JP5713351B2 - 妊孕性検査方法、妊孕性検査キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 - Google Patents
妊孕性検査方法、妊孕性検査キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5713351B2 JP5713351B2 JP2011504749A JP2011504749A JP5713351B2 JP 5713351 B2 JP5713351 B2 JP 5713351B2 JP 2011504749 A JP2011504749 A JP 2011504749A JP 2011504749 A JP2011504749 A JP 2011504749A JP 5713351 B2 JP5713351 B2 JP 5713351B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- base
- pgam4
- human
- gene
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000035558 fertility Effects 0.000 title claims description 91
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 55
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 31
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 31
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 18
- 238000010998 test method Methods 0.000 title claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 124
- 101100351822 Homo sapiens PGAM4 gene Proteins 0.000 claims description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 69
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 40
- 102100037384 Probable phosphoglycerate mutase 4 Human genes 0.000 claims description 34
- 101000600395 Homo sapiens Probable phosphoglycerate mutase 4 Proteins 0.000 claims description 33
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 33
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 26
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 24
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 19
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 16
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 14
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 claims description 3
- 101150093005 PGAM4 gene Proteins 0.000 description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 44
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 27
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 27
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 27
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 26
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 18
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 14
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 10
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 8
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004150 Flap endonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108090000652 Flap endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 4
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 3
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037492 Sex Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 2
- 206010061513 Sex chromosome abnormality Diseases 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002863 seminiferous tubule Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 108010029692 Bisphosphoglycerate mutase Proteins 0.000 description 1
- 101710085985 Centrin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101001124887 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase PRDM9 Proteins 0.000 description 1
- 101000600387 Homo sapiens Phosphoglycerate mutase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000600392 Homo sapiens Phosphoglycerate mutase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000716795 Homo sapiens Succinyl-CoA:3-ketoacid coenzyme A transferase 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 206010064919 Hypospermia Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 229910001300 Mazak (alloy) Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101150106023 PRM2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000011025 Phosphoglycerate Mutase Human genes 0.000 description 1
- 108050006040 Phosphoglycerate mutase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037385 Phosphoglycerate mutase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101150009841 TP gene Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000004090 human X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N phosphono 2,3-dihydroxypropanoate Chemical compound OCC(O)C(=O)OP(O)(O)=O KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/99—Isomerases (5.)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする技術に関するものである。具体的には、妊孕可能性と相関性のある遺伝子の欠損又は変異を検出し、妊孕可能性を検査・診断する方法、並びに、該方法に用いることができるキット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体に関する。
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもなく、有効な不妊治療法の開発が強く望まれている。
不妊症の原因は男女同率であるが、男性不妊症は精子形成メカニズムの複雑さから、その治療法も含めて未解明の部分が多く、ヒト精子数の減少や生殖力の低下など生殖にまつわる問題の多くは原因不明である。体外受精（ＩＶＦ；Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能となってきているものの、不妊の背後にある分子メカニズムの詳細は依然として明らかになっておらず、適切な治療法の選択が困難な場合や、十分な治療効果が得られない場合も多い。従って、より負担の少ない不妊治療のためには、不妊メカニズムの理解に立った遺伝子診断・生殖補助医療の開発が強く望まれている。
非特許文献１によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。
一方、精子形成過程の減数分裂後に起こる形態学的変化には、エネルギー代謝に利用される酵素において、精子細胞特異的な構造もしくは機能変化が認められるとされ、精子特異的なｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ（非特許文献２参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（非特許文献３参照。）、ａｌｄｏｌａｓｅ（非特許文献４参照。）、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（非特許文献５参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ（非特許文献６参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ（非特許文献７参照。）、ｅｎｏｌａｓｅ（非特許文献８参照。）などが活性化される。非特許文献５では、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのノックアウトマウス（オス）が不妊となり、精子の運動不良が認められることから、これら精子特異的な解糖系の酵素機能における異常は不妊の原因となる可能性が示唆される。
