JPH07258299A

JPH07258299A - Ｐｇａｍアイソザイムに対する抗体

Info

Publication number: JPH07258299A
Application number: JP7986794A
Authority: JP
Inventors: Koji Uchida; 田浩二内
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 1994-03-25
Filing date: 1994-03-25
Publication date: 1995-10-09

Abstract

(57)【要約】【構成】Ｅ．ｃｏｌｉでの遺伝子組換えによるヒトＰ
ＧＡＭ（ホスホグリセリン酸ムターゼ）のＭ型及びＢ型
アイソザイムの新規生産、これ（ら）を抗原とするＭ型
（又はＢ型）アイソザイムに特異的な新規抗体の作製、
及び、該抗体を用いる各アイソザイムの分別定量。【効果】該抗体は特異性が高いので各アイソザイムの
正確な定量が可能となり、各種診断薬に利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ホスホグリセリン酸ム
ターゼ（ＰＧＡＭ）アイソザイムに対する抗体、及び該
抗体を用いるＰＧＡＭアイソザイムの測定システムに関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】ホスホグリセリン酸ムターゼ（Ｐｈｏｓ
ｐｈｏｇｌｙｃｅｒｉｃａｃｉｄｍｕｔａｓｅ）（Ｐ
ＧＡＭということもある）；ＥＣ５．４．２．１かって
はＥＣ２．７．５．３）は、解糖系酵素の一つで、２，
３−ビスホスホグリセリン酸（２，３−ｂｉｓｐｈｏｓ
ｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ：２，３−ＢＰＧ）の存在
下、２−ホスホグリセリン酸（２−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌ
ｙｃｅｒａｔｅ）と３−ホスホグリセリン酸（３−ｐｈ
ｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）の相互交換を触媒す
る。

【０００３】哺乳動物のＰＧＡＭは、Ｍサブユニットと
Ｂサブユニットの組合わせから成る三つのダイマー構造
を有する；ＭＭホモダイマー（Ｍ型アイソザイム）、Ｂ
Ｂホモダイマー（Ｂ型アイソザイム）およびＭＢヘテロ
ダイマー（ＭＢ型アイソザイム）、Ｍ型は骨格筋に、Ｂ
型は脳、肝臓、腎臓および赤血球にそれぞれ存在する。
心筋には、ＭＢ型が、Ｍ型やＢ型とともに存在する。

【０００４】すなわち、哺乳動物にはＰＧＡＭをコード
する遺伝子が二つ存在する。Ｍサブユニット（分子量約
３万）の遺伝子は成人の骨格筋、心筋で発現され、これ
らの組織ではＭＭホモダイマー（Ｍ型ＰＧＡＭ又はＭ型
アイソザイムともいう）が存在する。Ｂサブユニット
（分子量約３万）の遺伝子は成人の脳、肝、腎および赤
血球で発現され、これらの組織ではＢＢホモダイマー
（Ｂ型ＰＧＡＭ又はＢ型アイソザイムともいう）が存在
する。従って、Ｍ型ＰＧＡＭは筋肉特異的アイソザイム
に、またＢ型ＰＧＡＭは非筋肉型あるいは脳型アイソザ
イムに分類される。ＭおよびＢの両サブユニットの遺伝
子は心筋で特異的に発現されており、この組織ではＢ型
およびＭ型ＰＧＡＭに加えてＭＢヘテロダイマー（ＭＢ
型ＰＧＡＭ又はＭＢ型アイソザイムともいう）も存在す
る。胎児および新生児骨格筋ではＭ型以外にＢ型とＭＢ
型が存在する。ＹａｔｅｓらはＰＧＡＭアイソザイムを
分別できるｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ
を使って、正常血しょう中のＰＧＡＭ活性が専らＢ型Ｐ
ＧＡＭに由来すること、一方これまでに調べられた全て
のＤｕｃｈｅｎｎｅｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏ
ｐｈｙ患者の血しょう中にはＭ型とＢ型が混在すること
を示した。正常ヒト胎児および成人の脳では、主にＢ型
ＰＧＡＭが存在するが、腫瘍脳組織ではＭ型ＰＧＡＭが
認められ、発現レベルが腫瘍の悪性度と相関することが
示されている。

【０００５】したがって、各アイソザイムを分別定量す
る方法を確立することは非常に有用であり、例えば、Ｍ
Ｂ型は心筋梗塞のよいマーカーとして期待される。

【０００６】一方、臨床検査において重要な測定法の一
つであるイムノアッセイは抗原と抗体の品質に依存して
いる。しかし、抗原がヒト由来の場合は多くの制限があ
る；原料の入手が困難である、その取扱いに種々の問題
がある、含量が低い、その結果として安定供給が難し
く、標品の純度も低い。遺伝子工学の発達により、ヒト
由来の蛋白／酵素を大量に、高純度で調製できるように
なった。従って、これまでのイムノアッセイで使われて
いるヒト由来抗原を組換え型として、上記の欠点を改良
することも可能であるし、また、新種の蛋白やアイソザ
イムに意図的に着目し、新しい臨床検査法の開発も困難
ではなくなった。

【０００７】しかし、実際には組換え型が生理活性を保
持していなかったり、発現量が十分ではない、などの理
由でヒト由来蛋白や酵素の分野での実用化は遅れてい
る。特に、酵素のように特異的な生理活性を持つ蛋白の
場合は封入体として発現される変性蛋白ではなく、高次
構造を保持した活性型組換え蛋白が必須である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記した技術背景に鑑
み、本発明は、遺伝子操作による酵素活性をもつ組換え
ヒトＭ型及びＢ型ＰＧＡＭの高発現と、そのアイソザイ
ムに対する特異的抗体の調製を行い、もって、感度及び
特異性の高い血しょう中ＰＧＡＭアイソザイムのイムノ
アッセイシステムを新たに開発する目的でなされたもの
である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、鋭意研究を行い、各方面から検討した結果、次のよ
うな遺伝子操作を行うことにより、ヒト組換え型ＰＧＡ
ＭのＭ型及びＢ型アイソザイムの効率的生産にはじめて
成功した。

【００１０】トリプトファンプロモーターをもつ発現ベ
クターに、ヒトＭ型又はＢ型ＰＧＡＭ遺伝子を挿入し、
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換して、ヒトＰＧＡ
Ｍアイソザイムの発現を行った。Ｍ型遺伝子は、ヒト胎
盤由来の染色体ＤＮＡを鋳型として、ｍＰＣＲ法で作製
した。Ｂ型遺伝子は、ラットＰＧＡＭのＢ型ｃＤＮＡか
ら部位特異的変異によって作製した。

