JPH02265498A - ｒｅｇタンパク質を認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌｌ上立五月公里 本発明はｒｅｇタンパク質を認識するモノクローナル抗
体、該抗体を産生ずるハイプリドーマおよびｒｅｇタン
パク質の測定法に関する。

狐３ヱリＬ末 膵臓を部分切除したラットに、ニコチンアミドを投与す
ると、約−ケガ後に膵臓う成鳥の再生と共にｒｅｇ遺伝
子の発現が著明に認められ、また床中グルコースレベル
の低下が認められる。（Ｋ。

Ｔｅｒａｚｏｎｏ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、　　２６３１＝　５．　２１１１−２１
１４（１９８ｇ＞）　、　　ｒ　ｅ　ｇ遺伝子はまた金
チオグルコース処理によ吟過形成となったう成鳥に於い
ても発現が認められる。したがって、ｒｅｇ遺伝子およ
びこれがコードするタンパク質（ｒｅｇタンパク質）は
う氏島β細胞の増殖ないしは機能発現に重要な役割を果
たしていることが考えられる。

さらにヒト膵臓由来のｃＤＮＡライブラリー中にｒｅｇ
遺伝子と相同な配列が存在することが明らかにされてお
り、ヒト膵臓う成鳥においてもラット膵臓う成鳥におい
て考えられているのと同様な役割をｒｅｇ遺伝子並びに
ｒｅｇタンパク質が果たしていることが予測される。

明が　　しようとする課 従って、ｒｅｇタンパク質を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体あるいはこれと特異的に結合する試薬は、該
タンパク質の検出、同定、測定、精製ならびにその生物
学的作用の解明に極めて有用な手段を提供する。さらに
該タンパク質発現異常が関与する疾病の診断及び治療の
ための有用な手段となることが期待される。

するための　段 本発明は、かかる知見に基づいて遺伝子組換ｒｅｇタン
パク質を免疫原として作成したモノクローナル抗体に関
するものである。

免疫原としてのｒｅｇタンパク質は、天然のｒｅｇタン
パク質を抽出・精製して用いても良いが、上記の通り既
にｒｅｇ遺伝子が得られているので、これを微生物内で
発現させて得た遺伝子組換ｒｅｇタンパク質を用いるの
が簡便で好ましい、遺伝子工学によるｒｅｇタンパク質
の製造方法については、特願昭６３−７１６７１および
特願昭６３−１９５７２７に詳述諮れているが、これら
に限定される。ものではなく、実施例１に示すような、
他のタンパク質、例えばヒトＩ　ＦＮ７との融合タンパ
ク質とした、ｒｅｇタンパク質を含む融合タンパク質を
用いてもよく、これらを免疫原として、目的のｒｅｇタ
ンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生ずるハイ
プリドーマを調製する。

免疫原は、フロイントの完全アジュバント等の適当なア
ジュバントに乳濁し、マウスの免疫に用いる。

免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔内、皮
下または静脈内に数回繰り返し接種することにより行な
う、最終免疫後２日ないし７日後に肺臓を取り出し、抗
体産生細胞として使用する。この時、同時に抗体産生細
胞と融合させてハイブリドーマを得るための親細胞とし
て、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ−）あるいはチミジンキ
ナーゼ欠損（ＴＫ−）の様な適切なマーカーを持ツミエ
ローマ細胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融合さ
せてハイプリドーマを作製する。

ハイブリドーマ作製における培地として、イーグルＭＥ
Ｍ、ダルベツフ変法培地、ＲＰＭＩ−１６４０などの通
常よく使用されているものに、適宜的１０％の牛胎児血
清（ＦＣ５ｓ　ｆａｔａｌ　ｃａｌｆｓａｒｕａ＋　）
などを加えて用いる。

まず、親細胞であるミエローマと肺細胞を用意する。融
合剤としては約５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）を用いるのが融合率が高いとされている。融合株はＨ
ＡＴ選択法により選択する。生じるハイプリドーマのス
クリーニングは培養上清を用い、膜螢光抗体法、ＥＬＩ
ＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓ
ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）、免疫組織染色法、ＥＩＡ
法など既知の方法により行ない、目的の免疫グロブリン
を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択する。

ハイブリドーマの単一性を吟味するため、要すればマイ
クロウェルにフィーダーレイヤー（ｆａａｄｅｒ　１ａ
ｙｅｒ　）として正常な肺細胞を蒔いた上に、ハイプリ
ドーマを１穴に１個より多くならないように蒔き、生育
してくるクローンについて再びスクリーニングを行なう
、このサブクローニングを繰り返すことにより、単一性
のハイブリドーマを得る。

次に、本発明のモノクローナル抗体を製造するために、
上記で得られたハイプリドーマを培養容器中（ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ　）または動物体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）で培
養する。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系で培養する場合、培地は
先に述べた通常培地にＦｅ２を添加したものでよく、こ
の培地で３から５日培養の後、培養上清からモノクロー
ナル抗体を得る。　ｉｎ　ｖｉｖｏ系の培養では、ハイ
ブリドーマを哺乳動物の腹腔に接種し、約１週間後に腹
水を採取し、これよりモノクローナル抗体を得る。

こうして得られた培養上清または腹水からのモノクロー
ナル抗体の精製は、硫安分画、ゲル濾過等の既知の方法
を適宜組み合わせて行なうことができる。

本発明で得られたモノクローナル抗体ＲＥＧ　５、ＲＥ
Ｇ　１７およびＲＥＧ　３０は、ヒトＩＦＮ７とラット
ｒｅｇタンパク質との融合タンパク質を免疫原として得
られたものであるが、実施例に示すとおり、ヒトｒｅｇ
成熟タンパク質およびラットｒｅｇ成熟タンパク質とも
反応性を有する。また、本発明で得られたモノクローナ
ル抗体ＨＲＥＧ　ＮｌおよびＨＲＥＧ　９は、酵母中に
より発現きれたヒトｒｅｇ成熟タンパク質を免疫原とし
て得られたものであり、ヒトｒｅｇ成熟タンパク質と反
応性を有する。ヒトｒｅｇタンパク質とラットｒｅｇタ
ンパク質との高い相同性を考慮すれば、ｒｅｇタンパク
質は哺乳類全般に存在すると考えられ、本発明のモノク
ローナル抗体は哺乳類全般のｒｅｇタンパク質を認識し
うると推定される。即ち、本発明は哺乳類全般のｒｅｇ
タンパク質を認識しうるモノクローナル抗体を提供する
ものである。

なお、本発明のモノクローナル抗体ＲＥＧ　５、ＲＥＧ
　１７およびＲＥＧ　３０を産生するハイプリドーマＲ
ＥＧ　５、ＲＥＧ　１７およびＲＥＧ　３０は、それぞ
れ、１９８８年１１月８日から茨城系つくば南東１丁目
１番３号の工業技術院微生物工業技術研究所に、１（ｙ
ｂｒｉｄｏｍａ　ＲＥＧ　５、ＲＥＧ　１７およびＲＥ
Ｇ　３Ｇ、微工研条寄第２１３４号、第２１３５号およ
び第２１３６号（ＦＥＲＭＢＰ　−２１３４，２１３５
および２１３６）として、ブダペスト条約に基づいて寄
託されている。また、本発明のモノクローナル抗体ＨＲ
ＥＧ　９およびＨＲＥＧ　Ｎｌを産生するハイプリドー
マＨＲＥＧ　９およびＨＲＥＧ　Ｎｌはそれぞれ１９８
９年９月から上記工業技術院微生物工業技術研究所にＭ
ｏｕｓｅ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＨＲＥＧ　９およびＨ
ＲＥＧ　Ｎｌ、微工研条寄第２５９１号および第２５９
２号（ＦＥＲＭ　ＢＰ　−２５９１および２５９２　’
）として、ブダペスト条約に基づいて寄託されている。

（以下余白） 本発明のモノクローナル抗体を用いるｒｅｇタンパク質
の免疫学的測定法としては、１種の抗体を用いるＲＩＡ
およびＥＩＡ、２種の抗体を用いるＲＩＡも当然可能で
あるが、サンドイッチＥ！Ａが好ましい。

