚合酶鏈鎖反應時，得以擴增出至少一PKD1短片段產物，該PKD1短片段產物具有一核酸序列與該PKD1長片段產物之部分序列實質上相同。
較佳的，對該至少一PKD1短片段產物進行利用變性高效能液相層析(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)進行離子配對逆相層析分離，測定該至少一PKD1短片段產物之滯留時間，並與一源自於正常檢體之對應的PKD1短片段產物之標準滯留時間相比較，當滯留時間與標準滯留時間不同時，則該短片段產物具有異常。
更佳的，以DHPLC分析該至少一PKD1短片段產物，並確認PKD1短片段產物具有變異後，進一步將對PKD1短片段產物進行核苷酸定序，並比較所得序列對應序列之差異，以確認變異之核苷酸序列位置。
依據本發明，前述的PKD1長片段引子組係為選自於下列所構成之群組的任一引子對：(1)具有如SEQ ID NO. 3及4所示序列之引子對；(2)具有如SEQ ID NO. 5及6所示序列之引子對；(3)具有如SEQ ID NO. 7及8所示序列之引子對；(4)具有如SEQ ID NO. 9及10所示序列之引子對；以及(5)具有如SEQ ID NO. 11及12所示序列之引子對。
前述的PKD1短片段引子組係為選自於下列所構成之群組之任一引子對：(6)具有如SEQ ID NO. 13及14所示序列之引子對；(7)具有如SEQ ID NO. 15及16所示序列之引子對；(8)具有如SEQ ID NO. 17及18所示序列之引子對；(9)具有如SEQ ID NO. 19及20所示序列之引子對；(10)具有如SEQ ID NO. 21及22所示序列之引子對；(11)具有如SEQ ID NO. 23及24所示序列之引子對；(12)具有如SEQ ID NO. 25及26所示序列之引子對；(13)具有如SEQ ID NO. 27及28所示序列之引子對；(14)具有如SEQ ID NO. 29及30所示序列之引子對；(15)具有如SEQ ID NO. 31及32所示序列之引子對；(16)具有如SEQ ID NO. 33及34所示序列之引子對；(17)具有如SEQ ID NO. 35及36所示序列之引子對；(18)具有如SEQ ID NO. 37及38所示序列之引子對；(19)具有如SEQ ID NO. 39及40所示序列之引子對；(20)具有如SEQ ID NO. 41及42所示序列之引子對；(21)具有如SEQ ID NO. 43及44所示序列之引子對；(22)具有如SEQ ID NO. 45及46所示序列之引子對；(23)具有如SEQ ID NO. 47及48所示序列之引子對；(24)具有如SEQ ID NO. 49及50所示序列之引子對；(25)具有如SEQ ID NO. 51及52所示序列之引子對；(26)具有如SEQ ID NO. 53及54所示序列之引子對；(27)具有如SEQ ID NO. 55及56所示序列之引子對；(28)具有如SEQ ID NO. 57及58所示序列之引子對；(29)具有如SEQ ID NO. 59及60所示序列之引子對；(30)具有如SEQ ID NO. 61及62所示序列之引子對；(31)具有如SEQ ID NO. 63及64所示序列之引子對；(32)具有如SEQ ID NO. 65及66所示序列之引子對；(33)具有如SEQ ID NO. 67及68所示序列之引子對；(34)具有如SEQ ID NO. 69及70所示序列之引子對；(35)具有如SEQ ID NO. 71及72所示序列之引子對；(36)具有如SEQ ID NO. 73及74所示序列之引子對；(37)具有如SEQ ID NO. 75及76所示序列之引子對；(38)具有如SEQ ID NO. 77及78所示序列之引子對；(39)具有如SEQ ID NO. 79及80所示序列之引子對；(40)具有如SEQ ID NO. 81及82所示序列之引子對；(41)具有如SEQ ID NO. 83及84所示序列之引子對；(42)具有如SEQ ID NO. 85及86所示序列之引子對；(43)具有如SEQ ID NO. 87及88所示序列之引子對；(44)具有如SEQ ID NO. 89及90所示序列之引子對；(45)具有如SEQ ID NO. 91及92所示序列之引子對；(46)具有如SEQ ID NO. 93及94所示序列之引子對；(47)具有如SEQ ID NO. 95及96所示序列之引子對；(48)具有如SEQ ID NO. 97及98所示序列之引子對；(49)具有如SEQ ID NO. 99及100所示序列之引子對；(50)具有如SEQ ID NO. 101及102所示序列之引子對；(51)具有如SEQ ID NO. 103及104所示序列之引子對；(52)具有如SEQ ID NO. 105及106所示序列之引子對；(53)具有如SEQ ID NO. 107及108所示序列之引子對；(54)具有如SEQ ID NO. 109及110所示序列之引子對。
依據本發明之方法，其更包括以基因組核苷酸樣品為模板並且使用至少一PKD短程引子組進行聚合酶鏈鎖反應，以擴增出至少一PKD專一性產物；以及以變性高效能液相層析分析該至少一PKD專一性產物，將該PKD專一性產物之DHPLC分析結果和一正常控制組檢體之結果比較，藉以判定該至少一PKD專一性產物是否具有具有變異。
較佳的，所述的PKD專一性產物係利用DHPLC進行離子配對逆相層析分離，測定該至少一PKD專一性產物之滯留時間，並與一源自於正常檢體之對應的PKD專一性產物之標準滯留時間相比較，當滯留時間與標準滯留時間不同時，則該PKD專一性產物具有異常。
依據本發明，所述的PKD短程引子組係選自於下列所構成之群組之任一引子對：(55)具有如SEQ ID NO. 111及112所示序列之引子對；(56)具有如SEQ ID NO. 113及114所示序列之引子對；(57)具有如SEQ ID NO. 115及116所示序列之引子對；(58)具有如SEQ ID NO. 117及118所示序列之引子對；(59)具有如SEQ ID NO. 119及120所示序列之引子對；(60)具有如SEQ ID NO. 121及122所示序列之引子對；(61)具有如SEQ ID NO. 123及124所示序列之引子對；(62)具有如SEQ ID NO. 125及126所示序列之引子對；(63)具有如SEQ ID NO. 127及128所示序列之引子對；(64)具有如SEQ ID NO. 129及130所示序列之引子對；(65)具有如SEQ ID NO. 131及132所示序列之引子對；(66)具有如SEQ ID NO. 133及134所示序列之引子對；(67)具有如SEQ ID NO. 135及136所示序列之引子對；(68)具有如SEQ ID NO. 137及138所示序列之引子對；(69)具有如SEQ ID NO. 139及140所示序列之引子對；(70)具有如SEQ ID NO. 141及142所示序列之引子對；(71)具有如SEQ ID NO. 143及144所示序列之引子對；(72)具有如SEQ ID NO. 145及146所示序列之引子對；(73)具有如SEQ ID NO. 147及148所示序列之引子對；(74)具有如SEQ ID NO. 149及150所示序列之引子對；(75)具有如SEQ ID NO. 151及152所示序列之引子對；(76)具有如SEQ ID NO. 153及154所示序列之引子對；(77)具有如SEQ ID NO. 155及156所示序列之引子對；(78)具有如SEQ ID NO. 157及158所示序列之引子對；(79)具有如SEQ ID NO. 159及160所示序列之引子對；(80)具有如SEQ ID NO. 161及162所示序列之引子對；(81)具有如SEQ ID NO. 163及164所示序列之引子對；(82)具有如SEQ ID NO. 165及166所示序列之引子對；(83)具有如SEQ ID NO. 167及168所示序列之引子對；(84)具有如SEQ ID NO. 169及170所示序列之引子對。
較佳的，於前述方法中，係以基因組核苷酸樣品為模板並且分別使用5組PKD1長片段引子組進行聚合酶鏈鎖反應，以擴增出5種長片段產物，其等包括PKD1外顯子1區域、PKD1外顯子2至12區域、PKD1外顯子13至15區域、PKD1外顯子15至21區域以及PKD1外顯子22至33區域，此5種長片段產物之大小分別為2298、8734、4395、3395、7500鹼基對(base pair,bp)。