一方、精子形成過程の減数分裂後に起こる形態学的変化には、エネルギー代謝に利用される酵素において、精子細胞特異的な構造もしくは機能変化が認められるとされ、精子特異的なｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ（非特許文献２参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（非特許文献３参照。）、ａｌｄｏｌａｓｅ（非特許文献４参照。）、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（非特許文献５参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ（非特許文献６参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ（非特許文献７参照。）、ｅｎｏｌａｓｅ（非特許文献８参照。）などが活性化される。非特許文献５では、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのノックアウトマウス（オス）が不妊となり、精子の運動不良が認められることから、これら精子特異的な解糖系の酵素機能における異常は不妊の原因となる可能性が示唆される。
マウスにおけるＰｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ（ＰＧＡＭ）は、Ｐｇａｍ−１とＰｇａｍ−２の２つの遺伝子にコードされ、Ｂ型、Ｍ型のホモ、及びヘテロのＰＧＡＭからなる３種類のアイソザイムを形成する。成長したマウスの睾丸では３種類のアイソザイムが検出されるが、新生児マウスの睾丸ではＭ型アイソザイムは認められず、出生後１４−１６日からＭ型が観察される。（非特許文献９参照。）。転写レベルでは、Ｂ型は脳と腎臓で強く、肝臓・甲状腺・筋肉・心臓で中程度発現しており、Ｍ型は筋肉と睾丸で強く、心臓・肺で中程度発現していることが明らかにされている（非特許文献１０参照。）。ヒト睾丸におけるＰＧＡＭの発現解析はないが、ＰＧＡＭ１（Ｂ型）は肝臓及び脳で発現し、ＰＧＡＭ２（Ｍ型）は筋肉での発現が確認されている（非特許文献１１参照。）。一方、ヒトにおいては、Ｂ型のアイソザイムとしてイントロンが含まれないＰＧＡＭ４（ＰＧＡＭ３、ＰＧＡＭ−Ｂ）が存在することが知られている(非特許文献１２参照)。成熟したヒト精巣においても、Ｂ型に加えＭ型のＰＧＡＭが発現していると考えられるが、精巣特異的に発現する遺伝子の多くはイントロンが含まれないため（非特許文献１３、１４参照）、ＰＧＡＭ４の精巣における機能が示唆される。従って、ＰＧＡＭ４をコードする遺伝子における変化は、精子におけるＰＧＡＭ機能に異常をもたらす可能性がある。その結果、解糖系によるエネルギー供給が低下し、精子の運動能が低下することにより受精に障害が起こる可能性が考えられる。
マザック（Matzuk）、外１名、ネイチャー・セル・バイオロジー（Nature Cell Biology）、２００２年、第４（Ｓｕｐｐ１）巻、Ｓ４１〜Ｓ４９。
モリ（Mori）、外４名、モレキュラー・リプロダクション・アンド・デベロップメント(Molecular reproduction and development)、１９９６年、第４４巻第１号、第１４〜２２ページ。
ブール（Buehr）、外１名、ジャーナル・オブ・リプロダクション・アンド・ファーティリティ（Journal of reproduction and fertility）、１９８１年、第６３巻第１号、第１６９〜１７３ページ。
ベムガンチ（Vemuganti）、外５名、デベロップメンタル・バイオロジー（Developmental biology）、２００７年、第３０９巻第１号、第１８〜３１ページ。
ミキ（Miki）、外８名、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、２００４年、第１０１巻第４７号、第１６５０１〜１６５０６ページ。
マッカレイ（McCarrey）、外６名、デベロップメンタル・ジェネティックス（Developmental genetics）、１９９６年、第１９巻第４号、第３２１〜３３２ページ。
ブロセノ（Broceno）、外４名、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European journal of biochemistry）、１９９５年、第２２７巻第３号、第６２９〜６３５ページ。
フォース（Force）、外４名、ジャーナル・オブ・アンドロロジー（Journal of andrology）、２００４年、第２５巻第５号、第８２４〜８２９ページ。
ファンデル（Fundele）、外４名、デベロップメンタル・バイオロジー（Developmental biology）、１９８７年、第１２４巻第２号、第５６２〜５６６ページ。
ツァン（Zhang）、外８名、ジーン（Gene）、２００１年、２６４巻第２号、第２７３〜２７９ページ。
サコダ（Sakoda）、外４名、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The journal of biological chemistry）、１９８８年、第２６３巻第３２号、第１６８９９〜１６９０５ページ。
"Symbol Report: PGAM4"、［online］、２００５年４月２５日、Human Genome Organisation、［２００８年１２月２日検索］、インターネット〈URL：http://www.genenames.org/data/hgnc_data.php?hgnc_id=21731〉
マッカレイ（McCarrey）、外１名、ネイチャー（Nature）、１９８７年、第３２６巻第６１１２号、第５０１〜５０５ページ。
ダール（Dahl）、外４名、ゲノミクス（Genomics）、１９９０年、第８巻第２号、第２２５〜２３２ページ。
男性不妊を診断するための有効な遺伝子検査・診断方法は未だ十分に確立されていない。男性不妊の原因は生殖細胞自体の欠失から精子の受精不全まで多岐に渡る。従って、病態に応じた有効な治療法を確立するためには、様々な病態の原因を特定できる方法が望まれている。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、精子運動におけるエネルギー供給に関わる酵素機能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性検査・診断方法を提供することを目的とする。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、精子運動におけるエネルギー供給に関わる酵素機能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性検査・診断方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、精巣特異的なＰＧＡＭ４が機能的に低下すると精子運動におけるエネルギー供給が減少し、受精に至る確率が低下すると考えられることから、ヒトにおける精巣型ＰＧＡＭ４分子が妊孕性に関連し、ＰＧＡＭ４遺伝子の変異は、男性不妊を引き起こす(或いは引き起こしやすい)と考え、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子配列を解析し、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子に男性不妊症に関連した変異を見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は下記の構成をとる。
（１）ヒトから採取された生体サンプルについて、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の、第７５位の塩基、第１３８位の塩基、及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出する、妊孕性検査方法。
（２）前記検査方法の検出行程において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の、第７５位の塩基及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の変異の有無を検出する、妊孕性検査方法。
（３）下記の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからシトシンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
からなるポリヌクレオチド。
（４）下記の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列：
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列；
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（５）配列番号１で表される塩基配列において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基又は第５３９位の塩基が置換されており、この置換された塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第１３８位の塩基がシトシンに置換された塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
（７）上記（５）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（８）上記（５）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合しない、抗体。
（９）ヒトから採取された生体サンプルについて、発現しているＰＧＡＭ４ポリペプチドの変異の有無を、上記（８）に記載の抗体を使用することで検出する検出工程を有する、妊孕性検査方法。
（１０）ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含み、前記ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬が、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基、第１３８位の塩基、及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することができる、ヒトの妊孕性検査キット。
（１１）前記試薬が、抗ＰＧＡＭ４抗体である、上記（１０）記載の妊孕性検査キット。
（１２）前記試薬が、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域を増幅することができるプライマーセットである、上記（１０）記載の妊孕性検査キット。
（１）ヒトから採取された生体サンプルについて、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の、第７５位の塩基、第１３８位の塩基、及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出する、妊孕性検査方法。
（２）前記検査方法の検出行程において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の、第７５位の塩基及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の変異の有無を検出する、妊孕性検査方法。
（３）下記の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからシトシンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
からなるポリヌクレオチド。
（４）下記の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列：
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列；
