FI100336B - Ilmentämiskasetti, menetelmä ja isäntäsolu fuusioproteiinin valmistami seksi - Google Patents

Ilmentämiskasetti, menetelmä ja isäntäsolu fuusioproteiinin valmistami seksi Download PDF

Info

Publication number
FI100336B
FI100336B FI885031A FI885031A FI100336B FI 100336 B FI100336 B FI 100336B FI 885031 A FI885031 A FI 885031A FI 885031 A FI885031 A FI 885031A FI 100336 B FI100336 B FI 100336B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
platelet factor
dna sequence
amino acids
gene
region
Prior art date
Application number
FI885031A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI885031A0 (fi
FI885031A (fi
Inventor
George J Todaro
Daniel Twardzik
Original Assignee
Oncogen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncogen filed Critical Oncogen
Publication of FI885031A0 publication Critical patent/FI885031A0/fi
Publication of FI885031A publication Critical patent/FI885031A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI100336B publication Critical patent/FI100336B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/522—Alpha-chemokines, e.g. NAP-2, ENA-78, GRO-alpha/MGSA/NAP-3, GRO-beta/MIP-2alpha, GRO-gamma/MIP-2beta, IP-10, GCP-2, MIG, PBSF, PF-4, KC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

ILMENTÄMISKASETTI, MENETELMÄ JA ISÄNTÄSOLU FUUSIOPROTEIININ VALMISTAMISEKSI
RISTIVIITTAUS SUKULAISHAKEMUKSIIN 100336 Tämä hakemus on jatko-osa hakemukseen sarjanumeroltaan 115.139, jätetty 30.10.1987 ja hakemukseen sarjanumeroltaan 020.609, jätetty 2.3.1987, jälkimmäisen ollessa jaettu hakemuksesta sarjanumeroltaan 912.407, jätetty 26.9.1986, joka on jaettu hakemuksesta sarjanumeroltaan 712.302, jätetty 15.3.1985, nyt US-patentti nro 4 645 828, myönnetty 24.2.1987, joka on jatko-osa hakemukseen sarjanumeroltaan 592.969, jätetty 23-3.1984, nyt US-patentti nro 4 590 003, myönnetty 20.5.1986, jotka hakemukset on liitetty tähän yhteyteen viitteeksi.
JOHDANTO
Tekninen alue
Esitetään solujen kasvunsäätelykoostumuksia, joissa yhdisteet edullisesti inhiboivat kasvainsolujen kasvua.
Tausta
Vertarauodostavien solujen itsensä ja niiden aikaansaaman erilaistumisen ja kasvun säätelyn monimutkaisuus on tullut lisääntyvällä tavalla ilmeiseksi, kun näitä tapahtumia säätelevien eristettyjen tekijöiden joukko jatkuvasti kasvaa. Enimmäkseen nämä tekijät ovat mukana äärimmäisen pieninä määrinä lukuisten muiden proteiinien yhteydessä, jotka suorittavat monia erilaisia toimintoja. Tekijöitä, jotka on eristetty ja joilla on todettu olevan aktiivisuutta, ovat polypeptidit ja proteiinit, kuten ^-interferoni, verihiu-taleperäonen kasvutekijä, kasvustoja stimuloiva tekijä, interleukiini-2, erytropoietiini, sekä lukuisat muut lymfo-kiinit. olennaisen kiinnostavaa on näiden verikomponenttien eristys, puhdistus ja karakterisointi sekä näiden peptidien suurten määrien valmistus niiden mahdollisen käytön vuoksi syövän hoidossa, sekä niiden käytön vuoksi tutkittaessa sairauksia, kuten syöpää.
100336
Asiaanliittyvä kirjallisuus
Holley et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1980) 77;5989-5992, kuvaavat epiteelisolujen kasvuinhibiittoreiden puhdistusta. Nelsen-Hamilton ja Holley, kuten edellä, (1983) 80:5636-5640, kuvaavat kasvuinhibiittorin ja epidermaalisen kasvutekijän vaikutusta radiomerkityn metioniinin liittymiseen proteiineihin, jotka on eristetty afrikkalaisista vihreistä apinoista (BSC-l). Morgan et ai♦, Thromb. Haemost.
(1980) 42:1652-60 antavat aminohapposekvenssin humaaniveri-hiutaletekijälle 4. Dawes et ai., Thromb. Res. (1983) 29:569-81 ja Schernthaner et ai., Acta Med. Austriaca (suppl.) (1979) (5:375-9 esittävät polyklonaaliset vasta-aineet verihiutaletekijälle 4. Lawler, Thromb. Res. (1981) 2^: 121-7 vertaa β-tromboglobuliinin ja verihiutaletekijän 4 sekvenssejä ja rakenteita. Taylor et ai., Nature (1982) 297:307-312 esittivät, että verihiutaletekijä 4 tuottaa veri-suonettoman vyöhykkeen kananpojan verinahan allantoiinikal-volle ja että angiogenesiksen inhibiittoreita voidaan mahdollisesti käyttää kliinisesti hoitamaan erittäin angiogeenisiä kasvaimia, kuten aivokasvaimia. Protamiinista, eräästä angiogenesiksen inhibiittorista, kuitenkin osoitettiin, että sillä ei ole suoraa sytotoksisuutta viljellyille kasvainso-luille ja joissakin tapauksissa se jopa stimuloi kasvua. Machin et ai., j. Mol. Biol. (1984) 172:221-222 esittivät verihiutaletekijän 4 kiteytyksen. Folkman et ai. Ciba Symposium 100:ssa (1983) s. 132-139 (pitman Books, London) esittivät, että verihiutaletekijä 4 inhiboi hepariinin edis-tämää angiogenesistä.
KEKSINNÖN YHTEENVETO
Käyttöön tarjotaan ilmentämiskasetti, menetelmä ja transformoitu prokaryoottinen isäntäsolu fuusioproteiinin valmistamiseksi, joille on tunnusomaista se, että ilmentämis-kasetin transkription säätelyalue käsittää bakteriofaagi-lambda-PL-promoottorin, bakteriofaagi-lambda-0L-operaatto- 3 100336 rin ja lämpötilaherkän C1857-repressorin, jolloin represso-ri vuorovaikuttaa operaattorin kanssa säätäen promoottoria, ja jossa translaation aloitusalue käsittää N-geenin riboso-mien sitoutumiskohdan, kuten on esitetty patenttivaatimuksissa 1, 4 ja 13.
LYHYT KUVAUS PIIRROKSISTA
Kuva 1 on kartta, joka vertaa verihiutaletekijän 4 vaikutusta kasvaimen kasvuun kateenkorvattomissa hiirissä.
Kuva 2 on restriktiokartta verihiutaletekijän 4 synteettisestä geenistä; ja
Kuva 3 on verihiutaletekijän 4 DNA-sekvenssi, joka osoittaa ennustetut aminohapot.
SPESIFISTEN TOTEUTUSMUOTOJEN KUVAUS
Käyttöön tarjotaan koostumukset, jotka koostuvat polypepti-deistä, niiden johdannaisista, fragmenteista tai analogeista, ja näitä koostumuksia sisältävät formuloinnit, jotka inhiboivat nisäkkäiden kasvainsolujen kasvua. Kohdepolypeptidit ovat sukua luonnossa esiintyvälle polypeptidille, jota kutsutaan verihiutaletekijäksi 4 ja joka on läsnä verihiutaleita uuttamalla saadussa HCl-fraktiossa.
Humaanilla verihiutaletekijällä 4 on seuraava sekvenssi: E-A-E-E-D-G-D-L-Q-C-L-C-V-K-T-T-S-Q-V-R-P-R-H-I-T- S-L-E-V-I-K-A-G-P-H-C-P-T-A-Q-L-I-A-T-L-K-N-G-R-K- x_c-l-d-l-q-a-p-l-y-k-k-i-i-k-k-l-l-e-s
Polypeptidit ovat stabiileita kohtuullisissa lämpötiloissa (0-25°C^' aihaisella pH-arvolla, yleensä alle 3/ tavallisesti pH-arvossa 2. Polypeptidien molekyylipaino on alueella noin 4 100336 5.000-8.000, tarkemmin alueella noin 6-000-7.500, vielä tarkemmin noin 7.000. Verihiutaletekijä 4 saadaan korkeampien nisäkkäiden, erityisesti kädellisten, tarkemmin ihmisten, verihiutaleista.
Käytettävissä polypeptideissä on noin 15-80 aminohappoa, jolloin luonnossa esiintyvissä polypeptideissä ja niitä matkivissa analogeissa on noin 60-75 aminohappoa, tavallisemmin noin 65-72 aminohappoa, kun taas fragmentit ovat yleensä alueella noin 15-60 aminohappoa, tavallisemmin noin 15-35 aminohappoa. Erityisen mielenkiintoisia ovat polypeptidit, joissa on noin 58-72 aminohappoa, tarkemmin 69, 70 tai 71 aminohappoa. Nämä polypeptidit voidaan liittää muihin yhdisteisiin, kuten antigeeneihin, reseptoreihin, merkkiaineisiin tai vastaaviin .
Käyttöön tarjotaan myös verihiutaletekijä 4:n kaltaiset aineet, polypeptidin mutantit, sekä fuusiopeptidit, jotka käsittävät verihiutaletekijä 4:n tai sen funktionaalisen osan, jolla on ehjän verihiutaletekijä 4:n biologinen aktiivisuus mukaanlukien solukasvua moduloiva aktiivisuus, reseptoria sitova aktiivisuus ja immunologinen aktiivisuus.
Tämän keksinnön polypeptidit sisältävät verihiutaletekijä 4:n kongeneerejä, nimittäin yhdisteitä, joissa on ainakin yksi biologinen aktiivisuus, joka vastaa verihiutaletekijä 4:n aktiivisuutta ja jossa on ainakin yksi aminohapposekvenssi, jossa on olennaisesti sama aminohapposekvenssi kuin verihiutaleteki jä 4:ssä, jolloin kongeneerissä voi olla enemmän tai vähemmän aminohappoja kuin verihiutaletekijä 4:ssä. Biologinen aktiivisuus käsittää immunologisen ristireaktiivisuuden luonnossa esiintyvän verihiutaletekijä 4:n kanssa, tai sitoutumisen verihiutaletekijä 4:n reseptorimolekyyliin suurella affiniteetilla, "immunologisella ristireaktiivisuudella" tarkoitetaan sitä, että tämän keksinnön uuden polypeptidin indu-soima vasta-aine ristireagoi ehjän verihiutaletekijä 4:n kanssa, ainakin silloin kun verihiutaletekijä 4 on denaturoidussa tilassa. "Suurella affiniteetilla" tarkoitetaan 5 100336 dissosioitumisvakiota (Kd), joka on ainakin noin 10~7 M. "Verihiutaletekijä 4:n reseptorilla" tarkoitetaan sitoutumiskohtaa solun pinnalla, joka spesifisesti sitoo verihiutale-tekijä 4:n suurella affiniteetilla, sitoutumiskohdan ollessa tyydyttyvä ja sellainen, etteivät sitä inhiboi rakenteellisesti eri sukua olevat polypeptidit. jotkut polypeptideistä voivat myös säilyttää luonnossa esiintyvän verihiutaletekijä 4:n solukasvua moduloivan aktiivisuuden, joka sisältää kas-vainsolujen kasvun inhiboimisen. Solukasvua moduloiva aktiivisuus voi olla erilainen kuin luonnossa esiintyvällä verihiutaleteki jä 4:llä, tavallisesti pienempi, polypeptideillä on ainakin yksi biologisesti aktiivinen sekvenssi, esim. immunologinen tai epitooppinen, ja sillä saattaa olle useampi kuin yksi biologisesti aktiivinen sekvenssi, jolloin tämä sekvenssi voi kilpailla luonnossa esiintyvän tuotteen kanssa biologisissa ominaisuuksissa.
Aminohappojen määritelmät on esitetty alla.
Neutraalit (Ne) alifaattiset (Ai)
substituoimattomat G, A, V, L, I, P
substituoidut
oksi S, T
tio C, M
amido N, Q
aromaattiset (Ar)
substituoimattomat F
substituoidut γ
heterosykliset H, W
Varaukselliset (pH:Ssa 6,0)
emäksiset K, R
happamat p, E
6 100336
Suluissa olevat lyhenteet viittaavat erityisiin aminohappo-ryhmiin. Substituoimattomalla ei tarkoiteta muita heterosubs-tituentteja kuin glysiinissä läsnä olevaa karboksi- ja amino-rynmää. Aminohapot ovat luonnossa esiintyviä L-aminohappoja.
Neutraaleita aminohappoja voidaan myös kuvata siten, että niillä on polaarittomia tai polaarisia (mutta varauksettomia) R-ryhmiä. Näihin määritelmiin sisältyviä aminohappoja ovat seuraavat.
polaarittomat aminohapot A, V, L, I, P, M, F, W
polaariset aminohapot G, S, T, C, Y, N, Q
Kiinnostavilla koostumuksilla on hapan (anioninen) N-pää ja emäksinen (kationinen) C-pää, jossa varaukselliset alueet ovat 6-15 aminohappoa, tavallisesti 6-12 aminohappoa, jolloin alue sisältää 6-8 aminohapon aminohapposekvenssin, jossa ainakin 50 %, tavallisesti 60 % on ionisia aminohappoja ja tavallisesti ei enempää kuin 90 % ole ionisia aminohappoja.
Näillä koostumuksilla, joissa on ainakin noin 60 aminohappoa, on varautuneet alueet, joita erottaa ainakin 25 aminohappoa, tavallisesti ainakin 40 aminohappoa ja vähemmän kuin noin 70, tavallisesti vähemmän kuin noin 65 aminohappoa, varautuneita . alueita erottavassa aminohappojen yhdyssekvenssissä on taval lisesti ylimäärä kationisia aminohappoja anionisiin verrattuna, suhteen ollessa yleensä noin 1,5-3, tavallisesti noin 2:1, yhdisteen pK-arvon ollessa alueella noin 6,5-8, erityisesti noin 7,4.
Yhdyssekvenssissä on tavallisesti kaksi disulfidisiltaa, jolloin disulfidisilloissa on noin 20-45, tavallisesti 22-40 aminohappoa erillään, edullisesti noin 25-39 aminohapon erottamina. N-pään viereiset kysteiinit ovat noin 8-16 aminohapon päässä N-päästä, C-pään viereisten kysteiinien ollessa noin 12-45 aminohapon, tavallisesti noin 16-40 aminohapon päässä C-päästä.
g i tu.i mu . i il ’ 100336
Kiinnostuksen kohteena olevissa koostumuksissa on tavallisesti N-pään viereinen sekvenssi, jolla on pentapeptidin E-A-E-E-D kaava, tavallisemmin dekapeptidin E-A-E-E-D-G-D-L-Q-C kaava, usein pentadekapeptidin E-A-E-E-D-G-D-L-Q-C-L-C-V-K-T kaava, ja useammin sillä on seuraava kaava: E-A-E-E-D-C-D-L-Q-C-L-C-V-K-T-T-S-Q-V-R-P-R-H- jossa kirjaimilla on seuraava merkitys sopimuksen mukaisesti: A - alaniini P - proliini C - kysteiini Q - glutamiini D - asparagiinihappo R - arginiini E - glutamiinihappo S - seriini G - glysiini T - treoniini H - histidiini V - väliini L - leusiini
Tulisi ymmärtää, että aminohapoille voidaan tehdä konservatiivisia substituutioita. Konservatiivisia muutoksia ovat substituutiot, jotka käsittävät D:n ja E:n; F:n ja Y:n; K:n ja R:n; G:n ja A:n; N:n ja Q:n; V:n, I:n ja R:n, ja vastaavat. joissakin tapauksissa ei-konservatiiviset muutokset ovat toivottavia, esimerkiksi substituoitaessa K tai R N:llä tai Q:lla. Tämä substituutio on erityisen mielenkiintoinen silloin, kun kaksiemäksisen aminohapon proteaasilohkaisukohta on läsnä, esim. K-R, jolloin substituutio suojaa kohtaa proteo-lyyttiseltä lohkeamiselta.
