JP2533869B2

JP2533869B2 - Ｈｕｓｉ―ｉ型インヒビタ―の生物学的活性を有するタンパク質をコ―ドするｄｎａ配列、前記ｄｎａ配列を含む組換え体クロ―ニングベクタ―及び前記ベクタ―により形質転換された細菌

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Publication number: JP2533869B2
Application number: JP62003084A
Authority: JP
Inventors: ハインツェルレジナ; アッペルハンスヘリベルト; ギュンテルガッセンハンス; マッハライトヴェルネル; ゼーミュレルウルズラー
Original assignee: Gruenenthal GmbH
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 1986-01-10
Filing date: 1987-01-09
Publication date: 1996-09-11
Anticipated expiration: 2011-09-11
Also published as: US4845076A; EP0232523A2; LV10490A; PT84089B; JPS62259591A; ES2054612T3; DK11187A; LV10490B; DK11187D0; LTIP1753A; AU6745287A; HUT43106A; PT84089A; CA1326216C; HU204888B; ZA87141B; EP0232523B1; EP0232523A3; AU604003B2; DE3600571A1

Description

【発明の詳細な説明】（１）序本発明はHUSI−Ｉ型インヒビターの生物学的活性を有
するタンパク質をコードする哺乳動物のゲノムからの、
殊にヒトのゲノムからのDNA配列に関し、また組換え体D
NA技術を用いるそのようなDNA配列を含むベクターのク
ローニングおよび発現に関する。

（２）発明の背景生体細胞および生物中で、酵素の活性は最初に酵素の
ドゥノボ合成および化学修飾により調節される。細胞ま
たは生物の改変環境態および同時に高活性の特異性酵素
に対する速い適応が必要であるときに、常にこの酵素が
多量にドゥノボ合成されることを意味しない。しばしば
既に存在する酵素のプールが活性化される。例えば消化
酵素（プロテアーゼ）がそれらの貯蔵形態、いわゆるチ
モーゲンから活性プロテアーゼに転移される。必要なと
きに血液凝固因子が同様に不活性貯蔵形態から生物学的
活性形態に転移される。貯蔵酵素の公知活性化機構は特
異性ペプチダーゼによる開裂、プロテインキナーゼによ
るリン酸化、ベシクルからの遊離およびアロステリック
配位子によるタンパク質立体配座の変更である。過度の
上記活性化反応および活性化酵素の長時間効果はこれら
の酵素の制御された分解または特異的阻害により防がれ
る。例えば活性化プロティナーゼの生物学的活性はしば
しば特異的プロティナーゼインヒビターにより阻害され
る。

過去数年中に種々のプロティナーゼインヒビターの臨
床および病因の関連が認められた（１、２）。リソソー
ムプロティナーゼインヒビターが敗血症、リウマチ型の
慢性疾患並びに上肺系の疾患の療法に適することが認め
られた。しかし現在、これらの疾患の治療に使用できた
と知られるプロティナーゼインヒビターは存在しない。
差当り、プロティナーゼインヒビターアプロチニンが療
法に使用されるだけである。アプロチニンは高フィブリ
ン溶解により生ずる術後出血の処置およびショックの早
期処置に使用される。

上記疾患の療法にはHUSI（ヒト−精漿インヒビター）
−Ｉ型インヒビターが適当であることができよう。それ
らはタンパク質である。HUSI−Ｉ型インヒビターの群の
例はプロティナーゼインヒビターHUSI−Ｉ、CUSI−Ｉ
（子宮頸分泌インヒビター）およびBSI（気管支分泌イ
ンヒビター）である。

HUSI−Ｉはヒト精漿からの酸耐性プロティナーゼイン
ヒビターであり、グラニュロザイト（granulozyt）のリ
ソソーム顆粒からのプロティナーゼ例えばエラスターゼ
を阻害する。HUSI−Ｉは単に他の細胞内または細胞外プ
ロティナーゼに対し低い阻害活性を示す。その分子量は
約11,000である。HUSI−Ｉの部分アミノ酸配列はフリッ
ツ（Fritz）（48）により発表された。

HUSI−Ｉのほかに、ヒト精漿中にさらに酸耐性プロテ
ィナーゼインヒビター、すなわちHUSI−IIが存在する
（３）。その分子量は約6,500である。HUSI−ＩおよびH
USI−IIは全く異なる阻害スペクトルを有する。HUSI−I
Iの阻害活性はトリプシンおよびアクロシンに限定され
るけれども、HUSI−Ｉの最も顕著な性質はグラニュロザ
イトのリソソーム顆粒からのプロテアーゼ例えばエラス
ターゼの特異的不活性化である。その異なる生物学的活
性のためにHUSI−IIは従って非HUSI−Ｉ型インヒビター
である。

酸耐性インヒビターCUSI−Ｉは子宮頸分泌物から分離
された（４）。CUSI−Ｉの分子量はHUSI−Ｉとほゞ等し
い。さらにHUSI−ＩおよびCUSI−Ｉは同様の阻害スペク
トルを有する。オッテルロニー免疫拡散試験においてHU
SI−ＩおよびCUSI−Ｉは抗HUSI−Ｉ抗体と免疫交差反応
を示す（５、６）。最後に、HUSI−ＩおよびCUSI−Ｉの
アミノ酸分析は単に断片的に知られた限りほゞ等しい
（47）。

気管支分泌インヒビター（BSI）は気管支分泌物から
分離された（41、44、45、46）。BSIの初めの25個のア
ミノ酸配列は（41）に不完全に発表された。BSIは約10,
000の分子量を有する。免疫試験において、BSIはウサギ
抗HUSI−Ｉ抗体と交差反応を示す（47）。BSIは酸耐性
であり、プロティナーゼロイコザイト（leukozyte）エ
ラスターゼ、カテプシンＧ、トリプシンおよびキモトリ
プシンを阻害する。

HUSI−Ｉ型インヒビターの生物学的活性は実質的に知
られているけれども、今までのところ、これらのインヒ
ビターはそれらが実質的に純粋な形態で十分な量入手で
きなかったので治療目的に使用できなかった。

（３）発明の概要従って本発明の基礎となる問題はHUSI−Ｉ型インヒビ
ターの生物学的活性を有するタンパク質をコーディング
するDNA配列を提供することである。

この問題は哺乳動物のゲノムから、殊にヒトのゲノム
から誘導されるDNA配列を提供することにより解決さ
れ、それは、好ましくは緊縮条件下に第４図および（ま
たは）第５図記載のDNA配列にハイブリッド形成し、ま
たHUSI−Ｉ型インヒビターの生物学的活性を有するタン
パク質をコードする。

本発明における「HUSI−Ｉ型インヒビターの生物学的
活性を有するタンパク質」という語はインヒビターHUSI
−Ｉ、CUSI−ＩまたはBSIの生物学的活性、すなわち、
例えば天然タンパク質の免疫特性および（または）天然
タンパク質の特異的阻害性を有する融合タンパク質およ
び非融合タンパク質に関する。HUSI−Ｉ型インヒビター
の生物学的活性を有する本発明のタンパク質の阻害活性
は後に酵素キモトリプシンの抑制の測定により決定され
る。「緊縮条件下のハイブリッド形成」および「普通の
ハイブリッド形成条件」という語に関しては（28）第38
7〜389頁およびボンナー（Bonner）ほか（28）が参照さ
れる。一般にT_m−15〜T_m−30、好ましくはT_m−20〜T_m−
27が使用される。HUSSI−Ｉ、CUSI−ＩおよびBSIのアミ
ノ酸配列の単に一部を含む融合タンパク質および非融合
タンパク質は本発明においてHUSI−Ｉ型インヒビターの
生物学的活性を有するタンパク質と称される。タンパク
質のアミノ酸配列の部分領域はまた「ドメイン」と称さ
れる。