抗体を固定化する同相としては、通常の免疫測定法に使
用される市販の抗原抗体反応層担体、例えば、ガラスま
たは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボ
ール）、チューブ、プレートなどを用いることができる
。これらの担体に、ｒｅｇタンパク質を認識する抗体を
吸着せしめる。吸１は、通常、重炭酸ソーダやリン酸バ
ッファー中、ｐＨ６〜１０付近で、４℃、１夜または３
７℃、１時間などの条件で放置することにより行なう、
抗体を吸着した担体は、要すればアジ化ナトリウムなど
の防腐剤の存在下、冷所に保存する。

本発明の抗体は、精製後そのまま使用することもできる
が、そのＦ（ａｂ’）、断片やＦａｂ　’断片として使
用することも可能である。抗体を含む腹水または培養上
清は硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムによる分画
、カラムクロマトグラフィ、ゲル濾過などにより精製す
る。得られたＩｇＧはペプシンで消化してＦ（ａｂ’）
ｍ断片とし、更にこれを２−メルカプトエチルアミンで
還元すれば、Ｆａｂ　’が得られる。　ＩｇＧからＦａ
ｂ　’の調製については、ジャーナル・才プ・イムノア
ッセイ［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　］、土、２０
９〜３２７（１９８３）に詳細な説明があり、本発明に
おいても、同様の手法を利用することができる。

抗体の標識酵素としては、アルカリ性ホスファターゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼなどが利用可能であるが、本発明にお
いては、特に西洋わさびペルオキシダーゼが好ましく用
いられる。

抗体と酵素の結合は、ペルオキシダーゼの場合、実施例
に示すとおり、酵素の糖鎖の水酸基を酸化してアルデヒ
ドとした後、抗体のアミノ基と結合させることができる
。

また、抗体の標識に架橋剤を用いる場合には、Ｎ、Ｎ’
−ｏ−フェニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステ
ル、６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエ
ステル、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ
−スクシンイミドエステル、４．４’−ジチオジピリジ
ン、そのイ也公知の架橋剤が利用可能である。これらの
架橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤
の性質に応じて、既知の方法に従って行なえばよい。

上記酵素標識抗体はアフィニティ・クロマトグラフィー
などにより精製すれば、更に感度の高い免疫測定系が可
能となる。精製した酵素標識抗体は、安定剤としてチメ
ロサールまたはグリセリンを加えて、あるいは凍結乾燥
して冷暗所に保存する。

ｒｅｇタンパク質の測定法としては、ｒｅｇタンパク質
を認識する抗体を２種類用い、用いた抗体の一方だけを
特異的に認識する抗体を、きらに反応させて測定するこ
とができる０例えば、一方にＩｇＧ　（ＲＥＧ　５）、
他方にＩｇＨ　（ＲＥＧ　１７）を用いてサンドイッチ
すれば、ＩｇＧまたはＩｇＨを特異的に認識する第３の
抗体をさらに反応妨せてｒｅｇタンパク質を測定できる
。この第３の抗体は標識きれていてもよく、また、標識
されていない場合には、第３の抗体に識別可能な酵素な
どを特異的に結合させればよい。

また、２種類の抗体のうち、一方を酵素などで標識して
サンドイッチアッセイを行い、ｒｅｇタンパク質を測定
することができる。他方の抗体は、通常よく用いられる
固相に固定化しておくとよい。

以下、実施例により本発明の詳細な説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。

ヒトインターフェロン７ＷＡ合成熟ラットｒｅｇの発現 ・発現ベクターの構築 用いられた全ての酵素は宝酒造から購入した。

発現に用いられた大腸菌は、Ｃ６００（Ｆ−１ｔｈｉ−
１、ｔｈｒ−１，１ａｕＢ６．１ａｃＹ１、ｔｏｎＡ２
１．５ｕｐＥ４４、λ−）である０組換ＤＮＡ法はすべ
てＭｏ１ａｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　（１９８２）に記載の方法に従った。ＤＮＡ
断片は、アガロースゲルからの溶出　（Ｎｕｃｌ、　　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　旦、　　２５３〜２６４゜（１
９８０）　）により単離した。

第４＠に示すとおり、ヒトインターフェロン７融合ＰＳ
ＴＩ発現プラスミド（τｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕ−ＩＦＮ７
ｆｕｓｅｄ　ＰＳＴＩ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１
０２．６０７．　（１９８７）　）を、５ａｌＩ　（４
０ｕ／μｇ　ＤＮＡ）　テ３７℃、１時間消化し、続イ
テ、ＢＡＰ（０，１ｕ／ｐｍｏｌ）テ３７℃、２時間処
理した。大きい方の断片を単離し、下記オリゴヌクレオ
チドアダプターおよびＳａｌ　ＩとＸｂａ　Ｉで予め消
化しておいたτｒｐＰＡτｈｕ−Ｉ　ＦＮ７の小きい方
の断片を連結させた。

（以下余白） 得られたＤＮＡは発現ベクターとして使用され、これは
アダプタ一部位にエンドペブデダーゼＸａ因子認識配列
（Ｉｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ）をコードするＤＮ
Ａ配列を有する。

上記発現ベクターをＰｓｔｌ　　（３ｕ／μｇ　ＤＮＡ
）で消化し、クレノーフラグメント（重合用に０．５ｕ
／μｇＤＮＡ、消化用に　３　ｕ／μｇ）で３７°Ｃ，
１時間処理して、Ｘａ因子認識部位を形成させ、次いで
、Ｘｂａ　Ｉで３７℃、１時間消化した。この消化され
た発現ベクターに、ブライマー伸長成熟ラットｒｅｇＤ
ＮＡ断片（第３図）を挿入する。

成熟ラットｒｅｇタンパク質をフードするＤＮＡ断片を
得るために、突然変異を引き起こして３′非翻訳部位に
Ｘｂａ　Ｉを形成させ、予想されるシグナルペプチドの
５゛翻訳位を、下記合成オリゴヌクレオチドを用いるブ
ライマー伸長法（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、旦、　４０５７．　（１９８０）
）により削除した。

５’　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡ
Ｔ　３″このようにして得られたプライマー伸長ＤＮＡ
をＸｂａＮ３ｕ／μｇ　ＤＮＡ＞で３７℃、１時間消化
し゛、上記の発現ベクターに挿入した。この発現ベクタ
ーをＩｒｐ　ｐＡＴ　ｈｕ−ＩＦＮ７　ｆｕｓｅｄ　（
Ｘａ）　ｒａｔ　ｒ＠ｇと命名した。

なお、上記発現ベクターを有する大腸菌株は、１９８８
年１１月９日から茨城系つくば南東１丁目１番３号の工
業技術院微生物工業技術研究所に、Ｉｒｐ　ｐＡＴ　ｈ
ｕＩＦＮ７　ｆｕｓｅｄ　（Ｘａ）　ｒａｔ　ｒｅｇ／
ＨＢＩＯＩ微工研条寄第２１４２号（ＦＥＲＭ　ＢＰ　
−２１４２）として、ブダペスト条約に基づいて寄託さ
れている。

・形質転換 大腸菌Ｃ６００株を、上記発現ベクターで形質転換した
。形質転換体は、１５　μｇ／ｍｌのテトラサイクリン
含有ＬＢ平板上で、３７℃、１６時間培養し、出現した
コロニーから、目的のプラスミドを有する形質転換体を
選択した。

・発現 上記形質転換体を１５　μｇ／ｍｌのテトラサイタリン
含有ＬＢ培地中３７℃で１夜培養し、改変Ｍ９培地中３
７℃で２４時間培養した。顆粒画分を分析するため、遠
心分離により細胞を採取し、リゾデーム（１ｍｇ／ｍｌ
培養液）で４℃、１時間処理した。得られた細胞抽出物
を超音波処理し、遠心分離して顆粒画分を得た。この沈
殿物は、ＳＤＳゲルサンプルバッファーに懸濁して、２
０倍に濃縮した。