【００１１】ヒトＰＧＡＭアイソザイムは、Ｅ．ｃｏｌ
ｉの細胞内に活性のある可溶性蛋白として発現された。
Ｅ．ｃｏｌｉの高密度培養によって得られた菌体から組
換え型酵素を精製した。精製酵素は、Ｎ末アミノ酸、熱
安定性、酸化剤に対する感受性において天然型アイソザ
イムと同一であった。

【００１２】次いで、このようにして得た精製アイソザ
イムを用いて以下の操作を行うことにより、特異的抗体
を調製するのにはじめて成功した。

【００１３】すなわち、精製アイソザイムを抗原として
調製したウサギ抗血清から、ヒト人組換え型ＰＧＡＭア
イソザイムを固定化した抗原カラムによるアフィニティ
クロマトグラフィによって、Ｍ型およびＢ型アイソザイ
ムに特異的なＩｇＧを調製するのに成功した。

【００１４】このようにして得られた抗体は、新規なも
のであり、しかも抗原であるアイソザイムとの特異的反
応性が非常に高いことも確認された。本発明は、これら
の新知見に基づいて更に研究の結果、完成されたもので
ある。以下、本発明について詳述する。

【００１５】本発明は、ＰＧＡＭアイソザイムに対する
抗体であって、Ｍ型及びＢ型アイソザイムに特異的な抗
体ＭＭＩｇＧ及びＢＢＩｇＧに関するものであり、
また更に、これらの抗体を利用する各アイソザイムのイ
ムノアッセイに関するものである。

【００１６】抗原として利用される各アイソザイムは、
ｔｒｐプロモーターを含有する発現ベクターを用い、こ
れに各アイソザイム遺伝子を挿入して各ＰＧＡＭ発現プ
ラスミドを構築し、例えば大腸菌等の微生物を形質転換
し、得られた形質転換体を培養して、発現せしめる。

【００１７】このようにして得られた各アイソザイムを
精製した後、これを抗原として常法によりウサギ等の動
物を免疫し、得られた抗血清をアフィニティクロマト処
理等によって精製して、目的とする精製された特異性の
高いポリクローナル抗体を得る。

【００１８】本発明においては、このようにして調製さ
れた抗体を利用して、アイソザイムのイムノアッセイを
行う。イムノアッセイは、免疫染色法、放射免疫測定法
（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定
法等常法が適宜利用できる。

【００１９】これらの内、固相免疫測定法も有利に利用
され、二抗体イムノアッセイ法、例えば固相化したＭＭ
ＩｇＧと検体とを反応させた後、酵素Ｅ１標識したＭ
ＭＩｇＧＦａｂ′断片又は酵素Ｅ２標識したＢＢＩ
ｇＧＦａｂ′断片と反応させ、酵素Ｅ１の反応値から
Ｍ型ＰＧＡＭ量が、そして酵素Ｅ２の反応値からＭＢ型
ＰＧＡＭ量が求められる。固相化したＢＢＩｇＧを用
いると、同様にして、ＭＢ型及びＢ型ＰＧＡＭ量が求め
られる。

【００２０】抗体の固相化は、酵素その他蛋白質を固相
に結合する常法にしたがって適宜行うことができる。例
えば、固相としてビーズ、マイクロプレート等を用い、
物理吸着や化学結合等既知の固定化技術を適宜利用すれ
ばよい。

【００２１】酵素標識抗体も、グルタルアルデヒド法や
マレイミド法等常法にしたがって調製すればよい。標識
酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウシ小腸
アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等、ＥＩＡに常用され
る酵素が広く使用される。また、基質も既知のものが適
宜使用され、例えばアルカリホスファターゼを用いる場
合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を用いると好適であ
る。以下、本発明の実施例について述べる。

【００２２】

【実施例】

（１）発現ベクターの構築基本的なクローニング方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方
法で行った。発現ベクターｐＴＲＰは、次のようにして
構築した（図１）。

【００２３】ｉ）ｐＴＺ１９ＵをＳａｌＩとＥｃｏＲＩ
で切断後、ＤＮＡを平滑末端となるようにＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼで修復し、ライゲーションにより再環化し
た。従って、得られたプラスミド、ｐＴＺ１９ｓｅはｐ
ＴＺ１９ＵがもつＳａｌＩとＥｃｏＲＩ間のクローニン
グ部位をもたない。 ii）Ｅ．ｃｏｌｉｔｒｐプロモーターに対するジーン
カセット（図２）としてセンスおよびアンチセンスを混
合し、ｐＴＺｓｅのＨｉｎｄIIとＥｃｏＲＩ部位の間に
挿入して、ｐＴＺｔｒｐを得た。 iii）ｐＴＺ１９ＵからＥｃｏＲＩとＰｓｔＩの間にク
ローニング部位をもつＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ
IIキット（ＢＩＯ１０１Ｉｎｃ．）で精製し、ｐＴ
ＺｔｒｐのＥｃｏＲＩとＰｓｔＩの間の部位に挿入し、
発現ベクターｐＴＲＰ（２９２８ｂｐ）を得た。ｐＴＲ
Ｐは外来遺伝子に対するクローニング部位としてＥｃｏ
ＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘ
ｂａＩ、ＳａｌＩそしてＰｓｔＩをもつ（図１）。

【００２４】（２）ＰＧＡＭ発現プラスミドの構築ヒトＭ型およびＢ型ＰＧＡＭの遺伝子クローニングおよ
びヌクレオチド配列は既に報告されている。ヒトＭ型Ｐ
ＧＡＭをコードするＤＮＡはヒトＭ型ＰＧＡＭ遺伝子の
３つのエキソンを、ｍＰＣＲ法によって一度に連結して
調製した。ヒトＭ型ＰＧＡＭをコードするＤＮＡを鋳型
として図３に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、
そのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断してｐＴ
ＲＰへ組み込み、Ｍ型ＰＧＡＭ発現プラスミドｐＴＲＰ
−Ｍ１および−Ｍ２を構築した。ラットＢ型ＰＧＡＭの
アミノ酸配列はＣ末端に近い２５１番目のアミノ酸（ラ
ットではバリン、ヒトではアラニン）を除いてヒトＢ型
ＰＧＡＭのアミノ酸配列と同一である。ヒトＢ型ＰＧＡ
ＭをコードするＤＮＡはラットＢ型ＰＧＡＭｃＤＮＡ
から図３に示すプライマーを用いたＰＣＲｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓによって作製した。得られたＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩとＢａｍＨＩで切断してｐＴＲＰへ組み込み、Ｂ
型ＰＧＡＭ発現プラスミドｐＴＲＰ−Ｂ１および−Ｂ２
を構築した。