Myöskin insertioita ja deleetioita voi olla mukana, jolloin insertioissa ja deleetioissa on tavallisesti 1-2 aminohappoa, erityisesti 1 aminohappo.
Uusilla kiinnostuksen kohteena olevilla polypeptideillä on enimmäkseen seuraava kaava.·
AcR ‘ MR " BaR
100336 jossa
Ac £ (hapan alue) on N-pääalue ja sille on tunnusomaista se, että siinä on 10-20 aminohappoa, joista neljästä viiteen on hapanta, ainakin kaksi ensimmäisestä kolmesta aminohaposta on hapanta, kaksi hapanta aminohappoa on peräkkäin ja erilliset kaksi hapanta aminohappoa ovat neutraalin alifaattisen aminohapon erottamia; kaksi C-jäännöstä on läsnä yksittäisen neutraalin alifaattisen aminohapon erottamana,- C-X-C on 2-6 aminohapon erottama D:stä tai E-X-D:stä tai E:stä; on keskialue, ollen joko lyhyt yhdistävä ryhmä, jossa on 2-30 hiiliatomia tai käsittäen noin 25-40 aminohappoa; sisältäen kaksi C-jäännöstä siten, että niitä erottaa Ac^:n kys-teiineistä ainakin 10, tavallisesti 20 aminohappoa ja kunkin näistä C-jäännöksistä muodostaessa disulfidisillan yhden ac^ :ssä olevan C-jäännöksen kanssa; lisäksi siinä on 5-7 emäksistä aminohappoa ja 2-5, tavallisesti 3-4 hapanta aminohappoa,·
Ba£ (emäksinen alue) on C-pääalue ja sille on tunnusomaista, että siinä on 12-30 aminohappoa; että siinä on kaksi paria emäksisiä aminohappoja, joita seuraa 2-3 neutraalia alifaat-tista aminohappoa, joko polaarista tai polaaritonta, tavallisesti polaaritonta; että siinä on p-jäännös 10-15 aminohapon päässä C-pään aminohaposta.
On toivottua, että Ac^tllä on seuraava kaava (siinä kohdassa, missä samalle kohdalle on osoitettu kaksi aminohappoa, voi olla kumpi tahansa aminohappo): (H)-aa1 -aa2-aa^-£-X1 -£-aa6-£-aa8-aa9-X2-C-aa11 -C-aa1 3-ξ-χ3 jossa (H) tarkoittaa vetyä N-päässä; ri 2 a » voi olla sidos tai alifaattinen aminohappo, jossa on 9 100336 2-6 hiiliatomia, tavallisesti hapan aminohappo tai polaariton aminohappo, jossa on 2-3 hiiliatomia; aa2 voi olla sidos tai alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6 hiiliatomia, tavallisesti emäksinen aminohappo, polaarinen aminohappo, jossa on 3-5 hiiliatomia, tai polaariton aminohappo, jossa on 2-3 hiiliatomia; χΐ on sidos tai aminohapposekvenssi, jossa on 1-2 aminohappoa, joissa on 2-6, tavallisesti 4-6 hiiliatomia, jotka ovat alifaattisia polaarittomia tai polaarisia aminohappoja; a on 0 tai 1 ; aa6 on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6, tavallisesti 2- 4 hiiliatomia, joka voi olla polaariton tai polaarinen, tai hapan aminohappo; aa8 on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6< tavallisesti 5-6 hiiliatomia, tavallisesti polaariton; aa^ on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6, tavallisesti 4- 6 hiiliatomia, erityisesti polaarinen karboksamidi substi-tuoituna tai emäksinen; X2 on sidos tai aminohapposekvenssi, jossa on 1-2 alifaattis-ta aminohappoa, joissa on 2-6 hiiliatomia, erityisesti neutraaleja aminohappoja; aall on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6, tavallisesti 3- 6 hiiliatomia, joka voi olla polaariton tai polaarinen; aal3 on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6, tavallisesti 5- 6 aminohappoa, erityisesti polaariton; χ3 on sidos, hydroksyyli, alkoksyyliryhmä, jossa on 1-3 hiiliatomia, amino, tai aminohapposekvenssi, jossa on 1-6, tavallisesti 1-3 aminohappoa, tavallisesti neutraali alifaatti- 10 100336 nen ja joko polaariton tai polaarinen, erityisesti polaarinen, kolmen ensimmäisen aminohapon ollessa tavallisesti neutraaleja, jolloin χ3 voi päättää molekyylin tai olla sidoksena M^:ään, Ba^:ään tai antigeeniin.
Edullisia aminohappoja symboleiksi ovat seuraavat: aal,3 _ sidos, D, E, G, A; aa2 _ sidos, G, A, K, R, S, T; X1 - sidos, (S tai T)a - (V, L tai i)a; aa6 - s, T, G, A, D, E; aa8 - v, L, I; aa9 - n, Q, K, R; X2 - (G tai A)a - (D tai E)a - (V, L tai l)a? aall - V, L, I, M, S, T; aa!3 _ v, L, I; X3 - sidos-(S tai T)b - (G* A, N tai Q)a - (v, I tai L)a “ (K, R, N, Q, H, F tai Y)a; a on 0 tai 1; ja b on kokonaisluku 0-3.
On toivottavaa, että Bar:llä on seuraava kaava: : aa«-aa«’-aa»=-J-3.aa45.K.aaW.G_K.K_ aa51-C-aa53_D_aa55-aa56_aa57-p-aa59_aa60_ M-aa^-aa^-aa^^K-K-aa^-aa^-X11 jossa aa40f56 ovat alifaattinen hapan aminohappo tai sen amidi, joissa on 4-5 hiiliatomia; aa41f42t 51f53t63i64t67 ovat alifaatti siä aminohappoja, erityisesti polaarittomia, joissa on 2-6 hiiliatomia, tarkemmin 5-6 hiiliatomia; 11 100336 aa45 on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6 hiiliatomia, erityisesti polaariton, jossa on 4-6 hiiliatomia, tai emäksinen aminohappo; aa47 on alifaattinen aminohappo, jossa on 3-5 hiiliatomia, erityisesti polaarinen, jossa on hydroksyyli- tai amidisubs-tituentti, tai hapan; aa55 on neutraali alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6 hiiliatomia, joko polaariton, erityisesti sellainen, jossa on 4-6 hiiliatomia, tai polaarinen, jossa on 4-5 hiiliatomia ja jossa on karboksamidifunktionaalisuus; aa^7 on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6 hiiliatomia, erityisesti polaariton, jossa on 2-3 hiiliatomia, tai emäksinen aminohappo; aa59 on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6, tavallisesti 4-6 hiiliatomia, tavallisesti polaariton tai emäksinen; aa^O on alifaattinen tai aromaattinen aminohappo, erityisesti 4-6 hiiliatomia sisältävä, jos on alifaattinen; aa64a on sidos tai alifaattinen polaarinen aminohappo, jossa on 4-5 hiiliatomia, erityisesti karboksamidisubstituoitu; aa68 on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6 hiiliatomia, erityisesti polaariton; χ4 on hydroksyyli, alkoksyyli, jossa on 1-3 hiiliatomia, amino tai aminohapposekvenssi, jossa on 1-4, tavallisesti 1-2 aminohappoa, erityisesti alifaattista aminohappoa, tarkemmin polaarista ja hapanta aminohappoa, ja jossa on 0-1 polaari-tonta aminohappoa, jossa on 2-3 hiiliatomia, 0-3 hapanta aminohappoa ja 0-3 hydroksyylisubstituoitua alifaattista aminohappoa, jolloin χ4 voi päättää molekyylin tai olla sidoksena antigeeniin tai immunoglobuliiniin.
Erityisen mielenkiintoinen on tapaus, jossa symboleilla on seuraavat merkitykset: 12 100336 aa40,56 _ d, e, n, Q; 3341,42,51,53,63,64,67 - v, L tai I; aa47 _ N, q, s, T, D, E; aa55 _ n, o, P, L, I, V, erityisesti P tai L; aa57 - G, A, K tai R; aa45,59 _ V, L, I, K, R; aa60 _ V» L, I, F, H, Y; aa64a _ sidos, N tai Q; aa68 _ G, A, P, L, I, V; χ4 _ (g, A, D, tai E)a - (S, T, D, A, G tai E)a - (D tai E)c - (T tai S)a; a on 0 tai 1; ja c on 0 tai 2.
On toivottavaa, että Mg sisältää sekvenssin, jossa on ainakin noin 15 aminohappoa, jotka sisältyvät seuraavaan kaavaan: P-p-aa^-aa^-aa*^ -|-aa^ -£-aa^-aa^ -aa^1 -aa^- C_aa39.H.c_aa37.aa38_aa39.aa«Vl-x5 jossa: aa23 on aromaattinen aminohappo tai alifaattinen polaarinen aminohappo, jossa on 3-5 hiiliatomia, erityisesti amidisubstituoitu aminohappo; aa24 Qn alifaattinen polaariton aminohappo, jossa on 2-6, ta-• vallisesti 5-6 hiiliatomia; aa25 on alifaattinen polaarinen aminohappo, jossa on 3-5 hiiliatomia, erityisesti amidi- tai hydroksyylisubstituoitu aminohappo ; aa27,29,30 ovat alifaattisia polaarittomia aminohappoja, joissa on 5-6 hiiliatomia; 13 100336 aa31 on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6 hiiliatomia, joko polaariton, jossa on 2-3 hiiliatomia, tai emäksinen; aa32 on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6 hiiliatomia, joko polaariton, jossa on 2-3 hiiliatomia, tai emäksinen; aa34 on alifaattinen aminohappo, jossa on 3-6, tavallisesti 3-5 hiiliatomia, joka on polaariton tai polaarinen, erityisesti hydroksyylisubstituoitu; aa37 on alifaattinen aminohappo, jossa on 2-6, tavallisesti 3- 5 hiiliatomia, joka on polaariton tai polaarinen, erityisesti proliini- tai karboksamidisubstituoitu; aa38 on alifaattinen polaarinen aminohappo, jossa on 3-5 hiiliatomia, tavallisesti amidi- tai hydroksyylisubstituoitu; aa39 0n alifaattinen polaariton aminohappo, jossa on 2-6 hiiliatomia; aa40 on alifaattinen hapan aminohappo tai sen amidi, jossa on 4- 5 hiiliatomia; aa41 on polaariton alifaattinen aminohappo, jossa on 5-6 hiiliatomia; ja χ5 on sidos, hydroksyyli, alkoksi, jossa on 1-3 hiiliatomia, jossa χ5 voi päättää sekvenssin, olla sidoksena Ba^jään tai antigeeniin.
: Erityisen mielenkiintoisia ovat seuraavat määritelmät symbo leille : 14 100336 aa23 - F, H, Y, N, Q; „24.27.29.30.41 . V. L, I; aa25,3Ö - s, T, N, Q; aa31*32 - G, A, K, R; aa31* - P, S, T; aa37 - P, N, Q; aa38 - S, T. N, Q; aa39 - G, A. P, V, L, I; aa1*0 - D, E, N, Q; ja
aa41 - V, K,tai U
Kuten edelläolevista kaavoista ilmenee, voidaan ylläolevissa sekvensseissä tehdä erilaisia konservatiivisia substituutioita vaikuttamatta merkittävästi polypeptidin fysiologiseen aktiivisuuteen. Voidaan käyttää myös 1-2 aminohapon deleetioita ja insertioita. Tavallisesti ylläolevassa sekvenssissä ei tehdä enempää kuin 5, tavallisesti ei enempää kuin 3, muutosta (substituutio, deleetio tai insertio).
Erityisen mielenkiintoisia käytettäväksi kohdekeksinnössä ovat yhdisteet, joilla on seuraava sekvenssi: e_a-e-e-d-g-d-l-q-c-l-c-v-k-t-t-s-q-v-r-p-r-h-i-t- S-L-E-V-I-K-A-G-P-H-C-P-T-A-Q-L-I-A-T-L-K-N-G-R-K-
I-C-L-D-L-Q-A-P-L-Y-K-K-I-I-K-K-L-L-E-S
tai niiden analogit, erityisesti analogit tai fragmentit, jotka sisältävät neljä C-jäännöstä suunnilleen niitä vastaa-: vissa paikoissa ja 12 aminohappoa C-päässä tai sen vieressä, erityisesti 10 aminohappoa C-pään vieressä, ja tarkemmin, 8 aminohappoa C-pään vieressä, jotka sisältävät neljä emäksistä ja neljä neutraalia alifaattista aminohappoa, ylläolevan koostumuksen analogit sisältävät tavallisesti ainakin noin 80 %, tavallisemmin ainakin noin 85 % ja edullisesti ainakin noin 90 % samaa aminohappoa ylläolevassa sekvenssissä tai ylläolevan sekvenssin osassa.
a : ilta i i i =t# 15 100336 yerihiutaletekijä 4:n ja kongeneerien valmistus Tässä keksinnössä käytetyt luonnossa esiintyvät polypeptidi-koostumukset voidaan saada erittäin puhtaana, kuten herkillä biologisilla kokeilla todistettiin. Luonnossa esiintyvissä polypeptidikoostumuksissa on vähemmän kuin noin 20 %, tavallisemmin vähemmän kuin noin 10 %, ja edullisesti vähemmän kuin noin 5 % painosta muita polypeptideitä kuin koostumuksessa oleva pääainesosa, näiden kontaminoituvien polypepti-dien liittyessä yhteen verihiutaleiden kanssa.
Verihiutaletekijä 4 voidaan saada uuttamalla verihiutaleita suunnilleen 0,3 M vetykloridihapon etanoliliuoksella. inhibiittoreina hajoamista vastaan voi mukana olla myös fenyyli-metyylisulfonyylifluoridia ja aprotiniinia, edellistä kon-sentraationa noin 1-10 paino-% uuttavasta koostumuksesta ja jälkimmäistä konsentraationa noin 0,1-1 Tiu/mg (TIU—trypsii-niä inhiboivaa yksikköä) uuttavasta koostumuksesta. Kun pH on nostettu noin 5?een ammoniumhydroksidia käyttäen, lisätään pieni määrä ammoniumasetaattia ja liuos kirkastettiin sentri-fugoimalla tai muulla tavanomaisella menetelmällä.
Proteiini saostetaan sitten käyttäen peräkkäin kylmää etanolia (95 %) ja eetteriä, sakka kerättiin ja dialysoitiin vas-* ten 0,1-0,5 M etikkahappoa käyttäen dialyysimembraania, jonka raja-arvo oli pienempi kuin noin 3-000 Mr. jäännös lyofili-soidaan, suspendoidaan uudelleen 1 M etikkahappoon, kirkastetaan ja sitten se on valmis edelleen puhdistettavaksi geeli-permeaatiokromatografiällä käyttäen Biogel P-10:ä. Tuote elu-oidaan noin 1 M etikkahapolla ja eri fraktioita seurataan käyttäen sopivaa koemenetelmää, esim. kasvainten kasvun inhiboimista .
Fraktiot, joilla on kasvainten kasvua inhiboivaa vaikutusta, lyofilisoidaan, suspendoidaan uudelleen trifluorietikkahapon (TFA) laimeaan vesiliuokseen, pH 2-3, kirkastetaan ja kroma-tografioidaan sitten korkeapainenestekromatografiällä (HPLC), jossa piidioksiditäytteellä on pinnoite, joka on muodostunut 16 100336 pitkästä alifaattisesta ketjusta, jossa on noin 16-20 hiili-atomia, esim. 18 hiiliatomia, pylväs tasapainotetaan laimealla TFA:lla (0,02-0,1 %) ja tuote eluoidaan asetonitriiligra-dientilla, jossa on korkeintaan 60 % asetonitriiliä laimeassa (0,01-0,1, tavallisesti noin 0,04-0,05 %) TFA. Käytetään suhteellisen hidasta nopeutta, yleensä noin 0,5-1 ml/min sopivissa lämpötiloissa. Fraktioita voidaan tutkia kasvainten kasvun inhibointikokeella tai muulla biologisella kokeella. Lisäpuhdistustarkoituksessa voidaan pylväästä saatu tuote puhdistaa käyttäen korkeapaineista geeliekskluusiokromato-grafiaa.