本発明の好ましい態様において、DNA配列はCUSI−Ｉ
タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコード
する。本発明のさらに好ましい態様において、DNA配列
は第５図に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を
コードする。

本発明の殊に好ましい態様はPstIフラグメントの形態
でpRH31およびpRH34中に含まれる第４図および第５図に
示されるDNA配列である。プラスミドpRH31およびpRH34
はドイッチェ・サムルング・フュア・ミクロオルガニス
メン〔Deutsche Sammlung f Mikroorganismen（DS
M）〕にそれぞれ寄託番号DSM3634およびDSM3635で寄託
された。プラスミドpRH31およびpRH34またはそれらから
誘導されたフラグメントおよび合成オリゴヌクレオチド
はHUSI−Ｉ型インヒビターの生物学的活性を有するタン
パク質、例えばHUSI−ＩおよびBSIをコードする他のDNA
配列の同定および分離に対するプローブとして適する。
この結論は、今までのところ利用できるインヒビターHU
SI−ＩおよびBSIの一次構造データが不完全であるけれ
ども大きい類似を示すので専門家には可能である。これ
からDNAレベルにおける高い配列同族関係が予想され
る。この高い配列同族関係に基いて単に１つの遺伝子が
３つのインヒビターのすべてをコードすること、および
個々のインヒビターが組織特異性発現生成物であること
を排除できない。

好ましくは緊縮条件下の、前記DNA配列の１つへのDNA
配列ハイブリッド形成もまた本発明の目的に適する。該
DNA配列は天然、半合成または合成由来であり、それら
は突然変異、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌ
クレオチド挿入またはヌクレオチド領域の逆位による前
記DNA配列の１つに関し、それらはHUSI−Ｉ型インヒビ
ターの生物学的活性を有するタンパク質をコードする。

本発明の主題はさらに前記DNA配列のクローニングお
よび発現のためのベクターである。本発明において「ベ
クター」という語は例えばプラスミド例えばpBR322、pU
C18、pUR290、pWH701およびpSP6、あるいはウィルスの
ゲノムおよびそのフラグメントまたは誘導体、例えばλ
ファージまたはファージM13のゲノムに関する。本発明
の発現ベクター中に、発明のDNA配列が表現制御配列に
適切に結合される。好ましい態様において遺伝子の５′
端における表現ベクターは次の配列：を有するDNAフラグメントを含む本発明による表現制御配列（プロモーター系）として
大腸菌（E.coli）lacプロモーター、大腸菌trpプロモー
ター、大腸菌リポタンパク質プロモーター、アルカリ性
ホスファターゼプロモーター、λP_Lプロモーター、λP_R
プロモーター、酵母表現制御配列または他の真核細胞表
現規制配列を用いることができる。本発明の殊に好まし
いプラスミドはプラスミドpRH31（DSM3634）およびpRH3
4（DSM3635）である。他の殊に好ましいプラスミドはプ
ラスミドpRH31、pRH34およびpRH1810（DSM3905）で構築
することができるプラスミドpRH24、pRH21およびpBA17
である。

さらに本発明の主題は前記ベクターで形質転換された
宿主生物である。好ましい宿主生物は種大腸菌（E.col
i）の株、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）ま
たは他の細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharo
myces cerevisiae）、他の顕微鏡的小真菌、動物または
ヒト細胞である。

本発明の主題はさらにHUSI−Ｉ型インヒビターの生物
学的活性を有するタンパク質にも言及する。前記タンパ
ク質はCUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を示す。殊に
好ましい態様において、CUSI−Ｉタンパク質の生物学的
活性を有するタンパク質は第５図に示されるアミノ酸配
列を示す。

他の殊に好ましい態様において、CUSI−Ｉタンパク質
の生物学的活性を有するタンパク質は次のアミノ酸配
列： Pro−Val−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−
Lys−Pro−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−
Gln−Cys−Leu−Met−Leu−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−
Cys−Glu−Met−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−
Leu−Lys−Cys−Cys−Met−Gly−Met−Cys−Gly−Lys−
Ser−Cys−Val−Ser−Pro−Val−Lys−Ala−OH。

を有する。

他の殊に好ましい態様においてCUSI−Ｉタンパク質の
生物学的活性を有するタンパク質は次のアミノ酸配列： Asp−Pro−Val−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−
Arg−Lys−Pro−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−
Gly−Gln−Cys−Leu−Met−Leu−Asn−Pro−Pro−Asn−
Phe−Cys−Glu−Met−Asp−Gly−Gln−Gys−Lys−Arg−
Asp−Leu−Lys−Cys−Cys−Met−Gly−Met−Cys−Gly−
Lys−Ser−Cys−Val−Ser−Pro−Val−Lys−Ala−OH。

を有する。

本発明のDNA配列によりコードされるタンパク質は、
好ましくは実質上純粋なタンパク質である。

本発明はさらに、前記形質転換した宿主生物の１つを
普通の栄養培地中で培養し、場合により遺伝子生成物の
発現を誘発し、培養から、すなわち培養細胞からおよび
（または）普通培地から発現生成物を分離し、場合によ
り発現生成物をさらに制御酸加水分解条件下に処理して
部分加水分解し、ゲルクロマトグラフィーにより水解物
から所望の生物学的活性タンパク質を分離することを含
む前記タンパク質の製造方法に関する。それらの用途に
より、得られたタンパク質を好ましくはクロマトグラフ
ィー、例えばアフィティークロマトグラフィーまたは高
性能液体クロマトグラフィー（HPLC）あるいはこれらの
方法の組合せによりさらに精製することができる。

本発明のDNA配列によりコードされたタンパク質およ
びタンパク質フラグメントは、特に慢性気管支炎、慢性
頸部炎症の治療、並びに過剰の粘液分泌に関連する他の
慢性炎症過程およびそれから生ずる急性緊急状態の治療
に適する。それらはさらにショックの初期治療および、
例えば高フィブリン分解に基く術後出血の治療に適す
る。相応して、HUSI−Ｉ型インヒビターの生物活性を有
するタンパク質有効量並びに普通の担体および（また
は）希釈剤および（または）アジュバントを含む製剤組
成物についても言及する。治療にはHUSI−Ｉ型インヒビ
ターの生物学的活性を有するタンパク質は無菌等張溶液
の形態で、筋肉内、静脈内または皮下注射により炎症領
域に、場合により注入により投与することができる。上
記製剤組成物において、スプレーの形態の製剤組成物ま
たは吸入製剤が好ましい。それらは活性成分の気管支の
管および肺の疾患部への直接適用により気道の疾患の治
療に殊に適する。

（４）発明の説明異質タンパク質を合成できる宿主生物を構築するため
に多くの実験段階を行なうことが必要である。最初に所
望タンパク質の生合成に対する情報をもつ遺伝子を同定
して分離する。遺伝子の同定および分離には種々の方法
がある。例えばCUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有
するタンパク質をコードするDNA配列の分離には、まずH
USI−Ｉタンパク質の部分タンパク質配列データに基く
合成オリゴヌクレオチドの２つの混合物を調製する。こ
れらのオリゴヌクレオチドは６個のアミノ酸をエンコー
ド（encode）するDNA配列に相補性である（第１図RH1お
よびRH2参照）。CUSI−Ｉ、HUSI−Ｉ（48）およびBSI
（41）の一次構造に関する不完全なデータを基にして適
当なオリゴヌクレオチド混合物を合成することができな
かった。アミノ酸配列の公知データに対しトリプシンフ
ラグメント、ブロモシアノフラグメントまたはNH₂末端
の化学的に不均一な混合物を基にして得られた（48）。
そのように得られた部分配列はさらに本発明により決定
されたCUSI−Ｉタンパク質のアミノ酸配列から30％以上
偏位する。アミノ酸の配列中の既に１つの簡単な不正確
に決定されたアミノ酸がこのアミノ酸配列から誘導され
るオリゴヌクレオチドプローブの作用を生じないことが
できることは十分に立証されている。（48）中には例え
ばRH2の領域中のアミノ酸配列がCys−Ser−Met−Gly−M
et−Cysであると記載されているが、しかしこの領域中
の本発明により決定されたアミノ酸配列はCys−Cys−Me
t−Gly−Met−Cysである（第４図参照）。