不溶性画分（Ｍ粒画分）のタンパク質を、クマジーブリ
リアントプルーＲによる染色および抗ヒトＩ　ＦＮ７抗
体によるイムノブロッティングにょるＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ
ＡＧ　Ｅ　（Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０．　（１９
７０））で分析した。

上記のようにして得られた３１．９キロダルトンのタン
パク質が抗ヒトＩ　ＦＮ７抗体と反応し、目的のタンパ
ク質が得られたことが判明した。

（以下余白） ヒトＩＦＮ７融合うットｒｅｇタンパク質のバンドは大
腸菌全タンパク質の約１０％を占めた。

・単離精製 上記形質転換体３．７　ｆｌを２４時間培養後、遠心分
離により菌体を集める。菌体をバッファーＡ（０、１Ｍ
　Ｉｒ１５−ＭＣｌ、５　ｍＭエチレンジアミンテトラ
アセテート、１０ａ＋Ｍベンザミジン、０．２Ｈジチオ
スレイトール、Ｉ）Ｈ７，５）に懸濁し、フレンチプレ
スまたはゴーリンホモジナイザーで破砕する１次いで、
遠心によりペレットを集め、バッファーＡで３回洗浄し
、２０．１ｇのペレットを得た０次いで、ペレットＬｏ
ｇを４００ｍ１のバッファーＢ（４Ｍ　グアニジン−Ｈ
Ｃｌ、０．Ｉ　ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、５　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、　１０　ｍＭ　ＢＡ、　２０　ｍＭジチオスレイト
ール、ｐＨ７，５）に溶かす、希釈し、最終濃度２Ｍグ
アニジン−ＨＣｌ、タンパク濃度１　、５　ｍｇ／ｍｌ
（他の組成はバッフｙ−Ｂに同じ、タンパク量はＢｉｏ
−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｋｉｔを用い
る）とする、この溶液にバッファーＣ（２Ｈグアニジン
−ＨＣｌ　、他の組成はバッファーＢと同じ）を加え５
倍希釈する。１時間静置し、生成した沈殿を遠心により
集める。沈殿はさらに、バッファーＣ１蒸留水の順で洗
浄し、次の酵素分解の原料とする（この標品を以下融合
タンパク質という）、収量：１０．３ｇ（湿重量）。

約３　ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質、０．０５５　　ｍ
ｇ／ｍｌのリジルエンドペプチダーゼ（いずれも最終濃
度）および５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ　Ｈ８、
０溶液を２５℃、４時間反応させる（融合タンパク質は
溶けていないためゆっくり攪拌）６反応終了後、遠心分
離して沈殿画分を集め蒸留水で２回ｆ９Ｇ浄する。以下
この標品を、標品ａという。

標品ａ２５０ｎ＋ｇを６Ｍ尿素、２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ、１　ｍＭジチオスレイト、−ノ呟　ｐＨ７，
０，０，１７ｍ１に溶かし、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７
５（３，２ｘ　７７．０ｃｍ、同上バッファーで平衡化
）に付する。遺伝子から推測諮れる１７にタンパク質は
ほぼ排除体積で溶出きれる。１７にタンパク質を含む画
分を集め、５０　　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ　Ｈ７
、５に透析する０次いで、遠心し上清を集める。収量：
５．９５ｍｇ、この上清には可溶性の１７にタンパク質
が含まれ、以下この標品を標品すという。

標品ａ　　２　ｍｇをＳＤＳ溶液（０，０６ＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ、２％ＳＤＳ、２．５％　２−メルカプトエタ
ノール、１０％グリセロール）０．５ｍｌに溶かした後
、１００℃、５分処理する０次いで、全量を５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（１３，８Ｘ１５．Ｏｃｍ、２１ａｍ。

１５％ゲル、３０ｍＡ、３時間泳動）に付す、電気泳動
終了後ガイドストリップの染色から１７にタンパク質の
位置を確認し、残りのゲルから１７にタンパク質をマッ
クスイールドタンパク回収機を用い溶出した１回収量＝
８７μｇ、この１７にタンパク質を再度５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅに付した結果、純粋な１７にタンパク質であった。１
７にタンパク質のアミノ酸組成を表１に示す、更に、Ｎ
−末端配列を調べた結果、Ｎ−末端から５ａｒ−Ｌａｕ
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇ　１　ｙ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ
−−−の１４番目までの残基の配列が明らかになった。

以下、これを標品Ｃという。

（以下余白） 以上の結果から、精製した１７にタンパク質は遺伝子か
ら推測きれるラットｒｅｇタンパク質の全配列を持って
いるが、ト末端に８アミノ酸残基を付加したものである
ことがわかった。

（以下余白） 表１　アミノ酸組成 アミノ酸　　　理論値　　　実験値 ｓｐ Ｇｌｕ ｈｒ ｅｒ Ｐｒ。

ｕｙ １ａ Ｃｙｓ／２ Ｖａｌ 　ｅ　　ｔ １ｅ Ｌａｕ ｙｒ ｈｅ ｙｓ 旧Ｓ ｒｐ Ａｒｇ １９．８ １４．５ ５．１ １９．０ ３．７ １４．９ １１．０ ４．６ ６．９ ２．１ ４．０ １１．８ ８．６ ６゜１ Ｂ、０ ４．１ ５．２ ５．９ 計 モノクローナル　　の調 （１）免疫 ハイプリドーマ及びモノクローナル抗体作成に用いた実
験動物はすべてマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ１雌、８〜１０週
令）である。

免疫及び抗体のアッセイには上記のラットｒｅｇタンパ
ク質標品ａ％ｂ、ｃおよび標品ｄ（ラツ）ｒｅｇ遺伝子
を組み込んだ酵母より抽出し均一に精製したｒｅｇタン
パク質）を用いた。

第１回免疫：ラットｒｅｇ標品ａをフロイントの完全ア
ジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊ
ｕｖａｎｔ　：ＦＣＡ）、！＝１　：　１のエマルシヨ
ンとし、マウス１匹当りタンパク質量１００μｇ（第１
群）または５０μｇ（第２群）各８匹ずつ皮下投与した
。

第２回免疫（第１回より４１日後）二うットｒｅ＆タン
パク質標品すをタンパク質量３４μｇ（第１群）または
１４μｇ（第２群）ずつＦＣＡとのエマルジョンとして
皮下および腹腔に等量ずつ投与した。

（２）血清力価測定 免疫動物の血液中の抗うットｒｅｇタンパク質抗体レベ
ルをＥＬＩＳＡ法によって測定した。即ちラットｒｅｇ
タンパク質（標品す、　３０　ｎｇｌｏ、１ｍｌ、０　
、　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ／ウェル）をマイクロタイタ
ープレートにくわえて４℃、−夜装置してコーディング
をおこなったのち、０．３　ａ＋１の１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓをくわえて３７℃、１時間インキュベートしてブロッ
キングをおこなった。これに試料液０．０５＋ａｌを加
えて３７℃、１時間反応せしめた後ベクタスティンＡＢ
Ｃキット（マウスＩｇＧキット、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉａｓ、　Ｉｎｃ、　）を用いそのプロト
コールに従ってアッセイをおこなった０発色剤はオルト
フェニレンジアミン（ＯＰＤ）２　ｓｉｇ／１１を用い
、４９２　（１（ＩＩの吸光度をコロナマイクロプレー
ト光度計ＭＴＰ−２２で測定した。

勘合タンパク質の遺伝子を組み込んでいない大腸菌可溶
化物に対する抗体価も同様にして測定し、抗うットｒｅ
ｇ抗体価が高く、大腸菌の可溶化物に対する抗体価が低
いマウスのうち２匹をハイプリドーマ作成に用いた。