Verihiutaletekijä 4:n aktiivisuuden pääpiikki, joka on hajotettu Novapak Cig-käänteisfaasi-HPLC:llä, lyofilisoidaan ja suspendoidaan uudelleen 100 yul:aan 40 % asetonitriiliä, joka sisältää 0,1 % TFA. Näyte injektoidaan hydroksyloituun poly-eetterigeelipylvääseen (BioRad TSK-250) ja eluoidaan liikkuvalla faasilla, joka koostuu 40 % asetonitriilistä 0,1 % TFA:ssa. Erät kustakin fraktiosta lyofilisoidaan ja tutkitaan verihiutaletekijä 4:n aktiivisuuden suhteen; kasvainsoluja inhiboiva aktiivisuus eluoituu mukana pääpeptidipiikin kanssa (Rf-0,9), joka myös vastaa molekyylipainoltaan 6.000 Mr:n insuliinimarkkeria, jota käytettiin kalibroimaan tätä kroma-tografiajärjestelmää.
Pylväästä saatu tuote voidaan elektroforesoida käyttäen SDS-PAGE:a. Suunnilleen molekyylipainossa 6.000-8.000 oleva vyöhyke eristetään. Vyöhykkeellä osoitetaan olevan voimakkaasti inhiboiva vaikutus nisäkkäiden kasvainsoluihin.
Sen sijaan, että verihiutaletekijä 4 eristetään luonnollisista lähteistä tai syntetisoidaan polypeptidi tai sen kongenee-rit kiinteällä alustalla, voidaan verihiutaletekijä 4 ja sen fragmentit tai analogit sekä fuusioproteiinit, joissa verihiutaleteki jä 4 on fuusioitunut esimerkiksi prokaryoottisesta geenistä peräisin olevaan ohjaajasekvenssiin, valmistaa hyb-ridi-DNA-menetelmällä. Rakennegeenit verihiutaletekijä 4:lle voidaan saada isäntäsoluperimästä käyttäen koettimia, jotka 17 100336 on valmistettu aminohapposekvenssiin perustuen, perimäkirjas-toa voidaan tutkia käyttäen koetinta (jota voi olla sopivasti ylimäärin), hybridisoimalla eristetyt fragmentit ja fragmentit, joiden kokoa on pienennetty ja karakterisoitiin restriktiokartoituksella ja sekventoimalla.
Vaihtoehtoisesti voidaan cDNA-kirjastoa tutkia analogisesti perimäkirjaston kanssa ja jos täydellisiä tai osittaisia rakennegeenejä eristetään, voidaan näitä käyttää, jälkimmäistä käyttämällä adaptoria korvaamaan puuttuvia kodoneita.
Synteettinen geeni voidaan sopivasti syntetisoida. Käyttämällä synteettistä geeniä saavutetaan olennainen joustavuus siinä että isännälle edullisia kodoneita voidaan käyttää ja ainutlaatuisia tai harvinaisia restriktiokohtia voidaan liittää. Restriktiokohdat lisäävät joustavuuden määrää modifioimalla geenin eri osia, panemalla alkuun deleetioita, transi-tioita, transversioita, insertioita ja vastaavia, strategia keksitään käyttäen yksisäikeisiä päällekkäinmeneviä fragmentteja, jotka voidaan sekoittaa yhteen hybridisoivassa kytkentä väliaineessa poikkeamatta heterodupleksin muodostuksesta. Saatu kaksisäikeinen geeni voidaan sitten kloonata ja puhdistaa. Esimerkkisekvenssi on esitetty kokeellisessa osassa.
On toivottavaa, että geenin päät ovat erilaisia sopivan orientoitumisen varmistamiseksi insertiossa. Geeni voidaan in-sertoida sopivaan ilmentyinisvektoriin ilmentymistä varten. Suuri määrä vektoreita on saatavissa ilmentymiseen prokaryoo-teissa ja eukaryooteissa, kuten sienet, esim. hiiva, nisäkäs-solut, esim. hiiren solut, kädellisten solut, jne. Replikoi-tumisjärjestelmä voi olla peräisin plasmideista, viruksista tai kromosomeista. Kuvaavia replikoitumisjärjestelmiä ovat ColEl,^, RSF1010, 2 jimm plasmidi, SV40, adenovirus, naudan syylävirus, bakulovirus, jne.
Kun täydellinen geeni on identifioitu, joko cDNArna tai kromosomi -DNA:na, sitä voidaan sitten manipuloida monin eri tavoin ilmentymisen aikaansaamiseksi. Voidaan käyttää sekä 18 100336 prokaryoottisia että eukaryoottisia isäntiä, joita voivat olla bakteerit, hiiva, hyönteissolut, ja nisäkkäiden solut, esim. E. coli-COS-solut, CHO-solut, apinan munuaissolut, ja silkkimatosolut (sf9). Sen vuoksi silloin, kun geenin on tarkoitus ilmentyä isännässä, joka tunnistaa oncostatin M:n luonnossa esiintyvän kannan tyyppiset transkription ja translaation säätelyalueet, koko geeni luonnossa esiintyvän kannan tyyppisine 5'- ja 3'-säätelyalueineen voidaan liittää sopivaan ilmentymisvektoriin. On olemassa erilaisia ilmentymis-vektoreita, jotka käyttävät replikoitumisjärjestelmiä nisä-käsviruksille, kuten Simian virus 40, adenovirus, naudan syylävirus, lehmänrokkovirus, hyönteisten bakulovirus, jne. Nämä replikoitumisjärjestelmät on kehitetty huolehtimaan markke-reista, jotka mahdollistavat transfektanttien valikoimisen, sekä antamaan sopivat restriktiokohdat, johin geeni voidaan insertoida.
Silloin kun geenin on tarkoitus ilmentyä isännässä, joka ei tunnista luonnossa esiintyvän kannan tyyppisiä transkription ja translaation säätelyalueita, vaaditaan lisämanipulointia. Sopivasti tunnetaan erilaisia 3'-transkription säätelyalueita ja ne voidaan insertoida pysäytyskodoneista alaspäin. Ei-koo-dittava 5'-alue ylöspäin rakennegeenistä voidaan poistaa endonukleaasirestriktiolla, Bal31-leikkauksella, tai vastaavalla. Vaihtoehtoisesti silloin, kun sopiva restriktiokohta on läsnä lähellä rakennegeenin 5'-päätä, rakennegeeni voidaan restriktoida ja käyttää adaptoria yhdistämään rakennegeeniä promoottorialueeseen, jolloin adaptori korvaa rakennegeenin puuttuvat nukleotidit. Erilaisia strategioita voidaan käyttää ilmentymiskasetin aikaansaamiseksi, jolla on transkription J 5'-3’-suunnassa transkription säätelyalue ja translaation aloitusalue, jotka voivat sisältää myös säätelysekvenssejä, jotka mahdollistavat säätelyn indusoitumisen; rakennegeeni aloitusalueen transkription ja translaation säätelyssä; ja transkription ja translaation päätöalue.
Sopivien säätelyalueiden valinta ottaa huomioon seuraavat tekijät, jotka vaikuttavat ilmentymiseen. Transkription 19 100336 säätelyssä lähetti-RNA:n määrä ja stabiilisuus ovat tärkeitä tekijöitä, jotka vaikuttavat geenituotteiden ilmentymiseen. mRNA:n määrä määritellään tietyn geenin kopioiden lukumäärällä, promoottorin suhteellisella tehokkuudella ja niillä tekijöillä, jotka säätelevät promoottoria, kuten lisääjät tai repressorit. mRNArn stabiilisuutta hallitsee mRNA:n herkkyys ribonukleaasientsyymeille. yleensä eksonukleaasihajotusta inhiboi rakenteellisten tekijöiden läsnäolo mRNA:n päissä; palindromiset rakenteet, vaihtuvat nukleotidit tai spesifiset nukleotidisekvenssit. Endonukleaasihajotuksen uskotaan tapahtuvan spesifisissä tunnistuskohdissa mRNAtssa ja stabiileista mRNAjsta puutuvat nämä kohdat, on myös joitakin todisteita siitä, että mRNArt, joissa tapahtuu paljon translaatiota, ovat myös suojattuja hajoamiselta mRNA:ssa läsnäolevien ribo-somien vaikutuksesta.
Translaation säätelyn suhteen, jolla saadaan mukaan mRNA, voidaan ilmentymistä säädellä vaikuttamalla aloitusnopeuteen (ribosoinin sitoutuminen mRNA:han), venymänopeuteen (ribosomin siirtyminen mRNA:n poikki), translaation jälkeisten muutosten nopeuteen ja geenituotteen stabiilisuuteen. venymänopeuteen vaikutetaan käyttämällä kodonia, jolloin kodonien käyttö harvinaisiksi tRNArksi saattaa vähentää translaation nopeutta. Aloituksen uskotaan tapahtuvan alueessa, joka on juuri ylöspäin koodittavan sekvenssin alusta, prokaryooteissa tämä alue useimmiten sisältää AGGAin yleisen mielipiteen mukaisen nuk-leotidisekvenssin, joka on nimeltään Shine-Dalgarno-sekvens-si. Koska tämä sekvenssi karakterisoi ribosomien sitoutumiskohdan, on ilmeistä, että molemmat sekvenssit sekä ylöspäin että alaspäin voivat vaikuttaa onnistuneeseen aloitukseen, on havaittu translaation lisääjäsekvenssit, jotka säätelevät ilmentymistä. Ilmeisyys osoittaa myös nukleotidisekvenssien läsnäolon koodattavassa alueessa, joka voi aiheuttaa ribosomien sitoutumisen, mahdollisesti muodostamalla rakenneosia, joiden avulla ribosomi tunnistaa aloituskohdan. AGGA-sekvens-sin sijainti aloittavan ATG-kodonin suhteen voi vaikuttaa : ilmentymiseen. Tällöin kaikkien näiden tekijöiden yhteisvai kutus määrää tietyn ilmentymisnopeuden. voimakkaasti ilmenty- 20 100336 neet geenit ovat kehittäneet yhdistelmän kaikista näistä tekijöistä saadakseen tietyn ilmentymisnopeuden. ilmentymisjärjestelmän suunnittelun geenituotteen suurten määrien saamiseksi on otettava huomioon ei vain ne tietyt alueet, joiden on määritetty vaikuttavan ilmentymiseen, vaan myös se, kuinka nämä alueet (ja jopa niiden sekvenssit) vaikuttavat toisiinsa .
Kuvaavia transkription säätelyalueita tai promoottoreita ovat bakteereille [B-gal-promoottori, TAC-promoottori, lambda-vasen ja lambda-oikea promoottorit, trp- ja lac-promoottorit, trp-lac-fuusiopromoottori, jne.; hiivalle glykolyyttiset entsyy-mipromoottorit, kuten ADH-I ja -il -promoottorit, GPK-pro-moottori ja PGI-promoottori, TRP-promoottori, jne.; nisäkkään soluille, SV40-varhainen ja myöhäinen promoottori, adenovi-ruksen pääasialliset myöhäiset promoottorit, jne.
Transkription säätelyalue voi lisäksi käsittää säätelysek-venssit, jotka mahdollistavat rakennegeenin ilmentymisajän moduloimisen, esim. ravintoaineiden tai ilmentymistuotteiden läsnä- tai poissaololla kasvuväliaineessa, lämpötilalla, jne. Esimerkiksi rakennegeenin ilmentymistä voidaan säädellä lämpötilalla käyttäen säätelysekvenssiä, joka sisältää bakte-riofaagi-lambda p^-promoottorin, bakteriofaagi-lambda (^-operaattorin ja CI857 lämpötilaherkän repressorin. promoottorin säätely saadaan aikaan vuorovaikutuksella repressorin ja operaattorin välillä.
Ilmentymiskasetti voi sisältyä replikoitumisjärjestelmään episomaaliseen säilyttämiseen sopivassa soluisännässä tai se : voidaan antaa ilman replikoitumisjärjestelmää, jolloin se voidaan integroida isännän perimään. DNA voidaan liittää isäntään tunnetuilla menetelmillä, kuten transformaatiolla, käyttäen kalsiumfosfaatilla saostettua DNA:ta, transfektiota tartuttamalla solut viruksella, mikroinjektioimalla DNA soluihin, tai vastaavasti.
21 100336
Kun rakennegeeni kerran on liitetty sopivaan isäntään, isäntä voidaan kasvattaa ilmentämään rakennegeeniä. joissakin tapauksissa voi olla toivottavaa tarjota signaalisekvenssi (erityksen ohjaaja) lukuvaiheistuksessa ja siitä ylöspäin raken-negeenin kanssa, joka mahdollistaa rakennegeenin erittämi-sen. Kuvaavia erityksen ohjaajia, joita on kuvattu, ovat pe-nisillinaasin, 0^-tekijän, immunoglobuliinien, T-solu-resep-torien, ulompien membraaniproteiinien ja vastaavien erityksen ohjaaja. Fuusiolla sopivassa lukuvaiheistuksessa voidaan kypsä verihiutale 4 tai kongeneeri erittää väliaineeseen.
Lisäaminohappoja voidaan insertoida rakennegeenin ja ohjaaja-sekvenssin välille, jolloin syntyy entsymaattinen tai kemiallinen lohkaisukohta erityksen ohjaajan lohkaisemiseen, jolloin kypsä polypeptidi saadaan supernatanttiin. vaihtoehtoisesti voidaan erityksen ohjaajasekvenssin ja rakennegeeni-tuotteen sisältävää fuusioproteiinia käyttää lohkaisematta kypsää polypeptidiä. Lisäksi voidaan sytotoksinen aine, kuten toksiini-A-ketjufragmentti tai kohdemolekyyli, kuten hormoni tai vasta-aine, kytkeä kovalenttisesti ohjaajasekvenssiin, vaikuttaen vain vähän rakennegeenituotteen biologiseen aktiivisuuteen .
Rakennegeenin ja reuna-alueet sisältävä rakenne, joka mahdollistaa ilmentymisen säätelyn, voidaan liittää ilmentymisisän-tään millä tahansa tavanomaisella tavalla, esim. transformoimalla, esimerkiksi kalsiumfosfaatilla saostetulla DNA:11a, transfektiolla, transduktiolla, konjugoimalla, mikroinjek-tiolla, jne. Isäntä voidaan sitten kasvattaa suureen tiheyteen sopivassa ravintoväliaineessa. Kun promoottori on indu-soitavissa, käytetään ehdollisia olosuhteita, esim. lämpötilan muutosta, aineenvaihduntatuotteen tai ravintoaineen poistamista tai ylimäärää, tai vastaavaa.
Kun tuote jää isäntäsoluun, solut korjataan, liuotetaan ja tuote eristetään ja puhdistetaan uuttamalla, saostamalla, kromatografiällä, elektroforeesilla, jne. Kun tuote erittyy, voidaan ravintoväliaine kerätä ja tuote eristää tavan- 22 1 0 0 3 3 6 omaisilla tavoilla, esim. affiniteettikromatografiällä.
Yhdistelmätuotteet voidaan glykosyloida tai ei-glykosyloida, käyttäen luonnossa esiintyvän kannan mukaista tai muuta gly-kosylointia. yleensä glykosylointi ei eroa enempää kuin noin 50 %, tavallisesti ei enempää kuin noin 20 %, luonnossa esiintyvän kannan tyyppisestä glykosylaatiosta. Glykosylaa-tion määrä riippuu osaksi kunkin peptidin sekvenssistä, sekä organismista, jossa se tuotetaan. Niinpä tuotteen ilmentyminen E. coli-soluissa johtaa glykosyloimattomaan tuotteeseen, ja tuotteen ilmentyminen hyönteissoluissa johtaa yleensä vähäisempään glykosylaatioon kuin tuotteen ilmentyminen nisäkkään soluissa.