較佳的，於前述方法中，以長片段產物為模板並且使用49組PKD1短片段引子組進行聚合酶鏈鎖反應，亦即巢式聚合酶鏈鎖反應，以擴增出49種PKD1短片段產物，該等PKD1短片段產物係利用PKD1短片段引子組擴增而得，具有與該PKD1外顯子1至33區域片段的相同序列，此49種短片段產物之大小分別為428、378、302、344、355、260、292、482、394、445、329、377、419、362、492、267、264、283、362、365、403、405、410、370、379、383、422、437、407、308、307、287、294、398、320、240、247、219、354、416、314、363、298、278、201、359、210、357、321鹼基對(base pair,bp)；且其DHPLC條件溫度係介於攝氏62度至70度之間，較佳的分別為攝氏69.8、57.1、64.2、65、65.9、66.2、65.4、64.9、65.3、63.3、64.1、64.8、65.3、65.2、64.9、63.7、64.6、64.5、65.4、65、65.7、63.2、64.3、63.6、64.6、64.1、65.1、66.1、65.4、64.1、64.1、65.3、64.3、65.1、66.1、64.7、64.2、66.2、64.7、62.4、64.4、64.1、64、64.4、65.3、64.7、64、60.9、64.5度。
較佳的，於前述方法中，以基因組核苷酸樣品為模板並且使用30組PKD短程引子組，其包括14組PKD1引子組以及16組PKD2引子組，分別進行聚合酶鏈鎖反應，以擴增出30種PKD專一性產物，該等PKD專一性產物係包括14種PKD1專一性產物以及16種PKD2專一性產物並且分別具有與PKD1基因外顯子34至46區域片段以及PKD2基因外顯子1至15區域片段相同的序列，此14種PKD1專一性產物與16種PKD2專一性產物之大小分別為201、265、297、311、262、264、248、292、349、377、292、386、344、371、441、417、225、249、381、323、399、374、393、322、261、314、315、310、284、367鹼基對(base pair,bp)；且其DHPLC條件溫度係介於攝氏52度至69度之間，較佳的分別為攝氏63.5、63.5、64.3、63.9、64.3、64.9、65.3、66、68.2、66.9、65.1、64.6、65.4、64.4、66.1、65.1、53.5、57.5、59.6、56.8、56.1、52.6、54.3、54.7、54.9、55.9、57.5、59.3、59.9、58.1度。
依據本發明，所述的變性高效能液相層析(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)如所知者可被應用於基因變異分析，尤其是單一核苷酸多型性之分析(single nucleotide polymorphism)，然合適的分析的片段大小需視所需要進行調整，以本發明前述之PDK1短片段產物以及PDK1、PDK2專一性產物而言，其等皆可適用於以變性高效能液相層析配合離子配對逆相層析進行單一或多個核苷酸變異之分析。
較佳的，於前述方法中測定該至少一PKD1短片段產物之滯留時間，並與一源自於正常檢體之對應的PKD1短片段產物之標準滯留時間相比較，當滯留時間與標準滯留時間不同時，則該短片段產物具有異常。
依據本發明，所述的「正常檢體」之來源係指一正常無病徵且其生理不會表現不具正常功能之自體顯性多囊性腎臟疾病1(PKD1)、自體顯性多囊性腎臟疾病2(PKD2)基因產物，亦即多囊腎蛋白-1(polycystin-1)以及多囊腎蛋白-2(polycystin-2)之具有正常功能，諸如作為調控腎小管新生作用之功能，不會導致自體顯性多囊性腎臟疾病之發生。一般而言，臺灣地區之健康人體具有之PKD1基因、PKD2基序列係如SEQ ID NO. 1以及2所列示者，然其基本上可能具有可接受而不影響多囊腎蛋白之正常功能的變異存在，亦即基因多型性(gene polymorphism)。變性高效能液相層析配合離子配對逆相層析可透過滯留時間的不同，而判別出導致功能喪失或變異之突變位的候選區域，進一步針對可能的候選區域進行DNA定序分析突變位置，最終達到檢驗自體顯性多囊性腎臟疾病的目的。
本發明亦提供一種自體顯性多囊性腎臟疾病之檢測套組，其包含具有如SEQ ID NO. 3至12所示序列之引子對，以及至少一PKD1短片段引子組。
本發明有效解決了PKD1基因由外顯子1(exon 1)到外顯子33(exon 33)的DNA片段在第16對染色體中含有多個高度相似卻無功能性的PKD1同系物(PKD1-homolog)而無法直接利用一般聚合酶鏈鎖反應，進一步的本發明亦可解決需要對整段基因進行定序分析以檢測基因變異之問題，而本發明之方法利用適當的PKD1長片段引子組與PKD短片段引子組並且配合變性高效能液相層析以及離子配對逆相層析達到利用少量的檢體，就可以經濟、有效率並準確的篩選出台灣族群自體顯性多囊性腎臟病的基因變異位點的目的。
本發明利用DHPLC配合DNA定序儀針對台灣族群發展出一ADPKD基因檢測平台，來檢測與自體顯性多囊性腎臟病相關之基因變異。
所述的ADPKD基因檢測平台的具體實施例係一種自體顯性多囊性腎臟疾病之整合式基因檢測方法，其包括下列步驟：(a)提供一源自於一檢體的基因組核苷酸；(b)利用基因組核苷酸進行PKD1基因(SEQ ID NO:1)和PKD2基因(SEQ ID NO:2)的核酸序列之擴增；(c-1)基於PKD1的外顯子1(exon 1)至外顯子33(exon33)有高度相似的PKD1-同系物(PKD1-homolog)，故以基因組核苷酸為模板、使用5組專一性長片段引子(SEQ ID NOs:3至12)進行擴增反應取得長片段產物，利用膠體電泳確認其產物大小為預定大小後，以該長片段產物為模板、使用49組PKD1短片段引子(SEQ ID NOs:13至110)進行巢式聚合酶鏈鎖反應(Nested-PCR)；(c-2)同時以基因組核苷酸為模板、使用30組之PKD短程引子組，即PKD1引子和PKD2引子(SEQ ID NOs:111至170)進行核苷酸序列之擴增；(d)將擴增後之79個PCR產物分別送入一DHPLC中分析；(e)將該檢體所得之PCR產物的DHPLC分析結果和一正常控制組檢體之結果比較，將相異的PCR產物之DNA片段進行DNA定序；(f)確認DNA序列變異點並分析結果；(g)將PKD1和PKD2基因的所有DNA結果統整並判斷DNA變異的影響性。
於本發明中，主要以擴增基因組核苷酸之體染色體顯性多囊性腎臟病之相關基因-PKD1基因和/或PKD2基因為主。因PKD1基因所在的第16號染色體(chromosome 16)含有多個PKD1-同系物，為了成功擴增正確的基因產物，和PKD1-同系物相似度高達95%的PKD1-外顯子1至外顯子33區域利用前述方法步驟(c-1)中的5組PKD1專一性長片段引子(SEQ ID NOs:3至12)進行長片段核酸序列放大，這5組長片段引子特別針對臺灣族群和此區域的專一性位點進行設計，能正確的放大出包含PKD1外顯子1至外顯子33的長片段產物，排除了PKD1-同系物的干擾。
接著利用前述方法步驟(c-1)中的49組PKD1短片段引子(SEQ ID NOs:13至110)並以長片段產物為模板進行核苷酸序列擴增反應。不受到PKD1-同系物影響的PKD1區域和PKD2區域，則以前述方法步驟(c-2)中的30組PKD1和PKD2引子(SEQ ID NOs:111至170)，利用基因組核苷酸進行核苷酸序列擴增。前述方法中之步驟(c-1)和(c-2)中的49組PKD1短片段引子和30組PKD1和PKD2引子(SEQ ID NOs: 13-170)，係專門針對台灣族群DNA序列進行設計，能正確且具高敏感性的擴增出目標基因之DNA片段。
前述方法中的步驟(d)，利用由DHPLC配合離子配對逆相層析所構成的一DNA突變分析儀進行分析後，其結果和正常控制組進行比對，即可以區分出所有具有鹼基差異的基因片段，而能有效率的進行基因片段分析並快速篩選需進行DNA定序之片段。
前述方法係先利用台灣族群專一性引子，正確且具高敏感度的擴增出部分PKD1和PKD2基因之核苷酸片段，再利用DNA突變分析儀分析，可快速準確的區分一檢體之基因片段和正常人控制組之基因片段的差異，將含有差異之基因片段再經由DNA定序分析後，可判斷基因片段異常是否會使檢體來源之受檢者引起此疾病，將可快速、準確、且有效率的篩檢出自體顯性多囊性腎臟病之患者。
在本發明之較佳實施例中，所述的離子配對逆相層析係使用任何離子配對試劑，例如，但不限於：三乙基醋酸銨(triethyl-ammonium acetate,TEAA)。
在本發明之較佳實施例中，含有不同鹼基配對的DNA，其中離子配對試劑三乙基醋酸銨(triethyl-ammonium acetate,TEAA)的氨基與DNA的磷酸基(PO3 -)形成離子配對，並且配合使用Transgenomic Wave核苷酸片段分析系統(Transgenomic Inc.)分析雙股DNA在分離管柱中的滯留時間。雙股DNA在分離管柱中的滯留與否，主要決定於TEAA中帶正電氨基和DNA中帶負電磷酸基的結合，因此含有不同鹼基而有不同構型之DNA，經過DHPLC分離後，可得到不同的管壁滯留時間，藉由DHPLC的層析圖譜分析可看出待檢測之DNA片段是否有鹼基不同。
本發明將進一步藉由下面的實施例來作說明，但應明瞭的是，該等實施例僅為說明之用，而不應被視為本發明的實施上的限制。
實施例