本発明によれば、cDNAライブラリーは合成オリゴヌク
レオチドの前記混合物を用いてスクリーンされる。これ
らのcDNAライブラリーは出発物質としてヒト頸部組織か
らmRNAで調製された。本発明によるcDNAライブラリー調
製の出発物質として、またヒト肺の上部気道（死後10時
間にとった剖検物質）の組織からのmRNAを用いることが
できる（７）。供与組織から分離されたmRNAは常法で相
補性DNA（cDNA）分子の合成に使用され、それは最後に
プラスミドpBR322のPstI部位に挿入される。そのように
調製されたcDNA分子で宿主生物、例えば大腸菌K12DH1、
を形質転換し、常法でテトラサイクリンを含む寒天平板
上で培養する。CUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有
するタンパク質をコードするcDNA配列を有するプラスミ
ドを含む形質転換宿主細菌のコロニーはハイブリッド形
成実験、いわゆるコロニーハイブリッド法で同定され
る。この実験には、レプリカニトロセルロースフィルタ
ーを寒天平板上に成長する細菌コロニーから調製する、
サヤー（Thayer）（８）参照。レプリカニトロセルロー
スフィルターを次いでワリス（Wallace）（９）に従い
２つの前記オリゴヌクレオチド混合物でハイブリッド形
成する。陽性コロニーから、組換え体cDNA含有プラスミ
ドを分離する。プラスミド中のcDNA挿入の大きさが決定
され、適当な大きさの挿入体を有するプラスミドはcDNA
挿入体のDNA配列の分析により一層詳細に確認される。
従って組換え体プラスミドpRH31が分離される。それはD
SMに寄託番号DSM3634で寄託されている。さらに頸部組
織試料のmRNAからプラスミドpRH31のDNA配列から誘導さ
れたオリゴヌクレオチドで調製したcDNAライブラリーを
スクリーニングし、ハイブリッド形成中のブローブとし
て作用させることにより組換え体プラスミドpRH34を分
離する（第４図、RH5参照）。組換え体プラスミドpRH34
の挿入体のDNA配列を決定すると、このプラスミドがCUS
I−Ｉタンパク質をコードする全領域を含むことを知る
ことができる。組換え体プラスミドpRH34はDSMに寄託番
号DSM3635で寄託された。

プラスミドpRH31およびpRH34中に含まれるcDNA配列の
援助で次に発現ベクターが構築される。最初の組換え体
プラスミドpRH24は中間体として作用する組換え体プラ
スミドpRH1810から調製される。組換え体発現プラスミ
ドpRH24はCUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有する
タンパク質をコードするプラスミドpRH34の領域、並び
にシャイン−ダルガルノ配列および翻訳由来をともに含
む合成DNAフラグメントを含む。組換え体発現ベクターp
RH24から誘導された発現生成物は第５図に示される全ア
ミノ酸を含む。

さらに組換え体発現プラスミドpRH21が調製される。
このため、Sau III AフラグメントがプラミドpRH31から
切り出され、プラスミドpUR290のBamH I制限部位中へ挿
入される。そのように構築された組換え体発現プラスミ
ドpRH21から誘導された発現生成物はＮ末端がβ−ガラ
クトシダーゼのアミノ酸配列からなり、59C−末端アミ
ノ酸がCUSI−Ｉタンパク質の最後の59アミノ酸に相当す
る融合タンパク質である（第５図参照）。58アミノ酸の
長さを有するポリペプチドを常法で、この発現生成物か
らアスパラギン酸−プロリン結合の酸加水分解により
（例えば10〜70％の酢酸またはギ酸、好ましくは約30％
酢酸または70％ギ酸で、約10〜30℃の範囲内の温度、好
ましくは室温で、20〜40時間処理することにより）分離
する。次いでゲルクロマトグラフィーにより精製する。
この58アミノ酸の長さを有するポリペプチドはCUSI−Ｉ
タンパク質の生物学的活性を有する第５図に記載される
タンパク質のＣ−末端ドメインに相当する。

プラスミドpBA17は他の組換え体発現プラスミドとし
て構築される。このためBamH I/Hinf Iフラグメントが
プラスミドpRH1810から切り出され、末端を満たした後
発現プラスミドpSP6に連結される。発現プラスミドは連
結のためにHind III開裂並びに次のムングビーン（Mung
bean）ヌクレアーゼおよびアルカリ性ホスファターゼに
よる処理により調製される。生じた組換え体発現プラス
ミドpBA17から得られる発現生成物は59個のアミノ酸か
らなる。その配列は第５図中の59C−末端アミノ酸の１
つに相当する。発現生成物はCUSI−Ｉタンパク質の生物
学的活性を示す。

相当する形質転換した宿主生物による前記タンパク質
の発現は免疫沈殿10により、またはウエスターンブロッ
ト（Westernblot）分析11、12により示される。発現生
成物の生物学的活性はプロティナーゼキモトリプシンの
阻害により決定される。

図面には次のように示される：第１図:HPLCにより精製し、トリプシンによるタンパク
質の酵素開裂により得られた天然CUSI−Ｉタンパク質の
フラグメントのアミノ酸配列。

合成オリゴヌクレオチドの２混合物が誘導された配列
領域はRH1およびRH2と称される。それらはアンダーライ
ンされている。

第２図：プラスミドpRH31の制限地図。

組換え体プラスミドpRH31が制限部位、Ｐ＝Pst I、Ｅ
＝EcoR I、Ｂ＝BamH I、Ｈ＝Hind III、とともに示され
る。黒バーはcDNA挿入体を示し、円中の矢はテトラサイ
クリン耐性遺伝子（tet^r）および中断アンピシリン耐性
遺伝子（amp^s）を示す。

第３図：プラスミドpRH31のcDNA挿入の配列化方策の図
式。

黒バーはプラスミドpRH31の500bp−Pst Iフラグメン
トを示し、黒矢はそれぞれの場合において配列反応に相
当する。白色非充填矢はCUSI−ＩをコードするcDNA挿入
体上の領域を示す。

第４図：プラスミドpRH31のCUSI−Ｉ−cDNAフラグメン
トのヌクレオチド配列。

二重鎖DNA配列が示される。CUSI−Ｉ配列の読取り枠
はcDNA挿入体の５′（G:C）ホモポリマー尾の直後に始
まる。読取り枠は３文字記号で示される90個のアミノ酸
をエンコードする。さらに停止コドンTGAの後に178個の
塩基が示される。

第５図：プラスミドpRH34のCUSI−Ｉ−cDNAフラグメン
トのヌクレオチド配列。

二重鎖DNA配列が示される。DNA配列から誘導されたア
ミノ酸が３文字記号で示される。位置59〜133のヌクレ
オチドはCUSI−Ｉタンパク質のシグナルペプチドをエン
コードする。

第６図:pRH1807（プラスミドpRH34のCUSI−I cDNAフラ
グメントを含む）のPst I挿入の配列化方策。

各矢は配列実験を示す。

Ｈ＝Hind III、Ｐ＝Pst I、Ｂ＝BamH I。

第７図：調節可能プロモーターλP_Lの３′端にCUSI−Ｉ
遺伝子をもつ発現ベクターpRH24の構築図式。

amp^r:アンピシリン耐性遺伝子Ｎ−CUSI−I:CUSI−Ｉ−Ｎ末端をコードするDNAフラグ
メントＣ−CUSI−I:CUSI−Ｉ−Ｃ末端をコードするDNAフラグ
メント O_LP_L:バクテリオファージλの左オペレーターおよびプ
ロモーター領域 SD:シャイン−ダルガルノ配列またはリボソーム結合部
位制限エンドヌクレアーゼの略号：Ｂ＝BamH I、Ｅ＝EcoR I、Ｈ＝Hind III、Hae＝Hae II
I、Ｐ＝Pst I、Sph＝Sph I。