Verihiutaletekijä 4;n ja kongeneerien käytöt Tämän keksinnön polypeptidikoostumuksilla on monia erilaisia fysiologisia aktiivisuuksia. Kohdekoostumuksia voidaan käyttää inhiboimaan kasvainten kasvua in vitro ja in vivo. Kohde-koostumuksia voidaan myös käyttää stimuloimaan pp60:n auto-fosforyloitumista. Kohdekoostumukset voivat tällöin toimia kasvualustana pp60 src-entsyymille ja ne voidaan fosforyloida tyrosiiniasemassa (jäännös 60) polypeptidissä. Myös kasvain-solut voidaan indusoida vapauttamaan 52 kD:n (p52) proteiinia käsiteltynä verihiutaletekijä 4:llä. Lisäksi verihiutaleteki jä 4:ää tai sen analogeja tai fragmentteja, tai fuusiopro-teiineja, jotka sisältävät alasekvenssejä (fragmentteja), joilla on kilpailukykyisiä immunologisia ominaisuuksia, voidaan käyttää tuottamaan monoklonaalisia vasta-aineita tai toimimaan reagenssina diagnostisissa kokeissa verihiutalete-kijä 4:n tai immunologisesti kilpailukykyisten yhdisteiden havaitsemiseen tai solupintareseptorien läsnäolon havaitsemiseen verihiutaletekijä 4:Ile.
Kohdeyhdisteet ovat hyvin aktiivisia inhiboimaan kasvaimia. Kohdekoostumuksia voidaan käyttää in vitro tai in vivo alentamaan kasvainsolujen kasvunopeutta, polypeptidikoostumuksilla voidaan l ng:n määrillä saada aikaan 20 % inhibiitio 23 100336 kasvainsolujen kasvulle, erityisesti syöpien ja sarkoomien kasvulle, esim. keuhkoissa, rinnassa, ihossa, jne. Edullisesti polypeptidikoostumukset inhiboivat ainakin noin 40 % ja edullisemmin ainakin noin 50 % kasvainsolujen kasvua kokeellisessa osassa kuvatun pesäkeinhibointikokeen mukaan.
Kohdekoostumuksia voidaan käyttää in vivo antamalla isännälle, jolla epäillään olevan uudiskasvua. Kohdekoostumuksia voidaan antaa uudiskasvukohdalle, esim. melanoomaan, lisääntymisnopeuden alentamiseksi. Käyttömenetelmiä voivat olla injektointi, katetrin kiinnittäminen, suora käyttö, tai vastaava, riippuen kasvaimen paikasta, kohdekoostumuksen formuloinnista, annostasosta ja vastaavasta. Annostus voi vaihdella riippuen siitä onko se koko elimistöön vaikuttava vai paikallinen, annostuspitoisuuksien ollessa yleensä noin 0,1 yug - 1.000 pg/kg ja kokonaisannostuksen suurille nisäkkäille, kädelliset mukaanlukien, ollessa noin 0,01-10 mg käsittelyan-nosta kohti.
Verihiutaletekijä 4:n kaltaiset aineet, mukaanlukien verihiu-taletekijä 4 ja sen kongeneerit, voidaan formuloida fysiologisesti sopiviin kantajiin, kuten fosfaattipuskuroitu suolaliuos, tislattu vesi, täyteaineet, tai vastaavat, tai voidaan käyttää pelkästään.
•
Verihiutaletekijä 4:ää ja sen kongeneereja voidaan käyttää epäsuorasti havaitsemaan kasvainsolujen läsnäolo. Kun kas-vainsoluihin käytetään vaikuttavaa ainetta konsentraatioina noin 1-500 ng/ml, edullisesti noin 50-350 ng/ml vaikuttavaa ainetta, erittyy p52. Niinpä kasvainsolujen läsnäolon voi ha-* väitä havaitsemalla p52:n erittyminen ulkoiseen väliainee seen, esim. ravintoaineeseen, vereen, virtsaan tai muuhun fysiologiseen nesteeseen. Verihiutaletekijää 4 voidaan siksi käyttää seuraamaan isännän tilaa ja kasvainolosuhteiden olemassaoloa tai poissaoloa, verihiutaletekijää 4 voidaan käyttää kasvaimen olemassaolon diagnostisoimiseen leikkauksen : seurannassa, metastoitumistason diagnostisoimiseen, tai vas taavaan. verihiutaletekijä 4:n kaltaista ainetta annettaisiin 2* 100336 in vitro tai in vivo (viljelmäväliaine tai isäntä) riittävä määrä aiheuttamaan p52:n erittymisen indusoituminen. Järjestelmään liittyvää nestettä seurataan sitten p52:n läsnäolon suhteen osoittamassa kasvainsolujen läsnäoloa.
Verihiutale 4:n kaltaisia aineita voidaan käyttää myös stimuloimaan immuunijärjestelmää, joko sellaisenaan, mutta edullisesti muiden lymfokiinien, esim. interferonin, tarkemmin ^interferonin, yhteydessä. Niinpä verihiutaletekijä 4:n kaltaiset aineet voidaan muodostaa muiden polypeptidien kanssa ja antaa isännälle, joka on hylkimistä vastustava, immuuni-järjestelmän stimuloimiseksi. Gamma-interferonin tiedetään indusoivan ia:n ilmentymistä monosyyteissä ja makrofaageissa, sekä muissa kudoksissa, kuten endotelium ja fibroblastit. verihiutaleteki jä 4:n kaltaiset aineet indusoivat ia:n ilmentymistä ja stimuloivat ^-interferonin ia-induktiota nostaen annetun ^-interferoniannoksen tehokkuutta, verihiutaletekijä 4:n kaltaisia aineita käytetään yleensä saattamaan väliaineen konsentraatio alueelle noin 1-200, edullisesti noin 2-70 ng/ml. jf-interferonin määrä on tavanomainen mitä tulee sen käyttöön lymfokiinina, ollen yleensä alueella noin 0,5-200 ng/ml. ia:n ilmentymisen lisääntyminen voidaan verihiutaleteki jä 4:n kaltaisten aineiden avulla saada ainakin noin 1,5-, tavallisesti ainakin 2-kertaiseksi, kun näitä käytetään sel-\ laisenaan tai yhdessä muiden lymfokiinien kanssa, voidaan käyttää edellä kuvattuja antotapoja.
Verihiutaletekijä 4:n kaltaisia aineita voidaan myös käyttää kinaasien, erityisesti pp60 src:n yhteydessä, muuttamaan entsyymin kasvualustaspesifisyyttä. Erityisesti saattamalla ent-syymi kosketuksiin pienten määrien kanssa verihiutaletekijä 4:n kaltaista ainetta, erityisesti konsentraatioissa noin 0,05-50 ^ug/ml, voidaan kinaasiaktiivisuutta lisätä, mukaanluettuna muutos havaituissa aminohapoissa, jotka ovat fosfo-ryloituja, erityisesti sen ohella että tyrosiini fosforyloi-daan, fosforyloidaan myös seriini. Tällä tavalla voidaan pp60-src:n tai analogisten kinaasien yhdistelmää käyttää modifioimaan polypeptideitä, joissa on aminohapot tyrosiini 25 100336 ja seriini, suorittamalla sekä tyrosiiniin että seriinin fos-forylointi suuremmilla nopeuksilla.
Hakemuksen kohteena olevia verihiutaletekijä 4:n kaltaisia aineita voidaan myös käyttää hapteeneina tai antigeeneinä, hapteeneina sitoutuneena immunogeeniseen potentiaattoriin, esim. antigeeniin, hiukkaseen tai vastaavaan, monoklonaalis-ten vasta-aineiden tai polyklonaalisten seerumien tuottamiseen. vasta-aineilla voi olla paljon käyttöä, erityisesti diagnostisissa tarkoituksissa, vasta-aineita voidaan käyttää sellaisenaan tai verihiutaletekijä 4:n kaltaisten aineiden yhteydessä reagensseina verihiutaletekijä 4:n ja verihiutale-tekijä 4:n reseptorien havaitsemisessa, mukaanlukien vasta-aineet verihiutaletekijä 4:Ile.
Käytettävissä on suuri joukko suoritustapoja ja menetelmiä kiinnostuksen kohteena olevien analyyttien määrittämseksi. Nämä menetelmät käsittävät paljon erilaisia merkkiaineita, mukaanlukien entsyymit, radionuklidit, fluoresoijät, kemilu-minesoijat, entsyymikasvualustat, entsyymi-inhibiittorit, hiukkaset ja vastaavat. Menetelmät voivat käsittää erotusvai-heen (heterogeeniset) tai ei erotusvaihetta (homogeeniset). Merkkiaine voi olla kovalenttisesti sidottu joko verihiutale-tekijä 4:n kaltaiseen aineeseen tai verihiutaletekijä 4:n vasta-aineeseen (anti-verihiutaletekijä 4) tai voi liittyä vasta-aineeseen, joka on suunnattu anti-verihiutaletekijä 4:lle, esimerkiksi anti-verihiutaletekijä 4:n Fc:lle. Voidaan käyttää koko vasta-ainetta tai sen fragmentteja, mukaanlukien Fab, F(ab)'2, Fv tai vastaavat. On julkaistu joukko US-pa-tentteja, jotka kuvaavat suurta joukkoa diagnostisia menetel-.· miä, joita voidaan käyttää tässä keksinnössä. Esimerkkejä näistä patenteista ovat us-patentit nro 3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; 3.996.345; ja 4-233.402. Erityisiä analyysityyppejä ovat RIA, EIA, EMIT (rekisteröity tavaramerkki), ELISA, SLFIA, FIA, joilla kaikilla on kaupallista käyttöä ja joita varten muille analyyteille on saatavissa reagensseja.
• Erilaisia reagensseja voidaan tarjota pakkauksissa, jolloin reagenssien luonne ja niiden suhteelliset määrät on valittu analyysin herkkyyden optimoimiseksi.
26 100336
Vasta-aineet voidaan valmistaa tavanomaisella tavalla mono-klonaalisten vasta-aineiden tai polyklonaalisten seerumien valmistuksen mukaisesti, joka tapauksessa sopiva isäntä injektoidaan immunogeenin kanssa, jossa on yksi tai useampi kiinnostuksen kohteena oleva epitooppinen kohta, ja tavallisesti suoritetaan yksi tai useampi tehosteinjektio. polyklonaalisten vastaseerumien tapauksessa isännästä voidaan ottaa verta ja globuliinifraktio eristää. Globuliinifraktio voidaan edelleen puhdistaa affiniteettikromatografiällä. Monoklonaa-listen vasta-aineiden tapauksessa isäntä immunisoidaan kuten aikaisemmin, mutta tässä tapauksessa perna poistetaan normaalisti ja fuusioidaan sopivan fuusiokumppanin kanssa. Hybri-doomien valinnan jälkeen, jotka ilmentävät halutun vasta-aineen, hybridoomille suoritetaan rajoitettu laimennus, sen jälkeen ne valikoidaan ja kloonataan ja edelleen karakterisoidaan.
Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet voivat olla luonnossa ilmenevän tyypin kaltaisia, kuten IgA, igD, igE ja igM, erityisesti igM ja erilaiset lgG:n alatyypit, esim. igGl, 2, 3 tai 4.
Saatuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää immuno-geeneinä tuottamaan anti-idiotyyppisiä vasta-aineita, jotka ovat konformaatioltaan samanlaisia kuin verihiutale 4:n kaltaiset aineet. Näitä voidaan sitten käyttää korvaavina rea-gensseina verihiutaletekijä 4:n kaltaisille aineille erilaisissa sovellutuksissa.
Sen ohella, että käytetään ilmentymiseen, voidaan rakennegee-*: nisekvenssejä käyttää koettimina hybridisointiin ja dupleksi- sekvenssien havaitsemiseen. Esimerkiksi mRNAsn läsnäolo ja määrä voidaan havaita isäntäsoluissa.
Seuraavat esimerkit annetaan kuvaamistarkoituksessa eikä rajoittamaan.
27 100336
KOKEELLINEN OSA
Lyhenteet: DMEM = Dulbeccon modifioitu kotkan väliaine; PBS = fosfaattipuskuroitu suolaliuos; p/s = penisilliini/strepto-mysiini (0,57 mg/ml kumpaakin); FCS = sikiövasikan seerumi; SDS-PAGE = natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeeli-elektroforeesi.
Taulukko sisällöstä
Esimerkki 1: Bioanalyysien suoritukset A. DNA-synteesin inhibointi B. Pehmytagarpesäkkeiden inhibointi C. Kasvainten kasvun inhibointi paljaissa hiirissä E. pp60 src:n autofosforyloitumisen stimulointi F. Makrofaagi-ia-antigeenin ilmentyminen
Esimerkki 2: Verihiutaletekijä 4:n eristys humaaniverihiutaleista_ A. Happo-etanoliuutto humaaniverihiutaleista B. Geelipermeaatiokromatografia C. Käänteisfaasi-korkeapainenestekromatografia
Esimerkki 3: Humaaniverihiutaleista eristetyn verihiutale- tekijä 4:n biologinen aktiivisuus_ A. DNA-synteesin inhibointi B. pehmytagarpesäkkeiden inhibointi C. Kasvainten kasvun inhibointi paljaissa hiirissä : D· Mr 52K:n polypeptidin spesifinen vapauttaminen E. pp60 src:n autofosforyloitumisen stimulointi
Esimerkki 4: Verihiutaletekijä 4:lle spesifisten monoklonaalisten ja polyklonaalisten vasta-aineiden tuotanto_ 28 100336 A. verihiutaletekijä 4:n silloittaminen bakteerilipopolysakkaridiin B. Balb/c-pernasolujen in vitro-immunisointi verihiutaletekijä 4:n ja LPS-konjugaatin kanssa C. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuotanto D. ELISA-analyysi verihiutaletekijä 4:lie E. polyklonaalisen anti-verihiutaletekijä 4:n vastaseerumin tuotanto
Esimerkki 5: Synteettisen verihiutaletekijä 4:n oligonukleotidien valmistus_ A. verihiutaletekijä 4:n geenin synteesi B. Kuvaus kloonauksesta ja ilmentymisplasmideista C. Yhdistelmä-verihiutale 4-geenien valmistus
Esimerkki 6: Yhdistelmä-verihiutaletekijä 4:n valmistus A. Yhdistelmäbakteereissa ilmentyneen PF4:n eristys
Esimerkki 7: Prokaryoottisissa soluissa valmistetun verihiutaletekijä 4:n biologinen aktiivisuus A. DNA-synteesin inhibointi • B. Kasvainten kasvun inhibointi paljaissa hiirissä
Esimerkki 1
Biologisten kokeiden suoritukset . .· A. DNA-synteesin inhibointi Päivänä 2 aamulla istutettiin A549-soluja (humaani keuhkosyöpä) Nuncin 96-koloiselle levylle (Kamstrupvej 90. DK-4.000,
Roskilde, Denmark). Nämä solut siirrettiin, kun niitä oli vähemmän kuin 30. Kaikkiin paitsi ulkokehän koloihin tuotiin 29 100336 4 x 1θ3 solua/50 pl/kolo (9 x 10^ solua/ml koeväliainetta (DMEM) sekä 10 % FCS, P/s, glutamiinia). Ulkokehän koloihin pantiin 50 ^il PBS ja koko levyä inkuboitiin 37°C:ssa. iltapäivällä koeyhdisteet suspendoitiin uudelleen koeväliainee-seen. Kaikki yhdisteet tutkittiin kolmeen kertaan. Kuhunkin koekoloon siirrettiin 50 jul koeyhdistettä koeväliaineessa, kun taas vertailukoloihin pantiin 50 yu 1 koeväliainetta yksinään. Kutakin levyä inkuboitiin sitten 37°C:ssa 3 päivää. Päivänä 4 lisättiin kuhunkin koloon 50 yul 125χ_jodo-2'-deok-siuridiinin liuosta (4 Ci/mg - 0,5 mCi/ml)(l ^ul isotooppia/ml koeväliainetta) ja levyjä inkuboitiin 37°C:ssa yön yli. Päivänä 5 väliaine imettiin koloista ja kolot pestiin lx PBSrllä. Sata mikrolitraa metanolia lisättiin 10 minuutiksi huoneenlämmössä. Metanoli imettiin pois ja 200 yu 1 1 M nat-riumhydroksidia lisättiin kuhunkin koloon. Levyä inkuboitiin 30 min 37°C:ssa ja natriumhydroksidi poistettiin Titertek-puikoilla (Flow Labs), puikot laskettiin sitten gammalasku-rilla.