本發明提供一種ADPKD基因檢測方法，其流程係如圖1所示，由健康捐贈者或病人血液檢體中製備基因組核苷酸後，利用長片段聚合酶鏈鎖反應(long range PCR)擴增出PKD1之長片段DNA，並且藉由巢式聚合酶鏈鎖反應(nested PCR)或直接進行短片段聚合酶鏈鎖反應，藉以擴增出短片段DNA，並利用DHPLC突變分析儀，取得DHPLC圖譜，比較正常檢體與病人檢體之DNA片段之差異，判讀異常之片段並定序確認突變位。所述的基因檢測方法步驟係詳述如下。實施例1
製備基因組核苷酸
以自願受檢者之血液為檢體，利用NucleoSpin核酸萃取套組抽取血液中之基因組核苷酸。此外，以健康的自願捐贈者之血液為檢體，以同樣之方式製備基因組核苷酸作為對照組。
實施例2　聚合酶鏈鎖反應
本實施例係利用聚合酶鏈鎖反應將PKD1基因和PKD2基因之片段從基因組核苷酸中大量複製，以供後續檢測。
A.引子設計
已知PKD1基因由外顯子1(exon 1)到外顯子33(exon 33)的DNA片段在第16對染色體中含有多個高度相似卻無功能性的PKD1同系物(PKD1-homolog)。本實施例針對台灣族群之PKD1基因序列進行長片段引子的設計，利用已知的正常PKD1基因序列(SEQ ID NOs:1)，和PKD1同系物(PKD1-homolog)序列相比較，分析出已知正常PKD1基因序列特有之序列區域，設計出能快速且專一性放大的台灣族群PKD1之外顯子1到PKD1之外顯子33區域(PKD1 exon 1 to exon 33)的5組長片段引子(SEQ ID NOs:3-12)，這5組長片段引子係使用以進行「長片段PCR」。此外，針對PKD1之外顯子1到PKD1之外顯子33區域亦設計出另外49組短片段引子(SEQ ID NOs:13-110)，以長片段PCR之擴增產物為模板，進行「短片段PCR」。PKD1之外顯子34到PKD1之外顯子46以及PKD2基因無高度相似的同系物(homolog)，因此，針對PKD1之外顯子34到PKD1之外顯子46區域和PKD2基因之外顯子1到外顯子15區域，係直接設計30組專一性引子(SEQ ID NOs:111-170)，以基因組核苷酸為模板，進行擴增反應。
B.長片段PCR
進行長片段PCR的反應液中含有：基因組核苷酸100 ng，長片段引子對0.4 μM，dNTPs 500 μM，聚合酶3.75 unit(Expand Long Template Enzyme mix)，10X Expand Long Template buffer 3(27.5 mM MgCl2)。所使用聚合酶鏈鎖反應儀為ABI thermocycler(ABI/Veriti-96 well)。聚合酶鏈鎖反應之條件為：先將反應液於95℃下培育5分鐘；接著進行35個循環，每個循環包括：於95℃歷時30秒，於對應的引子黏合溫度歷時1分鐘，68℃歷時3分鐘；最後再置於68℃反應7分鐘，形成長片段產物。
長片段PCR所使用的長片段引子對，其序列如下表1所示：
所得的5種長片段產物包括PKD1-L1至L5，其大小分別為2298、8734、4395、3395、7500鹼基對(base pair,bp)。
C.短片段PCR
進行短片段PCR的反應液中含有：長片段產物2 μl，短片段引子對0.4 uM，dNTPs 400 μM，聚合酶0.5 unit(FastStart Taq)，10X PCR Reaction Buffer(20 mM MgCl2)；所使用聚合酶鏈鎖反應儀為ABI thermocycler(ABI/Veriti-96well)；進行聚合酶鏈鎖反應之條件為：先將反應液於95℃下10分鐘；接著進行35個循環，每個循環條件包括95℃歷時30秒，適當引子黏合溫度歷時45秒，72℃歷時45秒；最後再置於72℃反應10分鐘。
短片段PCR所使用的短片段引子對，其序列如下表2所示：
D.針對PKD1基因由外顯子34到外顯子46以及PKD2基因的PCR
針對PKD1基因由外顯子34到外顯子46和PKD2基因的PCR反應液中含有：基因組核苷酸100 ng，引子對0.4 μM，dNTPs 400 μM，聚合酶0.5 unit(FastStart Taq)，10X EXpand Long Template buffer 3(27.5mM MgCl2)；所使用聚合酶鏈鎖反應儀為ABI thermocycler(ABI/Veriti-96well)；進行聚合酶鏈鎖反應之條件為：先將反應液於95℃下10分鐘；接著進行35個循環，每個循環條件包括95℃歷時30秒，引子黏合溫度歷時45秒，72℃歷時45秒；最後再置於72℃反應10分鐘。
針對PKD1基因由外顯子34到外顯子46以及PKD2基因的PCR所使用的引子對，其序列如下表3所示：
表2　PKD1部分基因片段及PKD2基因的PCR所使用的引子對
PKD1短片段產物，具有與該PKD1外顯子1至33區域片段的相同序列，此49種PKD1短片段產物之大小分別為428、378、302、344、355、260、292、482、394、445、329、377、419、362、492、267、264、283、362、365、403、405、410、370、379、383、422、437、407、308、307、287、294、398、320、240、247、219、354、416、314、363、298、278、201、359、210、357、321鹼基對，經計算其等之DHPLC條件溫度分別為攝氏69.8、57.1、64.2、65、65.9、66.2、65.4、64.9、65.3、63.3、64.1、64.8、65.3、65.2、64.9、63.7、64.6、64.5、65.4、65、65.7、63.2、64.3、63.6、64.6、64.1、65.1、66.1、65.4、64.1、64.1、65.3、64.3、65.1、66.1、64.7、64.2、66.2、64.7、62.4、64.4、64.1、64、64.4、65.3、64.7、64、60.9、64.5度。
14種PKD1專一性產物與16種PKD2專一性產物之大小分別為201、265、297、311、262、264、248、292、349、377、292、386、344、371、441、417、225、249、381、323、399、374、393、322、261、314、315、310、284、367鹼基對，經計算其等之DHPLC條件溫度分別為攝氏63.5、63.5、64.3、63.9、64.3、64.9、65.3、66、68.2、66.9、65.1、64.6、65.4、64.4、66.1、65.1、53.5、57.5、59.6、56.8、56.1、52.6、54.3、54.7、54.9、55.9、57.5、59.3、59.9、58.1度。
實施例3　DNA突變檢測
本實施例係利用DHPLC突變分析儀(DHPLCWAVE3500或DHPLC WAVE4500)，針對實施例二使用所得之PCR產物進行DNA突變檢測。所述的DHPLC突變分析儀係利用高效能液相層析(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)進行離子配對逆相層析分離含有不同鹼基配對的DNA，其中離子配對試劑三乙基醋酸銨(triethyl-ammonium acetate,TEAA)的氨基與DNA的磷酸基(PO3 -)形成離子配對，並且配合使用Trandgenomic Wave核苷酸片段分析系統(Transgenomic Inc.)分析雙股DNA在分離管柱中的滯留時間。雙股DNA在分離管柱中的滯留與否，主要決定於TEAA中帶正電氨基和DNA中帶負電磷酸基的結合，因此含有不同鹼基而有不同構型之DNA，經過DHPLC分離後，可得到不同的管壁滯留時間，藉由DHPLC的層析圖分析可看出待檢測之DNA片段是否有鹼基不同。
取實施例二之「C.短片段PCR」與「D.針對PKD1基因由外顯子34到外顯子46以及PKD2基因的PCR」中使用79組不同引子對所得之含有未經純化之DNA片段之PCR反應產物20 μl，分別注射入DHPLC突變分析儀中，每個不同預定大小的DNA片段的DHPLC條件溫度以Transgenic Wave system的WAVE Maker軟體所算出的溫度為基準，進行DHPLC分析，各個含有未經純化之DNA片段的PCR反應產物分析約需10分鐘。受檢者的PCR反應產物與正常人控制組的PCR反應產物係分別注入DHPLC分析。
實施例4　DHPLC圖譜分析
利用實施例3的DHPLC突變分析儀，先做出正常人控制組的79個DNA片段之DHPLC圖譜，以利於檢體的比對。
將受檢者的79個DNA片段之DHPLC圖譜與正常人控制組的DHPLC圖譜進行比對。經過DHPLC分析含有不同鹼基配對而構型不同的DNA，可以從圖譜觀察到不同的波峰，利用此差異來判斷受檢者的DNA片段是否有變異位點。
實施例5　利用定序進行變異位點分析
取DHPLC突變分析儀發現和正常人控制組之圖譜有差異的PCR產物中的DNA片段進行定序分析，本發明利用Bigpye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit，於ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer定序儀中進行序列分析，藉由定序找出DNA的變異位點。