（３）ハイプリドーマ作成 第２回免疫より４６日後に第３回免疫を行なった。ラッ
トｒｅｇタンパク質標品ｂ３４μｇをＰＢＳｏ、２ａ＋
１に溶解して腹腔内投与した。第３回免疫より３日後に
細胞融合を行なった。細胞融合の方法は概ねＧａ１ｆｒ
ｅ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｍａｔｈｏｄｓ
　Ｅｎｚｙｍｏｌ、７３．３　（１９８１））にしたが
った、即ち、マウスミエローマ細胞（Ｐ３／ＮＳＩ／１
−Ａｇ４−１　）をＲＰＭ１１６４０培地（ＲＰＭＩ　
１６４０９０％；子牛胎児血清　１０％：ピルビン酸ナ
トリウム　０．１５１１Ｉｇ／ＩＩ＋１；オキサロ酢酸
　０　、１５　ｍｇ／ｍｌ：カナマイシン　０　、１　
ｍｇ／ｍｌ　）で培養し、その１．３７Ｘ１０７個と免
疫マウスの肺細胞２．８９Ｘ１０”個を合して遠心し、
遠心管中でペレットとし、４８％ポリエチレングリフー
ル溶液１ｍｌを１分間かけて滴下した後さらに１．５分
間攪拌し、血清無添加ＲＰＭ１１６４０培地２＋ａｌを
２分かけて、また同培地２ａ＋１を１分かけて、次いで
同培地ａｍｌを２分かけて徐々に滴下しつつ攪拌し、最
後に同培地１５ｍ１を緩やかに加えた後遠心してペレッ
トとし、ＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ　１６４０７０％：　Ｎ
ＣＴＣ１０９１０％；牛胎児血清２０％；ヒボキサンチ
ン　１０−’Ｗニアミノプテリン４　Ｘ　１０−’ＭＳ
　？　ミジン　１．８Ｘ１０−ｓＭ；ピルビン酸ナトリ
ウム０．１５−ｇ／Ｉ＋１１；オキサロ酢酸０　、１５
　ｍｇ／ａ＋１；インシュリン　０．２Ｉ（Ｊ／ｍｌ；
　　２−メルカプトエタノール　２．５Ｘ１０”Ｍ；Ｈ
ＥＰＥＳ　５　Ｘ　１０−３ＭＢカナマイシン　０．１
−ｇ／ｍｌ　；非必須アミノ酸混合液）に懸濁して肺臓
細胞の濃度を２Ｘ１Ｇ’個／＋１とし、予め無処理正常
マウスの肺臓細胞（０，９５Ｘ１０’個１０．１ｍｌ、
ＨＡＴ培地／ウェル）をまきこみ２４時間培養した９６
穴プレートの各ウェルに０．１ｍｌずつ分注した。細胞
は９５％ａｉｒ−５％ｃｏ、中、温度３７℃、湿度９５
％以上で培養し、およそ３日毎に培地の半量ずつを新鮮
なＨＡＴ培地と交換した。

（４）ハイプリドーマのスクリーニング約２週間後に増
殖してきたハイプリドーマの培養上清について、抗うッ
トｒｅｇ抗体産生の有無を検討した。アッセイは（２）
と同様の方法で行なった、このアッセイによって陽性を
示したハイプリドーマの上清は、さらにラットｒｅｇタ
ンパク質標品Ｃおよび大腸菌可溶化物に対する反応性を
検討し、ラットｒｅｇタンパク質に特異的に反応する抗
体を産生ずるハイブリドーマ３種（ＲＥＧ５、ＲＥＧ１
７およびＲＥＧ３０）を選択した。

（５）ハイブリドーマのクローニングおよび凍結保存 上記３種のハイプリドーマ細胞は限界希釈法によるクロ
ーニングを行なった。即ち、各細胞をＲＰＭ１１６４０
培地中にサスペンドして０，３個１０、２　ｍｌ／ウェ
ルの濃度になるように９６穴プレートに加えて培養した
。培養上清の抗うットｒｅｇタンパク質抗体の力価を（
４）と同様にして測定し、抗うットｒｅｇタンパク質抗
体産生ハイプリドーマを選択して培養した後、凍結用溶
液（９０％子牛血清、１０％ジメチルスルホキシド）中
凍結保存した。

（６）腹水の調製 ハイブリドーマ細胞ＲＥＧ　５．　　ＲＥＧ　１７およ
びＲＥＧ３０のＰ　Ｂ　Ｓ　（Ｐｈｏｓｐｈａｔａ−ｂ
ｕｆｆａｒａｄ　５ａｌｉｎｅ）サスペンション（２〜
５Ｘ１０’個／ａ＋１）　０　、５　ｍｌずつを、７〜
１０日前にプリスタン０　、５　ｍｌを腹腔内投与した
マウスに腹腔内投与し、約１３！１間後に貯溜してきた
腹水をタッピング法により採取した。

腹水はセパラビッドデユープ（セキスイ化学）で遠心す
ることにより沈殿物を除去した後、分注し℃凍結保存し
た。

（７）抗体のクラスおよびサブクラスの決定モノクロー
ナル抗体ＲＥＧ　５、ＲＥＧ　１７及びＲＥＧ　３０の
イムノグロブリンクラスおよびサブクラスをＥＬＩＳＡ
法によって同定した。同定にはマウスＭｏｎｏＡｂ４ｆ
）ＥＩＡキット（Ｚｙｍｅｄ社）を用いた。

ＲＥＧ　５はＩｇＧ２ａ（Ｋ　）、ＲＥＧ　１７はＩＢ
Ｍ（に）、ＲＥＧ　３０はＩｇＧ２ａ（に）と同定きれ
た。

（８）抗体の精製 ＲＥＧ　５およびＲＥＧ　３０はアフィゲルプロティン
ＡＭＡＰＳ　Ｎキット（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてその
プロトコールにしたがって精製した。　ＲＥＧ　１７は
セファデックスＧ−２００によるゲル濾過によって精製
した。腹水１ｍｌより得られる抗体の量はそれぞれ、　
ＲＥＧ　５：　９．４ａｉｇ、　ＲＥＧ　１７：　４．
１　ｍｇ％ＲＥＧ　３０：　４．Ｏｍｇであった。

（９）　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅの
作成Ｎａｋａｎｅらの方法ＣＰ、　Ｋ、　Ｎａｋａｎａ
　ａｎｄ　Ａ、　Ｋａｗａｏｉ、Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍ、　Ｃｙｔｏｅｈａｔ、　２２＋　　１０８４　（
１９７４）　）に準じてＲＥＧ　１７の西洋ワサビペル
オキシダーゼとのｃｏｎｊｕｇａｔｅを１作成した。ペ
ルオキシダーゼ（４ＱＣ／ｍｌ　ｗａｔｅｒ）に０　、
１　Ｍ　Ｎａ１Ｏ，０、２ｍｌを加えて室温で２０分間
反応したのち、　１　ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，４）に対し４°Ｃ１−夜透析後０　、２　Ｍ　Ｎａ
ｍＣＯ５で＄）８９．５とし、ＲＥＧ　１７（８ｍｇ／
１１．０　、　ＯＩ　Ｗ　ＮａＨＣＯｓ　）を加えて室
温で２時間攪拌し、水冷後ＰＢＳに対し４℃、−夜透析
してｃｏｎｊｕｇａｔｅを得た。

（１０）Ｒｅｇタンパク質のサンドイッチアッセイｈ　
）　ＲＥＧ　１７−Ｐ＠ｒｏｘｉｄａｓａ　ｃｏｎｊｕ
ｇａｔａによる：ＲＥＧ　５溶液（１０μｇ１０．１ｍ
ｌ、０　、　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯａ／ウェル）をマイク
ロタイタープレート各ウェルに加えて４′Ｃ１−夜靜置
後、１％カゼイン（ＰＢＳ中）０．３ｍｌを加えて３７
℃、１時間インキュベートしてｂｌｏｃｋｉｎｇをおこ
ない、ｒｅｇ溶液（標準液または被検液”）０．０５　
■１（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中）を加えて３７℃、１時間
反応する。これに（９）にて作成したＲＥＧ　１７−Ｐ
ｅｒｏｘｉｄａ−ｓａ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅの２００倍
希釈液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中）０．０５ｍ１を加えて
室温で３０分間反応せしめた後、オルトフェニレンジア
ミン（０゜５　ｍｇｌｏ、０５　ｍｌ、０．１Ｈクエン
酸緩衝液、ｐＨ４，２）およびＨ＊　Ｏ＊　（終濃度：
０．０３％）を加えて室温で３０分間反応させた。０．
１　閤１のＩＮ　ＨｇＳＯ４を加えて反応を停止させ、
４９２ｎｍの吸光度を測定した０本法によるｒｅｇタン
パク質の測定感度は５　ｎｇ／ウェルであった（第１図
）。