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（５）配列番号１で表される塩基配列において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基又は第５３９位の塩基が置換されており、この置換された塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第１３８位の塩基がシトシンに置換された塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
（７）上記（５）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（８）上記（５）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合しない、抗体。
（９）ヒトから採取された生体サンプルについて、発現しているＰＧＡＭ４ポリペプチドの変異の有無を、上記（８）に記載の抗体を使用することで検出する検出工程を有する、妊孕性検査方法。
（１０）ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含み、前記ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬が、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基、第１３８位の塩基、及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することができる、ヒトの妊孕性検査キット。
（１１）前記試薬が、抗ＰＧＡＭ４抗体である、上記（１０）記載の妊孕性検査キット。
（１２）前記試薬が、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域を増幅することができるプライマーセットである、上記（１０）記載の妊孕性検査キット。
本発明の妊孕性検査・診断方法や妊孕性検査・診断キットを用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を、高精度かつ簡便に行うことができる。
本発明に係る妊孕性検査・診断方法は、ヒトから採取された生体サンプルについて、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有する。ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損や特定の塩基の変異は、男性不妊との相関性が高い。したがって、被験者から生体サンプルを採取し、この生体サンプルを用いて被験者のＰＧＡＭ４遺伝子に欠損又は変異があるか否かを調べることにより、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。
配列番号１は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号ＮＣ＿００００２３．９で登録されている野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号１に示すように、野生型ヒトＰＧＡＭ４遺伝子は、７６５ｂｐからなる翻訳領域を有している。また、配列番号２は、野生型ヒトＰＧＡＭ４タンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソースによれば、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子は、ヒトＸ染色体長腕に位置している（Ｘｑ１３）。
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号１に示すヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域において塩基が置換している患者がいることを見出した。一方、これらの塩基置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では見られなかった。
ヒトＰＧＡＭ４遺伝子に上記の置換変異が起こると、正常なタンパク質が発現しなくなったり、発現効率が低下するおそれがある。それゆえ、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の置換変異は、正常なＰＧＡＭ４タンパク質の翻訳量が低下することにより不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
本発明において、変異とは、遺伝子の塩基配列において、塩基が欠失・置換・挿入されていることを意味する。本発明に係る妊孕性検査・診断方法の検出工程において検出されるＰＧＡＭ４遺伝子の変異は、男性不妊との相関性が高い変異である。具体的には、以下に述べる４個の変異のうち、少なくとも1つを検出することにより、検出工程に用いられた生体サンプルを採取されたヒトが、妊孕させやすいか否か、不妊症であるとすでに診断されている場合には、不妊症の原因がＰＧＡＭ４遺伝子の変異によるものであるか否かを検査することができ、この検査結果を受けて、医師が妊孕性の診断を行うことができる。なお、「ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第Ｘ位の塩基」とは、「翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第Ｘ位の塩基」を意味する。
男性不妊との相関性が高い変異として、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位のグアニンがシトシンンに置換している変異がある。この塩基置換によって、推定アミノ酸配列の第２５位のトリプトファンがシステインにコードされるようになる。
また、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第１３８位のアデニンがシトシンに置換している変異がある。当該第１３８位の塩基は、推定アミノ酸配列の第４６位のアルギニンをコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化せず、アルギニンのままである。
また、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第５３９位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１８０位のアルギニンがヒスチジンにコードされるようになる。
本発明に係る妊孕性検査・診断方法においては、特に、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基又は第５３９位の塩基を検出することが好ましい。より妊孕性との相関性が高いためである。また、本発明に係る妊孕性検査・診断方法においては、上記の変異のうち、１種類の変異を検出するものであってもよく、複数種類の変異を検出するものであってもよい。
本発明に係る妊孕性検査・診断方法は、これらの一塩基変異を、妊孕性の遺伝子マーカーとして用いるものである。たとえば、これらの塩基の変異が検出されなかった場合、検出工程に用いられた生体サンプルが回収された被験者は、妊孕性に問題がない可能性が高いと推定できる。また、被験者がすでに不妊症患者であると診断されている場合は、不妊症の原因が、ＰＧＡＭ４遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。一方、変異が検出された場合は、その被験者は、妊孕可能性が低いと推定される。したがって被験者が不妊症患者には、本発明の妊孕性検査・診断方法を使用することで、その原因がＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異に起因した、ＰＧＡＭ４分子の機能欠損が原因である可能性が高いと判定できる。したがって、そのような被験者に対して、たとえばＴＥＳＥ−ＩＣＳＩ（Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｓｐｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ−Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；精巣生検−顕微授精）等の適切な処置を施すことにより、早期に疾患を治癒することができる。すなわち、本発明に係る妊孕性検査方法は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を目的とした検査方法ともいえるものであり、該方法の結果により、不妊症の診断を行う上で重要な情報が提供されるため、被験者に対して、現存の治療法の中から適格な選択を提示することができる。このため、本発明に係る妊孕性検査方法等は、低妊孕性又は不妊症の診断において好ましく用いることができる。
本発明に係る妊孕性検査・診断方法において用いられる生体サンプルは、ヒトから採取されたものであって、ＰＧＡＭ４遺伝子由来の核酸やタンパク質を含有することが期待できるサンプルであれば、特に限定されるものではなく、たとえば、血液、血清、血漿、頬の内側等の粘膜、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を挙げることができる。ここで、ＰＧＡＭ４遺伝子由来の核酸とは、ＰＧＡＭ４遺伝子のゲノムＤＮＡや、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ等を意味する。また、ＰＧＡＭ４遺伝子由来のタンパク質とは、ＰＧＡＭ４遺伝子から発現されるタンパク質であるＰＧＡＭ４分子やその分解物等を意味する。特に、ＰＧＡＭ４遺伝子由来のタンパク質を検出対象とする場合には、生体サンプルとして、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を用いることが好ましい。精漿は、たとえ精子細胞を含んでいなくても、精子細胞が破壊等されることにより放出された、精子細胞で発現するタンパク質を含んでいると考えられている。
なお、生体サンプルを適宜希釈等することによりそのまま検出工程に用いてもよく、該生体サンプルから予め抽出したゲノムＤＮＡ等のＤＮＡを用いてもよい。また、該生体サンプルからｍＲＮＡ等のＲＮＡを抽出した後、逆転写反応により該ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを検出工程に用いてもよい。
本発明に係る妊孕性検査・診断方法の検出工程において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異を検出する方法としては特に限定されず、遺伝子の変異や多型の検出等において用いられる公知の各種手法、たとえば、サンガー法を基礎とする塩基配列決定法、インベーダー法、Ｔａｑｍａｎプローブ法、ＳＭＭＤ法（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＡＳＡ法、及び塩基伸長法、並びにそれらを改変した方法等を用いることができる。検出感度及び精度に優れているため、インベーダー法やＴａｑｍａｎプローブ法等のように、変異部位を特異的に認識する塩基配列を有するプローブやプライマーを用いて検出する方法であることが好ましい。
ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異を検出するためのプローブやプライマーは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子及びその周辺の塩基配列に基づき、常法により設計し、合成することができる。なお、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子及びその周辺の塩基配列は、たとえばＮＣＢＩヒトゲノムリソース（ＮＣＢＩ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／）等の公知のデータベースから当業者であれば容易に入手することができる。
たとえば、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを用いて、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がグアニンからシトシンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第７５位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号３で表される塩基配列は、ＰＧＡＭ４遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基に相当する。