實施例6　自體顯性多囊性腎臟病病人基因變異位點之檢驗
利用前述實施例之方法檢測與判讀，針對正常人控制組和1個自體顯性多囊性腎臟病病人之檢體進行比對，篩選出病人檢體之PKD1之外顯子31至32區域中，亦即PKD1-exon31-32片段(標示為PKD1-31+32)，具有核苷酸變異位點。正常人控制組之PKD1-exon31-32片段之DHPLC圖譜如圖2所示，接著將正常人控制組與病人檢體PKD1-exon31-32之基因片段的DHPLC圖譜和定序結果進行比對，如圖3所示。由圖3可以觀察到正常人控制組和病人檢體之DHPLC圖形有差異，代表病人檢體之DNA片段有鹼基變異，由圖4(正常人控制組DNA序列)和圖5(病人檢體DNA序列)可以觀察到正常人控制組之序列無異常，但病人檢體之PKD1-exon31-32的序列分析結果，依據序列分析可以發現到DNA序列有閱讀框架位移(reading frame shift)之情形產生，依據定序結果，發現位於SEQ ID NOs：1的第45462個bp位置，其中一個等位基因(allele)嵌入(insertion)一個G鹼基，且此序列上的變異將會導致轉譯出的蛋白質功能有缺失，造成自體顯性多囊性腎臟病的病狀。
由於PKD1與PKD2基因相當龐大且複雜，以PKD1基因而言，有46個外顯子，大小超過50 Kb，基因體中存在有多組高度相似的PKD1-homolog；而PKD2基因具有15個外顯子，目前兩者皆無基因變異之熱點，而需作整段基因的掃描才可找出異常位點。本發明經過測試，使用針對台灣族群設計出之5組專一性長片段引子(SEQ ID NOs:3至12)以及79組各基因片段專一性引子(SEQ ID NOs: 13至170)，能快速、準確且有效率的獲得核苷酸擴增產物，接著經由DHPLC突變分析儀配合定序分析的方式進行DNA片段的分析，可檢測出自體顯性多囊性腎臟病病人的基因變異位點。藉由比對受檢者和正常人控制組的DHPLC圖譜，可先快速的篩選出PKD1基因和PKD2基因含有變異的DNA片段，再利用定序分析找出確切的變異位點。
在臨床方面，本發明方法可以提供一個早期診斷的方式，改善目前臨床上最常使用影像學檢查無法提供早期確診的遺憾。在基因分析方法上，本發明方法可節省PKD1基因和PKD2基因全基因定序分析的耗時和昂貴之缺點，解決cDNA之序列分析的敏感度太低及操作複雜耗時之問題，且不用受限於傳統之基因連鎖分析(Linkage analysis)需要龐大病患家族資料的限制，相較於現行之方法，本發明只需利用少量的檢體，就可以經濟、有效率並準確的篩選出台灣族群自體顯性多囊性腎臟病的基因變異位點。
<110>　申請人名稱：創源生物科技股份有限公司
<120>　發明名稱：自體顯性多囊性腎臟疾病(Autosomal dominant polycystic kidney disease；ADPKD)引子組及整合式基因檢測技術
<130>
<160>　170
<210>　1
<211>　56511
<212>　DNA
<213>　人類
<400>　1
<210>　2
<211>　77110
<212>　DNA
<213>　人類
<400>　2
<210>　3
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子1所設計之正向引子
<400>　3
<210>　4
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子1所設計之反向引子
<400>　4
<210>　5
<211>　22
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子2至12區域所設計之正向引子
<400>　5
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子2至12區域所設計之反向引子
<400>　6
<210>　7
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子13至15區域所設計之正向引子
<400>　7
<210>　8
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子13至15區域所設計之反向引子
<400>　8
<210>　9
<211>　24
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15至21區域所設計之正向引子
<400>　9
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<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15至21區域所設計之反向引子
<400>　10
<210>　11
<211>　21
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子22至33區域所設計之正向引子
<400>　11
<210>　12
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子22至33區域所設計之反向引子
<400>　12
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<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子1所設計之正向引子
<400>　13
<210>　14
<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子1所設計之反向引子
<400>　14
<210>　15
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子2至3區域所設計之正向引子
<400>　15
<210>　16
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子2至3區域所設計之反向引子
<400>　16
<210>　17
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子4所設計之正向引子
<400>　17
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子4所設計之反向引子
<400>　18
<210>　19
<211>　21
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子5所設計之正向引子
<400>　19
<210>　20
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子5所設計之反向引子
<400>　20
<210>　21
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子5所設計之正向引子
<400>　21
<210>　22
<211>　21
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子5所設計之反向引子
<400>　22
<210>　23
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子5所設計之正向引子
<400>　23
<210>　24
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子5所設計之反向引子
<400>　24
<210>　25
<211>　21
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子6所設計之正向引子
<400>　25
<210>　26
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子6所設計之反向引子
<400>　26
<210>　27
<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子7所設計之正向引子
<400>　27
<210>　28
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子7所設計之反向引子
<400>　28
<210>　29
<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子8所設計之正向引子
<400>　29
<210>　30
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子8所設計之反向引子
<400>　30
<210>　31
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子9所設計之正向引子