ｂ）抗ＩｇＨ抗体使用による： ＲＥＧ　５によるｃｏａｔｉｎｇｓ　カゼインによるｂ
ｌｏｃｋ−ｉｎｇ、及びｒｅｇタンパク質試料の添加を
ａ）と同様に行なった後、ＲＥＧ　１７溶液（２０μｇ
／ｍｌ＋　　１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ中）０．０５ｍ１を
加えて３７℃、１時間反応した。これにベクタステイン
マウスＩｇＨキットをそのプロトコールにしたがって添
加して反応を行ない、ＲＥＧ　１７に抗ＩｇＨ抗体及び
ペルオキシダーゼを結合せしめた。オルトフェニレンジ
アミン添加以降の操作はａ）と同様である。

本性によるＴｅｌタンパク質の検出感度は２．５ｎｇ／
ウェルであった（第２図）。

（１１）ウェスタンブロッティングによるＴｅｌタンパ
ク質の検出 ＠　）　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｔｅｌタンパク質の
検出大腸菌で発現した融合タンパク質及び酵母で発現し
たラットとヒトのＴｅｌタンパク質のウェスタンブロッ
ティングを行なった。モノクローナル抗体ＲＥＧ　５及
びＲＥＧ　３０によって、融合タンパク質は３２ＫＤの
位置に、またヒト及びラットＴｅｌタンパク質は１６Ｋ
Ｄの位置に呈色が認められ、これらはそれぞれ融合タン
パク質及びＴｅｌタンパク質の位置に一致した。また低
分子側に抗ｒｅｇタンパク質抗体に反応するバンドが一
個認められたが、これはＴｅｌタンパク質の部分分解物
であることがアミノ酸組成および配列の分析により確か
められた。

ｂ）ラット及びヒト膵臓のＴｅｌタンパク質の検出 ラット及びヒト膵臓ホモジネートの５ＤＳ−ＰＡＧＥを
行ない、このものをウェスタン　ブロッティングに供す
ると、モノクローナル抗体ＲＥＧ　５及びＲＥＧ　３０
によってＴｅｌタンパク質に相当する位置に１明なバン
ドが認められた。ヒト膵臓の試料においては高分子側に
も上記抗体によって検出されるタンパク質の存在が認め
られたが、これの意味するものについては現在のところ
不明である。

（１２）正常ラット膵臓及び各組織のＴｅｌタンパク質
のサンドイッチアッセイ 正常ラッ）　（ｌａｗｉｓ、雌、５週令）の膵臓及び各
組織を１ｍＭＰＭＳＦ存在下、０．１　Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ４，４）中、ポリトロンで破砕し、１０
．０００　ｘ　ｇ　１５分遠心し、上清を分けた。沈殿
に２％５ＤＳＣＰＢＳ中）を加えて室温１時間処理後再
び１０．０００　ｘ　ｇ　１５分間遠心し、上清を膜可
溶化画分とした。これら各組織の上清及び膜可溶化画分
中のｒｅｇタンパク質含質量有量（１０）にて作成した
サンドイッチアッセイ法によって測定した。正常ラット
膵臓の膜標品のＳＤＳ可溶化物に特異的に極めて高濃度
のＴｅｌタンパク質が検出きれた。これは同時に測定し
た標準の遺伝子組換Ｔｅｌタンパク質の呈色を基にして
約１．０８０ｇｇ／ｌ　ｇ　ｗｅｔ　ｔｉｓｓｕｅのＴ
ｅｌタンパク質に相当する。他の組織においてもＴｅｌ
タンパク質は検出きれたがその量は膵臓に比べて微量で
あり（膵臓３６；肝臓１４：皐丸１１＋脳ｉｌｌ腎臓１
０　μｇ／　ｌ　ｇ　ｗｅｔ　ｔｉｓｓｕｅ　）、また
、それら組織の上清にはほとんど認められなかワた。ま
た、正常ラット血清にも、Ｔｅｌタンパク質はほとんど
認められなかった。

（以下余白） 衷ｌ九主 発現ベクター構築のための宿主としては、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２（Ｆ−１ｈｓｄＲ”、
ｈｓｄＭ”、ｒ虻Ａ０、ｔｈｒ、　ｌａｕ、ｔｈｉ、１
ａｃＹ、　５ｕｐＥ％ｔｏｎＡ）が用いられた。

発現ベクターの宿主としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃ
ｅｓｃａｒ＠ｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２（ａ　１ｅｕ２、
ｈｉｓ４、ｃａｎｌ、ａｉｒ”）（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５．１９２９
−１９３３　（１９７ｇ）　：特公昭６１−５５９５１
：微工研条寄第３１２号）を用いた。この酵母は予めＹ
ＰＤＡ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％
グルフース、２０ｍｇ／ｌアデニン）中で培養しておい
た。

１．５ｉ／１のＫＭ　、ＰＯ４を含むＰ１添加培地（以
下Ｐｉ（＋）培地と略記）および、上記Ｐｉの代わりに
　１．５ｇ／ｌのＫＣＩを含むＰ１欠損培地（以下Ｐｉ
（−）培地と略記）の調製には、パークホルダ−最小培
地（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｍｅ
ｄｉｕｍ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　　υＳＡ　
７’１．　４５０４−４５０８　（１９８０））を用い
た。

およびリンカ− 制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、クレノーフラグメント
は宝バイオケミカルズから購入し、ＸｈｏＩリンカ−は
ファルマシアから購入した。

プラスミド 発現ベクターとしては、酵母−大腸菌シャトルベクター
ｐＡＭ８２　（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８０、　Ｉ−５（１９８３）、特
公昭６１−５５９５１：微工研条寄第３１３号〉を用い
た。これは、ＡＲ５Ｉ、２μｍｏｒｉとＬａｕ２を有す
る５　、　５　Ｋｂの５．　ｃａｒｅ−ｖｉｓｉａｅ　
ＤＮＡ断片およびＡｐ１マーカーとｏｒｉを有する３、
７ＫｂのｐＢＲ３２２断片からなり、さらに、ＰＨ０５
プロモーターを有する２、７Ｋｂの酵母ＤＮＡ断片を有
する。

発現ベクターの構築に用いたｐＧＥＭ４は、プロメ゛ガ
バイオテク　（Ｐｒｏｒｍｅｇａ　Ｂｉｏｔａｃ　（υ
、Ｓ、Ａ、））から購入した。

ヒトｒ　ｅ　ｇ　ｃＤＮＡ　（第５図）には、その構造
遺伝子内にＥｃｏＲＩサイトがあり、従って、ｐＢｓベ
クターの）：ｃａＲＩ　　サイトに挿入する際には、２
つのＥｃｏＲＩ断片に分かれて挿入されている。

脛１亙羞 形質転換はＫｉｍｕｒａらの方法（Ｊ、　Ｂａｅｔａｒ
ｉｏｌ。

出、　１６３−１６８　（１９８３））に従って行なわ
れた。

Ｌａｕ”株は、２％寒天を含むパークホルダー最小培地
上で選択した。

里１巳」１導 プロモータＰＨ０５は培地中のＰｉ濃度により制御でき
る（工ｈａ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　ｉ、　６７５−
６８０　（１９８２〉）、最初に、酵母を、ヒスチジン
（２０μｓ／ｍ１）を加えたＰｉ（＋）培地中で、３０
℃、２日間、好気的に培養した。そのうちの　２００μ
ｍを、ヒスチジン（２０μｓ／ｍｌ）を加えたＰｉ（−
）培地１０ｍ１に移した。これを同様に培養したところ
、３〜５日後に、ヒトｒｅｇタンパク質が培地中に検出
された。

（以下余白） ベクターの 発現ベクターの構築は、第６図に示される通り常法に従
ってなされた（Ｍｏｌ＠ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）参照）。

ｐＢＳベクターに挿入されたヒトｒｅｇｃＤＮＡは、５
″末末端片および３′末末端片の、２つの断片（前半と
後半）に分かれてそれぞれ挿入されている。

まず、５゛末末端片（前半）を有するｐＢｓベクターを
Ａｆｔ　Ｎで消化し、クレノーフラグメントで処理し、
Ｘｈｏｌりンカーを付加してＥｃｏＲＩで消化した。３
゛末末端片（後半）を有するｐＢｓベクターは、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＸｂａ　Ｉで消化した。　ｐＧＥＭ４のＳａ
ｃ　ＩをＸｈｏ　Ｉリンカ−を用いてＸｈｏ　Ｉサイト
とし、このｐＧＥＭ４（Ｘｈｏ　Ｉ　）に、上記で得ら
れた２つのヒトｒｅｇｃＤＮＡ断片を挿入した。得られ
たｐＧＥＭ４　（Ｘｈｏｌ　）　ｈｕｍａｎ　ｒｅｄを
Ｘｈｏ　ＩおよびＷｉｎｃ■で消化し、Ｘｈｏ　Ｉとｐ
ｖｕ　ＩＩ　で消化したｐＡＭ８２に挿入した。このプ
ラスミドを、ｐＡＭ８２−ｈｕｍａｎｒｅｚ　　と命名
した。

それぞれの制限酵素は、３単位／μｇ　ＤＮＡの濃度で
使用し、３７℃で１時間インキュベートした。

ヒトｒｅ　　タンパク　の産 上記で構築されたヒトｒ　ｅ　ｇ　ｃＤＮＡ発現ベクタ
ーをＥ、　ｅｏｌｉ　Ｋ−１２Ｃ６００に導入し、アン
ピシリン耐性コロニーを選択した。これらの形質転換株
を用いて、プラスミドＤＮＡを大量に調製した。

）：、　ｅｏｌｉ中で増殖した組換えプラスミドを、酵
母宿主Ｓ、　ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２に常法に
従って導入し、Ｌｅｕ”コロニーを選択した。

形質転換株は、２日間Ｐｉ（＋）培地中で培養した後、
Ｐｉ（−）培地に移すことにより誘導した。

酵母は、ｐｔ（＋）およびＰｉ（−）両培地において３
０℃で激しく振とうしながら培養した。

Ｐｉ（−）培地における培養の３．４および５日後に、
培地の一部を取り、遠心して細胞を除去した。

こうして得られた培養液を、ｃａｎｔｒｉｃｏｎ−１０
（Ａｍｉｃｏｎ）およびＮ、ガスを通すことにより約１
００分の１に濃縮した。

濃縮サンプル（培養液の０．７５ｍ１に相当）は、１６
％５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　５８．
２５４−２５８（１９７５＞、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏ
ｎｄｏｎ）　２２７．６８０　（１９７０））に付し、
クマジーブリリアントブルーＲ染色により分析した。

この分析により、ヒトｒｅｇタンパク質が、細胞から分
泌産生されたことが確認された。主に、ヒトｒｅｇタン
パク質が検出されたが、多少の夾雑タンパク質も検出き
れた。

ヒトｒｅ　　タンパク　の　　　出 上記＠養液を、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏ
ｎ）およびＮ□ガスを通すことにより約１００分の１に
濃縮した。

濃縮した培地を　１６％　５ＤＳ−ＰＡＧＥに付し、前
記モノクローナル抗体ＲＥＧ　５またはＲＥＧ　３０を
用いて、ウェスタンブロッティング（Ｊ、　　Ｖｉ−ｒ
ｏｌ、　１０．２１１　（１９７２）　）を行なうと、
約１６にダルトンのバンドが確認され、このｒｅｇタン
パク質をモノクローナル抗体の調製に用いることにした
。

ヒトｒｅ　　タンパク　の精 ｒｅｇタンパク質を含む培養液を、ＩＮ塩酸でｐＨ３，
４にＩＪ１４ｖ１シ、最終導電率　０．３ｍｍｈａとな
るように蒸留水で希釈した。この溶液に、５　ｍＭ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，４＞（緩衝液Ａ）で平衡化
した１００ｍ１のＳ−セファロース（ファストフロータ
イブ）を加え、４℃で１６時時間中かに攪拌した。この
ｒｅｇタンパク質を吸着したＳ−セファロースをカラム
（５Ｘ８ｃｍ＞にバックし、０．３ＭＮａＣ１を含む緩
衝液Ａで洗浄し、０．６ＭＮａＣ１を含む緩衝液Ａで溶
出した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１５％ゲル）上で約ｔａ、ｏｏ。

の分子量を示すｒｅｇタンパク質画分をプールし、４°
Ｃで１６時間緩衝液Ａに対して透析した。

これを緩衝液Ａで平衡化したＳ−セファロシスカラム（
０，７Ｘ２５ｃｍ）に付し、０　、３　Ｍ　ＮａＣ１を
含む緩衝液Ａで洗浄した＊ｒｅｇタンパク質は、カラム
の１０倍量の０．３〜０．６１１ＮａＣ１を含む緩衝液
Ａの線状勾配により溶出した。ｒｅｇタンパク質は０．
４４ＭＮｇＣ１を含む緩衝液Ａで溶出きれ、５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ　（１５％ゲル）上で均一であった。精製ｒｅｇ
タンパク質は、　Ａａ＋ｉｃｏｎＹＭ−１０ｍｅｍｂｒ
ａｎｅを用いる限外濾過により脱塩後、１０ｍＭの酢酸
中に　０．１ｍｇ／ｍｌとなるように保存した。１２の
培養液から約２００　　μｇのｒｅｇタンパク質が得ら
れた。

ヒトｒｅ　　タンパク　の　性 ・分子量 精製ｒｅｇタンパク質の分子量は５ＤＳ−ＰＡＧＥによ
り決定し約１６．０００であった。これは、♂ＮＡ配列
から推定されるアミノ酸配列から計算した理論値１６．
２７５とよく一致した（ｒｅｇのＮ末端は２２番目のＧ
ｌｎと推定した）。

・アミノ酸組成 ｒｅｇタンパク質をＨＰ　Ｉ、　Ｃ（Ｂｒｏｗｎｉｅｅ
、　ａｑｕａｐｏｒｅＲＰ−３００ｃａｌｕｍｎ）　テ
脱塩し、４Ｍメタンスルホン酸（０，２％　３−（２−
アミノエチル）インドールを含む）を用いて１１０”Ｃ
で２４時間加水分解した。アミノ酸分析は、日立アミノ
酸分析ｍ（Ｍｏｄｅｌ　８３５）を用いて行なった。

表２に示すとおり、ｒｅｇタンパク質のアミノ酸組成は
理論値とほぼ一致した。

・Ｎ末端配列 ｒｅｇタンパク質のＮ末端配列を、ＡｐｐｌｉａｄＢｔ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７Ａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ａｑ
ｕｅｎｃｅｒを用いて分析しようとしたが、Ｎ末端およ
びそれに続くアミノ酸は全く検出されなかった。そこで
、ピログルタメイトアミノペプチダーゼで処理した後、
上記と同様に分析した。酵素処理したｒｅｇタンパク質
のＮ末端２９個のアミノ酸が、表３に示すように、決定
された。この酵素処理タンパク質のＮ末端はグルタミン
酸であり、アミノ酸配列（Ｇｌｕ−２からＧｌｕ−３０
）はｃＤＮＡから推定きれる配列と一致した。

従って、ｒｅｇタンパク質のＮ末端は、第５１３０中の
２２番目のＧｌｎまたは２３番目のＧｌｕであると推定
された。う・７トｒｅｇタン／くり質１こおいては、そ
のＮ末端アミノ酸は、ヒトｒｅｇタンパク質の２３番目
のＧｌｕに対応するＧｌｕであった。

（以下余白） ｓｐ ｈｒ ｅｒ １ｕ Ｐｒ。

ｌｙ ｌａ １／２Ｃｙｓ ａ１ ｅｔ １ｅ ｅｕ ｙｒ ｈｅ ｙｉ １ｓ Ａｒ　　区 表２ １７．１ ６．９ １５．７ １４．８ ６．４ １０．２ ８．０ ５．５ ９．９ １．０ ３．９ ８．１ ７．１ ７．０ ９．１ ２．２ ４．８ 分解段階 表３ ｒｅｇ蛋白質残基 （Ｇ　Ｉ　ｎ　）” Ｇｌｎ ｌａ Ｇｌｎ ｈｒ Ｇｌｎ ｅｕ Ｐｒ。

Ｇｌｎ ｌａ ｒｇ １ｅ ｅｒ （ｃ　ｙ　ｓ　）　１７１ Ｐｒ。

Ｇｌｎ ｌｙ ｈｒ ｓｎ ｌａ ｙｒ ｒｇ ｅｒ ｙｒ （ｃ　、　Ｓ）ｍｌ ｙｒ ｙｒ ｈｅ ｓｎ 　ｔＵ 収率（Ｘ） １７．３ １８．１ ２０．６ １１．９ １４．９ １６．８ １５．２ １４．７ １４．２ ７．９ ９．８ ３５．６ ７．５ ５．７ ８．６ １２．２ ５．９ ６．８ ５．６ ３．５ ２２．０ ４．５ ４．８ ６．４ ４．４ ４．１ ２．７ 岨未同定残基：ビログルタメイトアミノペプチダーゼ処
理からＧｌｎと推定 傘２未同定残基：　ＣＤＮＡからＣｙｓと推定モノクロ
ーナル　　の （１）免疫 ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体作成に用いた
実験動物はすべてマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、第８退会
）である、免疫および抗体のアッセイに用いたヒトｒｅ
ｇタンパク質は上記の様にして調製されたものを用いた
。

第１回免疫：ヒトｒｅｇタンパク質のＰＢＳ溶液をＦＣ
Ａと１：１のエマルシヨンとし、マウス１匹当りタンパ
ク質量２０μｇを２１匹に皮下投与した。

第２回免疫（第１回より３２日後）：ヒトｒｅｇタンパ
ク質をタンパク質量５μｇ（第１群＝１０匹）または２
０μｇ（第２群：１１匹）ずつＦＣＡ　ａｄｊｕｖａｎ
ｔとのエマルジョンとして皮下投与した。

第３回および第４回免疫：第２回よりそれぞれ５５およ
び６９日後に、第２回免疫と同じ方法で行なった。

（２）血清力価測定 免疫動物の血液中の抗ヒトｒｅｇ抗体レベルをＥＬＩＳ
Ａ法によって測定した。即ち、ヒトｒｅｇタンパク質３
０　ｎ　ｇｌｏ、　１ｍｌ、０、ＩＭＮａＨＣＯａ／ウ
ェル）をマイクロタイタープレートに加えて、４℃で１
夜静置してコーティングを行なったのち、１％ＢＳＡ／
ＰＢＳ　　０．３ｍｌを加えて３７℃で１時間インキュ
ベートしてブロッキングを行なった。これに試料液０．
０５ｍ１を加えて、３７℃、１時間反応させた後、ベク
タスティンＡＢＣキット（マウス　ＩｇＧ　　キット、
ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　
）を用い、そのプロトフールに従ってアッセイを行なっ
た０発色剤はオルトフェニレンジアミン１　ｍｇ／ｍｌ
を用い、４９２ａｍの吸光度をコロナマイクロプレート
光度計ＭＴＰ−２２で測定した。高い抗ヒトｒｅｇ抗体
価を示したマウスをハイブリドーマ作成に用いた。

（３）ハイブリドーマ作成 実験１ 第４回免疫より３３日後に第５回免疫を行なった。ヒト
ｒｅｇタンパク質４５μｇをＰＢＳＯ。

２ｍｌに溶解して腹腔的投与した。第５回免疫より３日
後に細胞融合を行なった。細胞融合の方法は、概ねＧａ
１ｆｒｅ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、　７３．４６　（１９８１））
に従った。即ち、マウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳＩ
−１−Ａｇ４−１　）をＲＰＭ１１６４０培地（ＲＰＭ
Ｉ　１６４０９０％；子牛胎児血清　１０％；ピルビン
酸ナトリウム　０　、１５　ｍｇ／ｍｌ；゛オキサロ酢
酸０　、１５　ｍｇ／ｍｌ；カナマイシン　０．１ｍＢ
／ｍｌ　）で培養し、その３．９３Ｘ１０’個と免疫マ
ウスの肺細胞１．３４Ｘ１０ｉ個を合わせて遠心し、遠
心管中でベレットとする。４８％ポリエチレングリフー
ル４０００溶液１ｍｌを１分間かけて滴下し、さらに１
．５分間攪拌し、血清無添加ＲＰＭ１１６４０１地２ｍ
ｌを２分かけて、また、同培地２ｍｌを１分かけて、次
いで、同培地６ｍｌを２分かけて徐々に滴下しつつ攪拌
し、最後に同培地１２ｍ１を緩やかに加えた後、遠心し
てペレットとし、ＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ　１６４０７０
％ｊ　ＮＣＴＣ１０９１０％；子牛胎児血清２０％；ヒ
ポキサンチン１０−’Ｍ；アミノプテリン　４×１０“
’Ｍｉチミジン　１．６Ｘ１０−’Ｍｉ　ピルビン酸ナ
トリウム０　、１５　ｍｇ／ｍｌ；オキサロ酢酸０　、
１５　ｍｇ／ｍｌ；　インシュリン　０．２　　ＩＵ／
ｍｌ＋　２−メルカプトエタノール２．５　Ｘ　１０−
４Ｍ１　ＨＥＰＥＳ　５　Ｘ　１０−’　ＭＳカナマイ
シン　０　、１　ｍＢ／ｍｌ；非必須アミノ酸混合液）
に懸濁して肺臓細胞の濃度を１．５Ｘ１０’個／ｌ１１
１として９６穴プレートの各ウェルに０．１ｍｌずつ分
注し、９５％＠（ｒ−５％ＣＯ，中温度３７℃、湿度９
５％以上で培養した。３日後に、ＨＡＴ＠地０　、１　
ｍｌを加え、また必要に応じて培地の半量ずつを新鮮な
ＨＡＴ培地と交換した。

実験２ 第４回免疫より４６日後に第５回免疫を実験１と同様に
して行ない、第５回免疫より３日後に細胞融合を行なっ
た。マウスミエローマ細胞株として、Ｐ３Ｘ６３−ＡＪ
！　８．６５３（６，２７Ｘ　１０’個）を用い、マウ
ス胛臓細胞２．６５Ｘ１０”個と実験１と同様の方法で
融合きせた。融合処理した細胞をＨＡＴ培地に懸濁して
、１．３Ｘ１０’個／ｍｌとし、９６穴プレートの各ウ
ェルに０　、１　ｍｌずつ分注した。ＨＡＴ培地の添加
および交換、培養条件などは実験１と同様の方法によっ
た。

（４）ハイブリドーマのスクリーニング約２週間後に増
殖してきたハイプリドーマの培養上清について、抗ヒト
ｒａｇ抗体産生の有無を検討した。アッセイは（２）と
同様の方法で行なった。ヒトｒｅｇタンパク質に特異的
に反応する抗体を安定して産生するハイプリドーマを選
択した。

（５）ハイプリドーマのクローニングおよび凍結保存 上記のハイブリドーマ細胞は限界希釈法によるクローニ
ングを行なった。即ち、各細胞をＲＰＭＩ　　１６４０
培地中に懸濁し、０．３個／　０　、２　ｍｌ／ウェル
の濃度になるように９６穴プレートに加えて培養した。