B. Pehmytagarpesäkkeiden inhibointi Käytetyt materiaalit olivat 5 % agar (3,75 g Nobel-agaria (Difco)), 75 ml tislattua vettä autoklavioituna 125 ml:n Wheaton-pullossa, DMEM, jossa 10 % FCS, 100 U penisilliiniä, 100 U streptomysiiniä, 200 mM glutamiinia ja humaani melanoo-masoluja (A375)·
Tutkittavat materiaalit lyofilisoitiin steriilissä 12 x 75 mm:n koeputkessa. DMEM:llä valmistettiin 1:10 laimennus 5 % agarista ja kuumennettiin 46°C:een vesihauteessa. Alustaker-*: ros valmistettiin pipetoimalla l ml 0,5 % agar-liuosta jokai seen koloon 6-koloisella viljelylevyllä (35 x 14 mm). Kerroksen annettiin seistä huoneenlämmössä kunnes se jähmettyi. SAg-solut valmistettiin trypsinoimalla ja solujen lukumäärä laskettiin. Solut laimennettiin lopulliseen konsentraatioonsa 1 x 104 solua/ml ja 0,35 ml soluja lisättiin kuhunkin koe-näyteputkeen.
30 100336
Kuhunkin kymmeneen koenäyteputkeen pipetoitiin 0,750 ml 0,5 % agar-liuosta. Seosta vorteksoitiin lievästi ja koenäyteputken sisältö (koenäyte, solut, agar) kaadettiin alustakerrokselle ja annettiin seistä noin 20 min huoneenlämmössä, kunnes agar jähmettyi. Levyjä inkuboitiin sitten 37°C:ssa kosteutetussa inkubaattorissa, jossa oli 5 % hiilidioksidia/5 % ilmaa.
Levyt tarkastettiin pesäkkeiden kasvun inhiboinnin suhteen 3 päivän kuluttua ja aina 10 päivän kuluttua riippuen koemate-riaalin voimasta. Pesäkkeiden lukumäärä laskettiin 8 satunnaisessa matalatehoisen mikroskoopin kentässä. Kun levyjä oli tarkoitus säilyttää kauemmin kuin 5 päivää, siveltiin vielä 1 ml 0,3 % agar-liuosta koenäytekerrokselle koenäytekerroksen kuivumisen estämiseksi.
C. Kasvainten kasvun inhibointi paljaissa hiirissä
Urospuoliset paljaat hiiret (Balb/c-nu+/nu+) toimitti Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA. 12 viikon iässä hiirille annettiin injektiot (s.c. kaula-alueelle noin 1,3 x 106 humaani keuhkosyöpäsoluilla (A549) 0,2 ml:n tilavuudessa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, palpoitavat kasvaimet (noin 10 mm3) kehittyivät tavallisesti 20 päivässä. Kukin ryhmä sisälsi 5 eläintä. Eläimille injektoitiin joka toinen tai kolmas päivä kasvaimen kohtaan 0,1 ml PBS (vertailuryhmä) tai koenäytettä (1,2 pg/injektio) suspendoituna uudelleen 0,1 ml PBS. Jälkikäsittelypäivä yksi vastaa ensimmäistä päivää, jolloin eläimet injektoitiin kasvaimen kohtaan koeyhdisteillä. Kasvaimen koko mitattiin ennen seruaavaa injektiota osoitettuina päivinä ja edustaa kasvaimen keskimää-räistä kokoa kussakin ryhmässä olevassa eläimessä.
D. 52.000 Mr;n polypeptidin spesifinen vapauttaminen
Humaaneja keuhkosyöpäsoluja (A549) tai muuta solulinjaa käsiteltiin koenäytteellä (200 ng/ml viljelmää) tai PBS:llä ja . teho soluviljelmän supernatanttiin vapautuneisiin polypepti- deihin määritettiin. Käsitellyt ja vertailuviljelmät 31 100336 (ei verihiutaletekijää 4) pulssitettiin 35s-metioniinilla (5 uCi/ml S.A. - 800 Ci/mmol) ajankohdassa 0 (verihiutaletekijän 4 tai pelkän väliaineen (vertailu) lisäys). 12 tuntia myöhemmin viljelmän supernatantit poistettiin ja kirkastettiin, ensin alhaisella nopeudella (1500 x g 15 min) ja sitten suurella nopeudella (30.000 x g 1 h). polypeptidit saostettiin kirkastetuista supernatanteista trikloorietikkahapolla (TCA) ja sen jälkeen suoritettiin SDS-PAGE 12,5 % polyakryyliamidi-levygeeleillä.
Geelin radioautografiaa käytettiin sitten määrittämään 52.000 Mr:n 35s-metioniinilla leimatun polypeptidin läsnäoloa super-natanteissa, jotka oli saatu A549-soluista, jotka oli käsitelty koenäytteellä.
E. pp60 src:n autofosforyloitumisen stimulointi pp60 src puhdistettiin kuvatulla tavalla immunoaffiniteetti-kromatografiällä (Erickson et ai., proc. Natl. Acad. Sei. USA (1979) 76:6260-6264; Erickson et ai.. Cold spring Harbor Symp. Quant. Biol. (1979) 44:902-917. Viisi mikrolitraa puhdistettua entsyymiä (noin 0,47 pM) inkuboitiin 100 ng:n kanssa koenäytettä tai PBS:äa lopullisessa reaktiotilavuudessa 30 pl, joka sisälsi 20 mM ATP, 5 mM MgCl2# 10 mM Tris-Cl, pH 7,2, 30 min 30°C:ssa. Reaktiot päätettiin lisäämällä 2X näy-tepuskuria ja analysoitiin SDS-PAGE:11a kuvatulla tavalla (Laemmeli, Nature (1970) 227:680-685).
F. Makrofaagi-la-antigeenin ilmentyminen
Wehi-3 on hiiren makrofaagisolulinja, joka voidaan indusoida gamma-interferonilla (^-IFN) ilmentämään H2-luokan il antigeenejä. Tämän induktion piirteitä on tutkittu useissa laboratorioissa ja niiden on osoitettu olevan tarkkoja toistoja normaalista makrofaagi-induktiosta. Nämä solut kasvatettiin pienen konsentraation kanssa ^-IFN tai ilman sitä ja yhden kanssa useista konsentraatioista tutkittavaa näytettä. Sekä Λ-IFN:n läsnä- että poissaollessa verihiutaletekijä 4 osoitti 32 100336 annosriippuvaista luokan II antigeenin lisääntymistä mitattuna suoralla immunofluoresenssilla fluoresenssiaktivoidulla solulajittelijalla (FACS). Verihiutaletekijän 4 tehon suuruusluokka oli yleisesti n. 2-70 ng/ml.
Esimerkki 2
Verihiutaletekijän 4 eristys humaaniverihiutaleista A. Happo-etanoliuutto humaaniverihiutaleista
Tuoreet tai huoneenlämmössä sulatetut verihiutaleet (50 g:n märkäpaino) suspendoitiin uudelleen kahteen tilavuuteen: 375 ml etanolia (95 %), 7,5 ml kons. HCl, 33 mg fenyylimetyyli-sulfonyylifluoridia ja l ml aprotiniinia (23 Tiu/ml; naudan keuhkoista, Sigma Chemical Co. A6012). Seosta sekoitettiin 4°C:ssa yön yli, sentrifugoitiin 8000 rpm:llä Beckmanin tyyppiä 19 olevassa roottorissa 30 min ja supernatantti poistettiin. Supernatantin pH säädettiin kons. ammoniumhydroksidilla arvoon 4,0 ja pH nostettiin arvoon 5,2 käyttäen 1:10 laimennusta kons. ammoniumhydroksidista. Kun oli lisätty 1 ml 2 M ammoniumasetaattia (pH 5,2) 0,1 l:aa kohti supernatanttia, liuos sentrifugoitiin 8000 rpm:llä tyypin 19 roottorissa 30 min. Supernatantti poistettiin, lisättiin 2X tilavuus kylmää 95 % etanolia, ja sen jälkeen 4X tilavuus kylmää dietyylieet-teriä ja seoksen annettiin seistä yön yli 0°C:ssa. Sakka kerättiin sentrifugoimalla 8000 rpm:llä tyypin 19 roottorissa 30 min ja pelletti suspendoitiin noin 10-20 ml:aan 1 M etik-kahappoa. Etikkahappodispersio dialysoitiin laajasti vasten 0,2 M etikkahappoa (51x2 vaihtoa) Spectrapor-dialyysimemb-raaniputkissa (#3)(raja-arvo 3.500 Mr) (American Scientific Products). Uute lyofilisoitiin, suspendoitiin uudelleen 7,5 ml:aan 1 M etikkahappoa ja sentrifugoitiin sen jälkeen 30.000 rpm:llä.
B. Geelipermeaatiokromatografia
Biogel P-10 (200-400 meshiä; BioRad Labs) turvotettiin yön yli 1 M etikkahapossa, kaasut poistettiin tarkoitn ja 33 100336 kaadettiin sitten 100 x 2,5 cm:n silikoinoituun lasipylvää-seen ja annettiin tasapainottua yön yli 1 M etikkahapon kanssa. Kaikista liuoksista poistettiin kaasut ennen käyttöä.
Happo-etanoliliukoiset peptidit (50-70 mg proteiinia) 25 g:sta humaaniverihiutaleita liuotettiin 7,5 ml:aan l M etik-kahappoa ja vietiin ylläolevaan pylvääseen. Fraktiot (3,5 ml) kerättiin ja erät lyofilisoitiin ja tutkittiin miten ne inhiboivat 5-125i_jodo-2'-deoksiuridiinin liittymistä A549 humaa-nikeuhkosyöpäsoluihin.
C. Käänteisfaasi-korkeapainenestekromatografia
Kasvainten kasvua inhiboivan aktiivisuuden omaavan piikin sisältämä fraktio (noin 200 ng proteiinia) ylläolevasta pylväästä lyofilisoitiin ja suspendoitiin uudelleen 0,05 % (v/v) TFA:han. Pylväs eluoitiin sitten lineaarisella 0,60 % gradi-entilla asetonitriiliä 0,045 % TFA:ssa virtausnopeudella 0,8 ml/min 23°C:ssa. Erät kustakin fraktiosta lyofilisoitiin ja analysoitiin kolmeen kertaan, kuten edellä on kuvattu.
Inhibiittoriaktiivisuutta sisältävä(t) fraktio(t) liuotettiin sitten 40 % asetonitriiliin, joka sisälsi 0,1 % TFA ja pantiin hydroksyloitua polyeetteriä sisältävään pylvääseen ·. (BioRad TSK-250) ja eluoitiin liikkuvalla faasilla 40 % ase tonitriiliä 0,1 % TFA:ssa. Fraktiot kerättiin, lyofilisoitiin ja analysoitiin kolmeen kertaan kasvua inhiboivan aktiivisuuden suhteen. Aktiivisuus eluoitui fraktiossa, jossa insulii-nimerkkiaine eluoitui ja vastaa molekyylipainoa 6-8 kD.
Fraktiot, joilla oli suurin aktiivisuus, elektroforesoitiin sitten käyttäen SDS-PAGE:a seuraavasti. Suurempaa verihiuta-letekijä 4:n aktiivisuutta vastaava peptidi käänteisfaasi-HPLC:llä suoritetusta puhdistuksesta lyofilisoitiin, suspendoitiin uudelleen ja keitettiin (2 min) 0,03 ml:ssa näytteen-valmistuspuskuria, joka sisälsi 12,5 mM Tris-Cl, pH 6,7, 4 % sDS, 10 % (3-merkaptoetanolia, 20 % glyserolia ja 0,01 % bro-mifenoli sinistä. Näyte ladattiin 5 % polyakryyliamiditäyttö- 34 100336 geeliin, kaadettiin 17-27 % polyakryyliamidigradienttilevy-geelille, joka sisälsi 0,1 % SDS, pH-arvossa 8,8. Geeliä kuljetettiin 10 milliampeerilla kunnes näytteet kulkeutuivat täyttögeelin läpi ja 20 milliampeerilla kunnes väririntama kulkeutui geelin pohjalle. Geelit kiinnitettiin ja värjättiin yön yli liuoksessa, jossa oli 0,2 % Coomassien sinistä, 50 % metanolia ja 9 % etikkahappoa. värinpoiston jälkeen Coomas-sie-positiiviset juovat lokalisoitiin käyttäen hyväksi Hoffe-rin densitometriä. Markkerit sisälsivät insuliinia (6.000 Mr), trypsinogeenia (24.500 Mr), RNasea (13.700 Mr) ja apro-tiniinia (6.500 Mj:) . Suurin peptidi kulkeutui yhdessä 6.500 Mr aprotiniinistandardin kanssa näissä elektroforeesin olosuhteissa .
Esimerkki 3
Humaaniverisoluista eristetyn verihiutaletekijä 4:n biologinen aktiivisuus A. DNA-synteesin inhibointi
Verihiutaletekijä 4:n vaikutus DNA-synteesiin tutkittiin käyttäen lukuisia solulinjoja, sekä transformoituja että transformoimattomia käyttäen edellä esimerkissä 1 kuvattua koetta. Kohdeyhdiste inhiboi erilaisia viljeltyjä humaanikas-·, vainsoluja, mutta ei normaaleja transformoimattomia humaani- esinahan sidekudosemosoluja, kuten seuraavassa taulukossa on esitetty.
ui idii UI I , Hl 35 100336
Taulukko I
Verihiutaletekijä 4;n vaikutus in vitro-DNA-synteesiin viljellyissä humaanisoluissa 125j_deoksiuridiinin liittymisen maksimaali-
Solulinja__nen1 inhiboitumis-%_
Transformoidut
Humaani keuhkosyöpä (A459) 100
Humaani keuhkon rauhassyöpä (Hl25) 41
Humaani melanooma (A375) 67
Humaani rintasyöpä (MCF-7) 37
Transformoimaton
Humaani esinahan sidekudosemosolu (HuFpg) 0 Käyttäen kuvattuja analyysiolosuhteita ei havaittu 125i_deoksiuridiinin A549-soluihin liittymisen maksimaalinen inhiboituminen verihiutaletekijän 4 kyllästyskonsentraatioil-la (n. 100 ng/kolo) ylitä 50 %:a suhteessa hoitamattomiin vertailuviljelmiin.
B. Pehmytagarpesäkkeiden kasvun inhiboituminen
Edelläolevaa menetelmää käytettiin käyttäen erilaisia kon-sentraatioita puhdistettua verihiutaletekijää 4. Seuraava taulukko osoittaa tulokset, esitetyn verihiutaletekijä 4:n määrän ollessa lyofilisoitu, koeputkeen viety määrä. Tulokset ' on esitetty prosentteina maksimaalisesta inhibiitiosta.
Taulukko II
Verihiutaleteki jä 4 (ng)_Maksimaalinen inhibointi-% 0,8 45 : 2,6 73 20,0 81 _60,0_100 _ 36 100336
Edelläolevista tuloksista ilmenee, että keksinnön kohteena oleva polypeptidi on voimakas solukasvuinhibiittori. Melanoo-masoluilla havaittuihin tuloksiin perustuen noin l ng on riittävä aikaansaamaan noin 50 % inhibiition. Kohdeyhdisteel-lä voi sen vuoksi olla paljon erilaista käyttöä inhiboitaessa solukasvua, mukaanlukien kasvainsolujen kasvua.
C. Kasvainten kasvun inhiboituminen paljaissa hiirissä
Ei naudan seerumin albumiinin (0,2 mg) eikä ihokasvutekijän silmukka-aluetta (EGF-jäännökset 11-21) vastaavan synteettisen peptidin (200 ng) injektoiminen PBSissä inhiboinut kasvainten kasvua.