<400>　31
<210>　32
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子9所設計之反向引子
<400>　32
<210>　33
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子10所設計之正向引子
<400>　33
<210>　34
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子10所設計之反向引子
<400>　34
<210>　35
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子10所設計之正向引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子10所設計之反向引子
<400>　36
<210>　37
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子11所設計之正向引子
<400>　37
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子11所設計之反向引子
<400>　38
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子11所設計之正向引子
<400>　39
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子11所設計之反向引子
<400>　40
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子11所設計之正向引子
<400>　41
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子11所設計之反向引子
<400>　42
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子12所設計之正向引子
<400>　43
<210>　44
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子12所設計之反向引子
<400>　44
<210>　45
<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子13所設計之正向引子
<400>　45
<210>　46
<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子13所設計之反向引子
<400>　46
<210>　47
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子14所設計之正向引子
<400>　47
<210>　48
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子14所設計之反向引子
<400>　48
<210>　49
<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之正向引子
<400>　49
<210>　50
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之反向引子
<400>　50
<210>　51
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之正向引子
<400>　51
<210>　52
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之反向引子
<400>　52
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之正向引子
<400>　53
<210>　54
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之反向引子
<400>　54
<210>　55
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之正向引子
<400>　55
<210>　56
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之反向引子
<400>　56
<210>　57
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之正向引子
<400>　57
<210>　58
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之反向引子
<400>　58
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之正向引子
<400>　59
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之反向引子
<400>　60
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之正向引子
<400>　61
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子15所設計之正向引子
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<212>　DNA
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<212>　DNA
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<212>　DNA
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<212>　DNA
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<212>　DNA
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
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<213>　人工序列
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<212>　DNA
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<212>　DNA
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<212>　DNA
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
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<212>　DNA
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子23所設計之正向引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子24所設計之反向引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子25所設計之反向引子
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<212>　DNA
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子26所設計之反向引子
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<212>　DNA
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子27所設計之反向引子
<400>　100
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子28所設計之正向引子
<400>　101
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子28所設計之反向引子
<400>　102
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子29所設計之正向引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子29所設計之反向引子
<400>　104
<210>　105