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを用いて、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第５３９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第５３９位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、ＰＧＡＭ４遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第５３９位の塩基に相当する。
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを用いて、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第１３８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がアデニンからシトシンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１３８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、ＰＧＡＭ４遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第１３８位の塩基に相当する。
このように、上述する各変異の有無を検出するためのプライマー等としては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることができる。また、ヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子のゲノムＤＮＡにおいて、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることもできる。これらのポリヌクレオチドの長さとしては、１０〜７０塩基長であることが好ましく、１０〜５０塩基長であることがより好ましく、１０〜３０塩基長であることがさらに好ましい。なお、変異の有無の検出精度が改善されるため、該ポリヌクレオチド中、当該変異部位の塩基と対合し得る塩基の位置は特に限定されるものではないが、３’末端から１〜５塩基以内にあることが好ましく、３’末端にあることがより好ましい。
なお、ヒトの妊孕性を検査するためのキットであって、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性検査キットを用いることにより、本発明に係る妊孕性検査・診断方法をより簡便に行うことができる。本発明に係る妊孕性検査キットとしては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基、第１３８位の塩基、又は第５３９位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることが好ましく、第７５位の塩基又は第５３９位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることがより好ましい。また、これらの変異のうちの、１種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよく、複数種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよい。
これらの塩基の変異を検出するための試薬としては、たとえば、当該塩基を含む核酸領域をＰＣＲ等により増幅させるためのプライマーの組と、得られた増幅産物の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬とを含んでいてもよい。該塩基配列決定試薬としては、たとえば、上述したヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列又はその翻訳領域の塩基配列において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、予め蛍光色素等により標識したハイブリダイゼーションプローブ等が挙げられる。その他、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異を検出する方法がＰＣＲ−ＲＦＬＰ法である場合には、該ＲＦＬＰ法において用いられる制限酵素であってもよい。
また、本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。たとえば、上記妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、被験者のヒトＰＧＡＭ４遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよく、被験者のヒトＰＧＡＭ４遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。
より具体的には、一実施形態において、本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子内の領域のうち、上記の各変異部位（以下、「変異検出部位」という）の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
この場合、妊孕性検査キットには、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の上記の変異検出部位を含む領域を増幅させるために、変異検出部位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることができる。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。
被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲを行うことにより、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行うことにより、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、たとえば、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ.）等を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
また、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのＰＣＲに用いられるプライマーとは別のプライマーを、塩基配列の決定に用いられるプライマーとして用いてもよい。すなわち、妊孕性検査キットには、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組と、塩基配列の決定に用いられるプライマーとを含んでいてもよい。
上記のＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の変異検出部位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。
また、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
なお、それぞれのプライマーは、ＰＧＡＭ４遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。ＰＧＡＭ４遺伝子又はその周辺と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、ＰＧＡＭ４遺伝子の各変異部位のうちの少なくとも一方を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。
上記のプライマーの組としては、たとえば、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーとからなる組を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）等を用いてプライマーを設計することができる。
各プライマーは、たとえばホスホロアミダイト法等の公知の方法によって合成することができ、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.の３９２型シンセサイザー等を取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。
各プライマーは、たとえばホスホロアミダイト法等の公知の方法によって合成することができ、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ.の３９２型シンセサイザー等を取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性検査キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼ等がさらに含まれていてもよい。
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性検査キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼ等がさらに含まれていてもよい。
一実施形態において、本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の上記の変異検出部位における塩基の置換変異の有無を、インベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらによる論文（Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
図１は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダーオリゴ２及びアレルオリゴ３と、蛍光標識プローブのフレットプローブ５とが用いられる。
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される（いずれの塩基とも相補的な塩基ではない）。一方、アレルオリゴ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ３ｂと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに相補するように設計されたヌクレオチド３ａとが連結したものである。ここで、フラップ３ｂは、ヌクレオチド３ａの５’末端側に連結されている。
このように設計されたインベーダープローブ２とアレルオリゴ３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、ターゲット遺伝子１に対してアレルオリゴ３とインベーダープローブ２が重なり合った構造をとりながらハイブリダイズし、変異検出部位１ａにおいてインベーダープローブ２がアレルオリゴ３の下に１塩基のみ侵入する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）」ともいう）４がこの侵入構造を認識し、アレルオリゴ３を重なった塩基の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、 ３’末端がフラップ遊離体３ｃと相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３進入構造が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの侵入構造を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される（いずれの塩基とも相補的な塩基ではない）。一方、アレルオリゴ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ３ｂと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに相補するように設計されたヌクレオチド３ａとが連結したものである。ここで、フラップ３ｂは、ヌクレオチド３ａの５’末端側に連結されている。