D. Mr 52K:n polypeptidin spesifinen vapautuminen
Humaanikeuhkosolut (A549) käsiteltiin verihiutaletekijä 4:llä kuten esimerkissä ID edellä on kuvattu. SDS-PAGE:lla analysoituna käsitellyistä soluista saadut supernatantit sisälsivät radioleimattua 52K Mr proteiinia. Käsittelemättömät syöpäsolut vapauttivat minimimäärät tätä proteiinia (ainakin kymmenkertainen kasvu havaittiin sen jälkeen kun oli käsitelty verihiutaletekijällä 4). Mitään muita kvalitatiivisia tai kvantitatiivisia eroja ei havaittu käsiteltyjen ja vertailu-viljelmien välillä.
E. pp60 src;n autofosforyloitumisen stimulointi pp60 src:n autofosforyloitumista analysoitiin esimerkissä IE esitetyn menetelmän mukaan, verihiutaletekijä 4:llä käsitte-. lyn jälkeen levygeelien autoradiografia osoitti ilmeistä kak sinkertaista stimuloitumista pp60 src:n autofosforyloitumi-sessa. Fosforyloitumisen kasvu ei rajoittunut tyrosiinijäännöksiin, vaan havaittiin myös seriinipaikoissa src-entsyymis-sä.
; Esimerkki 4
Verihiutaletekijä 4;lie spesifisten monoklonaalisten ja poly-klonaalisten vasta-aineiden tuotanto 37 100336 A. verihiutaletekijä 4;n silloittaminen bakteerilipopolysak-karidiin
Menetelmä verihiutaletekijän 4 silloittamiseksi bakteerilipo-polysakkaridiin on muunnos menetelmästä, jonka ovat kehittäneet primi and Cazenave, j. immunol. (1982) 1299(3);1124-1129.
10 ng verihiutaletekijää 4 ja 12,5 ng bakteerilipopolysakka-ridia (LPS; sigma #L-263) laimennettiin tilavuuteen 500 yul tislatulla vedellä. 50 ^1 2,5 % glutaraldehydiä PBS:ssä lisättiin ja seosta inkuboitiin 30 min huoneenlämmössä. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 yul 2 M glysiiniä PBS:ssä ja inku-boiden seosta huoneenlämmössä 1 h. verihiutaletekijä 4:n ja LPS:n konjugaatti laimennettiin 10 ml :11a sekoitettua lymfo-syyttitasapainotettua (MLC) väliainetta (katso jäljessä) ja sitten se suodatussteriloitiin käytettäväksi in vitro-immuni-soinnissa.
B. Balb/c-pernasolujen in vitro-immunisointi verihiutaleteki jä 4:n ja LPS:n konjugaatilla
Ei-immuunit pernasolut immunisoitiin käyttäen verihiutale-tekijä 4:n ja LPS:n konjugaattia in vitro sen menetelmän muunnoksella, jonka on kuvannut Reading, immunol♦ Meth.
(1982) 53:261-269.
MLC-väliaine valmistettiin viljelemällä yhtä suuri lukumäärä (4 x 1θ6 solua/ml) Balb/C- ja C57-mustien hiirten kateenkor-vasoluja DMEM:ssä, joka sisälsi 2 % kaniseerumia, 48 h. Väliaine kerättiin ja säilytettiin -20°C:ssa.
Vatsakalvontulehdusnestesoluja (pec) kerättiin huuhtomalla tioglykollaatilla käsitelty Balb/c-hiiri steriilillä PBS:llä. PEC-solut pantiin viljelmään 1 hiiren ekvivalentti-sen määrän kanssa pernasoluja ja 10 ml:n kanssa MLC-väliai-; netta, joka sisälsi 10 ng verihiutaletekijä 4:n ja LPS:n kon jugaattia. Soluja viljeltiin 7 päivää.
38 100336 C. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuotanto
Immunisoidut pernasolut kerättiin ja yhdistettiin SP2/0-luu-ydinkasvainsolujen kanssa suhteessa 1:1 hybridoomien tuottamiseksi, jotka syntetisoivat verihiutaletekijälle 4 spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita. Hybridoomat tutkittiin verihiutaleteki ja 4:n vasta-aineiden tuotannon suhteen entsyy-misidosimmunokokeella (ELISA). Positiiviset hybridoomat kloonattiin kahdesti rajoittavalla laimennuksella. Kloonit kasvatettiin, tutkittiin niiden immunoglobuliiniluokka, ja injektoitiin Balb/c-hiiriin askiittituotantoa varten.
Alunperin kasvatettiin 40 positiivista hybridoomakloonia ja tutkittiin uudelleen anti-verihiutaletekijä 4-aktiivisuuden suhteen. Seitsemää reaktiivisinta kloonia käytettiin tuottamaan askiittinestettä Balb/C-hiirissä. Jäljelle jääneet kloonit kasvatettiin ja pakastettiin. Askiitit tutkittiin niiden spesifisyyden suhteen verihiutaletekijä 4:lie, verihiutale-tekijä 4-peptidin ja KLH:n konjugaatille ja BSAtlle ELISA-kokeella. Askiitit reagoivat sekä verihiutaletekijä 4:n kanssa että vähemmässä määrin verihiutaletekijä 4-peptidin kanssa laimennuksena 1-3000. Immunoglobuliinit puhdistettiin kapryy-lihapposaostusmenetelmällä, jonka ovat kuvanneet Russo et ai., Anal. Biochem. (1983) 6_5:269-271. Immunoglobuliinien ·. mallianalyysi ja Ouchterlonyn kaksoisdiffuusioanalyysi osoit tivat, että kaikki immunoglobuliinit olivat igM-tyyppiä.
D. ELISA-analyysi verihiutaletekijälle 4
Verihiutaletekijä 4 laimennettiin 0,1 M etikkahappoon ja 10 .’ ng/kolo pipetoitiin 96-koloiseen Dynatech immulon-levylle.
Liuos kuivattiin huoneenlämmössä yön yli. Levy suojattiin in-kuboimalla koloja PBSrssä olevan 2,5 % FCS:n kanssa. Hybri-doomaväliainetta, immunoglobuliinia tai vastaseerumia lisättiin sitten sopivana laimennuksena. Levyjä inkuboitiin sitten 37°C:ssa kaksi tuntia ja pestiin kolmesti PBS:ssä olevalla : 3,5 % FCS:llä. vector Labsin avidiini-biotiini-piparjuuri- peroksidaasi- (HRP) ELISA-reagensseja käytettiin valmistajan 39 100336 ohjeiden mukaisesti. Kolot pestiin pBS:ssä olevalla 2,5 % FCS:llä jokaisen vaiheen välillä, positiiviset kolot visualisoitiin lisäämällä 0,4 mg/ml o-fenyleenidiamiinia 0,1 M nat-riumsitraattiliuoksessa, joka sisälsi neljää bakteeri-LPS:ää 30 % vetyperoksidissa/10 ml liuosta. Reaktion annettiin jatkua 30 min huoneenlämmössä. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 bakteerin LPS:ää 1,4 N H2SO4:ssä/kolo.
E. polyklonaalisen anti-verihiutaletekijä 4:n vastaseerumin tuotanto
Balb/C-hiiret immunisoitiin nitroselluloosaan immobilisoidul-la verihiutaletekijä 4:llä. Tämän immunisointitoimenpiteen tarkoitus on välttää isännän aikaansaamaa polypeptidin nopeaa selvitystä. Tällä tavoin voidaan immunisointi saada aikaan hyvin pienillä määrillä verihiutaletekijää 4.
Verihiutaletekijän 4 liuos 0,1 M etikkahapossa pipetoitiin pisteiksi pienille nitroselluloosapalasille (Schleicher & Schuell, 0,45 utnj ja annettiin kuivua. Nitroselluloosapalaset pantiin 3 Balb/c-hiiren vatsaonteloon primääri-immunisointia varten (0,375 ng/hiiri). Hiirille annettiin myös vatsakalvon sisäinen injektio 0,1 ml Freundin täydellistä apuainetta. Hiiret tehosteinjektoitiin kahdesti 2 viikon välein verihiutaleteki jä 4:llä immobilisoituna nitroselluloosaan. Tehostetta varten nitroselluloosa leikattiin irti, homogenisoitiin 0,1 ml :11a vettä ja 0,1 ml :11a epätäydellistä Freundin apuainetta ja injektoitiin ihon alle (0,125 ng/hiiri). Hiiriseeru-mit tutkittiin niiden spesifisyyden suhteen verihiutaleteki-jälle 4 ELISA-kokeella, kuten aikaisemmin kuvattiin, siten, ; että toisen vaiheen reagenssina käytettiin HRP-konjugoitua proteiinia A. Seerumit tutkittiin spesifisyyden suhteen verihiutaleteki jä 4-peptidin ja KLH:n konjugaatille ja suojatulle levylle.
»o 100336
Esimerkki 5
Synteettisen verihiutaletekijä 4:n oligonukleotidien valmistus A. verihiutaletekijä 4-geenin synteesi
Suunniteltiin synteettiset verihiutaletekijä-4-geenit, jotka käyttävät bakteerikodoneita optimoituna suurille ilmentymis-määrille. Lisäksi sekvenssi on suunniteltu käytettäväksi E. colissa ja joukko restriktioentsyymien tunnistuskohtia suunniteltiin helpottamaan koodittavan sekvenssin muuntelua, jos mahdollista, uudet restriktiokohdat jättivät geenin aminohapposekvenssin muuttumattomaksi, vaikka joissakin tapauksissa uuden restriktiokohdan liittäminen antoi tulokseksi muuttuneen aminohapposekvenssin.
Valmistettiin yksisäikeiset päällekkäin menevät sekvenssit, yhdistettiin lämpökäsittelyväliaineessa ja sidottiin, jolloin saatiin täydellinen geeni, jolla oli sopivat päät insertoi-tavaksi ilmentymisvektoriin lukufaasissa fuusioproteiinin muodostamiseksi, josta verihiutaletekijä 4 voitiin eristää. Yksisäikeiset segmentit 5’-fosforyloitiin T4-polynukleotidi-ligaasilla ja lämpökäsiteltiin yhdistämällä 200 pM jokaisesta segmentistä 30 pl:n reaktiotilavuudessa (30 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2» 1 9/ml spermidiiniä, 100 mM Tris-HCl, pH
7,8 ja T4-DNA-ligaasia). dsDNA pilkottiin BssHII:11a ja BamHI:lla ja puhdistettiin 7 % luonnon polyakryyliamidigee-lillä.
Valmistettiin seuraava sekvenssi: 41 100336
GG TAC CTT CGA CTT CTT CTG CCT CTA GAC GTC ACG
CGC GCC ATG GAA GCT GAA GAA GAC GGA GAT CTG CAG TGC
MEAEEDGDLQC
/ nh2
GAC ACG CAT TTT TGA TGA AGA GTC CAT TCC GGA GCA GTG
CTG TGC GTA AAA ACT ACT TCT CAG GTA AGG CCT CGT CAC
LCVKTTSQVRPRH
TAG TGT AGT GAG CTC CAT TAG TTT CGG CCG GGC GTC ACG GGC
ATC ACA TCA CTC GAG GTA ATC AAA GCC GGC CCG CAC TGC CCG
ITSLEVUKAGPHCP
TGA CGA GTC GAC TAG CGC TGA GAC TTT TTG CCA GCA TTC
ACT GCT CAG CTG ATC GCG ACT CTG AAA AAC GGT CGT AAG
TAQLIATLKNGRK
TAG ACA GAT CTG GAC GTC CGA GGC GAC ATG TTT TTT TAG
ATC TGT CTA GAC CTG CAG GCT CCG CTG TAC AAA AAA ATC
ICLDLQAPLYLLI
TAG TTT TTT GAC GAC CTT AGA ATT CCT AG
ATC AAA AAA CTG CTG GAA TCT TAA G
I K K L L E S *** \
CO OH
B. Kloonaus- ja ilmentymisplasrnidien kuvaus 1. plasmidi plac/cro-β gal, vektorin plac/cro-β gal säätely-elementit käsittävät e. coli-laktoosi (lac) operonin operaattori-promoottori alueen, sekä lac.-n ja crp;n ribosomien liitoskohdat. Tämä vektori on peräisin plasmideista pTR213 (Roberts et ai., proc. Natl. Acad. Sei. USA (1978) 76:760) ja PLG300 (Guarente et ai., Cell (1980) 20:543) .
Plasmidi plac/cro—b 9^^- konstruoitiin sitomalla 0,96 ke:n Pstl-Bglll-fragmentti pTR213:sta ja 5,54 ke:n Pstl-BamHI-fragmentti pLG300:sta oligonukleotidisitojän läsnäollessa, 42 100336 joka oli pilkottu BamHI;11a ja Bglll;11a:
AAAGATCTCAGGCCTCGAGGATCC
TTTCTAGAGTCCGGATCTCCTAGG
Tämä kytkijä palveli seuraavissa tarkoituksissa: (l) regeneroi Bglll- ja BamHI-kohdat alkuperäisestä plasmidista, (2) antoi lisäkohtia vieraan DNA:n insertiolle, ja (3) mahdollisti insertoidun DNA:n olemisen oikeassa translaation lukuvai-heistuksessa ero 5'-gal-koodittavan sekvenssin suhteen.
2. plasmidi ptac/cro-β gal, ilmentymisvektori ptac/cro-β gal on samanlainen kuin plac/cro-β gal, sillä poikkeuksella, että ptac/cro-β gal:n promoottori käsittää alueen -35 tryptofaani-operonista ja lac-operonin pribnow-laatikon (alue -10). Tämä hybridipromoottori antaa suuremman ilmentymistason kuin plac/cro-β gal. plasmidi ptac/cro-β gal on peräisin plasmidista pDR540 (Russel and Bennett, Gene (1983) ^0:231) ja plac/cro-β gal:sta.
plasmidi ptac/cro-β gal konstruoitiin kahdessa vaiheessa. Ensin 0,87 ke:n Rsal-fragmentti plac/cro-β gal-plasmidista insertoitiin pDR540:een BamHI-kohtaan, joka aikaisemmin oli muutettu blunt-päiseksi Klenowin fragmentilla DNA-polymeraasi I:stä. insertoidun DNA:n orientointi oli sellainen, että ribosomien sitoutumiskohta ja ero:n koodittava sekvenssi olivat sijoittuneet alaspäin lac;n ribosomien sitoutumiskohdasta. Saatu plasmidi, ptac/cro, sisälsi sekä lac:n ja cro:n ribosomien sitoutumiskohdat, että ero:n N-pään koodittavat sekvenssit. Toinen vaihe ptac/cro-β gal:n konstruoinnissa saa- : tiin aikaan sitomalla 1,16 ke:n ja 5,54 ke:n pstl-BamHI-frag- mentit plasmideista ptac/cro ja pLG300, vastaavasti. ptac/cro-β gal:n rakenne oli sen vuoksi samanlainen kuin plac/cro-β gal :11a, hybridipromoottorialuetta lukuunottamatta; plasmidiin viitataan merkinnällä pSMl,2/Tac.
; 3. plasmidi pBMll, kuvattu Liu et ai.:n samaan aikaan vireillä olevassa uS-hakemuksessa sarjanumeroltaan 115.139, 43 100336 3. plasmidi pBMll, kuvattu Liu et ai.:n samaan aikaan vireillä olevassa uS-hakemuksessa, sarjanumeroltaan 115.139, mahdollistaa vieraan geenin kloonauksen alaspäin DNA-sekvenssis-tä, joka koodittaa bakteriofaagi ,Λ:η N-geenin 33 N-pään aminohappoa BamHI-restriktiokohdassa. indusoitaessa ΛPL-pro-moottoria inaktivoimalla lämpötilaherkkää C1857-repressoria 42°C:ssa ilmentyy vieras geenituote C-pääosana fuusioproteii-nista, jonka N-pääsekvenssi on N-geenin sekvenssi.