<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子30所設計之正向引子
<400>　105
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子30所設計之反向引子
<400>　106
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子31至32區域所設計之反向引子
<400>　108
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<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子33所設計之正向引子
<400>　109
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子33所設計之反向引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子34所設計之反向引子
<400>　112
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子35設計之反向引子
<400>　114
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子36設計之反向引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子37設計之反向引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子38設計之正向引子
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子38設計之反向引子
<400>　120
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
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<400>　121
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子39設計之反向引子
<400>　122
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子40設計之反向引子
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<211>　22
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子41設計之正向引子
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子41設計之反向引子
<400>　126
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<212>　DNA
<213>　人工序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子42設計之反向引子
<400>　128
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<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子43設計之正向引子
<400>　129
<210>　130
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子43設計之反向引子
<400>　130
<210>　131
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子44設計之正向引子
<400>　131
<210>　132
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子44設計之反向引子
<400>　132
<210>　133
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子45設計之正向引子
<400>　133
<210>　134
<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子45設計之反向引子
<400>　134
<210>　135
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子46設計之正向引子
<400>　135
<210>　136
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子46設計之反向引子
<400>　136
<210>　137
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子46設計之正向引子
<400>　137
<210>　138
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD1基因外顯子46設計之反向引子
<400>　138
<210>　139
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子1設計之正向引子
<400>　139
<210>　140
<211>　21
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子1設計之反向引子
<400>　140
<210>　141
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子1設計之正向引子
<400>　141
<210>　142
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子1設計之反向引子
<400>　142
<210>　143
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子2設計之正向引子
<400>　143
<210>　144
<211>　22
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子2設計之反向引子
<400>　144
<210>　145
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子3設計之正向引子
<400>　145
<210>　146
<211>　25
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子3設計之反向引子
<400>　146
<210>　147
<211>　23
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子4設計之正向引子
<400>　147
<210>　148
<211>　22
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子4設計之反向引子
<400>　148
<210>　149
<211>　22
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子5設計之正向引子
<400>　149
<210>　150
<211>　22
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子5設計之反向引子
<400>　150
<210>　151
<211>　23
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子6設計之正向引子
<400>　151
<210>　152
<211>　23
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子6設計之反向引子
<400>　152
<210>　153
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子7設計之正向引子
<400>　153
<210>　154
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子7設計之反向引子
<400>　154
<210>　155
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子8設計之正向引子
<400>　155
<210>　156
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子8設計之反向引子
<400>　156
<210>　157