このように設計されたインベーダープローブ２とアレルオリゴ３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、ターゲット遺伝子１に対してアレルオリゴ３とインベーダープローブ２が重なり合った構造をとりながらハイブリダイズし、変異検出部位１ａにおいてインベーダープローブ２がアレルオリゴ３の下に１塩基のみ侵入する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）」ともいう）４がこの侵入構造を認識し、アレルオリゴ３を重なった塩基の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、 ３’末端がフラップ遊離体３ｃと相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３進入構造が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの侵入構造を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。
従って、本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無をインベーダー法により検出するものであってもよい。この場合、妊孕性検査キットには、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、インベーダープローブ２、アレルオリゴ３及びフレットプローブ５等が含まれることが好ましい。
置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合には、インベーダープローブ２は、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型ＰＧＡＭ４遺伝子の各変異型塩基と対応するように設計される（但し、相補的でない）。また、アレルオリゴ３のヌクレオチド３ａは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基が変異型ＰＧＡＭ４遺伝子の上記の変異型塩基と相補するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記アレルオリゴ３が変異型ＰＧＡＭ４遺伝子とハイブリダイズしてインベーダープローブ２による侵入構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体３ｃを検出できるように設計される。
上記の構成により、被験者のＰＧＡＭ４遺伝子において上記の塩基が変異型置換している場合は、ターゲット遺伝子にハイブリダイズしたヌクレオチド３ａの５’末端にインベーダープローブ２の３’末端が侵入することにより、ヌクレオチド３ｃが切り出されて蛍光が生じる。一方、被験者のＰＧＡＭ４遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ２の末端部分による侵入構造が形成されないのでヌクレオチド３ｃが切り出されないため蛍光が生じない。
上記の構成により、被験者のＰＧＡＭ４遺伝子において上記の塩基が変異型置換している場合は、ターゲット遺伝子にハイブリダイズしたヌクレオチド３ａの５’末端にインベーダープローブ２の３’末端が侵入することにより、ヌクレオチド３ｃが切り出されて蛍光が生じる。一方、被験者のＰＧＡＭ４遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ２の末端部分による侵入構造が形成されないのでヌクレオチド３ｃが切り出されないため蛍光が生じない。
また、上記の例では、被験者の有するＰＧＡＭ４遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＰＧＡＭ４遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、或いは野生型と変異型で異なった蛍光色素を使用するなど様々に改変することができる。
なお、上記の各方法において、ＰＧＡＭ４遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
なお、上記の各方法において、ＰＧＡＭ４遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無をタンパク質レベルで検出するものであってもよい。すなわち、本発明に係る検出方法及び妊孕性検査キットは、ヒトにおいて、正常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよく、異常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。ここで、正常タンパク質とは、ヒト野生型ＰＧＡＭ４ポリペプチドであり、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。一方、異常タンパク質とは、たとえば、ヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、一塩基置換変異等の変異が生じているポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは異なるポリペプチドを意味する。具体的には、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチドにおいて、第７５位の塩基がシトシンに置換された塩基配列、又は第５３９位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドである。
なお、生体サンプル中に含まれているヒトＰＧＡＭ４タンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを検出する方法としては、特に限定されるものではないが、たとえば、ヒトＰＧＡＭ４タンパク質の正常タンパク質と異常タンパク質のいずれか一方のみを認識する抗体を用いることにより、生体サンプル中に含まれているヒトＰＧＡＭ４タンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを検出することができる。また、本発明に係る妊孕性検査キットに含まれるヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＰＧＡＭ４の異常タンパク質と結合し、かつ、正常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いてもよい。なお、このような抗体は、ヒトＰＧＡＭ４の異常タンパク質を抗原として、常法により作製したポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の中から、ヒトＰＧＡＭ４の正常タンパク質と交差しないものを選択することにより、作製することができる。
このような抗体は、具体的には、上述した第７５位もしくは第５３９位のアミノ酸の置換変異を含むヒト変異型ＰＧＡＭ４ポリペプチド又は変異部分を含むそのフラグメントを抗原として、実験動物を免疫処置することにより製造することができる（たとえば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914；Francis, M. J. et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)を参照のこと。）
一般的には、動物は遊離ペプチドによって免疫化することができる。ただし、遊離ペプチドを高分子キャリア（たとえば、ヒーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキシド）にカップリングすることによって効率的に免疫化できるようになる場合もある。たとえば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーによってキャリアにカップリングすることができる。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングすることができる。
ウサギ、ラット及びマウスのような動物は、遊離ペプチドまたはキャリア−カップリングペプチドと、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントとを含むエマルジョンを腹腔内及び／または皮内に注射することにより免疫化することができる。ＥＬＩＳＡにより検出できる程度に有用な力価の抗ペプチド抗体を得るためには、約２週間の間隔で追加免疫注射を行うことが望ましい。
そして、免疫化された動物から血液を採取し、血清からＩｇＧ画分を抽出することにより抗体を得ることができる。また、抗体を公知の技術によって精製することにより、抗体の力価が向上する。
本発明に係る抗体は、上述したヒト変異型ＰＧＡＭ４ポリペプチドに結合する一方で、ヒト野生型ＰＧＡＭ４ポリペプチドには結合しないものである。それゆえ、上記の手順によって得られた抗体のうち、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合しないものを選出することによって、本発明に係る抗体を得ることができる。上記の選出を容易にするためには、動物に注射する抗原ペプチドとして、ヒト変異型ＰＧＡＭ４ポリペプチドの変異部分とその周辺のアミノ酸配列からなる１０残基程度のオリゴペプチドを選択することが望ましい。
一般的には、動物は遊離ペプチドによって免疫化することができる。ただし、遊離ペプチドを高分子キャリア（たとえば、ヒーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキシド）にカップリングすることによって効率的に免疫化できるようになる場合もある。たとえば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーによってキャリアにカップリングすることができる。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングすることができる。
ウサギ、ラット及びマウスのような動物は、遊離ペプチドまたはキャリア−カップリングペプチドと、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントとを含むエマルジョンを腹腔内及び／または皮内に注射することにより免疫化することができる。ＥＬＩＳＡにより検出できる程度に有用な力価の抗ペプチド抗体を得るためには、約２週間の間隔で追加免疫注射を行うことが望ましい。
そして、免疫化された動物から血液を採取し、血清からＩｇＧ画分を抽出することにより抗体を得ることができる。また、抗体を公知の技術によって精製することにより、抗体の力価が向上する。
本発明に係る抗体は、上述したヒト変異型ＰＧＡＭ４ポリペプチドに結合する一方で、ヒト野生型ＰＧＡＭ４ポリペプチドには結合しないものである。それゆえ、上記の手順によって得られた抗体のうち、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合しないものを選出することによって、本発明に係る抗体を得ることができる。上記の選出を容易にするためには、動物に注射する抗原ペプチドとして、ヒト変異型ＰＧＡＭ４ポリペプチドの変異部分とその周辺のアミノ酸配列からなる１０残基程度のオリゴペプチドを選択することが望ましい。
このように、一実施形態において、本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、上述した各変異のうち、第７５位もしくは第５３９位の少なくとも一の塩基置換を含むヒト変異型ＰＧＡＭ４遺伝子によってコードされるヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合しない抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているかを判定するものであってもよい。