第８図：プラスミドpRH34の制限地図。

組換え体プラスミドpRH34が制限部位、Ｐ＝Pst I、Ｅ
＝coR I、Ｂ＝BamH I、Ｈ＝Hind III、Hae＝Hae IIIと
ともに示されている。黒バーはcDNA挿入の位置を示し、
円内の矢はテトラサイクリン耐性遺伝子（tet^r）および
破壊アンビシリン耐性遺伝子（amp^s）の位置を示す。

第９図：アミノ酸配列分析が生ずる興味ある観点。

配列の２つのシフトを無視すると分子中に存在する全
システィン残基が、タンパク質を２つに分け、それらを
相互の上に記したときに重ねることができる（アミノ酸
１〜54と55〜107）。さらに、隣接アミノ酸がシスティ
ン残基に関してしばしば保存されることが認められる。
この観察に対して２つの異なる説明が存在する：（ｉ）CUSIが２つのほぼ等しくたたまれたインヒビター
活性セグメント、すなわちトリプシンに対するものとロ
イコザイトエラスターゼまたはキモトリプシンに対する
もの、を含むことができる。

（ii）タンパク質はおそらく存在するドメインからの遺
伝子コードのレベル上で形成され、従って両ドメインが
互いに無関係に生じた。

第10図：β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として部
分CUSI−Ｉ配列の発現に対するクローニング方策。

黒バー部分CUSI−Ｉ配列を、非充填バーはβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子（lacZ）を表わし、円内の矢はテトラ
サイクリル耐性遺伝子（tet^r）またはアンビシリン耐性
遺伝子（amp^r）を示す。

Ｐ＝Pst I、Ｓ＝Sau3A、Ｅ＝EcoR I、Ｈ＝Hind III、Ｂ
＝BamH I、ｐ＝lacプロモータ、ｏ＝lacオペレーター。

第11図:C−末端CUSI−Ｉドメイン（＝CUSI−Ｉ第２ドメ
イン）の発現のための発現ベクターpBA17の構築図式。

Amp^r＝アンピシリン耐性遺伝子 Ptac＝tacプロモーター Tes^s＝不活性テトラサイクリン耐性残基遺伝子 rrnBT₁T₂＝リポソームRNA遺伝子の転写ターミネーター
シグナル用いた次の略号は次の意味を有する： A₅₇₈ 578nmにおける吸収 DTT ジチオトレイトール Bis N,N′,N′−メチレンビスアクリルアミド bp 塩基対Ｄドルトン DE（DEAE）ジエチルアミノエチル ds cDNA 二重鎖cDNA dNTP デオキシヌクレオシド−５′−三リン酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸 IgG 免疫グロブリン IPTG イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド³² P 相対質量32のリンの同位体 RPM 回転毎分³² S 相対質量35の硫黄同位体 SDS ドデシル硫黄ナトリウム ss cDNA 一重鎖cDNA TPEG ｐ−アミノフェニル−Ｉ−チオ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド Tris トリスヒドロキシメチルアミノメタンＵ酵素活性の単位サルコシンＮ−ラウリルサルコシン α−（³²P）−dCTP αリン酸残基中に同位体³²Pを有す
るデオキシシチジル−５′−三リン酸 LB培地 10g/酵素消化カゼイン〔シグマ（Sigm
a）〕、5g/酵母エキス（シグマ）、8g/NaCl、pH7.5 に調整。

実施例において、下記の方法および示した物質が使用
される。物質および方法はさらにマニアティス（T.Mani
atis）ほか28に記載されている。

（ｉ）酵素制限エンドヌクレアーゼ〔ベテスダ・リサーチ・ラボ
ラトリー（Bethesda Research Laboratory）（BRL）〕
およびT4−DNAリガーゼ〔ベーリンガー・マンハイム（B
oehringer Mannheim）〕並びに仔ウシ腸アルカリ性ホス
ファターゼ（ベーリンガー・マンハイム）、T4−ポリヌ
クレオチドキナーゼ（ベーリンガー・マンハイム）およ
びムングビーンヌクレアーゼ〔ファルマシア（Pharmaci
a）〕は商業的に入手でき、製造者の指図書に従って使
用される。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼ（BRL）はセクション（vii）記載のように使用され
る。大腸菌DNAポリメラーゼ（BRL）、リボヌクレアーゼ
Ｈ（BRL）並びにAMV逆転写酵素〔ライフ・サイエンス
（Life Science）は（13）に従って使用される。大腸菌
ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）（ベーリンガ
ー・マンハイム）は（14）記載のように使用される。

（ii）微生物グラム陰性およびグラム陽性株、例えば大腸菌または
バシラス・サチリス（Bacillus subtillis）の株はとも
にCUSI−Ｉの生物学的活性を有するタンパク質の発現の
ための微生物として使用できる。CUSI−Ｉの生物学的活
性を有するタンパク質に対する構造遺伝子を含む適当な
ベクターとともに真核生物例えばサッカロミセス・セレ
ビシェ（Saccharomyces cerivisiae）あるいは哺乳動物
細胞に対する通常の発現系も同様に使用できる。本発明
によれば大腸菌株K12MC1061λ15（DSMに寄託番号DSM363
1で寄託）が完全天然CUSI−Ｉタンパク質の直接発現に
使用される。遺伝子型は次のように規定することができ
る:ara D139、Δ（ara、leu）7697、Δlac X74、gal
U^-、gal K^-、hsr^-、hsm⁺、str A。本発明によれば大腸
菌株K12JM101〔アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（American Type Culture Collection）（ATC
C）に寄託番号ATCC33876で寄託〕がβ−ガラクトシダー
ゼとCUSI−Ｉタンパク質のＣ−末端ドメインとの間の融
合タンパク質の発現に使用される。その遺伝子型は次の
ように規定することができる：Δ（lac pro）、thi、St
r A、Sup E、end A、sbc B、hsd R^-、Ｆ′tra、D36、pr
o AB、lac Ig、ＺΔM15。合成cDNAの挿入後（実施例１
（ｃ）参照）に得られた組換え体プラスミドの分離には
大腸菌K12DH1（ATCCに寄託番号ATCC33849で寄託）が使
用される（17）。その遺伝子型は次のとお規定すること
ができる:F^-、res A1、end A1、gyr A96、thi−１、hsd
R17（r_k ^-、mK⁺）、sup E44、rel A1。プラスミドおよ
びλファージのプロモーターP_Lを含む新に構築された組
換え体プラスミドを分離するために、大腸菌K12野生型W
6菌を初めに形質転換する。これらの宿主細菌中でλP_L
プロモーターは絶えず温度耐性λリプレッサーによりブ
ロックされる。大腸菌K12野生型W6はDSMに寄託番号DSM3
632で寄託された。

（iii）ベクター大腸菌の形質転換には、次の公知プラスミドが使用さ
れる。それらの若干は市販されている。

pBR322〔ATCC31344、（23）、ファルマシア（Pharmaci
a、Freiburg）〕 pUC18〔DSMに寄託番号DSM3424で寄託、（24）、ファル
マシア（Pharmacia、Freiburg） pUR290〔DSM3417、（25）〕 pWH701〔DSM3633、（26）大腸菌K12JMB9のpRK248c I ts〔ATCC33766、（27）、
（49）〕 pSP6（DSM3904）、および PRH1810（DSM3905）。