4. plasmidi pBMHM4, kuvattu Liu et ai.:n samaan aikaan vireillä olevassa US-hakemuksessa sarjanumeroltaan 115.139, on peräisin pBMll:stä ja mahdollistaa vieraan geenin kloonauksen BamHI-restriktiokohtaan suoraan N-geenin aloittavan metionii-nin jälkeen.
5. plasmidi pBMll/NDP, kuvattu Liu et ai♦:n samaan aikaan vireillä olevassa US-hakemuksessa sarjanumeroltaan 115.139, on peräisin pBMll:stä ja siinä on DNA-sekvenssit, jotka koodattavat happolabiilia asparagiinihappo-proliinidipeptidiä, joka on insertoitunut N-geeniä ja vierasta geeniä koodattavien sekvenssien väliin.
6. Plasmidi pBMll/PAD, kuvattu Liu et ai.:n samaan aikaan vireillä olevassa US-hakemuksessa sarjanumeroltaan 115.139, / on peräisin plasmidista pBMHM4 ja mahdollistaa vieraan gee nin kloonauksen Hindin-, Smal- tai BamHI-kohtaan alaspäin modifioidusta alkaalisen fosfataasin signaalisekvenssistä.
7. Linearisoitu ptrpED5-l. Plasmidi ptrpED5-l (Hallewell and Entage, Gene (1980) 9:27; Tacon et ai., Mol. Gen. Genet.
(1980) 177 :427) pilkotaan endonukleaaseilla BssHII ja BamHI ja olennaisesti täysipituinen fragmentti, josta puuttuu trp D-geeni ja jossa on katkaistu trp E-geeni, eristetään prepa-ratiivise11a geelielektroforeesilla.
C. yhdistelmä-verihiutaletekijä 4-geenien valmistus 1. pTac/Cro/pF4:n konstruoiminen. Synteettinen geeni 44 100336 kloonattiin sopivassa E. coli-kloonausplasmidissa plasmidin pHC PF4 saamiseksi. Restriktiokartta (kuva 2) ja nukleotidi-sekvenssi (kuva 3) on esitetty piirroksina. pHC PP4 lohkaistiin BssHII:11a arg-kodonin 5'-päässä, sijoitettiin Klenowin fragmentti, lohkaistiin BamHI:11a ja PF4:ää koodittava fragmentti puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Fragmentti insertoitiin pSMl,2/Tac:iin, joka oli pilkottukloonat-tiin sopivassa E. coli-kloonausplasmidissa plasmidin pHC PF4 saamiseksi. Restriktiokartta (kuva 2) ja nukleotidisekvenssi (kuva 3) on esitetty piirroksina. pHC PF4 lohkaistiin BssHII:11a arg-kodonin 5'-päässä, sijoitettiin Klenowin fragmentti, lohkaistiin BamHI:11a ja PF4:ää koodittava fragmentti puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Fragmentti insertoitiin pSMl,2/Tac:iin, joka oli pilkottu Stui:llä ja BamHI:11a, polykytkijällä, joka antaa K-D-L-R:n koodittami-sen, ja saatua plasmidia pTac/PF4 käytettin transformoimaan E. coli NF1829- Koodattavassa sekvenssissä oli 21 kodonia ero 5'-päästä, 4 kodonia kytkijästä ja se alkoi PF4:n arg-kodo-nilla. Oikeat plasmidit sisältävät pesäkkeet identifioitiin restriktiouuttamalla mini-prep-DNA.
2. ptrpED5-l/PF4;n valmistus. Verihiutaletekijä 4-geeni sidotaan linearisoituun plasmidiin ptrpED5-l plasmidin ptrp/pF4 saamiseksi ja kytkentäseosta käytetään transformoimaan E♦ coli HBlOl-soluja. Transformantit valikoidaan ampisilliini-resistenssillä ja plasmidit analysoidaan restriktioendonuk-leaasipilkkomisella.
3. pBMll·/PF4:n (autenttinen verihiutaletekijä 4) valmistus. Nukleotidisekvenssi ja vastaava aminohapposekvenssi synteet-tisestä verihiutaletekijä 4-geenistä, joka ilmentyy autenttisena proteiinina alaspäin aloitusmetioniinista ilmentymisvek-torissa pBMll, on seuraava.
45 100336 PF4 ->
MEAEEDGDLQCLCV ATG GAA GCT GAA GAG GAT GGA GAT CTG CAA TGC CTG TGC GTT
KTTSQVRPRHITSL AAG ACT ACG TCT CAG GTT AGA CCG CGG CAT ATC ACT AGC CTC
EVIKAGPHCPTAQL GAG GTT ATC AAA GCG GGC CCA CAC TGT CCG ACT GCG CAG CTG
IATLKNGRKICLDL ATC GCG ACT CTG AAA AAC GGC CGT AAA ATA TGT CTG GAT CTG
QAPLYKKIIKKLLE CAG GCA CCG CTG TAC AAG AAA ATC ATC AAA AAG CTT CTC GAG
S ***
TCT TGA
4. pBMll/N/PF4;n (N-geeni/verihiutaletekijä 4) valmistus. Nukleotidisekvenssi ja vastaava aminohapposekvenssi fuusioituneesta synteettisestä verihiutaletekijä 4-geenistä alaspäin nukleotidisekvensseistä, jotka koodattavat bakteriofaagi^ N-geenin 33 ensimmäistä aminohappoa ilmentymisvektorissa pBMll, on seuraava.
N-geeni —>
MDAQTRRRERRAEK ATG GAT GCA CAA ACA CGC CGC CGC GAA CGT CGC GCA GAG AAA
QAQWKAANPLLVGV CAG GCT CAA TGG AAA GCA GCA AAT CCC CTG TTG GTT GGG GTA
PF4 ->
SAKPVRIRMEAEED AGC GCA AAA CC A GTT CGG ATC CGC ATG GAA GCT GAA GAG G AT
GDLQCLCVKTTSQV GGA GAT CTG CAA TGC CTG TGC GTT AAG ACT ACG TCT CAG GTT
RPRHITSLEVIKAG AGA CCG CGG CAT ATC ACT AGC CTC GAG GTT ATC AAA GCG GGC
PHCPTAQLIATLKN CCA CAC TGT CCG ACT GCG CAG CTG ATC GCG ACT CTG AAA AAC
GRKICLDLQAPLYK GGC CGT AAA ATA TGT CTG GAT CTG CAG GCA CCG CTG TAC AAG
KIIKKLLES ***
AAA ATC ATC AAA AAG CTT CTC GAG TCT TGA
46 100336 5· pBMll/NDP/PF4:n (N-geeni/pp/verihiutaletekijä 4) valmistus . Nukleotidisekvenssi ja vastaava aminohapposekvenssi fuusioituneesta synteettisestä verihiutaletekijä 4-geenistä alaspäin nukleotidisekvensseistä, jotka koodittavat bakterio-faagi Λ N-geenin 32 ensimmäistä aminohappoa ja happolabiilia dipeptidiä Asp-pro (***) ilmentymisvektorissa pBMll, on seu-raava.
N - geeni">
MDAQTRRRE RRAEK ATG GAT GCA CAA ACA CGC CGC CGC GAA CGT CGC GCA GAG AAA
QAQWKAANPLLVGV CAG GCT CAA TGG AAA GCA GCA AAT CCC CTG TTG GTT GGG GTA
#** pplj _>
SAKPVRIDPMEAEE AGC GCA AAA CCA GTT CGG ATC GAT CCC ATG GAA GCT GAA GAG
DGDLQCLCVKTTSQ GAT GGA GAT CTG CAA TGC CTG TGC GTT AAG ACT ACG TCT CAG
VRPRHITSLEVIKA GTT AGA CCG CGG CAT ATC ACT AGC CTC GAG GTT ATC AAA GCG
GPHCPTAQL IATLK GGC CCA CAC TGT CCG ACT GCG CAG CTG ATC GCG ACT CTG AAA
NGRKICLDLQAPLY AAC GGC CGT AAA ATA TGT CTG GAT CTG CAG GCA CCG CTG TAC
KKIIKKLLES ***
AAG AAA ATC ATC AAA AAG CTT CTC GAG TCT TGA
6. pBMll/PAD/PF4:n (signaalisekvenssi alkaalisesta fosfataa-sista Asp jäännöksenä 2 Lys/verihiutaletekijä 4:n sijasta) valmistus. Nukleotidisekvenssi ja vastaava aminohapposekvenssi fuusioituneesta synteettisestä verihiutaletekijä-4-geenistä alaspäin nukleotidisekvensseistä, jotka koodittavat .* modifioitua alkaalisen fosfataasin signaalipeptidiä, on seu- raava. Ennustettu pilkkoutumiskohta on merkitty (***).
47 100336
Signaalisekvenssi ->
M DQSTIALALLPLL ATG GAT CAA TCT ACA ATC GCC CTC GCA CTT CTC CCA CTG CTG
*** PF4 ->
FTPVTKAEAEEDGD TTC ACT CCA GTG ACA AAA GCT GAA GCT GAA GAG GAT GGA GAT
LQCLCVKTTSQVRP CTG CAA TGC CTG TGC GTT AAG ACT ACG TCT CAG GTT AGA CCG
RHITSLEVIKAGPH CGG CAT ATC ACT AGC CTC GAG GTT ATC AAA GCG GGC CCA CAC
CPTAQLIATLKNGR TGT CCG ACT GCG CAG CTG ATC GCG ACT CTG AAA AAC GGC CGT
KICLDLQAPLYKKI AAA ATA TGT CTG GAT CTG CAG GCA CCG CTG TAC AAG AAA ATC
I K K L L E S ***
ATC AAA AAG CTT CTC GAG TCT TGA
Esimerkki 6
Yhdistelmä-verihiutaletekijä 4:n valmistus A. Yhdistelmäbakteereissa ilmentyvän PF4:n eristys 1. E. coli NF1829-transformantteja, jotka sisälsivät plasmidit pTac/pF4, kasvatettiin yön yli l % laktoosin kanssa tai ilman sitä, lingottiin, keitettiin 10 min IX Laemmli ' SDS-PAGE- näytepuskurin kanssa ja analysoitiin elektroforee silla 17,5 % polyakryyliamidi-SDS-geeleillä. Suurimittakaa-vaista valmistusta varten yksittäisiä pesäkkeitä kasvatettiin 2 ml:ssa L-lihalientä 8 h ja siirrettiin 1 l:aan L-lihalien-tä, joka sisälsi laktoosia sekä antibiootteja, ja kasvatettiin yön yli 37°C:ssa. Yhdistelmä-verihiutaletekijä 4, jossa oli 21 kodonia ero-geenistä, puhdistettiin seuraavasti: yksi 1 bakteereita indusoituna l % laktoosilla, kasvatettiin, sentrifugoitiin sen jälkeen pelletin saamiseksi ja pelletti pakastettiin -70°C:ssa. Kun pelletti oli suspendoitu uudelleen 50 ml:aan 50 mM Trisiä, pH 7,9, 0,2 M NaCl:a, 2 mM EDTA:a ja 2 mM 2-merkaptoetanolia, lisättiin lysotsyymiä mää-• räksi 200 ug/ml ja seosta inkuboitiin 20-30 min jäissä samalla ravistaen. Seokseen lisättiin Triton X-100:a määrään 48 100336 1% ja seosta inkuboitiin 10-20 min jäissä samalla ravistaen, jonka jälkeen lisättiin Zwittergentiä (Calbiochem) määrään 0,5 % ja sen jälkeen inkuboitiin 10-20 min jäissä samalla sekoittaen. Seosta sonikoitiin jäissä n. 0,625 cm:n (0,25 tuumaa) koettimen kanssa 2-3 min samalla pulssittaen seoksen saamiseksi, joka voitiin pipetoida. Seos ladattiin sitten 10 mitään 40 % sakkaroosia STEtssä, lingottiin kierrosnopeudella 13.000 30 min 5°C:ssa SW28 roottorilla ja supernatantit poistettiin. pelletti suspendoitiin uudelleen 5-10 mitään 0,01 M Trisiä, pH 7,2, 0,15 M NaClta ja näyte analysoitiin SDS-PAGEilla (17.5 %). Geeli kehitettiin Coomassie blue-värjäyk-sellä todistaen, että fuusioproteiini oli tuotettu E. colis-sa.
2. Transformantit kasvatetaan 37°Ctssa noin määrään 10® so-lua/ml Luria-lihaliemessä ja lisätään 3-indolyylietikkahappoa (IAA) noin 1 mMtksi ja kasvatusta jatketaan noin 1 h. Erät (1 ml) sentrifugoidaan muutamia sekunteja Eppendorfin sentrifuu-gissa ja pelletit suspendoidaan 500 ui taan 7 % muurahaishappoa, joka sisälsi 5 mg/ml syanogeenibromidia. 24 tunnin huoneenlämmössä pitämisen jälkeen erät laimennetaan kymmenkertaisesti veteen ja laimennetuista näytteistä tutkitaan veri-hiutaletekijä 4. Koska verihiutaletekijä 4:ssä ei ole sisäistä metioniinia, jolloin N-päämetioniinin sisältävä fuusiopro-·. teiinin lohkaisu antaa verihiutaletekijän 4, jolla on sama aminohapposekvenssi kuin luonnossa esiintyvällä verihiutale-tekijä 4:llä.
49 100336
Taulukko III
PF4;n ilmentyminen erilaisissa bakteerien ilmentymisjärjestelmissä
Kokonaisproteiini-% pTac/Cro/PFM 5ί pBMll/Ngene/PFH 20 %
pBMl1/Ngene/DP/PF4 20J
pBMI1/PAD/PF4 15* PBM11/PF4 2%
Esimerkki 7 prokaryoottisissa soluissa valmistetun verihiutaletekija 4:n biologinen aktiivisuus A. DNA-synteesin inhibointi
Suurin havaittu aktiivisuus oli fuusioproteiinin kanssa, joka oli saatu plasmidista pBMll/N-geeni/pF4 (katso esimerkki IA) . 50 % A549-solujen maksimi-inhibiitiosta saatiin, kun käytettiin 0,67 jug/kolo.
B. Kasvainten kasvun inhibointi paljaissa hiirissä
Urospuolisiin paljaisiin hiiriin injektoitiin verihiutale-tekijää 4 tai fosfaattipuskuroitua suolaliuosta 2-3 päivän välein, kuten esimerkissä 1C on kuvattu. Kuten taulukossa iv esitetään, verihiutaletekijä 4 inhiboi merkittävästi kasvainten kasvua.
so 100336
Taulukko IV
Yhdistelmä-verihiutaletekijä 4:n vaikutus kasvainten kasvuun paljaissa hiirissä _Kasvaimen koko (mm3)___ Päivää käsitt. jälkeen_vertailu_yerihiutaletekijä 4 0 17 25 6 205 25 9 275 25
U 420 HO
17 5H5 50 20 635 85
Edelläolevista tuloksista ilmenee, että keksinnön kohteena olevilla yhdisteillä on paljon erilaisia käyttöjä. Erityisesti voidaan yhdisteitä käyttää kasvaintilojen diagnoosissa ja hoidossa. Terapiassa yhdiste voi hidastaa kasvainsolujen kasvua, joten sitä voidaan käyttää yhdessä muiden hoitotapojen kanssa tuhoamaan kasvainsoluja. Diagnoosia varten on kohdeyh-disteiden havaittu indusoivan p52:n tuotantoa, niin että annettaessa kohdeyhdisteitä isännälle, p52:n kohonneet määrät osoittaisivat kasvainsolujen läsnäolon. Kasvaintilojen hoidon aikana voi olla erittäin tärkeätä määrittää, onko kasvainsolu jen poisto onnistunut vai onko metastaaseja ilmennyt. Kohdeyhdisteitä voidaan käyttää myös reagensseina diagnostisissa analyyseissä sen suhteen, onko läsnä verihiutaletekijä 4 tai ' sen reseptoreja.