【００２５】ＰＣＲは既知の方法で行った。全てのプラ
スミド構築とＰＧＡＭ遺伝子の全遺伝子配列の忠実さは
自動ＤＮＡ配列決定装置で行った。ｍＲＮＡの二次構造
計測は、ＧＥＮＥＴＹＸプログラムを用いて計算した。

【００２６】（３）Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換とその培養Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅ
ｌｌｓをコントロールプラスミドおよびＰＧＡＭアイソ
ザイム遺伝子をもつ組換えプラスミドで形質転換し、形
質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培
地中で、３７℃で２４ｈ培養した。菌体からの粗抽出液
は、界面活性剤としてｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉ
ｄの代わりにＬｕｂｒｏｌＰＸを用いた以外、Ｍａｒ
ｓｔｏｎの方法で溶菌して調製した。

【００２７】組換え型ヒトＰＧＡＭアイソザイム精製用
には、１６ＬＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃＦｅｒｍｅｎｔｏｒＳＦ−１１６（Ｅ
ｄｉｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて高密度培養を行っ
た。温度（３７℃）、ｐＨ（７．４）、攪拌速度（８０
０ｒｐｍ）、通気量（１５ｍＬ／ｍｉｎ）の培養パラメ
ータはＭＬ−４１００（ｍｕｌｔｉ−ｌｏｏｐｍｉｃ
ｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）によ
って制御した。ｐＨの調整は１０％ａｍｍｏｎｉａｓ
ｏｌｕｔｉｏｎを添加して行った。１晩前培養した培養
液（２４０ｍＬ）を２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
むＬＢ培地（８Ｌ）へ植菌して２時間培養を行い、その
後１０時間目まで添加培地を連続的に合計２Ｌ加えなが
ら培養を続けた。

【００２８】添加培地は、１０％ｇｌｕｃｏｓｅ、１５
％ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ＭｇＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ、０．７５％Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉ
ｄ、０．７５％Ｌ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、０．０４％Ｌ
−ｔｙｒｏｓｉｎｅ、０．４％ｈｉｍｉｄｉｎｅ、０．
４％ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（ｐＨ７．４）から成る。培
地の添加は１００ｍＬ／ｈの速度で開始して、２時間ご
とに２００ｍＬ／ｈ、３００ｍＬ／ｈ、４００ｍＬ／ｈ
の順で増加させて行った。集菌は１２時間目に遠心分離
（１１，０００ｇ×２０ｍｉｎ）で行った。菌体の増殖
は培養液の６００ｎｍでの吸光度を測定して調べた。

【００２９】（４）ＰＧＡＭ活性の測定法ＰＧＡＭ活性はＢｅｒｇｍｅｙｅｒらの方法を改変して
行った。反応混液（全量２．９２ｍｌ）は８．５ｍＭ
ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ｐＨ７．６）、１ｍ
ＭＭｇＳＯ₄、４．７ｍＭ３−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌ
ｙｃｅｒａｔｅ、０．１２ｍＭ２，３−ＢＰＧ、０．
２０ｍＭＮＡＤＨ、０．５７ｍＭＡＤＰ、８．５Ｕ
／ｍｌｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓ
ｅ、８．５Ｕ／ｍｌｐｙｒｕｖａｔｅｋｉｎａｓｅ
および３．４Ｕ／ｍｌｅｎｏｌａｓｅから成る。反応
は１０μｌの酵素サンプルを添加して開始し、ＮＡＤＨ
のＡ₃₄₀ｎｍの減少を測定した。酵素の１単位は３０℃
で１分間当たりに１μｍｏｌＮＡＤＨを減少させる酵素
量と定義する。ＮＡＤＨの定量は、吸光度係数６．２×
１０³ｌ／ｍｏｌｅ／ｃｍを用いて求めた。

【００３０】（５）蛋白測定と分析蛋白量は牛血清アルブミンを標準としてｂｉｃｉｎｃｈ
ｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ法で行った。ＳＤＳ−ｐｏｌｙ
ａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）による蛋白分析は１０−２０％
勾配の市販ゲル（第一化学；８４ｍｍ高×９０ｍｍ巾×
１ｍｍ厚）を用いてＬａｅｍｍｌｉの方法で行った。蛋
白はＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕ
ｅＲ−２５０（ＣＢＢＲ）で染色した。アミノ酸配列
の決定は、ＨＰＬＣＭｏｄｅｌ１２０Ａ装置付ＡＢＩ
社４７７Ａｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｒで行った。

【００３１】（６）組換え菌体から粗抽出液の調製ｐＴＲＰ−Ｍ２で形質転換されたＪＭ１０９の菌体を３
倍量の０．１５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含む５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ｐ
ＴＲＰ−Ｂ２によって形質転換されたＪＭ１０９の菌体
は、３倍量の１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。菌体を破
砕した後、１０％ＬＵＢＲＯＬＰＸを１／５０容量加
え、遠心分離（２２，０００ｇ×３０ｍｉｎ、４℃）
し、得られた上清を粗抽出液とした。菌体の破砕は、Ｄ
ＹＮＯ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍｉｌｌｔｙｐｅ
ＫＤＬ（ＷｉｌｌｙＡ．ＢａｃｈｏｆｅｎＡＧ，Ｂ
ａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行った；６００
ｍｌｇｒｉｎｄｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｓ，３０ｍｌ
／ｍｉｎｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｏｐｅｒａｔｉｏ
ｎ，ｇｒｉｎｄｉｎｇｂｅａｄｓＭＫ−ＩＧＸ０．
１−０．２ｍｍΦ。

【００３２】（７）精製方法１）Ｍ型ＰＧＡＭの精製：ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅＣＬ−６Ｂ（７００ｇｗｅｔｗｅｉｇｈｔ）は
２ＭＮａＣｌ、１ｍＭ β−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｅｔ
ｈａｎｏｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）５Ｌで洗浄後、１ｍＭ β−ｍｅｒｃａｐｔｏ
−ｅｔｈａｎｏｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化して使用した。このＤＥＡＥ−
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂを粗抽出液２Ｌに加
え、室温で２時間バッチ吸着を行い、得られた非吸着画
分を次の工程に使用した。Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅカラム（５．０×１．５ｃｍ）は１．７Ｍ硫安と
１ｍＭ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含む５
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化
して、疎水クロマトグラフィを行った。溶出は硫安の
１．７Ｍから０Ｍへの直線的濃度勾配で行った。