当業者はまた当業者に知られた宿主生物との関連で本
発明に使用できる他の適当なベクターに明るい。

（iv）ゲル電気泳動 DNAの長さにより、アガロースまたはポリアクリルア
ミドゲルがDNAフラグメントの分離に、使用される。800
bp以上のDNAフラグメントはTAE緩衝液（40mM−Tris−酢
酸塩、pH8.3、2mM−EDTA）中の１〜1.2％アガロースゲ
ルで、800bp以下のDNAフラグメントはTBE緩衝液（60mM
−Tris−塩基、60mMホウ酸、1mMEDTA、pH8.3）中の５％
ポリアクリルアミドゲル〔アクリルアミド／ビスアクリ
ルアミド（19:1）〕で分離される。cDNAの分離のための
変性アガロースゲル電気泳動は例えばマクドネル（McDo
nnell）ほか（19）による1.2％アルカリ性アガロースゲ
ル中で行なわれる。

mRNAの電気泳動分離は1.4％アガロースゲルおよび15m
M水酸化メチル水銀で行なわれる。試料は電気泳動にか
け、ベイレイ（Bailey）ほか（20）の方法により変性す
ることができる。SDS−ポリアクリルアミドゲル中のタ
ンパク質の分離にはレムリ（Laemmli）（21）の方法が
使用される。

（ｖ）ゲル溶離法 1,000bp以下のDNAフラグメントの調製分離は５％ポリ
アクリルアミドゲル中で行なわれる。フラグメントの溶
離はマクサム・アンド・ギルバート（22）に従って行な
われる。そのように分離されたフラグメントをそれぞれ
サブクローニングおよび配列分析に用いた。

（vi）RNAの分離ヒト組織からの全RNAはマニアチス（Maniatis）ほか
（28）の方法により分離される。全RNAの抽出の次にCsC
l−勾配遠心分離し、DNAを分離する（29）。このため5.
7M−CsCl3ml、100mM−EDTAを16mlベックマン（Beckma
n）−SW27遠心分離管に入れ、RNA溶液（１％Ｎ−ラウリ
ルサルコシン中３〜4mg核酸、5mM−Tris−HCl、pH7.5、
1mMEDTA、4g/4ml CsCl）4mlで覆い、ベックマンSW−27
ローター中で15℃で17,000rpmで17時間遠心分離にかけ
る。RNA沈降物をTE緩衝液（10mM−Tris−HCl、pH8.0、1
mM−EDTA）中に再懸濁し、エタノールで沈殿させ、最後
にアビブほか（Aviv and Leder）（30）に従いオリゴ
（dT）セルロース（タイプ９、ファルマシア）によるポ
リ（A⁺）mRNAの強化のためにクロマトグラフィーにかけ
る。mRNAを溶離液からエタノールで沈殿させ70％エタノ
ール中に−70℃で保持する。mRNA分離物の生存力はウサ
ギ網状赤血球リゼイト中の試験管内翻訳により（セクシ
ョン（xvi）参照）、または変性ゲル電気泳動により調
べることができる。そのように分離されたmRNAは次いで
cDNA合成およびノザンブロット（Northern blot）分析
に使用される。

（vii）cDNA合成相補性一重鎖または二重鎖DNAはガブラー（Gubler）
ほか（13）に従って合成される。合成収率はα−
〔³²P〕−dCTPの挿入によりスクリーニングし、生じたc
DNA分子の長さは1.2％アルカリ性アガロースゲルおよび
放射性標識標準DNA分子により決定される。cDNAの３′
末端のオリゴ（dC）ホモポリマーによるテーリングは次
の条件下に全量40μで行なわれる:100mM−Ｋ−カコジ
レート、pH7.2、10mM−CoCl₂、1mM−DTT、500μM dCT
P、１〜2mg/ml cDNA、600U/ml末端デオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼ。反応混合物を20で50分間イン
キュベートし、反応をEDTAの添加（最終濃度20mM）によ
り停止させる。0.3M酢酸ナトリウム溶液からエタノール
で沈殿させた後、沈殿したcDNAをTE緩衝液（10mM−Tris
−HCl、pH8.0、1mM−EDTA）中に懸濁させ、Pst I−開裂
３′−オリゴ（dG）テールプラスミドpBR322でハイブリ
ッド形成する（100mM−NaCl、10mM−Tris−HCl、pH7.
8、0.1mM−EDTA、0.1〜0.3ng/μ cDNA、1.2ng/μプ
ラスミドDNA）。ハイブリッド形成にはこの混合物を次
いで65℃で５分間、56℃で45分間、43℃で45分間および
室温で15分間インキュベートする。次いでそれを形質転
換に直接使用する（セクション（ix）参照）。

（viii）ノザンブロット分析 RNAを変性ゲル電気泳動にかけ、トーマス（Thomas）
（31）に従いニトロセルロースフィルターに移す。前ハ
イブリッド形式および５′−標識オリゴヌクレオチドと
のハイブリット形成は（９）記載のように行なうことが
できる（セクション（xi）参照）。非特異的に結合した
オリゴヌクレチオドはハイブリッド形成後ニトロセルロ
ースフィルターの洗浄により、例えばフィルターを室温
で15分間、SSC緩衝液（900mM−NaCl、90mMクエン酸ナト
リウム、pH7.0）中の融点の２℃下で３分間洗浄するこ
とにより除去することができる。融点はサグス（Sugg
s）ほか（32）に従って算出される。

（ix）大腸菌の形質転換およびプラスミドの分離ドウノボ合成したcDNAを含む組換え体プラスミド（実
施例１（ｃ）参照）による形質転換のため大腸菌K12DH1
のコンピテント細胞をハナハン（Hanahan）（17）に従
って調製する。大腸菌K12種JM101、W6およびMc1061の細
胞をマンデルほか（Mandel and Higa）（33）に従い形
質転換する。プラスミドDNAは（34）記載の方法に従い
１培養から調製された。プラスミドの迅速分析はホル
メス（Holmes）ほか（35）に従って行なわれる。

（ｘ）オリゴヌクレオチド合成オリゴヌクレオチドはホスホアミダイト（phosphoami
dite）法（36）により合成される。オリゴヌクレオチド
は、例えばシャンドン・ハイパーシル（Shandon−Hyper
sil）ODS（登録商標）（粒径５μｍ、カラムサイズ4.6
×250mm）上の逆相クロマトグラフィーにより精製す
る。トリチル基を80％酢酸で除去した後、生成物を再び
上記カラム物質上でクロマトグラフィーにかけ、５′端
に標識した後20％ポリアクリルアミド中で分析する（セ
クション（xi）参照）。この方法により２つのオリゴヌ
クレオチド混合物、すなわちRH1およびRH2が合成され
る。これらのオリゴヌクレオチド混合物はともにプロー
ブとして使用される。２混合物中のオルゴヌクレオチド
分子の配列はHUSI−Ｉタンパク質のトリプシンフラグメ
ントの適当なアミノ酸配列から誘導される（第１図参
照）。これらのフラグメントのアミノ酸配列はマチレイ
ト（W.Machleidt）（50）に従って決定された。単に若
干のトリプシンフラグメントおよび若干のブロモシアノ
フラグメントの分析により公知HUSI−Ｉ配列を補正する
ことにより、本発明のオリゴヌクレオチド混合物に到達
することが可能になった。オリゴヌクレオチド混合物は
いわゆる「混合プローブ」、すなわち遺伝子コードの退
化に基く規定された位置中で異なるオリゴヌクレオチド
の混合物である（９）。通常の「混合プローブ」の不利
益はHPLCによるオリゴヌクレオチドの高精製により、並
びにその定量的³²Pリン酸化により補うことができた。
オリゴヌクレオチド混合物RH1はCUSI−Ｉタンパク質の
トリプシンフラグメントT2のアミノ酸配列に相当する
（第１図参照）。従って、オリゴヌクレオチド混合物は
各17塩基の長さを有する16種の異なるオリゴヌクレオチ
ドを含む。配列は次のとおりである。