上記抗体を用いてヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質が発現されていると判定された場合は、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子に上述した置換変異が生じていることが強く示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合は、不妊症の原因がヒトＰＧＡＭ４遺伝子の異常に起因していると推定することができる。
上記抗体を用いてヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質が発現されていると判定された場合は、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子に上述した置換変異が生じていることが強く示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合は、不妊症の原因がヒトＰＧＡＭ４遺伝子の異常に起因していると推定することができる。
また、他の実施形態において、本発明に係る検出方法及び妊孕性検査キットは、ヒトにおいて正常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよく、正常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質の発現量の多寡を判定するものであってもよい。
より具体的には、本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程が、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合し、かつ、異常ヒトＰＧＡＭ４タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いることにより、生体サンプル中にヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質が存在しているか否かを検出するものであってもよい。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合し、かつ、異常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体（抗ＰＧＡＭ４抗体）を用いてもよい。
抗ＰＧＡＭ４抗体を用いてヒトＰＧＡＭ４タンパク質の発現の有無や発現量を調べ、被験者においてヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現していないと判定された場合や、ヒトＰＧＡＭ４タンパク質の発現量が遺伝子変異が生じていない被験者よりも少ないと判定された場合には、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子が欠失または変異していることが示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合には、不妊症の原因が正常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現していないことによるものと推定することができる。
より具体的には、本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程が、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合し、かつ、異常ヒトＰＧＡＭ４タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いることにより、生体サンプル中にヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質が存在しているか否かを検出するものであってもよい。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合し、かつ、異常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体（抗ＰＧＡＭ４抗体）を用いてもよい。
抗ＰＧＡＭ４抗体を用いてヒトＰＧＡＭ４タンパク質の発現の有無や発現量を調べ、被験者においてヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現していないと判定された場合や、ヒトＰＧＡＭ４タンパク質の発現量が遺伝子変異が生じていない被験者よりも少ないと判定された場合には、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子が欠失または変異していることが示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合には、不妊症の原因が正常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現していないことによるものと推定することができる。
抗体を用いて、生体サンプル中のヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質またはヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質を検出する手法は、特に限定されず、公知のいずれの手法を用いてもよい。たとえば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）等が挙げられる。
妊孕性診断キットがウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを利用する妊孕性診断方法に好適なキットである場合、妊孕性診断キットには、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、抗ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質抗体又は抗ヒト変異型ＰＧＡＭ４抗体に加えて、発色反応に必要なペルオキシダーゼ等の特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体が含まれていてもよい。
妊孕性診断キットがウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを利用する妊孕性診断方法に好適なキットである場合、妊孕性診断キットには、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、抗ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質抗体又は抗ヒト変異型ＰＧＡＭ４抗体に加えて、発色反応に必要なペルオキシダーゼ等の特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体が含まれていてもよい。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本実施例においては、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子配列を解析し、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子に男性不妊症に関連した変異の検出を行った。
［解析対象者］
非閉塞性不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝３８３）を、精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、１３％は非閉塞性無精子症であり、３１％は重症精子過少症（＜５×１０６細胞／ｍＬ）であり、３３％が運動無力症であり、残り２３％が形態的に異常のないものであった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Guideline for sperm donation. Fertil Steril. 2004: 82(suppl 1): S9 -S12）。コントロール群（Ｎ＝２５１）は産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親であり、妊孕性が確認された男性とした。全ての提供者からは、サンプルがゲノムＤＮＡ解析に使用される旨のインフォームドコンセントを取得した（大阪大学病院泌尿器科）。
［解析対象者］
非閉塞性不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝３８３）を、精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、１３％は非閉塞性無精子症であり、３１％は重症精子過少症（＜５×１０６細胞／ｍＬ）であり、３３％が運動無力症であり、残り２３％が形態的に異常のないものであった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Guideline for sperm donation. Fertil Steril. 2004: 82(suppl 1): S9 -S12）。コントロール群（Ｎ＝２５１）は産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親であり、妊孕性が確認された男性とした。全ての提供者からは、サンプルがゲノムＤＮＡ解析に使用される旨のインフォームドコンセントを取得した（大阪大学病院泌尿器科）。
［変異スクリーニング］
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って各処理を行った。
ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理とフェノール抽出により血液サンプル又は精液サンプルから単離し調製した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。血液由来ゲノムＤＮＡはＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて増幅したＤＮＡを使用した。
ＰＧＡＭ４遺伝子のタンパク質をコードする翻訳領域を含むＤＮＡを、表１に示したプライマーＦ及びプライマーＲを用いて、表２に示したＰＣＲ反応条件に従って増幅した。
なお、プライマーＦは、５’末端の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基とした場合の第−９８位の塩基とハイブリダイズするように設計されたプライマーである。一方、プライマーＲは、５’末端の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基とした場合の第８５０位の塩基とハイブリダイズするように設計されたプライマーである。
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って各処理を行った。
ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理とフェノール抽出により血液サンプル又は精液サンプルから単離し調製した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。血液由来ゲノムＤＮＡはＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて増幅したＤＮＡを使用した。
ＰＧＡＭ４遺伝子のタンパク質をコードする翻訳領域を含むＤＮＡを、表１に示したプライマーＦ及びプライマーＲを用いて、表２に示したＰＣＲ反応条件に従って増幅した。
なお、プライマーＦは、５’末端の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基とした場合の第−９８位の塩基とハイブリダイズするように設計されたプライマーである。一方、プライマーＲは、５’末端の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基とした場合の第８５０位の塩基とハイブリダイズするように設計されたプライマーである。