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子9設計之正向引子
<400>　157
<210>　158
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子9設計之反向引子
<400>　158
<210>　159
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子10設計之正向引子
<400>　159
<210>　160
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子10設計之反向引子
<400>　160
<210>　161
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子11設計之正向引子
<400>　161
<210>　162
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子11設計之反向引子
<400>　162
<210>　163
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子12設計之正向引子
<400>　163
<210>　164
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子12設計之反向引子
<400>　164
<210>　165
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子13設計之正向引子
<400>　165
<210>　166
<211>　21
<212>　DNA
<213>　人工序列
<223>　根據PKD2基因外顯子13設計之反向引子
<400>　166
<210>　167
<211>　20
<212>　DNA
<213> 人工序列
<223> 根據PKD2基因外顯子14設計之正向引子
<400> 167
<210> 168
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 根據PKD2基因外顯子14設計之反向引子
<400> 168
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 根據PKD2基因外顯子15設計之正向引子
<400> 169
<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 根據PKD2基因外顯子15設計之反向引子
<400> 170
圖1係本發明之ADPKD檢測流程示意圖。
圖2係正常人PKD1-exon31-32片段之DHPLC圖譜。
圖3係正常人與自體顯性多囊性腎臟病病人的PKD1-exon31-32片段之DHPLC圖譜比較分析。
圖4係正常人控制組PKD1-exon31-32片段一特定區域的DNA序列圖譜和等位基因序列。
圖5係自體顯性多囊性腎臟病病人PKD1-exon31-32片段之一特定區域的DNA序列圖譜和等位基因序列。

Claims (12)

  1. 一種自體顯性多囊性腎臟疾病之整合式基因檢測方法，其包含：提供一基因組核苷酸樣品，該基因組核苷酸樣品來自台灣族群；以基因組核苷酸樣品為模板並且使用至少一PKD1長片段引子組進行聚合酶鏈鎖反應，以擴增出至少一PKD1長片段產物；以該PKD1長片段產物為模板並且使用至少一PKD1短片段引子組進行聚合酶鏈鎖反應，以擴增出至少一PKD1短片段產物，該PKD1短片段產物具有一核酸序列與對應的PKD1長片段產物之部分序列相同；以及以變性高效能液相層析(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)分析該至少一PKD1短片段產物，將該至少一PKD1短片段產物的DHPLC分析結果和一正常控制組檢體之結果比較，藉以判定該至少一PKD1短片段產物是否具有變異；其中該至少一PKD1長片段引子組係選自於下列所構成之群組：(1)具有如SEQ ID NO.3及4所示序列之引子對；(2)具有如SEQ ID NO.5及6所示序列之引子對；(3)具有如SEQ ID NO.7及8所示序列之引 子對；(4)具有如SEQ ID NO.9及10所示序列之引子對；以及(5)具有如SEQ ID NO.11及12所示序列之引子對；以及其中該至少一PKD1短片段引子組係選自於下列所構成之群組：(6)具有如SEQ ID NO.13及14所示序列之引子對；(7)具有如SEQ ID NO.15及16所示序列之引子對；(8)具有如SEQ ID NO.17及18所示序列之引子對；(9)具有如SEQ ID NO.19及20所示序列之引子對；(10)具有如SEQ ID NO.21及22所示序列之引子對；(11)具有如SEQ ID NO.23及24所示序列之引子對；(12)具有如SEQ ID NO.25及26所示序列之引子對；(13)具有如SEQ ID NO.27及28所示序列之引子對；(14)具有如SEQ ID NO.29及30所示序列之引子對；(15)具有如SEQ ID NO.31及32所示序列之引子對；(16)具有如SEQ ID NO.33及34所示序列之引子對；(17)具有如SEQ ID NO.35及36所示序列之引子對；(18)具有如SEQ ID NO.37及38所示序列之引子對；(19)具有如SEQ ID NO.39及40所示序列之引子對；(21)具有如SEQ ID NO.43及44所示序列之引子對；(22)具有如SEQ ID NO.45及46所示序列之引子對；(23)具有如SEQ ID NO.47及48所示序列之引子對；(24)具有如SEQ ID NO.49及50所示序列之引子對；(25)具有如SEQ ID NO.51及52所示序列之引子對；(26)具有如SEQ ID NO.53及54所示序列 之引子對；(27)具有如SEQ ID NO.55及56所示序列之引子對；(28)具有如SEQ ID NO.57及58所示序列之引子對；(29)具有如SEQ ID NO.59及60所示序列之引子對；(30)具有如SEQ ID NO.61及62所示序列之引子對；(31)具有如SEQ ID NO.63及64所示序列之引子對；(32)具有如SEQ ID NO.65及66所示序列之引子對；(33)具有如SEQ ID NO.67及68所示序列之引子對；(34)具有如SEQ ID NO.69及70所示序列之引子對；(35)具有如SEQ ID NO.71及72所示序列之引子對；(36)具有如SEQ ID NO.73及74所示序列之引子對；(37)具有如SEQ ID NO.75及76所示序列之引子對；(38)具有如SEQ ID NO.77及78所示序列之引子對；(39)具有如SEQ ID NO.79及80所示序列之引子對；(40)具有如SEQ ID NO.81及82所示序列之引子對；(41)具有如SEQ ID NO.83及84所示序列之引子對；(42)具有如SEQ ID NO.85及86所示序列之引子對；(46)具有如SEQ ID NO.93及94所示序列之引子對；(47)具有如SEQ ID NO.95及96所示序列之引子對；(48)具有如SEQ ID NO.97及98所示序列之引子對；(49)具有如SEQ ID NO.99及100所示序列之引子對；(50)具有如SEQ ID NO.101及102所示序列之引子對；(51)具有如SEQ ID NO.103及104所示序列之引子對；(52)具有如SEQ ID NO.105及106所示序列之引子對；(53)具有如SEQ ID NO.107及108 所示序列之引子對；(54)具有如SEQ ID NO.109及110所示序列之引子對。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該至少一PKD1長片段引子組係5組PKD1長片段引子組，其等係由具有SEQ ID NO.3至12所示序列之引子對所組成。
  3. 如請求項2所述之方法，其中該至少一PKD1短片段引子組係49組PKD1短片段引子組，其係由具有SEQ ID NO.13至40、43至86、93至110所示序列之引子對所組成。
  4. 如請求項3所述之方法，其中PKD1短片段產物的DHPLC條件溫度係介於攝氏62度至70度之間。