オリゴヌクレオチド混合物RH2はHUSI−Ｉタンパク質
のトリプシンフラグメントT3のアミノ酸配列に相当する
（第１図参照）。従って、各17塩基の長さを有する32種
の異なるオリゴヌクレオチドが合成される。それらは次
の配列を有する：（xi）DNAの放射性標識化化学合成オリゴヌクレオチドおよび二重鎖脱リン酸化
DNAフラグメントのリン酸化は酵素T4−ポリヌクレオチ
ド−キナーゼで20〜50μ反応体積〔50mM−Tris−HC
l、pH9.5、20mM−MgCl₂、1mM−EDTA、10〜20pmol 5′−
OH端基質、８μ γ−〔³²P〕ATP（〜8,000Ci/mmo
l）、0.2U/μ T4−ポリヌクレオチド−キナーゼ〕中
で行なわれ、次に非転化γ−〔³²P〕−ATPが調製用ゲル
電気泳動、次にゲル溶離およびDE52（ジアミノジエチル
セルロース）〔ワットマン（Whatman）〕上のイオン交
換クロマトグラフィーにより分離される。DNA制限フラ
グメントの５′−突出端をフォルケルト（Volkert）ほ
か（14）に従って相補性α−〔³²P〕−デオキシリポヌ
クレオシド三リン酸の存在下に大腸菌DNAポリメラーゼ
Ｉのクレノウフラグメントで満たすことができる。組込
まれないα−〔³²P〕−dNTP_sはセファデックス（Sephad
ex）Ｇ−50上のゲルパーミエーションクロマトグラフィ
ーにより分離され、溶離画分を減圧下に濃縮する。

（xii）DNA配列分析 DNA分子の配列はマクサム・アンド・ギルバート（Max
am and Gilbert）（22）に従って決定される。

（xiii）β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の精製 CUSI−Ｉ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質はウ
ルマン（Ullmann）（37）に従ってアフィニティークロ
マトグラフィーにより精製される。

（xiv）タンパク質のニトロセルロースフィルターへの
移動 SDS−ポリアクリルアミドゲル中で分離されたタンパ
ク質はトウビン（Towbin）ほか（12）に従いニトロセル
ロースフィルターに移される。

（xv）CUSI−Ｉ阻害試験 CUSI−Ｉの生物学的活性を有するタンパク質の活性は
トリプシン（38）およびキモトリプシン（39）の阻害の
測定により示される。

（xvi）mRNAの無細胞翻訳網状赤血球リゼイト中のmRAの無細胞翻訳はペルハム
（Pelham）ほか（40）に従って、放射性標識アミノ酸と
して1200Ci/mmolの比活性を有する³⁵S−メチオニンを用
いて行なわれる。

実施例は発明の例示である。

実施例１部分CUSI−Ｉタンパク質−特異性cDNAクローンのクロー
ニングおよび同定（ａ）mRNAの分離および確認全RNAまたはmRNAをヒト頸部組織（生検物質）からセ
クション（vi）記載のように分離する。約1.6〜2.2mgの
全RNAが14〜17gの頸部組織から得られる。オリゴ（dT）
−セルロース（タイプ９、ファルマシア）でアフィニテ
ィ−クロマトグラフィーによりポリ（A⁺）−mRNAを強化
後、20〜25μg mRNA/mg全RNAが得られる。これは約2.0
〜2.5％mRNAの収率に相当する。変性アガロースゲル中
のゲル電気泳動分析によりRNAが分離中に分解しないこ
とが示される。相当する結果はまたウサギ網状赤血球リ
ゼイト中の全およびポリ（A⁺）−mRNAの試験管内翻訳か
ら得られる。

（ｂ）CUSI−Ｉタンパク質−特異配列の検出のための合
成オリゴヌクレオチドによる分離したmRNAのノザンブロ
ット分析ノザンブロット分析は頸部mRNA分離物中の特異mRNA配
列の確認のために行なわれる。アミノ酸Phe−Cys−Glu
−Met−Asp−GlyをコードするmRNAと相補性であるオリ
ゴヌクレオチド混合物RH1（第１図参照）はハイブリッ
ド形成プローブとして作用する。ハイブリッド形成中に
得られたニトロセルロースフィルターにＸ線フィルム
〔「コダック（Kodak）Ｘ−ｏ−mat−AR」〕にさらすこ
とにより特異性シグナルが検出される。オリゴヌクレオ
チド混合物RH2で陽性シグナルが認められなかったけれ
ども、混合物のオリゴヌクレオチド配列の１つは後に
（配列化後）右配列であると示された。

ハイブリッド形成mRNA種の分子の大きさをDNA標準分
子と変性ゲル中で比較するとハイブリッド形成mRNAの長
さが約650〜800塩基であることが認められる。

（ｃ）プラスミドpBR322によるcDNAライブラリーの調製４〜６μｇのポリ（A⁺）−mRNAをcDNA合成の出発物質
として用いる。一重鎖cDNAは約280ng（約７％）であ
る。合成一重鎖cDNA分子は約400〜2,500ヌクレオチドの
大きさを有する。280ngのSS cDNAから、約270ngの二重
鎖cDNAが第２鎖を合成するときに得られる。従って、二
重鎖合成の収率は約50％である。cDNA分子の３′端がホ
モポリマー（dC）領域でテーリングされる。得られたcD
NA分子はハイブリッド形成反応中に、Pst I開裂され
３′端にホモポリマー（dG）領域でテーリングされたプ
ラスミドpBR322の分子に付加する。付加生成物は大腸菌
K12DH1の形質転換に使用される。次いで形質転換細胞を
テトラサイクリン耐性およびアンビシリン感受性につい
て選択する。用いた毎ng cDNA当り120形質転換細胞（1
2,000形質転換細胞/100ng ds cDNA）が得られる。テト
ラサイクリン耐性およびアンピシリン感受性形質転換細
胞またはコロニーの割合は約80％である。これらの形質
転換細胞は貯蔵培養（培地:LB培地）、10g/酵素消化
カゼイン（シグマ）、8g/ NaCl、pH7.5、5g/酵母エ
キス（シグマ）、20μg/mlテトラサイクリン、20％グリ
セリン）としてミクロタイタープレート（98ウエル／プ
レート）中で培養し、−20℃で保つ。

（ｄ）CUSI−Ｉタンパク質特異性cDNAによる組換え体プ
ラスミドの同定上記のように得られた6,000形質転換細胞の分析のた
め、コロニーハイブリッド形成がオリゴヌクレオチド混
合物RH1で行なわれる。オリゴヌクレオチド混合物の活
性は0.8μCi/pmolの比活性でハイブリッド形成体積中約
１×10⁶cpmである。Ｘ線フィルムをハイブリッド形成中
に得られたフィルターの各−70℃で、２補強スクリーン
の存在下に12時間さらす。陽性シグナルが検出される。
相当する形質転換細胞の貯蔵培養から出発し、pRH31と
称される組換え体プラスミドが0.5培養〔LB培地、10g
/酵素消化カゼイン（シグマ）、10g/ NaCl、5g/
酵母エキス（シグマ）、pH7.5、20μg/mlテトラサイク
リン〕から調製される。制限エンドヌクレアーゼPst
I、EcoR I,BamH I並びにHind IIIの使用による組換え体
プラスミドpRH31の制限地図が得られる（第２図参
照）。cDNA挿入体は500bpの長さを有する（第２図参
照）。プラスミドpHR31はDSMに寄託番号3634で寄託され
た。