【００３３】２）Ｂ型ＰＧＡＭの精製：２Ｍ硫安を含む
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化されたｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅカラム（５．０×１．５ｃｍ）を用いて疎水
クロマトグラフィを行った。溶出は硫安の２．０Ｍから
０Ｍへの直線的濃度勾配で行った。分子ふるいクロマト
グラフィは１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００カラ
ム（４．５×７８．６ｃｍ）で行った。ＭＢ型ＰＧＡＭの調製Ｍ型ＰＧＡＭおよびＢ型ＰＧＡＭは適当な変性剤によっ
てモノマーに解離し、希釈等の繰作によってダイマーに
戻る（再生する）。この性質を利用することによって、
ＭＢ型ＰＧＡＭを調製することができる。即ち、変性剤
によってモノマーに解離したＭ型ＰＧＡＭとＢ型ＰＧＡ
Ｍを混合し、希釈することによってＭＢ型ＰＧＡＭが再
構成される。たとえば、次のような方法で効率よくＭＢ
型ＰＧＡＭを調製することができる。Ｍ型ＰＧＡＭ
（０．５ｍｇ／ｍｌ）とＢ型ＰＧＡＭ（０．５ｍｇ／ｍ
ｌ）を等量混合後、尿素を７Ｍになるように加え、室温
で５ｈインキュベーションした。それを０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３０倍に希釈し、
０．１Ｍ２−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃、一晩
透析を行って、ＭＢ型ＰＧＡＭを得た。

【００３４】（８）免疫学的方法ウサギ抗ＰＧＡＭアイソザイム抗血清は、Ｈａｒｌｏｗ
らの方法で調製した。ＥＩＡおよびｐＡ（ＡＢ）カラム
を用いる血清からのＩｇＧの調製は、紀平らの方法で行
った。Ａ₄₉₂ｎｍは、Ａ４ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒ
ｅａｄｅｒ（Ｔｏｓｏｈ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で
測定した。ウエスタンブロット分析は、ｐｏｌｙｖｉｎ
ｙｌｉｄｅｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜を使ってＴｏ
ｗｂｉｎらの方法で行った。二次抗体として西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いた。Ｉ
ｇＧ含量は１ｍｇ／ｍｌ溶液のＡ₂₈₀＝１．５として求
めた。

【００３５】（９）抗原固定化カラムの調製Ｆｏｒｍｙｌ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ１００ｍＬ
（約７７ｇｗｅｔｇｅｌ）に、０．１５ＭＮａＣ
ｌ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）８０ｍｌに溶解した精製組換えＭ型およびＢ型ＰＧ
ＡＭ（４８０ｍｇ）を加えた。室温で３ｈ振とう後、ｔ
ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｂｏｒａｎｅを５３９ｍ
ｇ加え、４℃で一晩振とうした。次いで０．１Ｍｈｙ
ｄｒｏｘｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｉｏｒｉｄｅを５
０ｍｌ加え、室温で２ｈ振とう後ろ過し、ゲルを２０倍
量の蒸留水で洗浄した。さらに、２０倍量のＰＢＳと
０．３ＭＫＣｌ−ＨＣｌ（ｐＨ２．３）による洗浄を
３回繰り返した。リガンド結合量は８５〜９０％であっ
た。こうして調製したＰＧＡＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎ
ｅゲルをカラム（５×５ｃｍ）につめた。ウサギ抗ＰＧ
ＡＭ抗血清から調製したＩｇＧ（約６．５ｍｇ／ｍＬ、
１００ｍＬ）をＰＢＳ（１００ｍＬ）で希釈して、Ｍ型
ＰＧＡＭ−カラムあるいはＢ型ＰＧＡＭ−カラムに添加
した。４倍量のＰＢＳで洗浄後、０．３ＭＫＣｌ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ２．３）で溶出した。溶出液に１／１０容量
の１０倍濃縮のＰＢＳを加えた後、Ｂ型ＰＧＡＭ−カラ
ムあるいはＭ型ＰＧＡＭ−カラムに添加して、同様の操
作を行った。

【００３６】（１０）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒトＰＧＡ
Ｍアイソザイムの高発現ＰＧＡＭ発現プラスミドｐＴＲＰ−Ｍ１およびｐＴＲＰ
−Ｂ１は、ｔｒｐプロモーターの下流にヒトＰＧＡＭの
ＭおよびＢサブユニットをコードするＤＮＡをそれぞれ
もつ、これらの発現プラスミドによって形質転換された
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を培養し、得られた菌体抽出液
のＰＧＡＭ活性を測定した。コントロールと比較してｐ
ＴＲＰ−Ｍ１の場合、ＰＧＡＭ活性レベルは約２倍に、
ｐＴＲＰ−Ｂ１の場合、約５倍に増加した。Ｅ．ｃｏｌ
ｉでのヒト酵素の発現量は、ｍＲＮＡの二次構造が影響
することがよく知られている。発現プラスミドから合成
されたＰＧＡＭのＭおよびＢサブユニットのｍＲＮＡ中
の５′領域の二次構造形成を予測し、これに基づいてア
ミノ酸置換がおきないようにヒトＰＧＡＭ遺伝子の５′
翻訳領域を再構築した。

【００３７】図３に示されるように、Ｐ２とＰ３を用い
てｐＴＲＰ−Ｍ２を、Ｐ５とＰ６を用いてｐＴＲＰ−Ｂ
２を調製した。これらのプラスミドｐＴＲＰ−Ｍ２およ
びｐＴＲＰ−Ｂ２を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９
を形質転換し、培養後ＰＧＡＭ活性を測定した。ｐＴＲ
Ｐ−Ｍ１およびｐＴＲＰ−Ｂ１を用いた場合と比較する
と、ＰＧＡＭの発現量が活性レベルで約１０倍増加し
た；コントロールと比較するとＭ型ＰＧＡＭで２０倍
に、Ｂ型ＰＧＡＭで５０倍に増加した。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの典型例（図４）から明らかなように、Ｍ型およびＢ
型サブユニットの分子サイズに相当する約３０，０００
の位置に濃いバンドが認められた。