得られたＰＣＲ増幅フラグメントを、ＡＭＰｕｒｅ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した。この精製されたＰＣＲ増幅フラグメントを鋳型とし、当該アンプリコンを増幅した際に使用したプライマーを用いて、シーケンシング反応を行った。具体的には、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、ＣｌｅａｎＳＥＱ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ３７３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。
［シークエンス解析結果］
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについて、プライマーＦとＲで増幅されるアンプリコンの塩基配列を解析したところ、表３に示すように、置換変異が合計４個検出された。
このうち、アミノ酸の変化を伴う置換変異は２個であり、このうちの１個は妊孕性確認被験者にも検出されたが、残る１個は妊孕性確認被験者からは全く検出されなかった。また、妊孕性確認被験者からも検出された２個の置換変異のうちの１個は、不妊症被験者に有意に多かった。
一方、アミノ酸の変化を伴わない２個の置換変異のうち、１個は妊孕性確認被験者にも検出されたが、残る１個は妊孕性確認被験者からは全く検出されなかった。
これらの結果から、妊孕性確認被験者からは全く検出されなかった２個の置換変異と、不妊症被験者に有意に多かった１個の置換変異が、妊孕性との相関性があることが確認された。以下、この３個の置換変異について、それぞれ説明する。
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについて、プライマーＦとＲで増幅されるアンプリコンの塩基配列を解析したところ、表３に示すように、置換変異が合計４個検出された。
このうち、アミノ酸の変化を伴う置換変異は２個であり、このうちの１個は妊孕性確認被験者にも検出されたが、残る１個は妊孕性確認被験者からは全く検出されなかった。また、妊孕性確認被験者からも検出された２個の置換変異のうちの１個は、不妊症被験者に有意に多かった。
一方、アミノ酸の変化を伴わない２個の置換変異のうち、１個は妊孕性確認被験者にも検出されたが、残る１個は妊孕性確認被験者からは全く検出されなかった。
これらの結果から、妊孕性確認被験者からは全く検出されなかった２個の置換変異と、不妊症被験者に有意に多かった１個の置換変異が、妊孕性との相関性があることが確認された。以下、この３個の置換変異について、それぞれ説明する。
ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第１３８位のアデニンが両方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者３８１人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４６位のアルギニンは変わらない。この置換変異は、妊孕性確認被験者２４９人には見出されなかった。
ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位のグアニンが両方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者３７６人の中に１７人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２５位のトリプトファンがシステインにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２４１人のうち、両方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が３人見出された。
また、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第５３９位のグアニンが両方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者３８３人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１８０位のアルギニンがヒスチジンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２５１人には見出されなかった。
これらの置換変異の中でも、特に、第７５位の塩基の置換変異の出現率が高く、男性不妊症との相関性が高かった。
上記の置換変異が見出された被験者は、正常なＰＧＡＭ４のタンパク質の翻訳量が低減したことにより、ＰＧＡＭ４タンパク質の働きが不十分になって不妊症になったものと推測された。なお、妊孕性確認被験者では全く検出されなかったアミノ酸置換を伴わない置換変異（第１３８位の置換変異）は、転写産物の安定性や翻訳効率に影響を与えるか、或いは他の変異とリンクした変異である可能性がある。
本研究により、上記の置換変異以外にも一塩基多型がＰＧＡＭ４遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。
本発明に係る妊孕性検査・診断方法等を用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を行うことができ、妊症の現象解明や治療法の確立並びに不妊症の診断に有用なツールが提供されるので、製薬分野や医療分野において本発明を好適に利用することができる。たとえば、本発明であるPGAM4遺伝子の他に、既知の発明であるSCOT-ｔ遺伝子（特許第4229973号）、PRM２遺伝子（特許第4276691）、TP遺伝子（特開2007-089409）、Centrin1遺伝子（特開2008-237114）、TSSK遺伝子（特開2008-067649）、Meisetz遺伝子（特開2009-065882）の遺伝子変異やSNPを同時に調べることにより、日本人男性不妊症の10％以上の男性不妊症原因遺伝子を明らかにすることができる。男性の不妊症の原因に性染色体異常（Y染色体変異）が知られており、その出現頻度は5−10％であるが、先進国において男性不妊症患者の原因診断として性染色体異常の検査がルーティーンに行われている。この現状を考えると、本発明を含むキットは10％以上の男性不妊症の原因遺伝子を同定でき、科学的根拠に基づいた不妊症治療法の選択や患者のカウンセリングのために、臨床現場での有用なツールとしてルーティーンに利用されることが期待される。
１…ターゲット遺伝子、１ａ…変異（又は一塩基多型）検出部位、２…インベーダーオリゴ、３…アレルオリゴ、３ａ…ヌクレオチド、３ｂ…フラップ、３ｃ…フラップ遊離体、４…フラップエンドヌクレアーゼ、５…フレットプローブ、５ａ…ヌクレオチド、５ｂ…蛍光色素、５ｃ…クエンチャー（発光抑制体）。
Claims (12)
- ヒトから採取された生体サンプルについて、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、
前記検出工程において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の、第７５位の塩基、第１３８位の塩基、及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出する、妊孕性検査方法。 - 前記検出工程において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の、第７５位の塩基及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の変異の有無を検出する、請求項１記載の妊孕性検査方法。
- 下記の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからシトシンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
からなるポリヌクレオチド。 - 下記の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列：
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列；
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
からなるポリヌクレオチド。 - 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第７５位の塩基がシトシンに置換された塩基配列又は第５３９位の塩基がアデニンに置換された塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
- 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第１３８位の塩基がシトシンに置換された塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
- 請求項５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
- 請求項５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合しない、抗体。
- ヒトから採取された生体サンプルについて、発現しているＰＧＡＭ４ポリペプチドの変異の有無を、請求項８に記載の抗体を使用することで検出する検出工程を有する、妊孕性検査方法。
- ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含み、
前記ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬が、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基、第１３８位の塩基、及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することができる、ヒトの妊孕性検査キット。 - 前記試薬が、抗ＰＧＡＭ４抗体である、請求項１０記載の妊孕性検査キット。
- 前記試薬が、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域を増幅することができるプライマーセットである、請求項１０記載の妊孕性検査キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011504749A JP5713351B2 (ja) | 2009-03-17 | 2010-03-15 | 妊孕性検査方法、妊孕性検査キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009065110 | 2009-03-17 | ||
| JP2009065110 | 2009-03-17 | ||
| PCT/JP2010/001850 WO2010106788A1 (ja) | 2009-03-17 | 2010-03-15 | 妊孕性検査方法、妊孕性検査キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 |
| JP2011504749A JP5713351B2 (ja) | 2009-03-17 | 2010-03-15 | 妊孕性検査方法、妊孕性検査キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2010106788A1 JPWO2010106788A1 (ja) | 2012-09-20 |
| JP5713351B2 true JP5713351B2 (ja) | 2015-05-07 |
Family
ID=42739456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011504749A Active JP5713351B2 (ja) | 2009-03-17 | 2010-03-15 | 妊孕性検査方法、妊孕性検査キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9194874B2 (ja) |
| EP (1) | EP2410050B1 (ja) |