（ｅ）rRH31のcDNA挿入体の配列分析マクサム・アンド・ギルバード（22）に従う配列化の
ためにプラスミドpRH31からのPst Iフラグメント（500b
p）をプラスミドpUC18中へ再クローンする。このためpR
H31のDNA10μｇを制限エンドヌクレアーゼPst I 30Uで
開裂し、アガロースゲル上で調製的に分離し、得られた
500bpフラグメントをゲルから溶離する。さらにプラス
ミドpUC18のDNA10μｇを制限エンドヌクレアーゼPst I
で開裂し、脱リン酸し、フェノールおよびエチルエーテ
ルで抽出し、最後に0.3mol酢酸ナトリウム溶液からエタ
ノールで沈殿させる。次のT4−DNAリガーゼ反応には0.2
pmolのプラスミドDNAおよび0.4pmolのPst Iフラグメン
トを用いる。得られた組換え体DNA分子を大腸菌K12JM10
1の形質転換に用いる。アンピシリンを含むLB平板（10g
/カゼイン、8g/ NaCl、5g酵母エキス、100μg/mlア
ンピシリン）上で選択を行なう。アンピシリン耐性形質
転換細胞中に含まれる組換え体プラスミドはプラスミド
迅速分析により確認される。pRH31のPst Iフラグメント
を反対配向で含む組換え体プラスミドpRH181およびpRH1
82が得られる。第３図に示される配列化方策はこれらの
プラスミドの構築から生じ、それは単に容易なDNA配列
化のための補助構築として作用する。配列化（22）によ
り決定されたプラスミドpRH31の500bp Pst Iフラグメン
トのヌクレオチド配列が第４図に示される。配列は20
（dG）−残基で５′−端で出発する。その後に273bpに
わたって延びる読取り枠が続く（第４図、位置25〜297
参照）。この読取り枠は90個のアミノ酸をコードし、停
止コドンTGAで終る（第４図参照）。ヌクレオチド配列
から、オリゴヌクレオチド混合物RH1のオリゴヌクレオ
チドがヌクレオチド配列の位置208〜224と相補性である
こと、およびオリゴヌクレオチド混合物RH2のオリゴヌ
クレオチドがヌクレオチド配列の位置247〜263と相補性
であることを知見できる。停止コドンTGAにさらに178bp
が続く。ヌクレオチド配列の分析はCUSI−Ｉタンパク質
のＮ末端セグメントをコードする領域がヌクレオチド配
列中に含まれないこと示す。

実施例２全CUSI−Ｉタンパク質をコードするcDNAフラグメントに
よる組換え体プラスミドの分離（ａ）オリゴヌクレオチドRH5の合成 CUSI−Ｉタンパク質をコードする全領域を含むcDNAフ
ラグメントを分離するためにオリゴヌクレオチドRH5を
ホスファミダイト法（36）に従って合成する。オリゴヌ
クレオチドRH5は20塩基の長さを有する。それは第４図
に示されるコーディングDNA鎖の位置31〜50と相補性で
あり、次の配列を有する：オリゴヌクレオチドRH5を放射性標識し、cDNAフラグ
メントがその５′端に少くともプラスミドpRH31の５′
−末端領域を含む組換え体プラスミドを含む形質転換細
胞を新cDNAライブラリー中で同定するためにプロブとし
て使用される。

（ｂ）CUSI−Ｉタンパク質の全コーティング領域による
組換え体プラスミドを含む新cDNA遺伝子ライブラリーの
調製プラスミドpBR322を用いる大腸菌中の新cDNAライブラ
リーを調製するためCUSI−Ｉタンパク質をコードするmR
NAを分離する。このためヒト頸部組織からの全RNA250μ
ｇを、その大きさにより15mM水酸化メチル水銀を含む変
性1.4％「低融点（LMP）」アガロース中で電気泳動的に
分離する（セクション（iv）参照）。約700〜850塩基の
長さを有するmRNA約10μｇがこのゲルから抽出により分
離される。このmRNA4μｇをcDNA合成に用い（セクショ
ン（vii）参照）、大腸菌K12DH1中へ導入する（セクシ
ョン（ix）参照）。53ng二重鎖cDNAを有する4,300形質
転換細胞が得られる。形質転換細胞は５′標識オリゴヌ
クレオチドRH5とのコロニーハイブリッド形成により分
析される（実施例２（ａ）参照）。ハイブリット形成溶
液中のオリゴヌクレオチドの活性は0.72μCi/pmolの比
活性で２×10⁵cpm/mlである。12形質転換細胞が分離さ
れ、その組換え体プラスミドはオリゴヌクレオチドRH5
とハイブリッド形成する。形質転換細胞の貯蔵培養のア
リコートで組換え体プラスミドを調製し、Pst I、BamH
IおよびHind IIIによる制限開裂により地図が作られ
る。これらのプラスミドの11個がプラスミドpRH31とほ
ぼ同様の制限パターンを有し、すなわちそれは各380bp
の１つのBamH I/Pst Iフラグメントおよび約125bpの１
フラグメント、並びに約290bpの１つのHind III/Pst I
フラグメントおよび約200bpの１フラグメントを含む。P
st Iフラグメントの長さはそれぞれの場合に約500bpで
ある。１つのプラスミドのみが異なる制限地図を示し、
すなわちそれは285bpの１つのBamH I/Pst Iフラグメン
トおよび約275bpの１フラグメント、並びに約450bpの１
つのHind III/Pst Iフラグメントおよび105bpの１フラ
グメントを含む。偏位組換え体プラスミドの挿入体の長
さは約550bpである。この組換え体プラスミドはpRH34と
称される。その制限地図は第８図に示される。プラスミ
ドpRH34はDSMに寄託番号DSM3635で寄託された。

（ｃ）組換え体プラスミドpRH34の挿入体のヌクレオチ
ド配列 pRH34からのPst I−cDNAフラグメントおよびpRH34か
らの両BamH I/Pst IフラグメントはDNAをPst IまたはPs
t IとBamH Iで開裂し、アルカリ性ホスファターゼで処
理した後プラスミドpUC18のDNA中でサブクローンする。
そのように構築したDNA配列分析のための補助構築物で
ある組換え体プラスミドはpRH1807（Pst Iフラグメン
ト）、pRH1808（Ｎ−末端BamH I/Pst Iフラグメント）
およびpRH1809（Ｃ−末端BamH I/Pst Iフラグメント）
と称される。サブクローンしたDNAフラグメントの配列
はマクサム・アンド・ギルバート（22）に従って分析す
る。組換え体プラスミドの配列化方策は第６図から知る
ことができる。pRH34からのcDNAフラグメントのヌクレ
オチド配列は第５図に示される。それは位置25〜308のp
RH31のcDNA挿入体の配列に等しい（第４図参照）。しか
し、pRH34のcDNA挿入体は５′−端で184bp長い。これら
の143bpはmRNAと相補性の配列に相当し、41bpはPst I制
限部位を含むdCTPによるcDNAのホモポリマーテーリング
に由来する。

アミノ酸はHUSI−ＩインヒビターのＮ−末端と同定された。アミ
ノ酸コドンは分離されたDNA配列の５′−末端ヌクレオ
チドから推論すると読取り枠のこの部分中に停止コドン
が認められない。従って、読取り枠中に出現するATGは
開始に関与し、CUSI−Ｉタンパク質の出発をコードす
る。さらに、分泌タンパク質のシグナルペプチド構造は
稀に25個のアミノ酸より長い。シグナルペプチド間の制
限部位および相当する天然タンパク質は最もしばしばア
ミノ酸アラニン、セリンおよびグリシンの後に認めら
れ、従って、配列が全く普通である。

頸部分泌物からのヒトCUSI−Ｉタンパク質の一次構造
は従って104個のアミノ酸からなる。決定されたヌクレ
オチド配列によりエンコードされるアミノ酸配列は、本
発明以前に単に不完全に知られた気管支抗ロイコプロテ
アーゼのＮ−末端アミノ酸配列（41）に実質的に等し
い。