【００３８】図４は、５種のプラスミドをもつＥ．ｃｏ
ｌｉ菌体抽出液中の蛋白（２０μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分析した結果であって、レーン１、ｐ−ＴＲＰ；レ
ーン２、ｐＴＲＰ−Ｍ１；レーン３、ｐＴＲＰ−Ｍ２；
レーン４、ｐＴＲＰ−Ｂ１；レーン５、ｐＴＲＰ−Ｂ
２、純度検定実験；レーン６はｐＴＲＰ−Ｍ２をもつ
Ｅ．ｃｏｌｉからの精製品（２μｇ）。レーン７はｐＴ
ＲＰ−Ｂ２をもつＥ．ｃｏｌｉからの精製品（２μ
ｇ）。レーンＭはＩｇＧ結合性分子量マーカー。矢印
は、ＰＧＡＭの分子サイズ（約３万）から予想される泳
動位置をそれぞれ示す。

【００３９】（１１）組換え型ヒトＰＧＡＭアイソザイ
ムの精製組換えヒトＢ型ＰＧＡＭは、Ｓａｓａｋｉらの方法を改
変し、硫安分画、ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに
よる疎水クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ
により、均一に精製した（下記表１）；４０％の収率で
比活性は１４８７Ｕ／ｍｇであった。生産量は菌体１ｋ
ｇ（湿重量）当たり酵素蛋白１．４ｇであった。組換え
ヒトＭ型ＰＧＡＭは粗抽出液をｉ）７０℃で１５分間処
理により熱安定なＭ型を上清に分画し、ii）ＤＥＡＥ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｐＨ７．０）によるバッチ吸着処
理でｐＩ１０のＭ型を非吸着分画に回収し、iii）３０
％硫安分画の上清に分画し、次いでiv）Ｅｄｗａｒｄｓ
らの方法に従ってｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラムで疎水クロマトグラフィを行い１６倍に精製した；
比活性２１８２Ｕ／ｍｇの精製品を４０％収率で得た。
生産量は菌体１ｋｇ（湿重量）当たり酵素蛋白２．２ｇ
であった。精製Ｍ型およびＢ型ＰＧＡＭはいずれもＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分子サイズ約３０，０００の位置に単一
バンドを示した（図４）。

【００４０】

【表１】

【００４１】上記結果から明らかなように、高発現によ
り酵素含量を高めることができたので、従来報告された
ものよりもＭ型ＰＧＡＭは約１０倍高い比活性を持ち、
Ｂ型ＰＧＡＭは約２倍高い比活性を持つことがわかっ
た。Ｅ．ｃｏｌｉ由来の内在性ＰＧＡＭは、Ｍ型ＰＧＡ
Ｍとは熱安定性の差で組換えＰＧＡＭと区別することが
できる。また粗抽出液中の内在性ＰＧＡＭの比活性は２
Ｕ／ｍｇ以下と極めて低い。従って、内在性ＰＧＡＭの
精製組換え標品への混在は無視することができると思わ
れる。

【００４２】（１２）精製ヒト組換え型ＰＧＡＭアイソ
ザイムの性質１）分子量（サイズ）：塩基配列から求められた分子量
はＢ型サブユニットが２８，７８４、Ｍ型サブユニット
が２８，８３０である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは両者とも
約３０，０００である（Ｆｉｇ．２）。変性剤の存在し
ない条件下のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムによるゲル
ろ過クロマトグラフィでは天然型の報告と同様に約６
０，０００と測定された。従って、組換え型アイソザイ
ムは天然型と同様二量体で存在する。

【００４３】２）Ｎ−末端分析：組換え型ＰＧＡＭはＭ
型もＢ型ともにＮ−末はアラニンである。天然型ＰＧＡ
ＭはＮ−アセチル化アラニンである。従って、Ｎ−アセ
チル化は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で起こらず、活性発現には必
要ないと思われる。

【００４４】３）熱安定性：精製したＭ型及びＢ型標品
（１．５ｍｇ／ｍｌ）を、２，３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈ
ｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ（２，３−ＢＰＧ）の存在（＋）
及び不存在（−）下、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッ
ファー（ｐＨ７．０）中で、２０分間各温度（６０、７
０、７５℃）でインキュベートし、残存活性を測定し、
下記表２の結果を得た。

【００４５】

【表２】

【００４６】上記表２（ヒト組換え型ＰＧＡＭのＭ型及
びＢ型アイソザイムの熱安定性）の結果から明らかなよ
うに、２，３−ＢＰＧの存在下、６０℃の熱処理に対し
てＭ型もＢ型ＰＧＡＭも安定であるが、７０℃および７
５℃ではＭ型の方が熱に対して安定であった。Ｍ型ＰＧ
ＡＭの熱安定性は、２，３−ＢＰＧ非存在下でも認めら
れた。これらの結果は、天然型の酵素を用いて行われた
実験結果とよく一致した。

【００４７】４）ＳＨ酸化剤による失活：精製アイソザ
イム（１５ｍｇ／ｍｌ）を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）で、１ｍＭＫ₂Ｓ₄Ｏ₆と２０℃で
反応させると、Ｍ型ＰＧＡＭアイソザイムは残存活性が
０．１％と不安定であるのに対して、Ｂ型は１００％で
酸化処理に対して安定であった。失活したＭ型ＰＧＡＭ
はＤＴＴ処理によりほぼ８０％元のレベルに回復した。
Ｂ型ＰＧＡＭはこれらの処理に対して全く影響を受けな
かった。以上の結果は天然型酵素のものとよく一致し
た。

【００４８】以上のことから、組換えＰＧＡＭアイソザ
イムはＮ−末アミノ酸がアセチル化されていない点を除
いて天然型と同一であることが明らかとなった。

【００４９】（１３）アイソザイム特異的ポリクローナ
ル抗体の調製組換え型ＰＧＡＭアイソザイムを５０ｍｇ調製し、これ
を用いてウサギポリクローナル抗体と、特異抗体の調製
のための抗原固定化カラムを作製した。

【００５０】１）ＩｇＧの調製：ウサギ抗血清６００ｍ
ｌからＩｇＧ結合性人工蛋白質、ｐＡ（ＡＢ）₄−カラ
ム〔１８〕を用いてＭ型ＰＧＡＭのＩｇＧを約７．１
ｇ、Ｂ型ＰＧＡＭのＩｇＧを約８．６ｇ調製した。