| JP (1) | JP5713351B2 (ja) |
| WO (1) | WO2010106788A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102624588B1 (ko) * | 2017-05-19 | 2024-01-15 | 젠-프로브 인코포레이티드 | 플랩 엔도뉴클레아제를 함유하는 건조 조성물 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07258299A (ja) * | 1994-03-25 | 1995-10-09 | Oriental Yeast Co Ltd | Ｐｇａｍアイソザイムに対する抗体 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04229973A (ja) | 1990-12-27 | 1992-08-19 | Tanaka Kikinzoku Kogyo Kk | 多線束摺動ブラシ接点 |
| CN1643148B (zh) | 2002-02-14 | 2011-04-20 | 独立行政法人科学技术振兴机构 | 小鼠精子形成基因、人男性不育关连基因、以及利用该基因的诊断系统 |
| JP2007089409A (ja) | 2005-09-27 | 2007-04-12 | Osaka Univ | Ｔｎｐ１遺伝子における変異の検出方法 |
| JP2008067649A (ja) | 2006-09-14 | 2008-03-27 | Osaka Univ | 妊孕性診断キット、変異検出方法、ポリヌクレオチド、及びポリペプチド |
| JP2008237114A (ja) | 2007-03-27 | 2008-10-09 | Osaka Univ | 妊孕性診断キット、変異検出方法、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、発現ベクター、及び発現キット |
| JP2009065882A (ja) | 2007-09-12 | 2009-04-02 | Osaka Univ | 妊孕性に関連するポリヌクレオチドおよびその利用 |
-
2010
- 2010-03-15 EP EP10753285.5A patent/EP2410050B1/en active Active
- 2010-03-15 US US13/256,860 patent/US9194874B2/en active Active
- 2010-03-15 WO PCT/JP2010/001850 patent/WO2010106788A1/ja active Application Filing
- 2010-03-15 JP JP2011504749A patent/JP5713351B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07258299A (ja) * | 1994-03-25 | 1995-10-09 | Oriental Yeast Co Ltd | Ｐｇａｍアイソザイムに対する抗体 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| JPN6010018573; Ｂｅｔｒａｎ Ｅ． ｅｔ ａｌ．: 'Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ' Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． Ｖｏｌ．１９, 2002, ｐ．６５４-６６３ * |
| JPN6010018576; 田中宏光ほか: '精巣生殖細胞特異的遺伝子のｓｉｎｇｌｅ-ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ）解析' 日本アンドロロジー学会総会記事 , 2007, 第１５２-１５３頁 * |
| JPN6010018578; 宮川康ほか: '男性不妊症患者における精巣生殖細胞特異的遺伝子ＳＮＰ解析とその臨床応用' 日本アンドロロジー学会総会記事 , 2008, 第８２-８３頁 * |
| JPN6010018579; 宮川康ほか: '男性不妊症と精子形成遺伝子' 日本疾患モデル学会記録 Ｖｏｌ．２０, 2004, 第２９-３４頁 * |
| JPN6010018581; 田中宏光: '男性不妊症の原因遺伝子の同定と臨床応用' 厚生労働科学研究費補助金 ヒトゲノム・再生医療等研究事業 平成１５年度総括研究報告書 , 2004, 第１９-２２頁 * |
| JPN6014028978; Ｈｅｒｍａｎ Ａ． Ｄｉｅｒｉｃｋ， ｅｔ ａｌ．: 'Ａ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ ｂｒａｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ （ＰＧＡＭ １） ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ ｉｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｍｅｎｋｅｓ ｄｉｓ' Ｇｅｎｅ Ｖｏｌ．１９８, 1997, ｐ．３７-４１ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20120116243A1 (en) | 2012-05-10 |
| JPWO2010106788A1 (ja) | 2012-09-20 |
| WO2010106788A1 (ja) | 2010-09-23 |
| US9194874B2 (en) | 2015-11-24 |
| EP2410050A4 (en) | 2013-02-20 |
| EP2410050B1 (en) | 2017-06-21 |
| EP2410050A1 (en) | 2012-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7000658B2 (ja) | 肝臓病変を評価する方法 | |
| US10939868B2 (en) | Method of predicting rapid progression of fibrosis and therapy and reagents therefor | |
| JP5713351B2 (ja) | 妊孕性検査方法、妊孕性検査キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 | |
| JP2008237204A (ja) | 疾患モデル動物、細胞、組織、精巣、交配用動物、生殖細胞生産方法、生殖細胞、培養細胞、スクリーニング方法、医薬組成物、妊孕性診断キット、検出方法、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 | |
| JP2010187556A (ja) | 妊孕性診断方法、妊孕性診断キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 | |
| US20100292088A1 (en) | Methods and compositions for detecting genetic markers associated with primary ciliary dyskinesia | |
| JP2014183839A (ja) | 哺乳動物における膵癌を診断するための診断キット、それを用いた検査方法および診断マーカー | |
| KR102063486B1 (ko) | Rnf213 단일염기다형성과 한국인 모야모야병 발병 위험도의 연관성 | |
| JP5897704B2 (ja) | ブラキスパイナ突然変異の検出 | |
| WO2006137487A1 (ja) | β遮断薬に対する反応性予測に有用な遺伝子多型 | |
| WO2021243166A2 (en) | Deterimining risk of spontaneous coronary artery dissection and myocardial infarction and systems and methods of use thereof | |
| JP5493359B2 (ja) | 方法、キット、ポリヌクレオチドの妊孕可能性の推定又は不妊症の原因の同定のための使用、ポリペプチドの妊孕可能性の推定又は不妊症の原因の同定のための使用、及び抗体 | |
| JP6516128B2 (ja) | 抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法及び判定用キット | |
| RU2777086C1 (ru) | Способ преимплантационного генетического тестирования буллезного эпидермолиза | |
| JP5263919B2 (ja) | メタボリック症候群の検査方法 | |
| CN113265405B (zh) | Samm50突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途 | |
| JP2010220586A (ja) | 妊孕性診断方法、妊孕性診断キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体 | |
| TWI535851B (zh) | Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) integrated gene detection method and its detection kit, primer group | |
| JP2009065882A (ja) | 妊孕性に関連するポリヌクレオチドおよびその利用 | |
| CN113186274A (zh) | Grpel1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途 | |
| JP4686713B2 (ja) | 関節リウマチの検査方法、関節リウマチ診断薬、及びそれに用いられるプライマー | |
| CN113308534A (zh) | Vdac1突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途 | |
| CN113403378A (zh) | Timm13突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途 | |
| CN113355405A (zh) | Tomm20突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途 | |
| JP5594655B2 (ja) | 網膜色素線条症の原因変異を判定するための方法及びこれに使用されるオリゴヌクレオチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130222 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130225 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130222 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140715 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140901 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20140902 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150203 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150304 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5713351 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |