JPH01503513A

JPH01503513A - 血小板関連増殖調節剤

Info

Publication number: JPH01503513A
Application number: JP63502722A
Authority: JP
Inventors: トワドジック，ダニエル　アール; トダロ，ジョージ　ジェイ
Original assignee: オンコゲン
Priority date: 1987-03-02
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1989-11-30
Also published as: IL85613A0; FI885031A; IE69678B1; AU623589B2; EP0281363A3; AU1492488A; PT86885A; IL85613A; NZ223696A; ATE123061T1; DE3853842D1; FI885031A0; KR890700672A; IE880591L; EP0281363A2; ES2074049T3; PT86885B; DE3853842T2; WO1988006628A1; GR3017041T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２７、前記細胞がＥ、コリ細胞である請求の範囲第２６項記載の細胞。

２８、多くのａｍ細胞の増殖を阻害するための方法であって、血小板第４因子又はその同類物を含んで成る、増殖阻害量のポリペプチドと前記腫瘍細胞とを接触することを含んで成る方法。

２９、生理学的に許容できる担体中に血小板第４因子又はその同類物の細胞増殖阻害量を含んで成る腫瘍細胞増殖阻害組成物。

３０、融合タンパク質であって、前記タンパク質のＣ−末端で血小板第４因子又はその同類物及び前記血小板第４因子又はその同類物のＮ−末端に融合された、バタテリオファージλＮ−遺伝子又はＣｒｏ遺伝子、又は細菌性アルカリホスファターゼ遺伝子からの約８〜約３５個のＮ−末端アミノ酸を含んで成る融合タンパク質。

３１、前記血小板第４因子又はその同類物と前記Ｎ−末端アミノ酸との間に少なくとも１個のアミノ酸の中央領域をさらに含んで成る請求の範囲第３０項記載の融合タンパク質。

３２、前記中央領域が化学的切断部位又は酵素的切断部位を含んで成る請求の範囲第３１項記載の融合タンパク質。

明　細　書ハ　゛　ζ ゛　の　ロス−Ｉ　レンスこの出願は、１９８７年１０月３０日に提出された出願第１１５．１３９号及び１９８７年３月２日に提出された出願第０２０，６０９号の一部継続出願であり、そしてその後者は、１９８６年９月２６日に提出された出願第９１２．４０７号の分割出願であり、これは１９８５年３月１５日に提出された特許出願第７１２．３０２号の分割出願であり、これは１９８７年２月２４日に発行されたアメリカ特許第４．６４５．８２８号であり、これは１９８４年３月２３日に提出された特許出願第５９２、９６９号の一部継続出願であり、これは１９８６年５月２０日に発行されたアメリカ特許第４．５９０．００３号であり、そしてこれらを引用により本明細書に組み込む。

腫瘍細胞の増殖を選択的に阻害する化合物を含んで成る細胞増殖調節組成物が開示される。

■−五造血細胞の分化及び増殖の調節の複雑さは、単離され、そ　。

してこれらの出来事を調節する因子が断え間なく増大するにつれて、ますます明白になって来ている。大部分、これらの因子は、広範囲の種類の機能を有する多くの他のタンパク質と共にひじょうに少量存在する。単離され、そして活性を有することが示された因子は、ポリペプチド及びタンパク質、たとえばγ−インターフェロン、血小板由来成長因子、コロニー刺激因子、インターロイキン−２、エリトロポエチン、及び多くの他のリンホカインを含む。これらの血液成分の単離、精製及び特徴化、並びに、癌治療及び癌のような疾病を研究することにそれらを使用するための、多量のこれらのペプチドの有効な調製法が実質的な興味の対象である。

聚盈文藍Ｈｏ１ｌｅｙ星（！’　、　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔ］５Ａ（１９８０）７７　：　５９８９〜５９９２は、上皮細胞増殖阻害剤の精製法を記載する。Ｎｅｌｓｅｎ−Ｈａｍ＋ｉｌ　ｔｏｎ及びＨａｌｌｅｙ、　皿ｋ（１９８３）８０　：　５６３６〜５６４０は、アフリカグリーンモンキイ細胞（ＢＳＣ−１）により分泌されるタンパク質への放射性標識されたメチオニンの導入における増殖阻害剤及び上皮増殖因子の効果を記載する。　Ｍｏｒｇａｎ星＆、＋　Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅ＋１ｌｏｓｔ、　（１９８０）４２　：　１６５２〜６０は、ヒト血小板第４因子についてのアミノ酸配列を提供する。Ｄａｗｅｓ呈？、＋　Ｔｈｒｏａ＋ｂ、Ｒｅｓ。

（１９８３）２９　：　５６９〜８１及び５ｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ星？、＋　Ａｃｔａ　Ｍｅｄ。

Ａｕ５ｔｒｉａｃａ　（追加）（１９７９）　６　：　３７５〜９は、血小板第４因子に対するポリクローナル抗体を報告する。　Ｌａｈｌｅｒ、　Ｔｈｒｏｍｂ。

匠（１９８１）２１　：　１２１〜７は、β−トロンボグロブリン及び血小板第４因子の配列及び構造を比較する。　Ｔａｙｌｏｒ星ｅ　＋ｊＮａｔｕｒｅ（１９８２）　２９７：　３０７〜３１２は、血小板第４因子がニワトリ漿尿膜上に無血管領域を生成し、そして脈管形成阻害剤が、高い脈管形成性腫瘍、たとえば脳腫瘍を治療するために臨床的にたぶん使用され得ることを開示する。しかしながら、もう１つの脈管形成阻害剤であるプロタミンは、培養された腫瘍細胞及び多くの場合、さらに刺激された増殖性に対して直接的な細胞毒性を有さないことが示された。Ｍａｃｈｉｎ星ｅ　＋ＩＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．　（１９８４）ニア２：　２２１〜２２２は、血小板第４因子の結晶化を開示する。　Ｆｏｌｋ＋＋＋ａｎ星＆、＋　Ｃ１ｂａ　Ｓｙｗ＋ｐｏｓｉｕａ＋　１００（１９８３）、　１３２〜１３９（Ｐｉｔｍａｎ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ）は、血小板第４因子がヘパリン促進性脈管形成を阻害することを開示する。

主恩Ω亙ｈ　・次の特性：正常な細胞増殖を阻害しないで、腫瘍増殖を阻害でき；　ｐｐ６ｏサーク自己リン酸化を刺激でき；腫瘍細胞から５２ＫＤのタンパク質の分泌を刺激できる特性の少なくとも１つを有し；そして哺乳類の血小板から単離できるポリペプチドの少なくとも一部分に実質的に等しいアミノ酸配列を有し、並びに前記指摘された特性の少なくとも１つを表すことを特徴とするポリペプチド組成物、及びそれらの使用方法が提供される。

図面の簡単な説明第１図は、無胸腺症マウスの腫瘍の増殖に対する血小板第４因子の効果を比較する図であり：第２図は、血小板第４因子の合成遺伝子の制限地図であり；そして第３図は、予想されるアミノ酸を示す血小板第４因子のＤＮＡ配列である。

豆定■旦唱至皿監ポリペプチド、その誘導体又はその相同体を含む組成物及びそのような組成物を含む製剤（哺乳類の腫瘍細胞増殖を阻害する）が提供される０本発明のポリペプチドは、血小板の抽出により得られるエタノール性ＨＣｊ２画分中に存在する血小板第４因子と称される天然に存在するポリペプチドに関連する。

ヒト血小板第４因子は、次の配列を有する：Ｅ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｄ−Ｌ− Ｑ−Ｃ−Ｌ−Ｃ−Ｖ−Ｋ−Ｔ−Ｔ−５−Ｑ−Ｖ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−）１−　Ｉ−Ｔ− Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｖ−１−Ｘ−Ａ−Ｇ−Ｐ−Ｈ−Ｃ−Ｐ−Ｔ−Ａ−Ｑ−Ｌ−１−Ａ− Ｔ−Ｌ−に−Ｎ−Ｇ−Ｒ−に−Ｉ−Ｃ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｙ４−に −Ｉ−１−に−に−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｓ　。

前記ポリペプチドは、中温で（０〜２５°Ｃ）、低いｐ）ｌで、一般的に約３以下のｐＨで、普通ｐＨ２で安定する。そのポリペプチドは、約５，０００〜８，０００、より正確には約６．０００〜７，５００、より特定には約７．０００の分子量を有する。血小板第４因子は、高等哺乳類、特に霊長類、より特定にはヒトの血小板から得られる。

使用されるポリペプチド化合物は、約１５〜８０個のアミノ酸を有し、ここで天然に存在するポリペプチド及びその類似相同体は、約６０〜７５個のアミノ酸、より普通には約６５〜７２個のアミノ酸を有し、そしてフラグメントは一般的に、約１５〜６０個のアミノ酸、より普通には約１５〜３５個のアミノ酸ををするであろう、約５８〜７２個のアミノ酸、より特定には６９　、７０又は７１個のアミノ酸を有するポリペプチドが興味の対象である。

これらのポリペプチドは、他の化合物、たとえば抗原、レセプター、ラベル又は同様のものに連結され得る。

血小板第４因子様物質、たとえば血小板第４因子フラグメント、ポリペプチドの突然変異体、及び損なわれていない血小板第４因子の生物学的活性、たとえば細胞増殖調節活性、レセプター結合活性及び免疫活性を存する、血小板第４因子本発明のポリペプチドは、血小板第４因子の相同体、すなわち血小板第４因子の活性に相当する少なくとも１種の生物学的活性を有し、そして血小板第４因子と実質的に同じアミノ酸配列を有する少なくとも１種のアミノ酸配列を有する化合物を含み、ここで前記相同体は、血小板第４因子よりも長いか又は短いアミノ酸数のものであり得る。生物学的活性は、天然に存在する血小板第４因子との免疫学的交叉反応性、又は高い親和性を有する血小板第４因子レセプター分子への結合性を含む。“免疫学的交叉反応性”とは、本発明の新規ポリペプチドにより誘発された抗体が、少な（とも血小板第４因子が変性状態にある場合、損なわれていない血小板第４因子と交叉反応するであろうことを意味する。“高い親和性”とは、少なくとも約１０１Ｍの解離定数（Ｋｄ）を意味する。

“血小板第４因子レセプター”とは、高い親和性により血小板第４因子を特異的に結合する細胞の表面上の結合部位を意味し、その結合は飽和可能であり、そして構造的に無関係のポリペプチドにより阻害されない、そのポリペプチドのいくつかはまた、腫瘍細胞の増殖の阻害を含む、天然に存在する血小板第４因子の細胞増殖調節活性も保持することができる。

その細胞増殖調節活性は、通常還元された天然に存在する血小板第４因子とは異なる。そのポリペプチドは、少なくとも１つの生物学的活性配列、たとえば免疫学的又はエピトープ活性配列を有するであろうし、そして１以上の生物学的活性配列を有することもでき、ここでそのような配列は、生物学的特性のために天然に存在する生成物と競争することができる。

アミノ酸の定義は、下記に示される。

生−一（Ｎｅ）脂肪族（ＡＩ）置換されていない　Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、１．Ｐ置換されているオキシ　Ｓ、Ｔチ　オ　Ｃ，Ｍアミド　Ｎ、Ｑ芳香族（Ａｒ）置換されていない　Ｆ置換されている　Ｙ複素環式　Ｈ，Ｗ皿里土九太（ｐＨ６，０で）塩基性　Ｋ、Ｒ酸性　Ｄ、Ｅカッコ内の略語は、特定のアミノ酸グループに関する。置換されていないとは、グリシンに存在するカルボキシ及びアミノ基以外のへテロ置換基を意味しない。

そのアミノ酸は、天然に存在するし一アミノ酸である。

中性アミノ酸はまた、非極性又は極性（但し、荷電されていない）のＲ基を有するものとして記載され得る。これらの定義内にあるアミノ酸は、次の通りである：非極性アミノ酸　Ａ、Ｖ、Ｌ、１．Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｗ極性アミノ酸　Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ，Ｙ、Ｎ、Ｑ。

対象の組成物は、酸性（アニオン性）Ｎ−末端及び塩基性（カチオン性）Ｃ−末端を有し、ここでそれらの荷電された領域は、６〜１５個のアミノ酸、普通６〜１２個のアミノ酸を有し、ここでその領域は、少なくとも５０％、普通６０％がイオン性アミノ酸であり、そして普通９０％を越えないアミノ酸がイオン性アミノ酸である、６〜８個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むであろう。

少なくとも約６０個のアミノ酸を有するこれらの組成物は、少な（とも２５個のアミノ酸、普通少なくとも４ｏ個のアミノ酸及び約７０個よりも少なく、普通約６５個よりも少ないアミノ酸により分離された荷電されたドメインを有するであろう。荷電されたドメインを分離するアミノ酸結合配列は、普通アニオン性アミノ酸よりも過剰のカチオン性アミノ酸を有し、それは一般的に約１．５：３、普通約２＝１の比で存在し、そしてその化合物のｐＫは約６．５〜８、特定には約７．４である。

結合配列に普通２個のジスルフィド架橋が存在し、ここでその架橋性ジスルフィドは、約２０〜４５、普通２２〜４０個のアミノ酸を別々に分離し、好ましくは約２５〜３９個のアミノ酸により分離される。Ｎ−末端に近いシスティンは、Ｎ −末端から約８〜１６個目のアミノ酸であり、そしてＣ−末端に近いシスティンは、Ｃ−末端から約１２〜４５個目、普通２２〜４０個目のアミノ酸であろう。

対象の組成物は、普通Ｎ−末端に近い配列を有し、これは、ペンタペプチドＥ− Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｄ　、より普通にはデカペプチドＥ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｄ−Ｌ −Ｑ−Ｃ、ＬばしばペンタデカペプチドＥ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｑ− Ｃ−Ｌ−Ｃ−Ｖ−に−Ｔの式を有し、そしテヨリ頻繁ニハ次ノ式：％式％を有し、ここで文字は国際協定に従って次の意味を有する：Ａ−アラニン　Ｐ− プロリンＣ−システィン　Ｑ−グルタミンＤ−アスパラギンｆｉＲ−アルギニンＥ−グルタミン酸　Ｓ−セゾンＧ−グリシン　Ｔ−）レオニンＨ−ヒスチジン　■−バリンＬ−ロイシンアミノ酸の保存性置換が行われ得ることが理解されるべきである。保存性置換は、Ｄ及びＥ、Ｆ及びＹ；Ｋ及びＲ；Ｇ及びＡ；Ｎ及びＱ；Ｖ、Ｉ及びＲ；及び同様のものを含む置換を含む。多くの場合、非保存性置換は、たとえばＫ又はＲをＮ又はＱにより置換することが所望されるであろう、この置換は、特別な興味の対象のものであり、ここで二塩基性アミノ酸のプロテアーゼ切断部位、たとえばに−Ｒ（ここでその置換は、タンパク質分解切断に対する部位を保護する）が存在する。

また、挿入又は欠失が関与し、ここで普通、挿入又は欠失は１〜２個のアミノ酸、特定には１個のアミノ酸を含むであろう。

対象の新規ポリペプチドは、大体は次の式：％式％を有し、ここでＡｃ、ｌ（酸性領域）は、Ｎ−末端領域であり、そして１０〜２０個のアミノ酸を有することを特徴とし、このうち４〜５個のアミノ酸が酸性であり、初めの３個のうち少なくとも２個のアミノ酸が酸性であり、２個の酸性アミノ酸は縦列に存在し、そして異なった２種の酸性アミノ酸が中性脂肪族アミノ酸により分離され；存在する２種のＣ残基は１つの中性脂肪族アミノ酸により分離され、Ｃ−Ｘ−Ｃが、２〜６個のアミノ酸によりＤもしくはＥ−Ｘ−Ｄ又はＥから分離され；Ｍ８は、２〜３０個の炭素原子の短い結合基か又は約２５〜４０個のアミノ酸かを有する中間領域であり；少なくとも１０個、普通少なくとも２０個のアミノ酸によりＡｃ、のシスティンから分離された２種のＣ残基を有し、そしてこれらのＣ残基のそれぞれは、Ａｃｍ中におけるＣ残基の１つとジスルフィド架橋を形成し；５〜７個の塩基性ア”ミノ酸及び２〜５“個、普通３〜４個の酸性アミノ酸を有し；Ｂａｇ（塩基性領域）は、Ｃ−末端領域であり、そして１２〜３０個のアミノ酸を有することを特徴とし；２対の塩基性アミノ酸ををし、その後、極性又は非極性、普通非極性の２〜３個の中性脂肪族アミノ酸が続き：Ｃ末端のアミノ酸からの１０〜１５個のアミノ酸のＰ残基を有する。

所望により、Ａｃ、は、次の式：％式％（ここで２個のアミノ酸が同じ部位で示され、どちらかのアミノ酸がその部位で存在することができる）を有し、ここで（Ｈ）は、Ｎ−末端での水素原子を表し；ａａｌｌ：ｌは、結合又は２〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸、普通酸性アミノ酸又は２〜３個の炭素原子の非極性アミノ酸であり；ａａ’・３は、結合又は２〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸、普通酸性アミノ酸又は２〜３個の炭素原子の非極性アミノ酸であり；・ａａ”は、結合又は２〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸、普通塩基性アミノ酸、３〜５個の炭素原子の極性アミノ酸又は２〜３個の炭素原子の非極性アミノ酸であり；ＸＩは、結合又は２〜６個、普通４〜６個の炭素原子を有する１〜２個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、これは脂肪族非極性又は極性アミノ酸であり；ａはＯ又は１であり；ａａ’は、非極性又は極性であり得る、２〜６個、普通２〜４個の炭素原子の脂肪族アミノ酸、又は酸性アミノ酸であり；ａａ’は、２〜６個、普通５〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸（通常非極性）であり：ａａ９は、２〜６個、普通４〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸（特に極性カルボキシアミド置換の又は塩基性アミノ酸）であり；Ｘ２は、結合又は２〜６個の炭素原子の１〜２個の脂肪族アミノ酸（特に中性アミノ酸）のアミノ酸配列であり；ａ　ａ　Ｉ　＋は、２〜６個、普通３〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸（非極性又は極性であり得る）であり；ａ　ａ　ｌ　３は、２〜６個、普通５〜６個のアミノ酸の脂肪族アミノ酸（特に非極性）であり； χ３は、結合、ヒドロキシル、１〜３個の炭素原子のアルコキシル基、アミノ又は１〜６個、普通１〜３個のアミノ酸のアミノ酸配列（普通中性の脂肪族アミノ酸及び非極性又は極性、特に極性である）であり、その初めの３個のアミノ酸は通常、中性であり、ここでＸ３はその分子を終結することができ、又はＭ　＊　＋　Ｂ　ａ　＊又は抗原に結合することができる。

その記号についての好ましいアミノ酸は、次の通りである：ａａｌ′３−結合、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ａ；ａａ”　−結合、Ｇ、Ａ、に、Ｒ，Ｓ、Ｔ；χｍ　−結合、（Ｓ又はＴ）ａ−（Ｖ、Ｌ又はＩ）ａ；ａａ’　−Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ；ａａ参　−Ｖ、Ｌ、Ｉ；ａａ”　−Ｎ、Ｑ、に、Ｒ；Ｘ”−（Ｇ又はＡ）ａ−（Ｄ又はＥ）ａ−（Ｖ、Ｌ又はＩ）ａ：ａａ”　−Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ；ａａＩ３−Ｖ、Ｌ、Ｉ；Ｘ３−結合−（Ｓ又はＴ）ｂ−（Ｇ、Ａ、Ｎ又はＱ）ａ−（Ｖ、Ｌ又はＬ）ａ− （Ｋ、Ｒ，Ｎ、Ｑ、ＨＦ又はＹ）ａ；ａはＯ又は１であり：そしてｂはＯ〜３の整数である。

所望によりＢａ、Ｉは、次の式を存するであろう：ａｏ　ａｒ　ａｚＧｓ　ａｓＫ　ａ７　ＧＫ−に−ａａ　−ａａ　−ａａ　ＡＴＲＡＲＲａａ”−Ｃ−ａａＳ３−Ｄ−ａａ”−ａａ”−ａａ”−Ｐ−ａａ”−ａａ”−ａａ４０１　Ｓ−は、４〜５個の炭素原子の脂肪族酸性アミノ酸又はそのアミ′ドであり；ａａ４Ｉ・４２・Ｓｌｎ　％Ｍ＋　ｂ２−　ｈａ°ｈ７は、２〜６個、より特定には５〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸（特に非極性）であり；ａ　ａ　４　Ｓは、２〜６個、特定には４〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸（特に非極性）、又は塩基性アミノ酸であり；ａ　ａ　４　？は、ヒドロキシル又はアミド置換基を有する、３〜５個の炭素原子の脂肪族アミノ酸（特に極性）、又は酸性アミノ酸で゛あり；ａ　ａ　％　Ｓは、２〜６個の炭素原子、特に４〜６個の炭素原子（非極性）又はカルボキシアミド官能価を有する４〜５個の炭素原子（極性）の中性脂肪族アミノ酸であり；ａ　ａ　Ｓ　？は、２〜６個の炭素原子、特に２〜３個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸、又は塩基性アミノ酸であり；ａａｓ’ｔは、２〜６個、普通４〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸（普通非極性）、又は塩基性アミノ酸であり；ａ　ａ　６０は、脂肪族又は芳香族アミノ酸、特に４〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸であり；ａ、ｂａｈは、結合又は４〜５個の炭素原子の極性脂肪族アミノ酸、特にカルボキシアミド置換のアミノ酸であり；ａ　ａ　＆！１は、２〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸（特に非極性）であり；Ｘ′は、ヒドロキシル、１〜３個の炭素原子のアルコキシル、アミノ、又は１〜４個、普通１〜２個のアミノ酸、特定には脂肪族アミノ酸、より特定には極性及び酸性のアミノ酸のアミノ酸配列又は２〜３個の炭素原子の０〜１個の非極性アミノ酸、０〜３個の酸性アミノ酸及び０〜３個のヒドロキシル置換の脂肪族アミノ酸を存するアミノ酸配列であり、ここでＸ４はその分子を終結せしめ、又は抗原又は免疫グロブリンに結合することができる。

次の定義を有する記号のアミノ酸が、特に興味の対象である：ａａ””’−Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ；ａａ　’　”７−Ｖ　、　Ｌ又はＩ；ａａ”　−Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ；ａａ”　−Ｎ、Ｏ，Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、特にＰ又はＬ；ａａＳ？−Ｇ＋Ａ＋Ｋ又はＲ；ａａ”””−Ｖ、Ｌ、１．に、Ｒ；ａａ”　−Ｖ、Ｌ、１．Ｆ、Ｈ，Ｙ；ａ　ａ　６４　′″−−結合又はＱ；ａａ”　Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ；Ｘ’　−ＣＧ、Ａ、Ｄ、又はＥ）ａ−（Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ａ、Ｇ又はＥ）ａ−（Ｄ又はＥ）ｃ−（Ｔ又はＳ）ａ；ａはＯ又は１であり；そしてＣはＯ〜２である。

所望により、Ｍ、Ｉは、次の式に含まれる少な（とも約１５個のアミノ酸の配列を含むであろう：Ｇ−ａａ”−Ｈ−Ｃ−ａａ”−ａａ”−ａａ”−ａａ４０−ａａ”−Ｘ’ここで：ａ　ａ　ｔ　３は、芳香族アミノ酸又は３〜５個の炭素原子の脂肪族極性アミノ酸、特にアミド置換のアミノ酸であり；ａ　ａ　ｔ　ｍは、２〜６個、普通５〜６個の炭素原子の脂肪族非極性アミノ酸であり；ａａｚＳは、３〜５個の炭素原子の脂肪族極性アミノ酸、特にアミド又はヒドロキシル置換のアミノ酸であり；ａａＺ’Ｔ°２９°３６は、５〜６個の炭素原子の脂肪族非極性アミノ酸であり；ａ　ａ　３１は、２〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸、特に２〜３個の非極性脂肪族アミノ酸又は塩基性アミノ酸のいずれかであり；ａ　ａ　Ｓ　ｔは、２〜６個の炭素原子の脂肪族アミノ酸、特に２〜３個の非極性脂肪族アミノ酸又は塩基性アミノ酸のいずれかであり；ａａ”は、３〜６個、普通３〜５個の炭素原子の脂肪族アミノ酸（非極性又は極性である）、特にヒドロキシル置換のアミノ酸であり；ａ　ａ　３１は、２〜６個、普通３〜５個の炭素原子の脂肪族アミノ酸（非極性又は極性である）、特にプロリン又はカルボキシアミド置換のアミノ酸であり；ａ　ａ　３　ｍは、３〜５個の炭素原子の脂肪族極性アミノ酸、普通アミド又はヒドロキシル置換のアミノ酸であり；ａ　ａ　３９は、２〜６個の炭素原子の脂肪族非極性アミノ酸であり；ａ　ａ　ａ　Ｏは、４〜５個の炭素原子の脂肪族酸性アミノ酸又はそのアミドであり；ａａ”は、５〜６個の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸であり；そしてＸは、結合、ヒドロキシル、１〜３個の炭素原子のアルコキシであり、ここでＸ５はその配列を終結することができ、又はＢａ、又は抗原に結合することができる。

次の定義を有する記号のアミノ酸が、特に興味の対象である：ａａ”−Ｆ、Ｈ，Ｙ、Ｎ、Ｑ；ａａ”°２’Ｔ＋　１９＋　３６＋　ＩＴ　Ｖ　、　ＩＬ、　、■＝ａａｚｓ＋３ｓ−３．Ｔ、Ｎ、Ｑ；ａａ”””−Ｇ、Ａ、に＋Ｒ；ａａ”−Ｐ　＋　Ｓ　、Ｔ　；ａａ”−Ｐ　＋　Ｎ　＋　Ｑ　；ａａ”−３，Ｔ、Ｎ、Ｑ；ａａ”−Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｔ；ａａ４０Ｄ　＊　Ｅ　＊　Ｎ　＋　Ｑ　；及びａａ４１−　Ｖ　、　Ｋ、又はＵ。

上記式から明らかなように、種々の保存性置換が、ポリペプチドの生理学的活性に有意に影響を及ぼさないで上記配列において行われ得る。また、１〜２個のアミノ酸の欠失及び挿入も行われ得る。普通、５よりも多くない、通常３よりも多くない変化（置換、欠失又は挿入）が、上記配列で行われるであろう。

次の配列を有する化合物が、本発明のために特に興味の対象である：゛Ｅ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｃ−Ｌ−Ｃ−Ｖ−Ｋ−Ｔ−Ｔ−５−Ｑ− Ｖ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｈ−１−Ｔ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｖ−１−Ｘ−Ａ−Ｇ−Ｐ−Ｈ−Ｃ− Ｐ−Ｔ−Ａ−Ｑ−Ｌ−Ｉ　−Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｋ−Ｎ−Ｇ−Ｒ−）ｆ　−１−Ｃ−Ｌ −Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｙ−に−に−Ｉ−１−に−に−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｓ又はその相同体、特にそれらのそれぞれのおおよその位置での４個のＣ残基及びＣ末端で又はそれに近い方の１２個のアミノ酸、特にＣ末端に近い方の１０個のアミノ酸、及びより特定には、４個の塩基性及び中性の脂肪族アミノ酸を含むＣ末端に近い方の８個のアミノ酸を含む相同体又はフラグメント、上記組成物の相同体は、通常、上記配列又は上記配列の一部において、少なくとも約８０％、より普通には少なくとも約８５％及び好ましくは、少なくとも約９０％の同じアミノ酸を有するであろう。

ハ　４　び石　の量。制本発明に使用される天然に存在するポリペプチド組成物は、高感度のバイオアッセイにより確立される場合、高純度で得られる。その天然に存在するポリペプチド組成物は、その組成物に存在する主要成分以外に、約２０重量％以下、より普通には約１０重量％以下及び好ましくは約５重量％以下のポリペプチドを有し、そしてこの汚染ポリペプチドは血小板に関連する。

血小板第４因子は、約０．３Ｍのエタノール性塩酸による血小板の抽出により得られる。劣化に対する阻害剤として、弗化フェニルメチルスルホニル及びアプロチニンがまた含まれ、前者は抽出組成物の約１〜１０重量％の濃度で存在し、そして後者は抽出組成物の約０．１〜Ｉ　ＴＩＵ／■（Ｔ　Ｉ　Ｕ−）リプシン阻害単位）の濃度で存在する。水性水酸化アンモニウムを用いて、約５にｐ）ｌを上げた後、少量の酢酸アンモニウムを添加し、そしてその溶液を遠心分離又は他の便利な手段により透明にする。

次に、タンパク質を、冷エタノール（９５％）及びエーテルを用いることによって沈殿せしめ、その沈殿物を集め、そして約３．０００以下の分子量をカットオフする透析膜を用いて０、１〜０．５Ｍの酢酸に対して透析する。残留物を凍結乾燥し、１Ｍの酢酸中に再懸濁し、透明にし、そして次にＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−１０を用いてゲル透過クロマトグラフィーによりさらに精製するために準備する。

その生成物を約ＩＭの酢酸により溶出し、そして種々の画分を適切なアンセイ技法を用いて、たとえば腫瘍増殖阻害について調べる。

増殖阻害活性を有する画分を凍結乾燥せしめ、希釈された水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｐＨ２〜３）中に再懸濁し、透明にし、そして次に高圧液体クロマトグラフィー（）ＩＰＬｃ）上でクロマトグラフィー処理し、ここでシリカ充填材は、約１６〜２０個、たとえば１８個の炭素原子の長い脂肪族鎖の被覆を有する。カラムを希釈ＴＦＡ（０，０２〜０．１％）により平衡化し、そして生成物を、希釈（０，０１〜０．１、通常的０．０４〜０．０５％）ＴＦＡ中、６０％までのアセトニトリルのアセトニトリルグラジェントにより溶出する。比較的ゆっくりした流速、一般的に約０．５〜ＩＴＩＡｌＺ分を周囲温度で用いる。画分を、腫瘍増殖阻害アッセイ又は他のバイオアッセイによりアッセイすることができる。さらに精製するために、カラムから得られた生成物を、高圧ゲル排除クロマトグラフィーを用いて精製することができる。

Ｎｏｖａｐａｋ　Ｃｐｓ逆相ＨＰＬＣにより決定された血小板第４因子活性の主なピークを凍結乾燥せしめ、そして０．１％ＴＦＡを含む４０％アセトニトリル溶液１００Ｊ１１中に再懸濁する。サンプルをヒドロキシル化されたポリエーテルゲルカラム（ＢｉｏＲａｄＴＳ）［−２５０）中に注入し、そして、０．１％ＴＦＡ中、４０％アセトニトリルから成る移動相により溶出する。それぞれの画分のアリコートを凍結乾燥せしめ、そして血小板第４因子について試験し：腫瘍細胞阻害活性を有する主なペプチドピーク（Ｒｆ−０，９）が同時溶出し、そしてまたそのピークは、このクロマトグラフィーシステムを検量するために使用される６、　ＯＯＯＭｒのインシュリンマーカーの分子量に対応する。

カラムから得られた生成物を、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動することができる。約６，０００〜８，０００の分子量でのバンドが単離される。そのバンドは、哺乳類の腫瘍細胞に対して強い増殖阻害活性を有することが示される。

天然源から血小板第４因子を単離し、又は固体支持体上でポリペプチド又はその同類物を合成する代わりに、血小板第４因子及びそのフラグメント又はその相同体並びに融合タンパク質（ここで血小板第４因子は、たとえば原核生物の遺伝子からのリーダー配列に融合される）が、ハイブリッドＤＮＡ技法により調製され得る。血小板第４因子のための構造遺伝子を、アミノ酸配列に基づいて調製されたプローブを用いて、宿主細胞のゲノムから得ることができる。ゲノムライブラリィが、そのプローブ（適当に過多で存在する）を用いて調べられ、ハイブリダイズされたフラグメントが単離され、そしてフラグメントが大きさを縮小され、そしてそのことは制限地図及び配列決定により特徴づけられる。

他方、ｃＤＮＡライブラリィを前記ゲノムライブラリィと同様にして調べ、そして完全な又は部分的な構造遺伝子が単離される場合、これらを使用することができ、ここで後者は、いずれか不明なコドンを補充するためにアダプターを用いることによって調べられる。

便利には、合成遺伝子が合成される。宿主の好ましいコドンが使用され、そしてユニークな又は数少ない制限部位が導入され得る実質的な柔軟性が合成遺伝子を用いることによって達成される。その制限部位は、遺伝子の種々の部分を変性すること、すなわち欠失、変異、トランスバージョン、挿入及び同様のものの導入において、ある程度の柔軟性を付加することができる。ペテロ二重鎖形成を妨害しないで、ハイブリダイジング連結媒体中において一緒に混合され得る一本鎖重複フラグメントを用いる方策を考案する０次にその得られた二本鎖遺伝子をクローン化し、そして精製することができる。典型的な配列は、実験部分に示される。

所望により、その遺伝子の末端は、挿入に基づいて正しい配向を確保するために異なる。その遺伝子を、発現するために、適切な発現ベクター中に挿入することができる。多くのベクターが、原核生物及び真核生物、たとえば菌類、酵母、哺乳類細胞、たとえばマウス細胞、霊長類細胞、等における発現のために利用できる。複製システムは、プラスミド、ウィルス又は染色体に由来することができる。例示的な複製システムは、Ｃｏ１Ｅ１　、λ、　ＲＳＦＩＯＩｏ　、　２　ｔａプラスミド、ＳＶ４０、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、バキュロウィルス、等を含む。

完全な遺伝子がｃＤＮＡ又は染色体ＤＮＡのいづれかとして同定された後、それは発現をもたらすために種々の方法で操作され得る。原核及び真核生物宿主の両者、たとえば細菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳類細胞、たとえば旦−ユニＣＯ３細胞、ＣＨＯ細胞、サルの腎Ｖ＆細胞、並びにカイコの細胞（ｓｔ９）が使用され得る。従って、遺伝子が、０ｎｃｏｓｔａｔｉｎ　Ｍの野生型転写及び翻訳開始領域を認識する宿主中に発現される場合、その野生型の５′−及び３′−調節領域を有する完全な遺伝子が、適切な発現ベクター中に導入され得る。種々の発現ベクターは、哺乳類ウィルス、たとえば５１ｍ１ａｎ　Ｖｉｒｕｓ　４０、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、ワタシニアウイルス、昆虫バキュロウィルス、等からの複製システムを用いて存在する。これらの複製システムは、トランスフエクタントの選択を可能にするマーカーを付与するために、及び遺伝子が挿入され得る便利な制限部位を付与するために開発されて来た。

遺伝子が、天然に存在する野生型の転写及び翻訳調節領域を認識しない宿主中に発現される場合、さらに操作が必要とされるであろう。便利には、種々の３′− 転写調節領域が知られ、そして停止コドンの下流に挿入され得る。構造遺伝子から上流の非コード５′−領域が、エンドヌクレアーゼによる制限、Ｂａｌ　３１による再切断又は同様のものによって除去され得る。他方、便利な制限部位が構造遺伝子の５′−末端近くで存在する場合、その構造遺伝子が制限され、そしてアダプターがその構造遺伝子をプロモーター領域に結合するために使用され、ここでそのアダプターは、構造遺伝子の失われたヌクレオチドを提供する。種々の方策が、転写の５’　−３’一方向において、転写調節領域及び翻訳開始領域を有し、そして調節の誘発を可能にする調節配列も含むことができるカ七ント；その開始領域の転写及び翻訳制御下での構造遺伝子；及び転写及び翻訳終結領域を付与するために使用され得る。

適切な調節配列の選択は、発現に影響を及ぼす次の要因を考慮に入れるであろう、転写調節に関しては、メツセンジャーＲＮＡ０量及び安定性が、遺伝子生成物の発現に影響を及ぼす重要な要因である。　ｍＲＮＡ０量は、特定の遺伝子のコピー数、そのプロモーターの相対的効力及びプロモーターを調節する要因、たとえばエンハンサ−又はリプレッサーにより決定される。　＋＊ＲＮＡの安定性は、リボヌクレアーゼ酵素へのｄｌｌｉＡの感受性により決定される。一般的に、エキソヌクレアーゼ消化は、ｍＲＮＡの末端での構造上の特色物の存在により阻害され：パリンドローム構造は、ヌクレオチド又は特定のヌクレオチド配列により変えられる。エンドヌクレアーゼ消化は、５ＲＮＡ内の特定の認識部位で起こるように思われ、そして安定したｍＲＮＡはこれらの部位を欠（であろう。高いレベルの翻訳を受けるｍＲＮＡはまた、そのｍＲＮＡ上のリポソームの存在により分解から保護されることもまた明らかである。

翻訳調節に関しては、ｍＲＮＡが存在する場合、発現は、開始速度（ｓ＋ＲＮＡに結合するリポソーム）、拡張速度（ｍＲＮＡを通してのリポソームのトランスロケーション）、翻訳後変性の速度及び遺伝子生成物の安定性に影響を及ぼすことによって調節され得る。拡張速度は、たぶんコドン使用法により影響され、ここで希少ｔＲＮＡのためのコドンの使用が翻訳速度を減じることができる。開始は、コード配列の起点のちょうど上流の領域で生じるように思われる。原核生物においては、はとんどの場合、この領域は、シャインーダルガルノの配列と称される、ＡＧＧＡの一致したヌクレオチド配列を含む、この配列はリポソーム結合部位に特徴を与えると同時に、上流及び下流の再配列が、好結果の開始に影響を及ぼすことができることは明らかである。発現を調節する翻訳エンハンサ−配列が検出された。構造的な特色物（これを通してリポソームが開始部位を認識する）の形成によりたぶん、リポソーム結合に影響を及ぼすことができるコード領域内にヌクレオチド配列の存在の証拠がまた強調される。開始ＡＴＣコドンに関するＡＧＧＡ配列の位置が発現に影響を及ぼすことができる。従って、それは、特定の発現速度を決定するこれらの要因のすべての相互作用である。高く発現された遺伝子は、特定の発現速度を得るために、これらの要因のすべての組合せを進化せしめた。高いレベルの遺伝子生成物を得るための発現システムの目的は、発現に影響を及ぼすかを決定された特定の領域のみならず、またいかにこれらの領域（及び従ってそれらの配列）がお互いに影響を及ぼすかを考慮すべきことである。

例示的な転写調節領域又はプロモーターは、細菌に関しては、β−ｇａｌプロモータ、ＴＡＣプロモーター、左右のλプロモーター、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−１ａｃ融合プロモーター、等；酵母に関しては、解糖酵素プロモーター、たとえばＡＤＨ−１及び−■プロモーター、ＧＰＫプロモーター及びＰＣＩプロモーター、ＴＲＰプロモーター、等：＠乳類細胞に関しては、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、アデノウィルスの主要後期プロモーター、等を含む。

その転写調節領域は、さらに、たとえば増殖媒体中での栄養物又は発現生成物の存在又は不在、温度、等により、構造遺伝子の発現の時間の調節を可能にする調節配列を含む、たとえば、構造遺伝子の発現は、バタテリオファージλＰＬプロモーター、バタテリオファージλＯＬオペレーター及びＣ１８５７温度感受性リプレッサーを含んで成る調節配列を用いて、温度により調節され得る。プロモーターの調節は、リプレッサーとオペレーターとの相互作用により達成される。

発現カセットは、適切な細胞宿主中におけるエピソーム維持のために複製システム内に含まれ、又は複製システムなしに提供され、ここでそれは宿主の中に組み込まれる。そのＤＮＡは、既知技法、たとえばリン酸カルシウム−沈殿性ＤＮＡを用いる形質転換、細胞とウィルスとの接触によるトランスフェクション、細胞中へのＤＮＡのマイクロインジェクション、又は同様の方法に従って、宿主中に導入され得る。

構造遺伝子が適切な宿主中に導入された後、その宿主はその構造遺伝子を発現するために増殖せしめられる。多くの場合、構造遺伝子の上流に及びそれと読み枠を整合してシグナル配列（分泌リーダー）（構造遺伝子の分泌を提供する）を付与することが所望される。ここに記載される例示的な分泌リーダーは、ベニシリナーゼーの分泌リーダー、α−因子、免疫グロブリン、Ｔ−細胞レセプター、外層膜タンパク質及び同様のものを含む。正しい読み枠での融合により、成熟血小板第４因子又は同類物は、培地中に分泌され得る。

追加のアミノ酸が、構造遺伝子とリーダー配列（上清液中に成熟ポリペプチドを提供するために、分泌リーダー切断のための酵素的又は化学的切断部位を付与する）との間に挿入され得る。他方、分泌リーダー配列及び構造遺伝子を含んで成る融合タンパク質は、成熟ポリペプチドの切断なしに使用され得る。さらに、細胞毒性物質、たとえば毒素Ａ−鎖フラグメント又は標的分子、たとえばホルモン又は抗体は、リーダー配列に共存結合され得、そして構造遺伝子生成物の生物学的活性に対する最少の効果を有する。

構造遺伝子及び発現の調節を付与するフランキング領域を含む構成体は、いづれか便利な手段、たとえばリン酸カルシウム沈殿性ＤＮＡを用いる形質転換、トランスフェクション、トランスダクション、接合、マイクロインジェクション、等の方法により発現宿主中に導入され得る。次に、その宿主は、通切な栄養培地中において高い密度に増殖せしめられる。プロモーターが誘発可能である場合、許容状態、たとえば温度変化、代謝生成物又は栄養物の消耗又は過多、又は同様のものが用いられるであろう。

生成物が宿主細胞に保持される場合、その細胞が収穫され、溶解され、そして生成物が抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動、等により単離され、そして精製される。生成物が分泌される場合、栄養培地が集められ、そして生成物が従来の方法、たとえばアフィニティークロマトグラフィーにより単離され得る。

野生型又は他のグリコジル化を有する組換え生成物は、グリコジル化され得るか、又はグリコジル化され得ない、一般的に、グリコジル化は、野生型グリコジル化と約５０％以下、通常約２０％以下で異なるであろう。グリコジル化の量は、特定のペプチドの配列及びそれが生成される生物体に一部依存するであろう、従って、Ｅ　コリ細胞におけるその生成物の発現は、グリコジル化されていない生成物をもたらし、そして昆虫細胞におけるその生成体の発現は、哺乳類細胞における生成物の発現よりもより低いグリコジル化をもたらすであろう。

ハ　４　び石　のための本発明のポリペプチド組成物は、種々の生理学的活性を示す。その組成物は、生体外及び生体内で腫瘍増殖を阻害するために使用され得る。本発明の組成物はまた、ｐｐ６０　ｓｒｃの自己リン酸化を刺激するためにも使用され得る。従って、その組成物は、ｐｐ６０３ｒＣ酵素のための基質として作用し、そしてポリペプチド中のチロシン位置（残基６０）でリン酸化され得る。また、ｌ！瘍細胞は、血小板第４因子により処理される場合、５２’ＫＤ　（Ｐ　５２）のタンパク質を開放するように誘導され得る。さらに、血小板第４因子又はその相同体、そのフラグメント又は競争免疫特性を有するサブ配列（フラグメント）を含む融合タンパク質が、モノクローナル抗体を生成するために、又は血小板第４因子又は免疫競争化合物、又は血小板第４因子のための細胞表面レセプターの存在の検出のための診断アッセイにおいて試薬として作用せしめるために使用され得る。

本発明の化合物は、腫瘍阻害に対して高い活性を有する。

本発明の組成物は、腫瘍細胞の増殖速度を減じるために生体外又は生体内で使用され得る。そのポリペプチド組成物は、ｌｎｇレベルで、たとえば肺、胸部、皮膚、等の腫瘍細胞増殖、特に癌及び肉腫の少なくとも約２０％の阻害を提供することができる。好ましくは、そのポリペプチド組成物は、実験部門に記載されるコロニー阻害試験によれば、腫瘍細胞増殖の少なくとも約４０％、及びより好ましくは少なくとも約５０゜％の阻害を提供するであろう。

本発明の組成物は、腫瘍を有すると思われる宿主に投与されることによって生体内で使用され得る。その組成物は、増殖の速度を減じるために、腫瘍部位、たとえば黒色腫に適用され得る。通用の方法は、腫瘍の部位、組成物の配合、投与レベル及び同様のものに依存して、注射、カテーテルによる導入、直接的な適用又は同様のことを含むことができる。投薬は、それが全身的又は局所的のいづれかに依存して異なり、そして投薬濃度は一般的に、約０．１■〜１，０００　ｐｇ／ｋｇであり、そして哺乳類、たとえば霊長類に対する合計投与量は、１回の処置当たり約０．０１〜１０■である。

血小板第４因子様物質、たとえば血小板第４因子及びその同類物は、生理学的に許容できる担体、たとえばリン酸緩衝溶液、蒸留水、賦形剤又は同様のものの中に配合され得、又はそのまま使用され得る。

血小板第４因子及びその同類物は、腫瘍細胞の存在を検出するために間接的に使用され得る。腫瘍細胞が約１〜５００　ｎｇ／−の濃度の活性剤、好ましくは約５０〜３５０　ｎｇ／−の濃度の活性剤にゆだねられる場合、ｐ５２が分泌される。従って、外部培地、たとえば栄養培地、血液、尿又は他の生体液中へのｐ５２の分泌を検出することにより、腫瘍細胞の存在をだれでも検出することができる。従って、血小板第４因子を用いて、宿主の状態及び腫瘍状態の存在又は不在をモニターすることができる。血小板第４因子は、！！瘍が、手術、転移のレベル又は同様のものをモニターすることにおいて存在するかを診断することに使用され得る。血小板第４因子様物質は、ｐ５２の分泌の誘発を提供するのに十分な量で生体外又は生体内（培養培体又は宿主）投与される０次に、そのシステムに関連する流体が、腫瘍細胞の存在の徴候としてｐ５２の存在のためにモニターされる。

血小板第４因子様物質はまた、それ自体により、好ましくは他のリンホカイン、たとえばインターフェロン、より好ましくはＴ−インターフェロンにより免疫系を刺激するためにも使用され得る。従って、その血小板第４因子物質は、他のポリペプチドと共に配合され得、そして免疫系を刺激するために、免疫抑制されている宿主に投与され得る。γ−インターフェロンは、単球細胞及びマクロファージ、並びに他の組織、たとえば内皮及び線維芽細胞中にＩａの発現を誘発することが知られている。血小板第４因子様物質は、１８発現を誘発し、そしてＴ−インターフェロンＩａ誘発を刺激し、並びに一定の量のＴ−インターフェロンの効率を増強する。血小板第４因子様物質の量は一般的に、約１〜２００、好ましくは約２〜７０ｎｇ／ｓＺの範囲の濃度を培体中に付与するために用いられるであろう、Ｔ−インターフェロンの量は、リンホカインとしてのその使用に関してと同じであり、そして一般的に約０．５〜２００ｎｇ／ａｆの範囲であろう、少なくとも約１．５、通常少なくとも２倍のＩａの発現の増強は、それ自体又は他のリンホカインと一緒に使用される場合、血小板第４因子様物質により達成され得る。投与法は、前記のようにして用いられる。

血小板第４因子様物質はまた、酵素の基質特異性を変えるために、キナーゼ、特にｐｐ６０　ｓｒｃと共に使用され得る。特に、少量、特に約０．０５〜５０ｎ／−の濃度での血小板第４因子様物質と酵素とを接触せしめることにより、キナーゼ活性、たとえばリン酸化される観察されるアミノ酸の変化（ここでチロシンがリン酸化される他に、セリンもまたリン酸化される）が増強され得る。この場合、ｐｐ６０　ｓｒｃ又は類似キナーゼの組合せが、増強された速度でチロシン及びセリンの両者のリン酸化を提供することにより、チロシン及びセリンのアミノ酸を有するポリペプチドを変性するために使用され得る。

本発明の血小板第４因子様物質はまた、モノクローナル抗体又はポリクローナル血清の産生のために、ハプテン又は抗原として、すなわち免疫原性ボテンシエーターたとえば抗原、粒子又は同様のものに連結されたハプテンとしても使用され得る。それらの抗体は、特に診断目的のために広範囲に使用され得る。それらの抗体は、血小板第４因子及び血小板第４因子レセプター、たとえば血小板第４因子に対する抗体の検出のための試薬として、単独で又は血小板第４因子様物質と一緒に使用され得る。

広範囲の種類の方策及び技法が、対象の分析物を決定するために利用できる。これらの技法は、広範囲の種類のラベル、たとえば酵素、放射性核種、螢光物質（フルオレサー）、化学ルミネネサー、酵素基質、酵素阻害剤、粒子及び同様のものを含む。その方法は、分離段１ｉ１（異種）を含むが、但し分離段階（同種）は含まれない。ラベルは、血小板第４因子様物質又は血小板第４因子に対する抗体（抗−血小板第４因子）のいづれかに共有結合され得、又は抗−血小板第４因子に向けられた抗体、たとえば抗−血小板第４因子のＦｃに接合され得る。全抗体又はそのフラグメント、たとえばＦａｂ、　Ｆ　（ａｂ）　’　ｚ＋Ｆｖ又は同様のものが使用され得る０本発明に使用される種々の診断技法を記載する多くのアメリカ合衆国特許が、発行されている。これらの特許の例として、アメリカ特許第３．７６６、１６２号；第３．７９Ｌ９３２号；第３．８１７．８３７号；第３．９９６，３４５号；及び第４，２３３．４０２号を挙げることができる。

特別なタイ゛ブのアッセイとして、ＲＩＡ、　ＥＩＡ、　ＥＭＩＴ　（登録商標）、ＥＬＩＳＡ、　５ＬＦＩＡ、　ＦＩＡが存在し、これらのすべては、市販されていて、そしてこ、のだめの試薬は、他の分析物のために利用できる０種々の試薬が、それらの試薬の性質及びそれらの相対量がアッセイの感度を最適にするために選択されるキットに供給される。

抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル血清の調製に従って従来の方法で調製され得る。それぞれの場合、適切な宿主は、対象の１又は複数のエピトープ部位を有する免疫原を注射され、続いて１又は複数回の追加免疫が注射されるであろう。ポリクローナル抗血清に関しては、宿主が混合され、そしてグロブリン画分が単離される。そのグロブリン画分は、アフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製され得る。モノクローナル抗体に関しては、宿主は前の通りに免疫化されるが、但しこの場合、肺臓が通常切除され、そして適切な融合パートナ−と融合されるであろう、所望する抗体を発現するハイブリドーマの選択の後、それらのハイブリドーマは限界希釈法、続いて選択及びクローニング、並びにさらに特徴化にゆだねられるであろう。

本発明の抗体は、天然に存在するタイプのいづれか、たとえばＩｇＡ、　ＩｇＤ、　ＩｇＥ　、及びＩｇＭ、特にＩｇＭ及び種々のサブタイプのＩｇＧ、すなわちＩｇＧ１．２．３又は４である。

得られたモノクローナル抗体は、血小板第４因子タイプの物質に類似する形状を有するであろう抗−イディオタイプ抗体の産生のだめの免疫原として使用され得る。次にこれらは、種々の用途で、血小板第４因子タイプの物質のための代用試薬として使用され得る。

発現のために使用される他に、構造遺伝子配列は、ハイブリダイゼーション及び二重配列の検出のためのプローブとして使用され得る。たとえば、ｎ＋ＲＮＡの存在及びその量は、宿主細胞中に検出され得る。

次の例は例示的であって、限定するものではない。

ｌ二」暖略語：　ＤＭＥ？ｌ−ダルベツコの変性イーグル培地、ＰＢＳ＝リン酸緩衝溶液；　Ｐ／Ｓ−ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ０．５７■／ａｔ）；ＰＣ３＝生胎児血清；　５ＤＳ−ＰＡＧＥ−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。

吉産且Ｘ工五１例１：バイオアッセイ法Ａ、ＤＮＡ合成の阻害Ｂ、軟寒天コロニー阻害Ｃ，ヌードマウス中における腫瘍増殖の阻害Ｅ、　ｐｐ６０　ＳｒＣ自己リン酸化の刺激Ｆ、マクロファージＩａ抗原の発現例２：ヒト　ハ　か゛　ハ　４　のＡ、ヒト血小板から酸−エタノール抽出Ｂ、ゲル透過クロマトグラフィーＣ０逆相高圧液体クロマトグラフィー例３：ヒト　ハ　か゛　れた　ハ　４　の　“・■ Ａ、ＤＮＡ合成の阻害Ｂ、軟寒天コロニー増殖阻害Ｃ，ヌードマウスにおける腫瘍増殖の阻害り、　Ｍｒ　５２）［のポリペプチドの特異的開放性Ｅ−ｐｐ６０　ＳｒＣ自己リン酸化の刺激例４；　ハ　４　に・して　・なモノクロ−ル　びポリクロ−ルー　のＡ、細菌性リボ多糖への血小板第４因子の架橋Ｂ、血小板第４因子及びＬＰＳ接合体によるＢａ１ｂ／ｃ牌臓細胞の生体外免疫化Ｃ，モノクローナル抗体の産生り、血小板第４因子のためのＥＬＩＳＡアンセイＥ、ポリクローナル抗−血小板第４因子抗血清の産生例５：ム　ハ牟　４　オリゴヌクレオチドの１ｌｉＡ、血小板第４因子遺伝子の合成り、クローニング及び発現プラスミドの説明Ｃ１組換え血小板第４因子遺伝子の調製例６：　え　ハ　４　の８．＋！Ａ８組換え細菌に発現されるＰＦ４の単離例７：７、）８　で８１された　ハ　４　の　８・２立Ａ、ＤＮＡ合成の阻害Ｂ、ヌードマウスにおける腫瘍の増殖の阻害Ｎｕｎｃ　９６−ウェルプレート（Ｋａｍｓｔｒｕｐｖｅｊ　９０．　ＤＫ−４＋ＯＯＯ＋Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）中に、２日目の朝のＡ３４９細胞（ヒト肺癌）を供給した。これらの細胞は、３０個よりも少ない場合、継代培養された。すべてのウェル（但し周囲のウェルを除く）中に、４Ｘ１０”個の細胞１５０ｉ、！／ウェル（９×１０４個の細胞／１０％ＦＣＳ、Ｐ／Ｓ、グルタミンを含むアッセイ培地（ＤＭＥＭ）　ａｆ）を導入した０周囲のウェルはＰＢＳ５０、Ｃ４を供給され、そして全プレートは、３７°Ｃでインキュベートされた。午後、試験化合物をアッセイ培地中に再懸濁した。すべての化合物を３回試験した。それぞれの試験ウェル中に、アッセイ培地中、試験化合物５０Ｊｉ１が供給され、そして対照ウェルはアッセイ培地５０ｍのみを供給された。次にそれぞれのプレートトを、３７°Ｃで３日間インキュベートした。

４日目、それぞれのウェル中に、　１２ｓＩ−ヨード−２′−デオキシウリジン（４Ｃｉ／■〜０．５　ｍｃｉ／　ａｆ）　（１ｉｄの同位体／−のアッセイ培地）の溶液５０ｍを添加し、そしてそれらのプレートを３７℃で一晩インキユベートした。５日目、培地をウェルから吸引し、そしてそのウェルをＰＢＳにより１回洗浄した。１００ｊｌ！のメタノールを室温で１０分間にわたって添加した。°メタノールを吸引し、そしてＩＭの水酸化ナトリウム２００Ｉをそれぞれのウェルに添加した。そのプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、そして水酸化ナトリウムをＴｉ　ｔｅｒｔｅｋプラグ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ）により除去した０次にそのプラグをγカウンターで計数した。

Ｂ、　夾　コロニー材料として、５％寒天（３，７５ｇのＮｏｂｅｌ寒天（Ｄｉｒｃｏ））、１２５ −のＷｈｅａ　ｔｏｎボトル中でオートクレーブされた蒸留水７５−１１０％ＦＣ３を含むＤＭＥＭ、１００　Ｕのペニシリン、１００Ｕのストレプトマイシン、２００ｍＭのグルタミン、及びヒト黒色腫細胞（Ａ３７５）を用いた。

試験されるべき物質は、殺菌された１２　Ｘ　７５ｍｍの試験管中に凍結乾燥せしめた。５％寒天のＤＭＥｌ’ｌによる１：１０希釈物を調製し、そして水浴中で４６°Ｃに加熱した。基層が、６−ウェル培養プレー）　（３５Ｘ１４ｍｍ）のそれぞれのウェル中に０．５％寒天溶液１−をピペットで添加することによって調製された。その層を、硬化するまで室温で放置した。Ｓ　Ａ　ｂ細胞をトリプシン化することによって調製し、そして細胞の数を計数した。その細胞を希釈し、ｌＸｌ０’個の細胞／ｌＩｉの最終濃度に希釈し、そして０．３５−の細胞をそれぞれの試験サンプル管に添加した。

１０個の試験サンプル管のそれぞれの中に、０．５％の寒天溶液０．７５０−をピペットで添加した。その混合物を穏やかに撹拌し、そしてその試験サンプル管中の内容物（試験サンプル、細胞、寒天）を、基層上に注ぎ、そして寒天が硬化するまで、室温で約２０分間放置した０次に、５％二酸化炭素／９５％空気を有する３７°Ｃの加湿インキュベーター中でそのプレートを、インキュベートした。

そのプレートを、試験物質の効力に依存して、３日後〜１０日目までコロニー増殖の阻害について調べた。コロニーの数を、８ランダム低パワー顕微鏡フイールドで計数した。

プレートが５日以上維持される予定である場合、０．３％寒天溶液の追加の１一層を試験サンプル層上にオーバーレイし、その試験サンプル層の乾燥を妨げた。

Ｃ，ヌードマウス　の　の雄のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕ”／ｎｕ”）を、Ｆｒｅｄ　ＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、シアトル、ワシントンがら得た。

１２週歳で、マウスは注射された（リン酸緩衝溶液０．２　ｍ７の体積中、約１．３Ｘ１０’個のヒト肺癌細胞（Ａ５４９）により首の部分に皮下注射された）、明白な腫瘍（約１０ｍａ＋”）が通常２０日で増殖した。それぞれのグループは５匹のマウスを含んだ、マウスは、ＰＢＳ　（対照グループ）　０．１　ｍｌにより又はＰＢＳｏ、１−中に再懸濁された試験サンプル（１，２ｊ！ｇ／注射）０．１−により腫瘍部位に２又は３日おきに注射された。処置後の１日日が、初めの日に相当し、ここで動物は試験化合物を腫瘍部位に注射された。腫瘍サイプは指示された日での続く注射の前、測定され、そしてグループ中のそれぞれの動物の腫瘍の平均サイズを示す。

Ｄ、　５２０００Ｍｒのポリペプチドノ１．４ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）又は他の細胞系を、試験サンプル（２００Ｍｇ／−の培養物）又はＰＢＳにより処理し、そして細胞培養上滑液中に開放されるポリペプチドに対する効果を決定した。

処理された及び対照培養物（血小板第４因子を含まない）を、時間Ｏ（血小板第４因子又は培地のみ（対照）の添加）で”Ｓ−メチオ；７　（５μＣｉ／ｍ／（７）Ｓ、Ａ、ｓｏｏ　Ｃｉ／ｍモル）によりパルスした。１２時間後、培養上清液を取り出し、そして初めに低速度（１、５００ｘｇで１５分間）で、次に高速度（３０，０’００ｘｇで１時間）で遠心分離し、透明にした。ポリペプチドは、透明にされた上滑液からトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈殿せしめられ、続いて１２．５％のポリアクリルアミドスラブゲルの５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた。

次に、ゲルのラジオオートグラフィーを用いて、試験サンプルにより処理されたＡ３４９細胞に由来する上滑液中における５２、ＯＯＯＭｚの１ｓ３−メチオニンラベルされたポリペプチドの存在を決定した。

Ｅ、　ｓｒｃ　’７　（７）Ｉ’ ｒｒ６０ｓｒｃを、免疫親和性クロマトグラフィーにより精製した（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ　ｌ　ｅ　、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９７９）７６　：　６２６０〜６２６４　；　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ？Ｃ？、、Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓ　ｍ　、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ。

（１９７９）４４：９０２〜９１７　）　、精製サレタ酵素（およソ０．４７ｐＭ）　５Ｉを、２０ｍＭのＡＴＰ　、　５ｍＭ（７）　ＭｇＣｆｚ　、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７，２）を含む最終反応体積３０ｍ中、試験サンプル又はＰ　Ｂ　Ｓ　１１００ｎと共に３０°Ｃで３０分間インキュベートした。

反応は２Ｘサンプル緩衝液の添加により停止され、そしてＷｅｈｉ−３！；！、Ｈ２クラス■抗原を発現するためにＴ−インターフェロンＣｒ−ＩＦＮ）により誘発され得るマウスマクロファージ細胞系である。この誘発の特徴は、いくつかの研究室により研究され、そして通常のマクロファージ誘発の正確なレプリカであることが示されている。これらの細胞を、低濃度のγ−ＩＦＮと共に又はそれを含まないで及びいくつかの濃度の試験されるべきサンプルの１つと共に増殖せしめた。

Ｔ−ＩＦＨの存在及び不在において、血小板第４因子は、螢光活性化細胞選別機（ＦＡＣ５）上で直接的な免疫螢光により測定されるようにクラス■抗原の投与量依存性増強を示した。

血小板第４因子効果の大きさは一般的であった（−２〜７０ヒト　ハ　か１の　ハ　４　の　− Ａ、ヒト　ハ　か゛の　−エ　ノール新鮮な又は凍結された血小板（５０ｇの二量）（室温で解凍された）を、エタノール（９５％）　３７５ｍＺ、濃Ｈ（／！７．５−１弗化フェニルメチルスルホニル３３■及びアプロチニン１ｄ（２３ＴＩＵ／ｄ　；ウシ肺から、Ｓｉｇｍａ　Ｃｂｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、Ａ６０１２）の２体積中に再懸濁した。その混合物を４°Ｃで一晩、撹拌し、Ｂｅｃｋｍａｎタイプ１９のローターにより８．０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、そして上滑液を除いた。その上滑液のｐＨを濃水酸化アンモニウムにより４．０に調整し、そしてそのｐ）Ｉを、濃水酸化アンモニウムの１＝１０希釈溶液により５．２に高めた。

上清液０．１！当たり２Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５，２）　１　ｗｌを添加した後、その溶液を、タイプ１９０−ターにより８．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離した。その上清液を取得し、２Ｉ体積の冷９５％エタノールを添加し、続いて４Ｉ体積の冷ジエチルエーテルを添加し、そしてその混合物を０°Ｃで一晩放置した。沈殿物をタイプ１９０−ターにより８．０ＯＯｒｐｏ＋で３゜分間遠心分離することにより集め、そしてそのベレットを約１０〜２０−の１Ｍ酢酸中に懸濁した。その酢酸分散液を、５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ透析膜（＃３）チュプ（３，５００Ｍ、をカットオフする）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により０．２　Ｍの酢酸５１！Ｘ２で透析した。抽出物を凍結乾燥せしめ、ＩＭの酢酸７、５　ｍｌ中に再懸濁し、続いて３０．　ＯＯＯｒｐｍで遠心分離した。

Ｂ、ｉ土゛・クロマトグーフィーＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−１０（２００〜４００メツシｓ　；　ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｓ）を、ＩＭの酢酸中に一晩膨潤し、十分にガス抜きし、そして次に１００Ｘ２．５ｃｍのシリコーンを裏打ちされたガラスカラム中に注ぎ、そしてＩＭの酢酸により一晩平衡化せしめた。すべての溶液は、使用する前、ガス抜きされた。

ヒト血小板２５ｇからの酸−エタノール溶解性ペプチド（タンパク質５０〜７０ｍｇ）を、ＩＭ（７）酢酸７．５　ｎｉｐ中に溶ＭＬ、そして上記カラムに適用した。画分（３，５ｍＺ）を集め、そしてアリコートを凍結乾燥せしめ、Ａ３４９ヒト肺癌細胞中への５１２５）−ヨード−２′−デオキシウリジンの取り込みの阻害について試験した。

Ｃ９゛　クロマトグラフィー腫瘍増殖阻害活性のピークを含む上記カラムからの画分（約２００ｎＨのタンパク質）を凍結乾燥せしめ、そして０．０５％（Ｖ／Ｖ）のＴＦＡ中に再懸濁した。次にそのカラムを、２３°ｃｒｏ、８ａｆｆ／分の流速で、０．０４５％ＴＦＡ中、アセトニトリルの０．６０％直線グラジェントにより溶離した。それぞれの両分のアリコートを凍結乾燥せしめ、そして上記のようにして三面アンセイした。

次に阻害活性を含む画分を、ｏ、１％ＴＦＡを含む４ｏ％アセトニトリル中に溶解し、そして水酸化ポリエーテルゲルカラム（ＢｉｏＲａｄ　ＴＳＫ−２５０）に通用され、そして０．１％ＴＦＡ中、４０％のア七ト二トリルの移動相により溶離した０両分を集め、凍結乾燥せしめ、増殖阻害活性について３回アッセイした。その活性を有する画分が溶離し、ここでインシュリンマーカーが溶離し、そしてそれは６〜８ＫＯの分子量に相当する。

次に最も高い活性を有する両分を、次のようにして５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動せしめた。逆相ＨＰＬＣ精製段階からの主要血小板第４因子活性に相当するペプチドを凍結乾燥せしめ、１２．５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｊ！　（ｐＨ６，７）　、４％のＳＤＳ、１０％のβ−メルカプトエタノール、２０％のグリセロール及び０．０１％のブロモフェノールプルを含むサンプル調製緩衝液０．０３− 中に再懸濁し、そして煮沸した（２分間）＠ｐＨ８，８で０．１％のＳＤＳを含む１７〜２７％のポリアクリルアミドグラジェントスラブゲル上に注がれた５％ポリアクリルアミド堆積ゲル上に、サンプルを負荷した。そのゲルを、サンプルが堆積ゲルを通して移動するまで１０ｍアンペアで、そして、色素がゲルの前部から底に移動するまで２０ｍアンペアで操作した。ゲルを固定し、そして０．２％のクーマシープル、５０％メタノール及び９％酢酸の溶液中で一晩染色せしめた。脱色した後、クーマシー陽性バンドをＨｏｆｆｅｒ濃度計を用いて局在下せしめた。マーカーは、インシュリン（６，ＯＯＯＭｒ）、トリプシノーゲン（２４，５００敗）、ＲＮアーゼ（１３，７００ヒ）及びアプロチニン（６，５００Ｍｒ）を含んだ、主要ペプチドは、電気泳動のこれらの条件下で６．５００ＭＨのアプロチニン標準液と同時移動した。

■ユヒト　ハ　か゛　れた　ハ　４　の　・・Ａ、−ｍＮ込ｊ」ＩＮ１ｌＤＮＡ合成に対する血小板第４因子の効果を、上記例ＩＡで記載されたアッセイを用いて形質転換された及び形質転換されていない多くの細胞系を用いて試験した。対象化合物は、次の表に示されるように、種々の培養されたヒト腫瘍細胞を阻害するが、但し正常な形質転換されていないヒト包皮線維芽細胞は阻害しなかった。

見上表量　れたヒト　にお番る　ＤＮＡ八　に・するヒト肺癌（Ａ５４９）　１００ヒト肺腺癌（Ｈ１２５）　４１ヒト黒色腫（Ａ３７５）　’　６７ヒト乳癌（ＭＣＦ−７）　３７多　−れていないヒト包皮線維芽細胞（ＨｕＦｐ、）　０＊：記載されたアンセイ条件を用いて、血小板第４因子の飽和濃度（＝　１１００ｎ／ウエル）で観察されたＡ３４９細胞への１２％Ｉ−デオキシウリジンの取り込みの最大阻害が、処理されていない対照培養物に対して５０％を雑種々の濃度の精製された血小板第４因子を用いて、上記方法を行った。次の表は、その結果を示し、示された血小板第４因子の量は、試験管中に導入された凍結乾燥された量である。その結果は、％最大阻害として報告される。

血小板第４因子（ｎｇ）　％最大阻害２０．０　８１６０．０　１００本発明のポリペプチドは、細胞増殖の効果のある阻害剤であることが上記結果から明らかである。黒色腫細胞により観察される結果に基づけば、約１ｎｇの血小板第４因子が約５０％阻害を提供するのに十分である。従って、本発明の化合物は、細胞増殖、たとえば腫瘍細胞増殖を阻害することに広く使用され得る。

Ｃ，ヌードマウス　の　の上皮成長因子のループ領域（ＥＧＦ残基１１〜２１）に対応するウシ血清アルブミン（０，２■）又は合成ペプチド（２００ｎｇ　）（ＰＢＳ中）のいづれかの注射は、腫瘍の増殖を阻害しなかった。

ヒト肺細胞（Ａ５４９）を、上記例ＩＤに記載のようにして血小板第４因子により処理した。５ＯＳ−ＰＡＧＥにより分析される場合、処理された細胞からの上滑液は、放射性ラベルされた５２％Ｍｒのタンパク質を含んだ、処理されなかった癌細胞は、最少量のこのタンパク質を開放した（血小板第４因子による処理の後、少なくとも１０倍の増大が見出された）。処理された及び対照培養物の間には、他の量的又は質的な差異は見出されなかった。

Ｅ、　ｐ６０ｓｒｃ　Ｔン　の１゛ｐｒ６０ｓｒｃの自己リン酸化を、例Ｉ已に概略された方法に従って分析した。

血小板第４因子による処理の後、スラブゲルのオートラジオグラフィーは、ｒｒ６０ｓｒｃの自己リン酸化において明らかに２倍の刺激を示した。リン酸化の増強は、チロシン残基に制限されるのみならず、またｓｒｃ酵素中のセリン位置においても見出される。

五土細菌のリボ多糖への血小板第４因子の架橋のための方法は、Ｐｒ１ｏ＋ｉ及びＣａｚｅｎａｖｅ　［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８２）　１２９９　（３）　：１１２４〜１１２９　）により開発された方法の変法である。

血小板第４因子１０ｎｇ及び細菌性リポ多＃Ｎ（ＬＰＳ；Ｓｉｇｎａ＃Ｌ−２６３）１２．５ｎｇを、蒸留水により希釈し、５００Ｉの体積にした。ＰＢＳ中、２．５％グルタルアルデヒド５０Ｊ！！を添加し、そしてその混合物を室温で３０分間インキュベートした−その反応を、ＰＢＳ中、２Ｍのグリシン５０ｐ１を添加し、そしてその混合物を室温で１時間インキュベートすることにより停止せしめた。血小板第４因子−ＬＰＳ接合体を、混合されたリンパ球ならし培地（ＭＬＣ）（下記を参照のこと）１０−により希釈し、次に生体外免疫化に使用するためにフィルターを通し殺菌せしめた。

Ｂ、ｍ　びＬＰＳ　ム　によるＢａ１ｂ／Ｃ少滋」す１九疫上。

非免疫肺臓細胞を、Ｒｅａｄｉｎｇ　［Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、　（１９８２）５３　：２６１〜２６９〕により記載された方法の変法により血小板第４因子−ＬＰＳ接合体を用いて生体外免疫化した。

２％ウサギ血清を含むＤＦＩＥＭ中において同数（４Ｘ１０’個（Ｄ細ｍ／ｄ）のＢａ１ｂ／Ｃ及びＣ５７ブラツクマウスの胸腺リンパ球を４８時間培養することによって、ＭＬＣ培地を調製した。

この培地を集め、そして−２０℃で貯蔵した。

腹膜滲出性細胞（ＰＥＣ）を、殺菌されたＰＢＳによりチオグリコレート処理されたＢａ１ｂ／Ｃマウスをフラッシュすることにより集めた。１匹のマウス相当の牌ｖ＆細胞、及び血小板第４因子−ＬＰＳ接合体１０ｎｇを含むＭＬＣ培地１０ａｆを有する培養物中に、前記ＰＥＣ細胞を添加した。その細胞を７日間培養した。

Ｃ，モ　ロール　の免疫化された肺臓細胞を集め、そして１：１の比でＳＰ２／１０骨髄腫と融合せしめ、血小板第４因子に対して特異的なモノクローナル抗体を合成するハイブリドーマを産生じた。そのハイブリドーマを、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により血小板第４因子抗体の産生について試験した。陽性のハイブリドーマを限界希釈法により２度クローン化せしめた。クローンを増殖し、免疫グロブリンクラスについて試験し、そして腹水産生のためにＢａ１ｂ／Ｃマウス中に注射した。

４０個の陽性ハイブリドーマクローンを、初めに増殖し、そして抗−血小板第４因子活性について再試験した。最も反応性のクローンのうち７個を用いて、Ｂａ１ｂ／Ｃマウス中の腹水を産生した。残るクローンを増殖し、そして凍結せしめた。

その腹水を、ＥＬＩＳＡにより血小板第４因子、血小板第４因子ペプチド−ＫＬ）Ｉ接合体及びＢＳＡに対する特異性について試験した。腹水は、血小板第４因子及び血小板第４因子ペプチド（少ない）の両者と、１：３，０００の希釈度で反応した。

免疫グロブリンを、Ｒｕ５ｓｏ、星＆、、Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８３）６５：２６９〜２７１により記載されたカプリル酸沈殿法により精製した。免疫グロブリンの典型的な分析及びオフテルロニー二重拡散分析は、すべての免疫グロブリンが１ｇＭタイプのものであることを示した。

Ｄ、　ハ　４　についてのＥＬＩＳＡアッセイ血小板第４因子を、０．１Ｍの酢酸中に希釈し、そしてウェル当たり１’Ｏｎｇを、９６−ウェルＤｙｎａｔｅｃｈ　Ｉ＋ｎ＋５ｕｌｏｎプレート中にピペットで添加した。その溶液を室温で一晩、乾燥せしめた。ＰＢＳ中、２．５％のＦｅ２と共にウェルをインキュベートすることにより、プレートを阻止した。次に、ハイブリドーマ培地、イムノグロブリン又は抗血清を、適切な希釈度で添加した０次に、プレートを３７゛Ｃで２時間インキュベートし、そしてＰＢＳ中、３．５％ＦＣ５により３度洗浄した。

Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓのアビジンービオチンホースラディシュ　ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）　ＥＬＩＳＡ試薬を、製造業者による使用法に従って使用した。

ウェルを、それぞれの段階の間で、ＰＢＳ中、２．５％ＦＣ３により洗浄した。

陽性のウェルを、溶液１〇−当たり３０％過酸化水素の４ｎｇの細菌性ＬＰＳを含む０．１　Ｍクエン酸ナトリウム溶液中、０．４■／−の旦−フェニレンジアミンの添加により可視化した。その反応を室温で３０分間続けた。その反応を、ウェル当たり１．４Ｎの硫酸中、５０ｎＨの細菌性ＬＰＳの添加により停止した。

Ｅ、ボックローナル　−　ハ　４　゛のＢａ１ｂ／Ｃマウスを、ニトロセルロース固定化血小板第４因子により免疫化した。この免疫化法の目的は、宿主によるポリペプチドの急速なりリアランスを避けるためである。この場合、免疫化は、ひじょうに少量の血小板第４因子によりもたらされ得る。

０．１Ｍ酢酸中、血小板第４因子の溶液を、小断片のニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ、　０．４５ｎ）上に点在せしめ、そして乾燥せしめた。ニトロセルロース断片を、−次免疫化のために３匹のＢａ１ｂ／Ｃマウスの腹腔内に注射した（０．３７５ｎｇ／マウス）、マウスはまた、０．１−の完全フロインドアジュバントの腹腔内注射をされた。マウスは、ニトロセルロース上に固定された血小板第４因子により２週間隔で２度追加免疫された。

追加免疫に関しては、ニトロセルロースを切り刻み、水０．１−及び不完全フロインドアジュバント０．１−と共に均質化し、そして皮下注射した（０．１２５ｎｇ／マウス）、マウス血清を、前記のＥＬＩＳＡアッセイにより、血小板第４因子・に対する特異性について試験し、そしてＨＲＰ接合性プロティンＡが第２段階の試薬として使用された。血清を、特異性を示すために、血小板第４因子ペプチド−ＫＬＨ接合体及び阻止されたプレートに対して試験した。

五１合成血小板第４因子遺伝子（高レベルの発現のために最適化された細菌性コドンを使用する）を構成した。さらに、その配列は、Ｅ。コリ中での使用のために予定され、そして多くの制限酵素認識部位が、そのコード配列の変性を容易にするためにくふうされた。可能な場合、新しい制限部位が変性されていない遺伝子のアミノ酸配列を去るが、しかしながら、多くの場合、新しい制限部位の組込みは、変性されたアミノ酸配列をもたらした。

一本鎖のオーバーラツプ配列を調製し、アニーリング培地中で組み合わし、そして連結し、血小板第４因子が単離された融合タンパク質を調製するために、読み枠を合わして発現ベクターへの挿入のための適切な末端を有する完全な遺伝子を提供した。一本鎖セグメントを、Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼにより５′−リン酸化し、そして３０ｍの反応体積（３０１のＡＴＰ、１０１１ＭのＤＴＴ、ｌｏｄのｌ’１ｇｃｊ！ｚ　、１ｎ／−のスペルミジン、１１００１ＩＩのＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，８）及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ）中で２００ｐＭのそれぞれのセグメントを組み合わすことによってアニールした。二本鎖ＤＮＡをＢｓ５ＨＩ［及びＢａａ＋ＨＩにより消化し、そして７％の純粋なポリアクリルアミドゲル上で精製した。

次の配列が調製された：ＬＣＶＫＴＴＳＱＶＲＰＲ）ＩＩＴＳＬＥＶＵＫＡＧＰ）ＩＣＰ ↑　ＡＱＬＩＡＴＬＫＮＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＬＬＩＩＫＫＬＬＥＳ　本本本ベクターｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌの制御要素は、Ｅ、コリのラクトース（ｌａｃ）オペロンのオペレーター−プロモーター領域及びｌａｃ及びｃｒｏのリポソーム結合部位から成る。このベクターは、プラスミドｐＴＲ２１３（Ｒｏｂｅｒｔｓ　星？、＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９７８）７６：７６０：ｌ及びｐＬＧ３００　［Ｇｕａｒｅｎｔｅ星ｅ　、　。

皿（１９８０）銭：５４３）に由来する。

プラスミドｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌが、ＢａｍＨＴ及びＪＩＩにより消化されたオリゴヌクレオチドリンカー：の存在下で、ｐＴＲ２１３からの０．９６Ｋｂの血１−Ｂ旦■フラグメント及びｐＬＧ３００からの５．５４Ｋｂの２旦Ｉ− 血Ｈｌフラグメントを連結することによって構成された。

このリンカ−は、次の目的の役に立つ：（１）親プラスミドから」■■及びＢａｍＨ）部位を再生すること、（２）外来性ＤＮＡの挿入のだめの追加の部位を付与すること、及び（３）挿入されたＤＮＡがｃｒｏ５　’　−ｇａｌコード配列と正しい翻訳読み枠が合うようにせしめること。

λ　−スミ’　ｔａｃ　ｃｒｏ　−ａｌ　。

発現ベクターｐｔａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌは、ｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌに類似するが、但し、ｐｔａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌのプロモーターがトリプトファンオペロンのプロモーターからの一３５領域及び上土±オペロンのブリブナウ配列（−１０ＳＩ域）から成る。このハイブリッドプロモーターは、ｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌ　よりも高いレベルの発現を可能にする。プラスミドｐｔａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌ　は、プラスミドｐＤＲ５４０（Ｒｕｓｓｅｌｌ及びＢｅｎｎｅｔｔ、Ｇｅｎｅ（１９８３）２０：２３１　：１及びｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌ　に由来する。

プラスミドｐｔａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌは２段階で構成された。初めに、ｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌプラスミドの０．８７Ｋｂ　Ｒｓａ　Ｉフラグメントを、Ｂ憇Ｈ１部位でｐＤＲ５４０中に挿入し、そしてこれは、ＤＮＡポリマラーゼＩのフレノウフラグメントの作用によりプラント末端に前もって転換されている。

挿入されたＤＮＡの配向は、ｃｒｏのリポソーム結合部位及びコード配列が、Ｉａｃのリポソーム結合部位から下流に位置するようにして存在した。その得られたプラスミド、ｐｔａｃ／ｃｒｏは、ｌａｃ及びｃｒｏの両リポソーム結合部位、及びｃｒｏのＮ−末端コード配列を含んだ、　ｐｔａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌの構成における第２段階は、それぞれｐｔａｃ／ｃｒｏ及びｐＬＧ３００プラスミドからの１．１６Ｋｂ及び５．５４ＫｂのＰｓｔＩ　−Ｂａｇ　Ｈｌフラグメントを連結することによって達成された。従って、ｐｔａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌの構造は、ｐｌａｃ／ｃｒｏ−βｇａｌに類似するが、但しハイブリッドプロモーター領域が異なる；そのプラスミドは、ｐＳＭｌ、２／Ｔａｃとして言及される。

３、　７≧＞　Ｘ　Ｑ　）１エ１１　（同時係属出願のアメリカ特許第１１５．１３９号（Ｌｉｎ星とによる）に記載される〕は、Ｂａｗ＋ＲＩ制限部位でバタテリオファージλＮ−遺伝子の３３Ｎ−末端アミノ酸をコードするＤＮＡ配列の下流に外来性遺伝子のクローニングを可能にする。４２°ＣでＣ１８５７温度域受性リプレッサーの不活性化によるλＰＬプロモーターの誘発に基づいて、外来性遺伝子生成物が、融合タンパク質（このＮ−末端配列はＮ−遺伝子のＮ−末端配列である）のＣ−末端部分として発現される。

４、ｙ−Ｌ乙ｚｖｓ１１握工〔同時係属出願のアメリカ特許第１１５、１３９号（Ｌｉｎ星＆による）に記載される〕は、ｐＢＭｌｌに由来し、そしてＮ−遺伝子の開始メチオニンの後のＢａ１ｔ）ｔｌ制限部位で直接的に外来性遺伝子のクローン化を可能にする。

５．２−Ｌ玉］−シボ団月／ＮＤＰ　（同時係属出願のアメリカ特許第１１５，１３９号（Ｌｉｎ奏上による）に記載される〕は、ｐＢＭｌｌに由来し、そしてＮ−遺伝子をコードする配列と外来性遺伝子との間に挿入される酸不安定性アスパラギン酸−ブロリンジペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する。

６、にΣ２２肛り姐Ｍｌｌ／ハＬ〔同時係属出願のアメリカ特許第１１５．１３９号（Ｌｉｎ５ｇによる）に記載される〕は、プラスミドｐＢＭ１１Ｍ４に由来し、そして変性されたアルカリホスファターゼシグナル配列から下流の）ｆｉｎｄ　ｍ、Ｓ＋＋＋ａ　ｌ又はプラスミドｐｔｒｐＥＤ５−１　［Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ及びＥｎｔａｇｅ、Ｇｅｎｅ（１９Ｂ０）９　：２７；Ｔａｃｏｎ　星？、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、（１９８０）１７７　：４２７）を、エンドヌクレアーゼＢｓ５ＨＩＩ及びＢａ５ｅ）ＩＩにより消化し、そしてｔｒｐＤ遺伝子を欠き、そして切断されたｔｒｐＥ遺伝子を有する実質的に十分な長さのフラグメントを、分離用ゲル電気泳動により単離する。

合成遺伝子を、適切なＥ、コリクローニングプラスミド中にクローン化し、プラスミドｐＨＣＰＦ４を得た。制限地図（第２図）及びヌクレオチド配列（第３図）は、図中に示される。

ｐＨｃ　ＰＦ４をＢｓ５ＨＩＩにより切断し、ａｒｇコドンの５′末端でフレノウフラグメントによりフィルインし、ＢａｍＨＩにより切断し、そしてＰＦ４をコードするフラグメントを、アガロースゲル電気泳動により精製した。そのフラグメントをｐｓＭｌ　、　２／Ｔａｃ中に挿入しく該プラスミドは、５ｔｕｌ及びＢａ５ａｌにより切断され、そしてそのポリリンカーは、Ｋ−Ｄ−Ｌ−只のためのコードを提供する）、そしてその得られたプラスミドｐＴａｃ／ＰＦ４を用いて、Ｅ、コリＮＦ１８２９を形質転換した。そのコード配列は、リンカ−からのｃｒｏ５’−末端の４個のコドンを含む２１個のコドンを有し、そしてＰＦ４のａｒｇコドンから始まった。正しいプラスミドを有するコロニーを、ミニープレプＤ　Ｎ　Ａ　（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐＤＮＡ）の制限消化により同定した。

２、ｔｒ　ＥＤ５−１／ＰＦ４の量　リ。

血小板第４因子遺伝子を、線状化されたｐｔｒｐＥＤ５−１プラスミドに連結し、プラスミドｐｔｒｐ／ＰＦ４を得、そしてその連結混合物を用いて旦−ユユ１（ＢＩＯＩ細胞を形質転換せしめた。形質転換体を、アンピシリン耐性により選択し、そしてプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ消化により分析した。

３．８Ｍ１１／ＰＦ４の８．＋１（゛　な　ハ　４　。

発現ベクターｐＢ？１１１中において開始メチオニンの下流に純粋なタンパク質として発現される合成血小板第４因子遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列は、次の通り発現ベクターｐＢＭ１１中においてバタトリオファージ λＮ−遺伝子の初めの３３個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の下流に融合する合成血小板第４因子遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列は、次の通りである：９」１１゜発現ベクターｐＢＭ１１中においてバタテリオファージλＮ−遺伝子の初めの３２個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列及び酸不活性ジペプチドＡｓｐ− Ｐｒｏ（本ネ本）の下流に融合する合成血小板第４因子遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列は、次の通りである：変性されたアルカリホスファターゼシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流に融合する合成血小板第４因子遺伝子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列は、次の通りである。予想される切断部位は、（’＊＊＊）で示さえ　ハ　４　の１０制Ａ、　え　に　４れるＰＦ４の１１、ｐＴａｃ／ＰＦ４プラスミドを含むＥ、ユｆｉＮＦ１８２９形質転換体を、１％ラクトースと共に又はそれなしで−晩増殖せしめ、回転せしめ、ｌ　ＸＬａｅｍｍｌｉ　ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で１０分間煮沸し、そして１７．５％のポリアクリルアミド−３ＤＳゲル上で電気泳動により分析した。大規模な調製のためには、１種のコロニーを、Ｌ−ブイヨン２−中で８時間、増殖せしめ、そして１％ラクトース＋抗生物質を含むし一ブイヨン１１に移し、そして３７℃で一晩増殖した。ＣｒＯ遺伝子の２１個のコドンを有する組換え血小板第４因子を次のようにして精製した２１％゛・慢りトースにより誘発された細菌１２を増殖し、次に遠心分離し、ペレットを形成し、そしてそのペレットを一７０°Ｃ゛で冷凍した。そのペレットを５０ｍＨのＴｒｉｓ　（ｐ）１７．９　）、０．２ＭのＮａＣｌ、２ｍ？１のＥＤＴＡ及び２ＩＩＩＭの２−メルカプトエタノールを含む溶液５〇−中に再懸濁した後、リゾチームを添加し、２００ｇ／ｍｌにし、そしてその混合物を、振盪しながら氷上で２０〜３０分間インキュベートした。その混合物に、Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００を添加し、１％にし、そしてその混合物を振盪しながら氷上で１０〜２０分間インキュベートし、次いでＺｗｉ　ｔｔｅｒｇｅｎｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加し、０．５％にし、次いで振盪しながら氷上で１０〜２０分間インキュベートした。その混合物をパルスしながら０．２５インチのプローブにより２〜３分間、氷上で音波処理し、ピペットで移せる混合物を得た。次にその混合物を、ＳＴＥ中、４０％スクロース１０−上に負荷し、１３．０００ｒｐｍでＳ−２８０−グーにより５℃で３０分間、回転せしめ、そしてその上滑液を除いた。ペレットを、０．ＯＩＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７，２）。

０．１５ＭのＮａＣ！！の溶液５〜１０ｗ！中に再懸濁し、そしてそのサンプルを５Ｏ５−ＰＡＧＥ　（１７，５％）により分析した。ゲルを、融合タンパク質がｌエユユ中で産生されることを示すクーマシープル染色により展開した。

２　形質転換体を３７°Ｃで増殖し、約１０８個の細胞／−（Ｌｕｒｉａブイヨン）にし、そして３−インドリル酢酸（ＩＡＡ）を添加し、約１ａ＋Ｍにし、そして増殖を約１時間続けた。アリコー）（Ｉｄ）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機により数秒間遠心分離にかけ、そしてそのペレットを、５■／ｄの臭化シアンを含む７％蟻酸溶液５００４中に再懸濁した。室温で２４時間後、アリコートを水中に１０倍に希釈し、そしてその希釈されたサンプルを、血小板第４因子について分析した。血小板第４因子は内部メチオニンを有さないので、融合タンパク質のＮ−末端メチオニン切断を有することが、天然に存在する血小板第４因子と同じアミノ酸配列を有する血小板第４因子を提供する。

１＝良々の　の　シスーム　でのＰＦ４の合計タンパク質の％ｐＴａｃ／Ｃｒｏ／ＰＦ４　５％ｐＢＭ１１／Ｎｇｅｎｅ／ＰＦ４　２０％ｐＢＭ１１／Ｎｇｅｎｅ／ＤＰ／ＰＦ４　２０％ｐＢＭ１１／ＰＡＤ／ＰＦ４　１５％ｐＢＭ１１／ＰＦ４　２％にｆ、＋１　れた　ハ　４　の　・旦Ａ０月下」ＡＩしく社）１蔓最も高い活性が、プラスミドｐＢＭ１１／Ｎｇｅｎｅ／ＰＦ４　（例ＩＡを参照のこと）からの融合タンパク質により見出された。　Ａ３４９細胞の５０％の最大阻害が、０．６７、ｗ／ウェルにより得られた。

Ｂ、ヌードマウス　の　の　の雄のヌー・ドマウスに、例ＩＣに記載のようにして２〜３日の間隔で血小板第４因子又はリン酸緩衝溶液を注射した。第４表に示されるように、血小板第４因子は、腫瘍増殖を有意に阻害した。

ｙＤＬ表腫瘍の大きさく■３）処理後の日数　対照　血小板第４因子本発明の化合物が広範囲の用途に用いられることは上記結果から明らかである。

特に、その化合物は、腫瘍状態の診断及び処理に使用され得る。治療においては、本発明の化合物は、腫瘍細胞の破壊のための他の態様の処置と共同に使用されるよ・うに、腫瘍細胞の増殖を遅めることができる。診断に関しては、本発明の化合物は、ｐ５２の産生を誘発することが見出され、その結果、その化合物の宿主への投与に基づいて、増強されたレベルのｐ５２が腫瘍細胞の存在のしるしである。これは、腫瘍細胞の切除が成功しているか、又は転移が生じているかいづれかを決定するために、腫瘍状態の処理の間、ひじょうに重要である０本発明の化合物はまた、血小板第４因子又は血小板第４因子レセプターの存在についての診断アッセイにおいて試薬としても使用され得る。

本明細書に記載されたすべての出版物及び特許出願は、当業者の熟練のレベルのしるしである。これらのすべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書中に組み込まれる。

この発明の好ましい態様を詳細に示し、そして記載したが、これによって本発明の範囲を限定するものではない。

国際調査報告ＰＣＴ／　ＵＳ８８１００６３４ＩＰＣ：　Ｃｌ２Ｎ　ｌ／２０；　Ｃｌ２Ｎ　７１００：　Ｃ０７Ｋ　１３１００；　Ａ６１Ｋ　３７１０００、Ｓ、　ＣＬ、：　４３５／２５３．４３５／３２０．５３０／３Ｂ０．５１４／２．５１４／１２Ｐａｒｔ　Ｉｌ、Ｆｉｅｌｄｓ　Ｓｅａｒｃｈｅｃｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．発現カセットであって、転写の方向に、宿主細胞中で機能する転写調節領域及び翻訳開始領域；下記の完全な配列：【配列があります】又はそのフラグメン中に含まれる少なくとも８個のアミノ酸（血小板第４因子の生物学的活性を有する）を含んで成るポリペプチドをコードする第１ＤＮＡ配列；及び前記宿主細胞中で機能する翻訳及び転写終結領域を含んで成り、ここで前記ＤＮＡ配列の発現が前記開始及び終結領域の調節制御下に存在し、そして前記転写調節領域、転写開始領域、及び翻訳及び転写終結領域の少なくとも１つが、前記ＤＮＡ配列が天然の配列である場合、血小板第４因子のための構造遺伝子に連結される天然の領域以外の領域であることを特徴とする発現カセット。
２．前記転写調節領域がプロモーター及び調節配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の発現カセット。
３．前記プロモーターが、バクテリオファージλＰＬプロモーター、細菌性ｌａｃプロモーター又は細菌性ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターを含んで成る請求の範囲第２項記載の発現カセット。
４．前記調節配列が、バクテリオファージλＯＬプロモーター、又は細菌性ｌａｃプロモーターを含んで成る請求の範囲第２項記載の発現カセット。
５．前記翻訳開始領域がＮ−遺伝子又はＣｒｏ遺伝子のリボソーム結合部位を含んで成る請求の範囲第１項記載の発現カセット。
６．前記第１ＤＮＡ配列の５′末端で正しく読み枠を整合して結合される分泌タンパク質遺伝子のリーダー配列をコードする第２ＤＮＡ配列をさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の発現カセット。
７．前記リーダー配列がバクテリオファージλＮ−遺伝子又はＣｒｏ遺伝子；又は細菌性アルカリホスファターゼ遺伝子からの約８〜約３５個のＮ−末端アミノ酸を含んで成る請求の範囲第６項記載の発現カセット。
８．前記第１ＤＮＡ配列と前記第２ＤＮＡ配列との間で正しく読み枠を整合して結合される少なくとも１個のアミノ酸をコードする第３ＤＮＡ配列をさらに含んで成る請求の範囲第６項記載の発現カセット。
９．前記第３ＤＮＡ配列が化学的切断部位又は酵素的切断部位をコードする請求の範囲第８項記載の発現カセット。
１０．前記化学的切断部位がアスパラギン酸−プロリンである請求の範囲第９項記載の発現カセット。
１１．発現カセットであって、転写の方向に、宿主細胞中で機能的な転写調節領域及び翻訳開始領域、血小板第４因子又はその同類物をコードするＤＮＡ配列と読み枠を合わして連結されるリーダー配列をコードするＤＮＡ配列、及び前記宿主細胞中で機能する翻訳及び転写終結領域を含んで成り、ここで前記ＤＮＡ配列の発現が前記開始及び終結領域の調節制御下に存在し、そして前記転写調節領域、転写開始領域、及び翻訳及び転写終結領域の少なくとも１つが、前記ＤＮＡ配列が天然の配列である場合、血小板第４因子のための構造遺伝子に連結される天然の領域以外の領域であることを特徴とする発現カセット。
１２．前記転写調節領域が、バクテリオファージλＰＬオペレーター、バクテリオファージλＯＬオペレーター、及びＣ１８５７温度感受性リプレッサーを含んで成り、ここで前記リプレッサーが前記プロモーターを調節するために前記オペレーターと相互作用し、そして前記翻訳開始領域がＮ−遺伝子リボソーム結合部位を含んで成る請求の範囲第１１項記載の発現カセット。
１３．前記転写調節領域が、（１）細菌性ｌａｃプロモーター；又は（２）ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーター及び細菌性ｌａｃオペレーターを含んで成り、そして前記翻訳開始領域がＣｒｏ遺伝子リボソーム結合部位を含んで成る請求の範囲第１１項記載の発現カセット。
１４．前記リーダー配列が、バクテリオファージλＮ−遺伝子又はＣｒｏ遺伝子、又は細菌性アルカリホスファターゼ遺伝子からの約８〜約３５個のＮ−末端アミノ酸を含んで成る請求の範囲第１２及び１３項のいづれか１項記載の発現カセット。
１５．下記のアミノ酸配列：【配列があります】中に少なくとも８個のアミノ酸のポリペプチドをコードする約５ｋｂｐよりも少ないＤＮＡ配列。
１６．血小板第４因子又はその同類物を含んで成るポリペプチドを調製するための方法であって；転写の方向に、宿主細胞中で機能する転写調節領域及び翻訳開始領域；前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列及び前記宿主細胞中で機能する翻訳及び転写終結領域を含んで成る発現カセット（ここで前記ＤＮＡ配列の発現が前記開始及び終結領域の調節制御下に存在し、そして前記転写調節領域、転写開始領域、及び翻訳及び転写終結領域の少なくとも１つが、前記ＤＮＡ配列が天然の配列である場合、血小板第４因子のための構造遺伝子に連結される天然の領域以外の領域であり、それによって前記ポリペプチドが発現される）を含む宿主細胞を栄養培地中で増殖せしめ；そして前記ポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
１７．前記宿主細胞がＥ．コリ細胞である請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．血小板第４因子又はその同類物のＮ−末端に融合される第１ポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を調製するための方法であって；転写の５′−３′方向に、転写調節領域；翻訳開始領域；前記血小板第４因子又はその同類物をコードする第２ＤＮＡ配列と読み枠を合わして連結される前記第１ポリペプチドをコードする第１ＤＮＡ配列；及び翻訳及び転写終結領域を含んで成るＤＮＡ発現カセットを含む宿主細胞を栄養培地中で増殖せしめ；そして前記融合タンパク質を単離することを含んで成る方法。
１９．前記単離の後、前記融合タンパク質を再び折りたたむことをさらに含んで成る請求の範囲第１８項記載の方法。
２０．前記第１ポリペプチドが、バクテリオファージλＮ−遺伝子又はＣｒｏ遺伝子、又は細菌性アルカリホスファターゼ遺伝子からの約８〜約３５個のＮ−末端アミノ酸を含んで成る請求の範囲第１８項記載の方法。
２１．前記第１ポリペプチドが、バクテリオファージλＮ−遺伝子又はＣｒｏ遺伝子；又はアルカリホスファターゼ遺伝子からの約８〜約３５個のＮ−末端アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含んで成る請求の範囲第１８項記載の方法。
２２．前記発現カセットが、前記第１ＤＮＡ配列と前記第２ＤＮＡ配列との間に少なくとも１個のアミノ酸をコードする第３ＤＮＡ配列をさらに含んで成る請求の範囲第１８項記載の方法。
２３．前記第３ＤＮＡ配列が化学的切断部位又は酵素的切断部位をコードする請求の範囲第２２項記載の方法。
２４．前記化学的切断部位がアスパラギン酸−プロリンである請求の範囲第２３項記載の方法。
２５．前記単離の後、前記酸不安定ジペプチドを切断し、それによって前記ポリペプチドを開放することをさらに含んで成る請求の範囲第２３項記載の方法。
２６．形質転換された宿主細胞であって；転写の方向に、宿主細胞中で機能的な転写調節領域及び翻訳開始領域；血小板第４因子又はその同類物を含んで成るポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配列と読み枠を合わして連結されるリーダー配列をコードする第１ＤＮＡ配列；及び前記宿主細胞中で機能する翻訳及び転写終結領域を含んで成る発現カセットを含有し；ここで前記転写調節領域、転写開始領域、及び翻訳及び転写終結領域の少なくとも１つが、前記ＤＮＡ配列が天然の配列である場合、血小板第４因子のための構造遺伝子に連結される天然の領域以外の領域であり、そして前記第２ＤＮＡ配列発現が前記開始及び終結領域の調節制御下にあることを特徴とする細胞。
２７．前記細胞がＥ．コリ細胞である請求の範囲第２６項記載の細胞。
２８．多くの腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、血小板第４因子又はその同類物を含んで成る、増殖阻害量のポリペプチドと前記腫瘍細胞とを接触することを含んで成る方法。
２９．生理学的に許容できる担体中に血小板第４因子又はその同類物の細胞増殖障害量を含んで成る腫瘍細胞増殖阻害組成物。
３０．融合タンパク質であって、前記タンパク質のＣ−末端で血小板第４因子又はその同類物及び前記血小板第４因子又はその同類物のＮ−末端に融合された、バクテリオファージλＮ−遺伝子又はＣｒｏ遺伝子、又は細菌性アルカリホスファターゼ遺伝子からの約８〜約３５個のＮ−末端アミノ酸を含んで成る融合タンパク質。
３１．前記血小板第４因子又はその同類物と前記Ｎ−末端アミノ酸との間に少なくとも１個のアミノ酸の中央領域をさらに含んで成る請求の範囲第３０項記載の融合タンパク質。
３２．前記中央領域が化学的切断部位又は酵素的切断部位を含んで成る請求の範囲第３１項記載の融合タンパク質。