【００５１】２）特異ＩｇＧの調製：Ｍ型ＰＧＡＭに対
するＩｇＧをまずＭ型ＰＧＡＭ固定化カラムに添加し、
得られた溶出画分（ｅｌｕａｔｅ）を、次にＢ型ＰＧＡ
Ｍ固定化カラムにかけ、非吸着画分と吸着画分を得た。
非吸着画分はＭ型ＰＧＡＭに対して高い親和性を示し、
Ｂ型ＰＧＡＭに対しては親和性が低いので、Ｍ型特異的
ＩｇＧである（ＭＭＩｇＧと称す）。一方、吸着画分
はＭ型にもＢ型にも反応するＩｇＧである（ＭＭ／ＢＢ
ＩｇＧと称す）；７．１ｇのＩｇＧから３８０ｍｇの
ＭＭＩｇＧと４８０ｍｇのＭＭ／ＢＢＩｇＧが得ら
れた。同様にして、Ｂ型ＰＧＡＭに対して高い特異性を
もつＢＢＩｇＧと同ＰＧＡＭアイソザイムと反応する
ＭＭ／ＢＢＩｇＧを調製した；８．６ｇのＩｇＧから
１．０１ｇのＢＢＩｇＧと４４０ｍｇのＭＭ／ＢＢ
ＩｇＧが得られた。得られたＭＭＩｇＧ、ＢＢＩｇ
Ｇ、ＭＭ／ＢＢＩｇＧの特異性をＥＩＡとウエスタン
ブロッティングで調べた。

【００５２】すなわち、精製されたヒトＭ型ＰＧＡＭ、
Ｂ型ＰＧＡＭを０．２５μｇずつ固相化し、０．０５μ
ｇのＩｇＧ試料と反応させた。ウサギ抗Ｍ型ＰＧＡＭ抗
血清から調製したＩｇＧ（６４２ｍｇ）を用いて固定化
Ｍ型ＰＧＡＭカラム（ＭＭカラム；１００ｍｌ）に添加
し、吸着されたＩｇＧを溶出した（吸着フラクション；
８２ｍｇ）。これを次に固定化Ｂ型ＰＧＡＭカラム（Ｂ
Ｂカラム；１００ｍｌ）に添加し、吸着されないＩｇＧ
（非吸着フラクション）と、吸着されたＩｇＧ（吸着フ
ラクション）を調製した。得られたＩｇＧの反応性を組
換えＢ型ＰＧＡＭとＭ型ＰＧＡＭについて調べた。同上
の実験をウサギ抗Ｂ型ＰＧＡＭ抗血清から調製したＩｇ
Ｇを用いて行った。

【００５３】得られた結果を、下記表３（組換え抗原固
定化カラムで調製した特異的ＩｇＧのＥＩＡでの反応
性）及び図５（ウエスタンブロット後の免疫染色法によ
る組換えヒトＰＧＡＭアイソザイムＩｇＧの特異性の検
定）に示した。図５において、Ｍは分子量マーカー、レ
ーン１，３，５，７にはＭ型ＰＧＡＭを、レーン２，
４，６，８にはＢ型ＰＧＡＭを加えた。色素染色（レー
ン１，２）には１μｇ蛋白を免疫染色（レーン３〜８）
には０．１μｇを使用した。レーン３と４はＭ型ＰＧＡ
ＭとＢ型ＰＧＡＭに反応するＩｇＧ（ＭＭ／ＢＢＩｇ
Ｇ）で、レーン５と６はＭ型ＰＧＡＭに特異的なＩｇＧ
（ＭＭＩｇＧ）、レーン７と８はＢ型ＰＧＡＭに特異
的なＩｇＧ（ＢＢＩｇＧ）で免疫染色した。

【００５４】

【表３】

【００５５】上記表３の結果及び図５に示されるよう
に、ＭＭＩｇＧはＭ型ＰＧＡＭに、ＭＭＩｇＧはＢ
型ＰＧＡＭに対して特異性の高い反応性を示した。これ
らの結果からＭＭＩｇＧはＭ型に、ＢＢＩｇＧはＢ
型に特異的なＩｇＧで、ＭＭ／ＢＢＩｇＧはＭ型、Ｂ
型いずれにも反応を示すことが明らかとなった。

【００５６】ヒトＢ型ＰＧＡＭに対するｃｈｉｃｋｅｎ
ａｎｔｉｓｕｒｕｍについての報告を除いて、ヒトＰ
ＧＡＭに対する特異的抗体に関する報告はない。本発明
では、ヒトＰＧＡＭのＭ、Ｂ両アイソザイム間における
アミノ酸配列の相同性が８０．６％であるにもかかわら
ず、ＰＧＡＭ反応性ＩｇＧの内の４０〜７０％がＭ型Ｐ
ＧＡＭおよびＢ型ＰＧＡＭに対して特異的なポリクロー
ナルＩｇＧ（ＭＭＩｇＧおよびＢＢＩｇＧ）である
ことが示された。

【００５７】（１４）二抗体ＥＩＡによるＰＧＡＭアイ
ソザイムの分別定量図６に示したアッセイ原理図にしたがい各アイソザイム
の分別定量を行った。

【００５８】（ｉ）固相化したＭＭＩｇＧとＰＧＡＭ
アイソザイム試料と反応させた後、酵素Ｅ１で標識した
ＭＭＩｇＧＦａｂ′断片または酵素Ｅ２で標識した
ＢＢＩｇＧＦａｂ′断片と反応させる。酵素Ｅ１の反
応値からＢ型ＰＧＡＭがＥ２からはＭＢ型ＰＧＡＭ量が
求められる。ii）同様に、固相化したＢＢＩｇＧと抗
原を反応させた後、酵素Ｅ１で標識したＭＭＩｇＧ
Ｆａｂ′断片または酵素Ｅ２で標識したＢＢＩｇＧ
Ｆａｂ′断片と反応させる。酵素Ｅ１の反応値からＭＢ
型ＰＧＡＭ量が、Ｅ２からＢ型ＰＧＡＭ量が求められ
る。

【００５９】酵素Ｅ１としては、ウシ小腸アルカリホス
ファターゼを用い、酵素Ｅ２としては、西洋ワサビペル
オキシダーゼを用い定量を行った。その結果、Ｍ型、Ｂ
型及びＭＢ型ＰＧＡＭ量が、それぞれ９４％、９１％、
９３％の確度で測定された。