培養上清の抗ヒｈｒｅｇタンパク抗体の力価を（４）と
同様にして測定し、抗ヒトｒｅｇ抗体産生ハイブリドー
マＨＲＥＧ　ＮｌおよびＨＲＥＧ９ヲ選択して培養した
後、凍結用溶液（９０％子牛血清、１０％ジメチルスル
ホキシド）中、凍結保存した。

（６）腹水の調製 ハイプリドーマ細胞のＰＢＳ懸濁液（２〜５Ｘ１０’個
／ａｌ）０．５ｍｌずつを、７〜１０日前にプリスタン
０　、５　ｍｌを腹腔内投与したマウスに腹腔内投与し
、約１週間後に貯溜してきた腹水をタッピング法により
採取した。腹水はセパラビッドチューブ（セキスイ化学
）で遠心することにより沈殿物を除去した後、分注して
凍結保存した。腹水ｌｌ１１１より得られる抗体量はＨ
ＲＥＧ　ＮｌおよびＨＲＥＧ　９についてそれぞれ１　
、９　ｍｇ／ｍｌおよび４　、４　ｍｇ／ｍｌであった
。

（７）抗体のクラスおよびサブクラスの決定ハイプリド
ーマ細胞の産生ずるモノクローナル抗体のイムノグロブ
リンクラスおよびサブクラスをＥＬＩＳＡ法によって同
定した。同定にはマウス１１ｏｎｏＡｂ４Ｄ−ＥＩＡキ
ット（ｚｙｍｅｄ社）を用いた。その結果、ＨＲＥＧ　
ＮｌはＩＢＧ２ａ（Ｋ　）またＨＲＥＧ　９はＩｇＨ　
（に）であった。

（８）抗体の精製 モノクローナル抗体ＨＲＥＧ　Ｎｌはアフィゲルプロテ
ィンＡ　ＭＡＰＳ　ｆｆキット（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社）を
用いてそのプロトコールに従って精製した。モノクロー
ナル抗体ＨＲＥＧ　９は硫酸アンモニウムによる分画（
５０％飽和）によって精製した。

（９）ヒトｒｅｇタンパク質のサンドイッチアッセイ モノクローナル抗体ＨＲＥＧ　Ｎｌ溶液（０，５μｇ１
０．１ｍｌ、０　、１　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ／ウェル）を
マイクロタイタープレート各ウェルに加えて４℃で１夜
静置後、１％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）０．３ｍｌを加えて３
７℃、１時間インキュベートしてブロッキングを行ない
ヒトｒｅｇタンパク質溶液０．０５ｍ１（１％ＢＳＡ／
ＰＢＳ中）を加えて３７℃、１時間反応させる。これに
モノクローナル抗体ＨＲＥＧ９のペルオキシダーゼフン
シュゲート（ｐａｒｏｘｉ−ｄａｓｅ　ｃｏｎｊｕｇａ
ｔａ）　（実施例１と同様の方法により調製）の４．０
００倍希釈溶液０．０５ｍ１を加えて３７℃、２時間反
応した後、オルトフェニレンジ７　ミン（０，０１ａ＋
ｇ１０．１５ｍ１．０．１Ｍクエ’／酸緩衝液、ｐＨ４
，２）ｊ：１−ｔｌ、びＨａ　Ｏａ　（終濃度：０．０
３％）を加えて室温で２０分反応きせた。ＩＮＨ，５０
，０、１ａ＋１を加えて反応を停止し、４９２１の吸光
度を測定した０本法によるヒトｒｅｇタンパク質の検出
感度は０．１６ｎｇ／ウェルであった（第７図）。

（以下余白） λ浬ＶＬ（釆 本発明によって得られたモノクローナル抗体を用いてラ
ット及びヒトのｒａｇタンパク質の検出、同定、及び測
定が可能となった。また、遺伝子組換えｒａｇタンパク
質及び天然のｒｅｇタンパク質の精製のための極めて有
用な手段を提供するものと考えられる。さらにｒｅｇタ
ンパク質が大腸癌の組織に高頻度に発現しているという
知見に基づけば、該モノクローナル抗体を用いた大腸癌
の診断及び治療の可能性が期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図はＲＥＧ　５とＲＥＧ　１７−ｐｅｒｏｘｉｄａ
ｓｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔａを用いたサンドイッチアッセ
イにおけるｒｅｇタンパク質の検量線を示す。 第２図はＲＥＧ　５とＲＥＧ　１７及び抗ＩｇＨ抗体を
用いたサンドイッチアッセイにおけるｒｅｇタンパク質
の検量線を示す。 第３図はラットｒｅｇ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列および
該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。 第４図はヒトインターフェロン７とラットｒｅｇタンパ
ク質との融せタンパク質を発現するプラスミドの構築図
である。 第５図はヒトｒｅｇ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列および該
塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。 第６図はヒトｒｅｇの発現ベクターの構築の概略図であ
る。 第７図はＨＲＥＧ　ＮｌとＤＲＥＧ　９−ｐｅｒｏｘｉ
ｄａｓｅ　ｃｏｎｊｕ−ｇａｔｅを用いたサンドイッチ
アッセイにおけるヒトｒｅｇタンパク質の検量線を示す
。 特許出願人　　塩野義製薬株式会社 代　理　人　　弁理士　岩崎　光隆 し・−３゜ 第２−図 ２．５ ｅｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ｎ９） 第１図 ｅｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ｎ９） 第７図 ｈｒｅ９　　ρｒｏｔｅｌｎ （ｎ９） ＣｙｓＬｙｓＰ１＋ｅＬｙｓＡＩ 第 図 に１ｊｓＬ７ＳＰｌ’１ｅＬｙｉＡＳｎ第 図

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｒｅｇタンパク質を認識するモノクローナル抗体
   。
2. （２）該ｒｅｇタンパク質がヒトおよび／またはラット
   ｒｅｇタンパク質である請求項１に記載のモノクローナ
   ル抗体。
3. （３）モノクローナル抗体ＲＥＧ５、モノクローナル抗
   体ＲＥＧ１７、モノクローナル抗体ＲＥＧ３０、モノク
   ローナル抗体ＨＲＥＧＮ１およびモノクローナル抗体Ｈ
   ＲＥＧ９よりなる群から選択される請求項１に記載のモ
   ノクローナル抗体。
4. （４）固相に固定化した抗体である請求項１ないし３の
   何れかに記載のモノクローナル抗体。
5. （５）酵素で標識した抗体である請求項１ないし３の何
   れかに記載のモノクローナル抗体。
6. （６）請求項１ないし３の何れかに記載のモノクローナ
   ル抗体を産生するハイプリドーマ。
7. （７）ハイプリドーマＲＥＧ５、ハイプリドーマＲＥＧ
   １７、ハイプリドーマＲＥＧ３０、ハイプリドーマＨＲ
   ＥＧＮ１およびハイ・プリドーマＨＲＥＧ９よりなる群
   から選択される請求項６に記載のハイプリドーマ。
8. （８）２種類の抗体で抗原をサンドイッチする免疫測定
   法において、該抗原がｒｅｇタンパク質であり、その抗
   体の一方を特異的に認識する抗体をさらに反応させるこ
   とを特徴とするｒｅｇタンパク質の測定法。
9. （９）ｒｅｇタンパク質を認識する抗体を特異的に認識
   する抗体が抗ＩｇＨ抗体である請求項８に記載の測定法
   。
10. （１０）２種類の抗体で抗原をサンドイッチする免疫測
    定法において、該抗原がｒｅｇタンパク質であり、その
    抗体の一方を標識抗体とすることを特徴とするｒｅｇタ
    ンパク質の測定法。
11. （１１）該標識抗体が酵素標識抗体である請求項１０に
    記載の測定法。
12. （１２）該酵素がペルオキシダーゼである請求項１１に
    記載の測定法。