  5. 如請求項1所述之方法，其更包括：以基因組核苷酸樣品為模板並且使用至少一PKD短程引子組進行聚合酶鏈鎖反應，以擴增出至少一PKD專一性產物；以及以變性高效能液相層析分析該至少一PKD專一性產物，將該PKD專一性產物之DHPLC分析結果和一正常控制組檢體之DHPLC分析結果比較，藉以判定該至少一PKD專一性產物是否具有變異；其中該至少一PKD短程引子組係選自於下列所構成之群組：(56)具有如SEQ ID NO.113及114所示序列之引子對；(57)具有如SEQ ID NO.115及116所示序列之引子對；(58)具有如SEQ ID NO.117及118所示序列之引子對；(59)具有如SEQ ID NO.119及120 所示序列之引子對；(60)具有如SEQ ID NO.121及122所示序列之引子對；(61)具有如SEQ ID NO.123及124所示序列之引子對；(62)具有如SEQ ID NO.125及126所示序列之引子對；(63)具有如SEQ ID NO.127及128所示序列之引子對；(64)具有如SEQ ID NO.129及130所示序列之引子對；(65)具有如SEQ ID NO.131及132所示序列之引子對；(66)具有如SEQ ID NO.133及134所示序列之引子對；(67)具有如SEQ ID NO.135及136所示序列之引子對；(68)具有如SEQ ID NO.137及138所示序列之引子對；(69)具有如SEQ ID NO.139及140所示序列之引子對；(70)具有如SEQ ID NO.141及142所示序列之引子對；(71)具有如SEQ ID NO.143及144所示序列之引子對；(72)具有如SEQ ID NO.145及146所示序列之引子對；(73)具有如SEQ ID NO.147及148所示序列之引子對；(74)具有如SEQ ID NO.149及150所示序列之引子對；(75)具有如SEQ ID NO.151及152所示序列之引子對；(76)具有如SEQ ID NO.153及154所示序列之引子對；(77)具有如SEQ ID NO.155及156所示序列之引子對；(78)具有如SEQ ID NO.157及158所示序列之引子對；(79)具有如SEQ ID NO.159及160所示序列之引子對；(80)具有如SEQ ID NO.161及162所示序列之引子對；(81)具有如SEQ ID NO.163及164所示序列之引子對；(82)具有如SEQ ID NO.165及166所示序列之引子對；(83)具有如SEQ ID NO.167及168 所示序列之引子對；(84)具有如SEQ ID NO.169及170所示序列之引子對。
  6. 如請求項5所述之方法，其中PKD專一性產物的DHPLC條件溫度係介於攝氏52度至69度之間。
  7. 如請求項1至6任一項所述之方法，其中以基因組核苷酸樣品為模板並且使用至少一PKD1長片段引子組進行聚合酶鏈鎖反應之條件包括進行35個循環，每個循環包括於95℃歷時30秒，對應的引子黏合溫度歷時1分鐘，68℃歷時3分鐘。
  8. 如請求項7所述之方法，其中以該PKD1長片段產物為模板並且使用至少一PKD1短片段引子組進行聚合酶鏈鎖反應之條件包括35個循環，每個循環條件包括95℃歷時30秒，對應的引子黏合溫度歷時45秒，72℃歷時45秒。
  9. 一種自體顯性多囊性腎臟疾病之檢測套組，其包含(1)具有如SEQ ID NO.3及4所示序列之引子對；(2)具有如SEQ ID NO.5及6所示序列之引子對；(3)具有如SEQ ID NO.7及8所示序列之引子對；(4)具有如SEQ ID NO.9及10所示序列之引子對；以及(5)具有如SEQ ID NO.11及12所示序列之引子對；以及至少一PKD1短片段引子組，該PKD1短片段引子組係選自於下列所構成之群組：(6)具有如SEQ ID NO.13及14所示序列之引子對；(7)具有如SEQ ID NO.15及16所示序列之引子對；(8)具有如SEQ ID NO.17及 18所示序列之引子對；(9)具有如SEQ ID NO.19及20所示序列之引子對；(10)具有如SEQ ID NO.21及22所示序列之引子對；(11)具有如SEQ ID NO.23及24所示序列之引子對；(12)具有如SEQ ID NO.25及26所示序列之引子對；(13)具有如SEQ ID NO.27及28所示序列之引子對；(14)具有如SEQ ID NO.29及30所示序列之引子對；(15)具有如SEQ ID NO.31及32所示序列之引子對；(16)具有如SEQ ID NO.33及34所示序列之引子對；(17)具有如SEQ ID NO.35及36所示序列之引子對；(18)具有如SEQ ID NO.37及38所示序列之引子對；(19)具有如SEQ ID NO.39及40所示序列之引子對；(21)具有如SEQ ID NO.43及44所示序列之引子對；(22)具有如SEQ ID NO.45及46所示序列之引子對；(23)具有如SEQ ID NO.47及48所示序列之引子對；(24)具有如SEQ ID NO.49及50所示序列之引子對；(25)具有如SEQ ID NO.51及52所示序列之引子對；(26)具有如SEQ ID NO.53及54所示序列之引子對；(27)具有如SEQ ID NO.55及56所示序列之引子對；(28)具有如SEQ ID NO.57及58所示序列之引子對；(29)具有如SEQ ID NO.59及60所示序列之引子對；(30)具有如SEQ ID NO.61及62所示序列之引子對；(31)具有如SEQ ID NO.63及64所示序列之引子對；(32)具有如SEQ ID NO.65及66所示序列之引子對；(33)具有如SEQ ID NO.67及68 所示序列之引子對；(34)具有如SEQ ID NO.69及70所示序列之引子對；(35)具有如SEQ ID NO.71及72所示序列之引子對；(36)具有如SEQ ID NO.73及74所示序列之引子對；(37)具有如SEQ ID NO.75及76所示序列之引子對；(38)具有如SEQ ID NO.77及78所示序列之引子對；(39)具有如SEQ ID NO.79及80所示序列之引子對；(40)具有如SEQ ID NO.81及82所示序列之引子對；(41)具有如SEQ ID NO.83及84所示序列之引子對；(42)具有如SEQ ID NO.85及86所示序列之引子對；(46)具有如SEQ ID NO.93及94所示序列之引子對；(47)具有如SEQ ID NO.95及96所示序列之引子對；(48)具有如SEQ ID NO.97及98所示序列之引子對；(49)具有如SEQ ID NO.99及100所示序列之引子對；(50)具有如SEQ ID NO.101及102所示序列之引子對；(51)具有如SEQ ID NO.103及104所示序列之引子對；(52)具有如SEQ ID NO.105及106所示序列之引子對；(53)具有如SEQ ID NO.107及108所示序列之引子對；(54)具有如SEQ ID NO.109及110所示序列之引子對。
  10. 如請求項9所述之自體顯性多囊性腎臟疾病之檢測套組，其更包含至少一PKD短程引子組，該PKD短程引子組係選自於下列所構成之群組：(56)具有如SEQ ID NO.113及114所示序列之引子對；(57)具有如SEQ ID NO.115及116所示序列之引子對；(58)具 有如SEQ ID NO.117及118所示序列之引子對；(59)具有如SEQ ID NO.119及120所示序列之引子對；(60)具有如SEQ ID NO.121及122所示序列之引子對；(61)具有如SEQ ID NO.123及124所示序列之引子對；(62)具有如SEQ ID NO.125及126所示序列之引子對；(63)具有如SEQ ID NO.127及128所示序列之引子對；(64)具有如SEQ ID NO.129及130所示序列之引子對；(65)具有如SEQ ID NO.131及132所示序列之引子對；(66)具有如SEQ ID NO.133及134所示序列之引子對；(67)具有如SEQ ID NO.135及136所示序列之引子對；(68)具有如SEQ ID NO.137及138所示序列之引子對；(69)具有如SEQ ID NO.139及140所示序列之引子對；(70)具有如SEQ ID NO.141及142所示序列之引子對；(71)具有如SEQ ID NO.143及144所示序列之引子對；(72)具有如SEQ ID NO.145及146所示序列之引子對；(73)具有如SEQ ID NO.147及148所示序列之引子對；(74)具有如SEQ ID NO.149及150所示序列之引子對；(75)具有如SEQ ID NO.151及152所示序列之引子對；(76)具有如SEQ ID NO.153及154所示序列之引子對；(77)具有如SEQ ID NO.155及156所示序列之引子對；(78)具有如SEQ ID NO.157及158所示序列之引子對；(79)具有如SEQ ID NO.159及160所示序列之引子對；(80)具有如SEQ ID NO.161及162所示序列之引子對；(81)具有如SEQ ID NO.163及164所示序列之引子對；(82) 具有如SEQ ID NO.165及166所示序列之引子對；(83)具有如SEQ ID NO.167及168所示序列之引子對；(84)具有如SEQ ID NO.169及170所示序列之引子對。
  11. 一種用於檢測自體顯性多囊性腎臟疾病之引子組，其包括具有如SEQ ID NO.3至40、43至86、93至110所示序列之引子。
  12. 如請求項11所述之引子組，其更包括具有如SEQ ID NO.113至170所示序列之引子。
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