Kaikki tässä selityksessä mainitut julkaisut ja patenttihakemukset osoittavat sen alan ammattimiesten tiedon määrää, johon tämä keksintö liittyy. Kaikki julkaisut ja patenttihakemukset on liitetty tähän yhteyteen viitteeksi samassa määrin kuin jos jokainen yksittäinen julkaisu tai patenttihakemus olisi spesifisesti ja yksittäisesti osoitettu liitetyksi viitteeksi.
51 100336
Keksinnön nyt tultua täysin kuvatuksi, on alan ammattimiehelle ilmeistä, että monia muutoksia ja muunnoksia voidaan siihen tehdä poikkeamatta mukaan liitettyjen patenttivaatimusten hengestä tai alueesta.

Claims (15)

100336
1. Ilmentämiskasetti fuusioproteiinin valmistamiseksi, joka fuusioproteiini sisältää polypeptidin fuusioituneena verihiutaletekijä 4:n tai sen kongeneerin N-päähän, ja joka ilmentämiskasetti käsittää transkription suunnassa isän-täsolussa funktionaalisen transkription säätelyalueen ja translaation aloitusalueen, DNA-sekvenssin, joka koodittaa ohjaajasekvenssiä, liittyneenä lukuvaiheistukseen DNA-sekvenssin kanssa, joka koodittaa verihiutaletekijä 4:ää tai sen kongeneeriä, ja mainitussa isäntäsolussa funktionaaliset translaation ja transkription päätösalueet, jolloin mainitun DNA-sekvenssin ilmentyminen on mainittujen aloitus- ja päätösalueiden säätelemä, ja jossa ainakin yksi transkription säätelyalueesta, transkription aloitusalu-eesta, ja translaation ja transkription päätösalueesta on muu kuin luonnollinen alue liittyneenä verihiutaletekijä 4:n rakennegeeniin, kun mainittu DNA-sekvenssi, joka koodittaa verihiutaletekijä 4:ää tai sen kongeneeriä, on luonnollinen sekvenssi, ja ilmentämiskasetti edelleen käsittää DNA:n joka koodittaa spesifejä N-pääaminohappoja lukuvaiheistuksessa DNA-sekvenssin kanssa, joka koodittaa verihiutaletekijä 4:ää tai sen kongeneeriä, ja translaation aloitusalue käsittää ribosomien sitoutumiskohdan joka on liittynyt luonnossa spesifeihin N-pääaminohappoihin, tunnettu siitä, että transkription säätelyalue käsittää bakteriof aagi - lambda-PL-promoottorin, bakteriof aagi - lambda -0L-operaattorin ja lämpötilaherkän C1857-repressorin, jolloin repressori vuorovaikuttaa operaattorin kanssa säätäen promoottoria ja jossa translaation aloitusalue : käsittää N-geenin ribosomien sitoutumiskohdan.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentämiskasetti, tunnettu siitä, että mainittu ohjaajasekvenssi käsittää noin 8-35 N-pääaminohappoa bakteriofaagi-lambda-N-geenistä.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentämiskasetti, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, joka koodittaa veri- 100336 hiutaletekijä 4:ää tai sen kongeneeriä käsittää bakteriaa-lisia suositeltavia kodoneja.
4. Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi, joka sisältää ensimmäisen polypeptidin fuusioituneena verihiutalete-kijä 4:n tai sen kongeneerin N-päähän, jossa menetelmässä kasvatetaan ravintoväliaineessa transformoitua prokaryoot-tista isäntäsolua, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-ilmentämiskasetin joka sisältää transkription 5'-3'-suunnassa transkription säätelyalueen; translaation aloitusalueen; ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka koodittaa mainittua ensimmäistä polypeptidiä, liittyneenä lukuvai-heistukseen toisen DNA-sekvenssin kanssa, joka koodittaa mainittua verihiutaletekijää 4 tai sen kongeneeriä; ja translaation ja transkripition päätösalueet; ja mainitun fuusioproteiinin eristämisen; ja ensimmäinen DNA-sekvenssi koodittaa spesifejä N-pääaminohappoja ja translaation aloitusalue käsittää ribosomien sitoutumiskohdan, joka on liittynyt luonnossa spesifeihin N-pääaminohappoihin, tunnettu siitä, että ilmentämiskasetin transkription säätelyalue käsittää bakteriofaagi-lambda-PL-promoottorin, bakteriofaagi-lambda-0L-operaattorin ja lämpötilaherkän C1857-repressorin, jolloin repressori vuorovaikuttaa operaattorin kanssa säätäen promoottoria ja jossa translaation aloitusalue käsittää N-geenin ribosomien sitoutumiskohdan.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se edelleen käsittää sen, että mainitun eristämisen jälkeen mainittu fuusioproteiini laskostetaan uudelleen .
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ensimmäinen polypeptidi käsittää noin 8-35 N-pääaminohappoa bakteriofaagi-lambda-N-geenistä.
7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ensimmäinen DNA-sekvenssi käsittää 100336 DNA-sekvenssin, joka koodit taa noin 8-35 N-pääatninohappoa bakteriofaagi-lambda-N-geenistä.
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, joka koodittaa verihiutaletekijä 4:ää tai sen kongeneeriä käsittää bakteriaalisia suositeltavia kodoneja.
9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ilmentämiskasetti edelleen käsittää kolmannen DNA-sekvenssin, joka koodittaa ainakin yhtä aminohappoa mainitun ensimmäisen DNA-sekvenssin ja mainitun toisen DNA-sekvenssin välillä.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kolmas DNA-sekvenssi koodittaa kemiallista lohkaisukohtaa tai entsymaattista lohkaisukohtaa.
11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kemiallinen lohkaisukohta on aspara-giinihappo-proliini.
12. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu menetelmä edelleen käsittää sen, että mainitun eristämisen jälkeen lohkaistaan mainittu happolabiili dipeptidi, jolloin mainittu polypeptidi vapautuu .
13. Transformoitu prokaryoottinen isäntäsolu, jota käytetään fuusioproteiinin valmistamiseksi, joka sisältää poly-peptidin fuusioituneena verihiutaletekijä 4:n tai sen kon-geneerin N-päähän joka käsittää: patenttivaatimuksen 1 mukaisen ilmentämiskasetin, jossa on transkription suunnassa isäntäsolussa funktionaalinen transkription säätelyalue ja translaation aloitusalue; ensimmäinen DNA-sekvenssi, joka koodittaa ohjaajasekvens-siä, liittyneenä sopivaan lukuvaiheistukseen toisen DNA-sekvenssin kanssa, joka koodittaa polypeptidiä, jossa on - 100336 verihiutaletekijä 4 tai sen kongeneeri; mainitussa isän-täsolussa funktionaalinen translaation ja transkription päätösalue; jolloin ainakin yksi transkription säätely-alueesta, transkription aloitusalueesta, ja translaation ja transkription päätösalueesta on muu kuin luonnollinen alue liittyneenä verihiutaletekijä 4:n rakennegeeniin, kun mainittu DNA-sekvenssi on luonnollinen sekvenssi, ja jolloin mainitun toisen DNA-sekvenssin ilmentyminen on mainittujen aloitus- ja päätösalueitten säätelemä; ja ilmentä-miskasetti edelleen käsittää DNA:n joka koodittaa spesifejä N-pääaminohappoja lukuvaiheistuksessa DNA-sekvenssin kanssa, joka koodittaa verihiutaletekijä 4:ää tai sen kon-geneeriä, ja translaation aloitusalue käsittää ribosomien sitoutumiskohdan joka on liittynyt luonnossa spesifeihin N-pääaminohappoihin, tunnettu siitä, että ilmentämiskasetin transkription säätelyalue käsittää bakteriofaagi-lambda-PL-promoottorin, bakteriofaagi-lambda-0L-operaattorin ja läm-pötilaherkän C1857-repressorin, jolloin repressori vuoro-vaikuttaa operaattorin kanssa säätäen promoottoria ja jossa translaation aloitusalue käsittää N-geenin ribosomien sitoutumiskohdan.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen solu, jossa mainittu solu on E. coli-solu.
15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen solu, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi, joka koodittaa verihiutaletekijä 4:ää tai sen kongeneeriä käsittää bakteriaalisia suositeltavia kodoneja. 100336 PATENTKRÄV
FI885031A 1987-03-02 1988-11-01 Ilmentämiskasetti, menetelmä ja isäntäsolu fuusioproteiinin valmistami seksi FI100336B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2060987A 1987-03-02 1987-03-02
US2060987 1987-03-02
US11513987A 1987-10-30 1987-10-30
US11513987 1987-10-30
US8800634 1988-02-26
PCT/US1988/000634 WO1988006628A1 (en) 1987-03-02 1988-02-26 Platelet related growth regulator

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI885031A0 FI885031A0 (fi) 1988-11-01
FI885031A FI885031A (fi) 1988-11-01
FI100336B true FI100336B (fi) 1997-11-14

Family

ID=26693642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI885031A FI100336B (fi) 1987-03-02 1988-11-01 Ilmentämiskasetti, menetelmä ja isäntäsolu fuusioproteiinin valmistami seksi

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0281363B1 (fi)
JP (1) JPH01503513A (fi)
KR (1) KR890700672A (fi)
AT (1) ATE123061T1 (fi)
AU (1) AU623589B2 (fi)
DE (1) DE3853842T2 (fi)
ES (1) ES2074049T3 (fi)
FI (1) FI100336B (fi)
GR (1) GR3017041T3 (fi)
IE (1) IE69678B1 (fi)
IL (1) IL85613A (fi)
NZ (1) NZ223696A (fi)
PT (1) PT86885B (fi)
WO (1) WO1988006628A1 (fi)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4844895A (en) * 1985-11-01 1989-07-04 New York University Composition containing a peptide fragment of platelet factor four and method for restoring suppressed immune responses
US5026639A (en) * 1988-01-14 1991-06-25 Nippon Mining Company, Limited Method to improve mRNA translation and use thereof for production of platelet factor-4
GB2214508A (en) * 1988-01-27 1989-09-06 Bayer Ag Plasmid vector for the efficient expression of foreign genes fused with newly conceived transcriptional and translational signal sequences.
US5800820A (en) * 1989-01-10 1998-09-01 Repligen Corporation Methods and compositions for treatment of angiogenic diseases
US5086164A (en) * 1989-01-10 1992-02-04 Repligen Corporation Novel methods and compositions for treatment of angiogenic diseases
US5187075A (en) * 1989-01-26 1993-02-16 Sri International Cloning and expression of a variant gene of platelet factor 4 and compositions thereof to modulate immune responses
US5112946A (en) * 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
JPH06509116A (ja) * 1991-07-15 1994-10-13 レプリゲン　コーポレーション 修正されたｐｆ４組成物及び使用方法
CA2106368A1 (en) * 1992-01-16 1993-07-17 Theodore E. Maione Methods and compositions for treatment of angiogenic disease
AU1171795A (en) * 1993-11-05 1995-05-23 Repligen Corporation Novel modified pf4 compositions and methods of use
IL113561A0 (en) * 1994-05-09 1995-08-31 Lilly Co Eli Expression of recombinant mpf-4, cpf-4, pf-4 and precursor compounds
US5985543A (en) * 1996-10-11 1999-11-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for detection of antibody binding to cells
US7067117B1 (en) 1997-09-11 2006-06-27 Cambridge University Technical Services, Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US6989435B2 (en) 1997-09-11 2006-01-24 Cambridge University Technical Services Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
US7238711B1 (en) 1999-03-17 2007-07-03 Cambridge University Technical Services Ltd. Compounds and methods to inhibit or augment an inflammatory response
WO2007053952A1 (en) * 2005-11-10 2007-05-18 Chemokine Therapeutics Corporation Platelet factor-4 (pf-4) analogs and their use
IL157378A0 (en) 2001-03-09 2004-02-19 Genentech Inc Process for production of polypeptides
US8609621B2 (en) 2010-11-15 2013-12-17 E I Du Pont De Nemours And Company Acid-cleavable linkers exhibiting altered rates of acid hydrolysis

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4565785A (en) * 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule
IL60184A (en) * 1979-05-31 1984-05-31 Schering Ag Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins
US4530901A (en) * 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4582800A (en) * 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
SE8300693L (sv) * 1983-02-09 1984-08-10 Sven Lofdahl Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta
EP0133123A1 (en) * 1983-07-25 1985-02-13 Mgi Pharma, Inc. Immunogens of papilloma viruses
US4645828A (en) * 1984-03-23 1987-02-24 Oncogen Platelet related growth regulator
AU4866485A (en) * 1984-09-18 1986-04-08 Sagami Chemical Research Center Cyclic double-stranded dna, process for its preparation, microorganism containing said cyclic double-stranded dna, andprocess for preparing protein containing antigen determinant
JPH0816063B2 (ja) * 1985-03-15 1996-02-21 オンコゲン 腫瘍細胞増殖阻害剤
EP0196864A3 (en) * 1985-03-25 1988-03-23 Cetus Corporation Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, dna sequences for use therein and cells transformed using such sequences
JPS61280292A (ja) * 1985-06-04 1986-12-10 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd 菌体外分泌による蛋白質の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
IL85613A0 (en) 1988-08-31
PT86885B (pt) 1995-08-09
KR890700672A (ko) 1989-04-26
DE3853842D1 (de) 1995-06-29
WO1988006628A1 (en) 1988-09-07
EP0281363A3 (en) 1988-11-17
JPH01503513A (ja) 1989-11-30
AU1492488A (en) 1988-09-26
EP0281363A2 (en) 1988-09-07
IE880591L (en) 1988-09-02
FI885031A0 (fi) 1988-11-01
FI885031A (fi) 1988-11-01
ATE123061T1 (de) 1995-06-15
IE69678B1 (en) 1996-10-02
EP0281363B1 (en) 1995-05-24
AU623589B2 (en) 1992-05-21
IL85613A (en) 1994-10-07
DE3853842T2 (de) 1995-12-07
GR3017041T3 (en) 1995-11-30
ES2074049T3 (es) 1995-09-01
PT86885A (pt) 1989-03-30
NZ223696A (en) 1991-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI100336B (fi) Ilmentämiskasetti, menetelmä ja isäntäsolu fuusioproteiinin valmistami seksi
DK172463B1 (da) Anvendelse af oncostatin-A eller derivater deraf til in vitro diagnostisk detektion af tumorceller
KR970002915B1 (ko) 제ⅷ인자 활성을 가지는 신규한 단백질 : 유전공학-제조 세포를 사용하는 그의 제조방법 및 그것을 함유하는 의약 조성물
AU616672B2 (en) Growth hormone receptor
JP2957974B2 (ja) エリスロポエチン活性を有するタンパク質の製造方法
EP0557418B1 (en) A beta-type transforming growth factor
GB2214185A (en) Proteins and methods for their production
JPH05308973A (ja) ハイブリドインターフェロン遺伝子
WO1988009818A1 (en) Growth hormone receptor
US5714581A (en) Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5115096A (en) Amphiregulin: a bifunctional growth modulating glycoprotein
JP2533869B2 (ja) Ｈｕｓｉ―ｉ型インヒビタ―の生物学的活性を有するタンパク質をコ―ドするｄｎａ配列、前記ｄｎａ配列を含む組換え体クロ―ニングベクタ―及び前記ベクタ―により形質転換された細菌
US5688763A (en) Compositions and methods for the synthesis of growth hormone receptor and growth hormone binding protein
US5858779A (en) Monoclonal antibody, hybridoma, their production and use thereof
US5248666A (en) Methods for inhibiting neoplastic cell proliferation using platelet factor 4
US4737580A (en) Platelet related growth regulator
US5175255A (en) Methods for purification of platelet-derived growth factor
JPH06506115A (ja) 新規ベータインテグリンサブユニット
FI104424B (fi) Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi
HUT50501A (en) Process for producing new polypeptides of growth factor activity and nucleinic-acid-sequences coding them
JP3232415B2 (ja) モノクローナル抗体，その製造法および用途
JPH0816063B2 (ja) 腫瘍細胞増殖阻害剤

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed

Owner name: ONCOGEN, A LIMITED PARTNERSHIP