【００６０】酵素標識抗体の作製ＭＭＩｇＧおよびＢＢＩｇＧからペプシン消化によって
Ｆ(ａｂ)₂をそれぞれ作製し、還元によってＦａｂ′断
片を得る。さらに、マレイミド化した酵素を結合させる
ことによって、酵素標識したＭＭＩｇＧＦａｂ′断片お
よびＢＢＩｇＧＦａｂ′断片を常法によって作製するこ
とができる。

【００６１】１）Ｆ(ａｂ′)₂断片の作製酢酸緩衝液（０．１Ｍ酢酸、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ
４．５）に溶解したＭＭＩｇＧおよびＢＢＩｇＧ（各１
０ｍｇ／ｍｌ）に対して、１％（ｗ／ｗ）および２％
（ｗ／ｗ）になるようにそれぞれペプシン溶液（ブタ胃
由来、ＳＩＧＭＡ）を加え、３７℃、２４ｈ反応させ
た。反応液を０．１ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＳｕｐｅｒ
ｄｅｘ２００カラム（２．６×６０ｃｍ）にかけて分子
ふるいクロマトグラフィを行い、Ｆ(ａｂ′)₂断片を分
画した。さらに、Ｆ(ａｂ′)₂に混在するＩｇＧおよび
ＦｃをｐＡ（ＡＢ）₄ゲルに吸着させて除去した。非吸
着画分をＰＥ緩衝液（０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄、５ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ６．０）に対して透析を行い、
Ｆ(ａｂ′)₂断片を得た。ＭＭＩｇＧおよびＢＢＩｇＧ
それぞれ２５ｍｇからＦ(ａｂ′)₂断片が８．３ｍｇお
よび１６．５ｍｇ得られた。

【００６２】２）Ｆａｂ′断片の作製Ｆ(ａｂ′)₂断片（約４ｍｇ／ｍｌ）に２−メルカプト
エチルアミン塩酸を１０ｍＭになるように加え、３７
℃、９０ｍｉｎ撹拌した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００か
ラム（２．６×６０ｃｍ）にかけて分子ふるいクロマト
グラフィを行い、Ｆａｂ′断片を分画した。その結果、
ＭＭＩｇＧおよびＢＢＩｇＧそれぞれ２５ｍｇからＦａ
ｂ′断片が７．０ｍｇおよび１３．９ｍｇ得られた。

【００６３】３）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のマレイミド化ＰＢＳ緩衝液（８ｇ／ｌＮａＣｌ，０．２ｇ／ｌＫ
Ｃｌ，２．９ｇ／ｌＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ，０．２
ｇ／ｌＫＨ₂ＰＯ₄，ｐＨ７．４）に溶解されたＡＬＰ
（ウシ小腸由来、オリエンタル酵母）１ｍｏｌに対して
Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉ
ｄｙｌ４−（ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）
ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔ
ｅ，ＰＩＥＲＣＥ）を１００ｍｏｌ加え３７℃、１ｈ振
とうした。ＰＢＳ緩衝液で平衡化されたＳｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５カラム（１．５×６０ｃｍ）に反応液をか
け、マレイミド化ＡＬＰを得た。

【００６４】４）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）のマレイミド化０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
されたＨＲＰ（ｔｙｐｅII，ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、
３）と同様にしてマレイミド化ＨＲＰを得た。

【００６５】５）ＡＬＰ標識ＭＭＩｇＧＦａｂ′断片の作製ＭＭＩｇＧＦａｂ′断片５ｍｏｌに対してマレイミド化
ＡＬＰを１ｍｏｌ加え、４℃、２０ｈ静置反応した。２
−メルカプトエチルアミン塩酸を１０ｍＭになるように
加え、３０℃、３０ｍｉｎ撹拌して反応を停止させた
後、ＡＬＰ溶解液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．
２ＭＮａＣｌ，５ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１ｍＭＺ
ｎＣｌ₂）で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００にか
け、ＡＬＰ標識Ｆａｂ′断片を分画した。その結果、Ａ
ＬＰ標識ＭＭＩｇＧＦａｂ′断片が４．６ｍｇ調製され
た。

【００６６】６）ＨＲＰ標識ＢＢＩｇＧＦａｂ′の作製ＢＢＩｇＧＦａｂ′断片５ｍｏｌに対してマレイミド化
ＡＬＰを１ｍｏｌ加え、５）と同様にして反応させ、
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡
化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００にかけ、ＨＲＰ標識Ｆ
ａｂ′断片を分画した。その結果、ＨＲＰ標識ＢＢＩｇ
ＧＦａｂ′断片が１４．９ｍｇ調製された。

【００６７】二抗体ＥＩＡによるＰＧＡＭアイソザイムの分別定量図６の原理に基づいてＰＧＡＭアイソザイムの分別定量
を行った。

【００６８】１）方法５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液に溶解したＭＭＩｇＧあ
るいはＢＢＩｇＧ（各０．５ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ
ずつ９６ウエルマイクロタイタープレートに入れ、４
℃、一晩インキュベーション後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢ
Ｓ）による洗浄４回、０．５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに溶
解したＢＳＡによるブロッキング（室温、１ｈ）、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎによる洗浄４回を行い、ＭＭＩｇＧある
いはＢＢＩｇＧ固相化プレートを作製した。次に、血清
試料あるいは標準試料（既知量のＰＧＡＭアイソザイ
ム）を１００μｌ加え、室温、１ｈインキュベーション
後洗浄操作を行った。さらに、ＡＬＰ標識ＭＭＩｇＧＦ
ａｂ′断片あるいはＨＲＰ標識ＢＢＩｇＧＦａｂ′断片
（各５μｇ／ｍｌ）を１００μｌ加え、さらにＡＬＰ標
識ＭＭＩｇＧＦａｂ′断片あるいはＨＲＰ標識ＢＢＩｇ
ＧＦａｂ′断片（各５μｇ／ｍｌ）を１００μｌ加え、
室温、２ｈインキュベーシヨン後洗浄操作を行った。最
後に、発色試薬（ＡＬＰの場合は０．２５ｍＭＭｇＣ
ｌ₂を含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．
８）に溶解した１ｍＭｐ−ニトロフェニルリン酸溶
液、ＨＲＰの場合は０．０１５％（ｖ／ｖ）過酸化水素
を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し
た８ｍＭｏ−フェニレンジアミン溶液）を２００μｌ
加え、５ｍｉｎインキュベーシヨョン後、Ａ₄₀₅あるい
はＡ₄₉₂の吸光度を測定した。

【００６９】２）標準試料による検量線の作成Ｍ型ＰＧＡＭの検量線は、ＭＭＩｇＧを固相化したプレ
ートに標準試料（既知量のＭ型、Ｂ型およびＭＢ型ＰＧ
ＡＭからなる試料）を加えた後、ＡＬＰ標識ＭＭＩｇＧ
Ｆａｂ′断片を反応させて作成した（図７）。Ｂ型ＰＧ
ＡＭの検量線はＢＢＩｇＧを固相化したプレートに標準
試料を加えた後、ＨＲＰ標識ＢＢＩｇＧＦａｂ′断片を
反応させて作成した（図８）。ＭＢ型ＰＧＡＭの検量線
は、ＢＢＩｇＧを固相化したプレートに標準試料を加え
た後、ＡＬＰ標識ＭＭＩｇＧＦａｂ′断片を反応させて
作成した（図９）。また、ＭＢ型ＰＧＡＭの検量線は、
ＭＭＩｇＧを固相化したプレートに標準試料を加えた
後、ＨＲＰ標識ＢＢＩｇＧＦａｂ′断片を反応させて作
成することもできる。

【００７０】３）血清試料によるヒトＰＧＡＭアイソザ
イムの分別定量正常血清および急性心筋梗塞患者血清についてアイソザ
イムの分別定量を行って結果、血清試料においても標準
試料と同様に測定することができることがわかった。ま
た、急性心筋梗塞症におけるＭＢ型ＰＧＡＭの経時変化
はクレアチンキナーゼ（心筋梗塞のマーカー酵素、Ｃ
Ｋ）の推移とほぼ同じであった（図１０）。

【００７１】

【発明の効果】本発明にしたがって、遺伝子操作を活用
することにより、ヒト組換え型ＰＧＡＭのＭ型及びＢ型
アイソザイムを高純度でしかも効率的に生産することが
可能となり、その結果、これらに対する特異的抗体を調
製することがはじめて可能となった。

【００７２】該新規抗体は、これらのアイソザイムに対
する特異性が非常に高いので、ＥＩＡ等イムノアッセイ
による各アイソザイムの分別定量に利用することがで
き、例えば、二抗体イムノアッセイ法によってＭＢ型Ｐ
ＧＡＭを定量することにより、各種疾患、特に心筋疾患
の診断を行うことも可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターｐＴＲＰ構築の戦略図であって、
ＥはＥｃｏＲＩ、ＨはＨｉｎｄIII、ＳはＳａｌＩ、Ｐ
はＰｓｔＩを示す。

【図２】トリプトファンプロモーター用のジーンカセ
ットを示す。

【図３】本発明で使用したプライマーのヌクレオチド及
びアミノ酸配列を示す。なお、下線のヌクレオチドは制
限酵素部位用のリンカーを示す。Ｐ３とＰ６の下線引き
ヌクレオチドがそれぞれＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ用のリン
カーで、これ以外のものはＥｃｏＲＩ用のリンカーであ
る。プライマー中の置換したヌクレオチドはアステリス
クで示した。アミノ酸配列中のＴｅｒは終止コドンを意
味する。ＰｒｉｍｅｒＰ６中の印はラットＢ型ＰＧＡ
ＭのｃＤＮＡを鋳型としてヒトＢ型ＰＧＡＭをコードす
るＤＮＡを調製するための変異を示す。

【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた４種のプラスミドを
もつＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９におけるヒトＰＧＡＭア
イソザイムの発現ならびに精製標品の純度検定を示す。

【図５】ウエスタンブロット後の免疫染色法による組換
えヒトＰＧＡＭアイソザイムＩｇＧの特異性の検定図を
示す。

【図６】二抗体ＥＩＡによるＰＧＡＭアソソザイムの分
別定量図を示す。

【図７】Ｍ型ＰＧＡＭの検量線を示す。

【図８】Ｂ型ＰＧＡＭの検量線を示す。

【図９】ＭＢ型ＰＧＡＭの検量線を示す。

【図１０】急性心筋梗塞症におけるＣＫとＰＧＡＭアイ
ソザイムの経時変化を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/573 Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡ
Ｍ）アイソザイムに対する抗体であって、Ｍ型アイソザ
イムに特異的な抗体ＭＭＩｇＧ及び／又はＢ型アイソ
ザイムに特異的な抗体ＢＢＩｇＧ。
【請求項２】抗体ＭＭＩｇＧ又は抗体ＢＢＩｇＧ
が、それぞれ、ヒト組換え型ＰＧＡＭのＭ型アイソザイ
ム又はＢ型アイソザイムを抗原として調製した動物抗血
清から分離精製したもの、であることを特徴とする請求
項１に記載の抗体。
【請求項３】ヒト組換え型ＰＧＡＭのＭ型アイソザイ
ム又はＢ型アイソザイムが、トリプトファンプロモータ
ーをもつ発現ベクターに、ヒトＭ型又はＢ型ＰＧＡＭ遺
伝子を挿入し、微生物を形質転換して発現させて得られ
たもの、であることを特徴とする請求項２に記載の抗
体。
【請求項４】Ｍ型遺伝子は、ヒト胎盤由来の染色体Ｄ
ＮＡを鋳型としてｍＰＣＲ法で作製したものであり、Ｂ
型遺伝子は、ラットＰＧＡＭのＢ型ｃＤＮＡから部位特
異的変異によって作製したものであること、を特徴とす
る請求項３に記載の抗体。
【請求項５】ＰＧＡＭアイソザイム発現プラスミド
が、発現ベクターとしてｐＴＲＰを用い、Ｍ型アイソザ
イムの場合はこれにＭ型遺伝子を挿入して得たＭ型ＰＧ
ＡＭ発現プラスミドｐＴＲＰ−Ｍ１及び／又はＭ２であ
り、Ｂ型アイソザイムの場合はこれにＢ型遺伝子を挿入
して得たＢ型ＰＧＡＭ発現プラスミドｐＴＲＰ−Ｂ１及
び／又はＢ２であること、を特徴とする請求項３又は請
求項４に記載の抗体。
【請求項６】請求項１〜請求項５のいずれか１項に記
載の抗体を使用することを特徴とするＰＧＡＭアイソザ
イムの分別測定方法。
【請求項７】免疫測定法によることを特徴とする請求
項６に記載の方法。
【請求項８】免疫測定法が、免疫染色法、放射免疫測
定法、酵素免疫測定法、及び／又は、蛍光免疫測定法で
あること、を特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】請求項１〜請求項５のいずれか１項に記
載の抗体を含有すること、を特徴とするＰＧＡＭアイソ
ザイム測定用キット。