参考例１大腸菌中のCUSI−Ｉタンパク質の発現（ａ）調節可能λP_Lプロモーターの下流に全CUSI−I cD
NAを含む発現プラスミドの構築開始するために、RH6およびRH7と称される２つの合成
オリゴヌクレオチドを合成する。それらは互いに相補性
であり、最適リボソーム結合部位（42）に対する配列、
Sal IおよびEcoR I制限部位並びに位置１〜位置14のCUS
I−Ｉのコーディング領域のヌクレオチド配列をもつ。
両オリゴヌクレオチドを酵素T4−−ポリヌクレオチド−
キナーゼで５′−末端をリン酸化し、12％ポリアクリル
アミドゲル中で調製的に電気泳動的に分離し、ゲルから
溶離し、DE52でクロマトグラフィーにかける。次のセフ
ァデックス（Sephadex）Ｇ−50上のゲルパーミエーショ
ンクロマトグラフィー後、各オリゴヌクレオチド10pmol
を混合し、90℃で変性し、室温で徐冷することにより相
互にハイブリッド形成させる。この方法で次の二重鎖DN
Aフラグメントが得られる：第２分離成分はプラスミドpRH34の210bp（Hae III/Ba
mH I）フラグメントであり、それはさらにＮ−末端領域
をコードする。このため、プラスミドpRH34、10μｇを
制限エンドヌクレアーゼHae IIIおよびBamH Iで開裂
し、５％ポリアミドゲル中で電気泳動的に分離する。21
0bpフラグメントを次いでポリアクリルアミドゲルから
溶離する。プラスミドpRH1807（第６図）は第３成分と
して、従ってベクターとして作用する（第７図）。この
ため、このプラスミド10μｇを制限酵素EcoR IおよびBa
mH Iで開裂する。ベクターフラグメントをアルカリ性ホ
スファターゼで処理し、次いでフェノールで抽出し、エ
タノールで沈殿させる。３成分を連結するため（第７
図）、合成オリゴヌクレオチド1pmolを互いにハイブリ
ッド形成させ、Ｎ−末端Hae III−BamH Iフラグメント
0.2pmolおよびベクターDNA0.03pmolと混合し30μの反
応体積で5UT4−DNAリレガーゼで互いに連結させる。大
腸菌K12株JM101を形質転換に使用する。得られた形質転
換細胞のプラスミドを放射性標識オリゴヌクレオチドRH
6でハイブリッド形成することによりスクリーニングす
る。さらにSal I、EcoR IおよびBamH Iに対する制限部
位を調べ、相当するフラグメントの長さを決定する。正
しい新しい構築されたプラスミドはpRH1810（DSM3905）
と称される（第７図）。

発現プラスミドを構築するため、ベクターpWH701（2
6）10μｇをEcoR IおよびSph Iで開裂し、脱リン酸し、
フェノールで抽出し、エタノールで沈殿させる。プラス
ミドpRH1810からEcoR I−Sph Iフラグメントを調製する
ため、DNA10μＲをEcoR IおよびSph Iで開裂する。生じ
た525bpフラグメントをゲル電気泳動により５％ポリア
クリルアムドゲルでベクターから分離し、ゲルから溶離
する。次いで0.3pmolのベクターpWH701および1pmolのEc
oR I−Sph Iフラグメントを互いに連結し、大腸菌K12野
性型W6へ案内する。生じた形質転換細胞のプラスミドを
プラスミド迅速分析および次のアガロースゲル電気泳動
により確認する。組換え体発現プラスミドは挿入のない
発現プラスミドより280bp長い。新同定組換え体発現プ
ラスミドはpRH24と称され、次の発現実験に使用され
る。第７図に組換え体発現プラスミドpRH24の構築図式
が示される。

（ｂ）発言プラスミドpRH24によるCUSI−I cDNAの大腸
菌K12MC1061/pRK248cIts中の発現（15、27）宿主菌株単独はλ−溶原でなく、すなわち、それはλ
cIリプレッサーを含まない。温度感受性リプレッサーλ
cI857に対する遺伝子情報はプラスミドpRK248cIts上に
局在化され、それはまた宿主細菌にテトラサイクリン耐
性を与える（27）。30で、λP_Lプロモーター支配転写が
完全に抑圧される。42℃で温度感受性cI857リプレッサ
ーがその不活性化形態中に存在し、P_Lプロモーターの下
流にある遺伝子が転写される。この大腸菌K12MC1061/pR
K248cItsを組換え体発現プラスミドpRH24で形質転換す
る。λP_Lプロモーターの下流にあるCUSI−Ｉ遺伝子の発
現を誘発するため、LB培地（20μg/mlテトラサイクリ
ン、50μg/mlアンピシリン）200mlに大腸菌K12MC1061/p
RK248cIts/pRH24の一夜培養3mlを接種し、28℃で0.7A
₅₇₈単位/mlの細胞密度まで培養する。次いで培養をさら
に42℃で振とうする。タンパク質分析を行なうため、発
現の誘発前および誘発開始後種々の間隔で細胞試料をと
り、細胞（約１×10⁹細胞）を1A₅₇₈単位当りに満たし、
３分間12,000gで遠心分離し、細胞沈降物を、さらにプ
ロセッシングするまで−20℃に凍結する。

参考例２大腸菌K12MC1061/pRK248cIts/pRH24中のCUSI−Ｉタンパ
ク質発現後の粗タンパク質抽出物の確認（ａ）ラビット抗HUSI−Ｉ抗血清との免疫交差反応試験細胞沈降物を60μ破壊緩衝液（50mM−Tris−HCl、p
H8.0、1mM−EDTA、２％トリトン−Ｘ−100）中に再懸濁
し、40μ還元緩衝液（４％SDS、40％β−メルカプト
エタノール、20％グリセリン、0.1％ブロモフェノール
ブルー）を加える。次に試料を100℃で５分間、次いで
超音波浴中室温で５分間、再び100℃で５分間インキュ
ベートする。細胞破壊体積20μを13.5％SDS−ポリア
クリルアミド中で電気泳動的に分離し、免疫検定のため
にニトロセルロース上に移す。ニトロセルロースフィル
ターを、フィルター上の非特異的結合部位を飽和するた
めに「ブロッキング」緩衝液（50mM−Tris−HCl、pH7.
4、200mM−NaCl、0.05％ツイーン20、1.5％ゼラチン）
で37℃で１時間インキュベートする。ウサギ抗HUSI−Ｉ
抗血清（「ブロッキング」緩衝液中1:600希釈）を第１
抗体反応に用い（インキュベーション：室温で２時
間）、ヒツジ抗ウサギIgG−ペルオキシダーゼ結合体を
第２抗体として用いる。ホースラディッシュ（horserad
ish）ペルオキシダーゼの基質反応をジアミノベンジジ
ンで行なう。

（ｂ）大腸菌中に発現されたプロティナーゼインヒビタ
ーの阻害活性試験誘発（誘発開始６時間後）、および非誘発細胞試料を
破壊し、試験した。細胞沈降物（1A₅₇₈単位細胞）を500
μのリゾチーム破壊緩衝液（50mM−Tris−HCl、pH8.
0、1mM−EDTA、1mg/mlリゾチーム）中に懸濁し、室温で
10分間インキュベートし、150μの50mM−Tris−HCl、
pH8.0、1mM−EDTAで希釈し、超音波浴中で室温で５分間
インキュベートする。非誘発および誘発細胞の粗抽出物
のそれぞれ20μおよび80μをキモトリプシン試験
（39）で阻害活性について試験する。試験結果は表Ｉに
示される。

大腸菌からのキモトリプシン非誘発粗抽出物の活性と
比較すると、誘発細胞の細胞抽出物による阻害がそれぞ
れ８％および37％高い。

参考例３大腸菌K12JM101中のβ−ガラクターゼ融合タンパク質と
してＣ−末端CUSI−Ｉドメインの発現第９図から知見できるように、CUSIインヒビターの構
造は遺伝子内重複により形成される２つのドメインから
なるタンパク質分子と記載することができる。大腸菌中
のＣ−端末ドメインの発現のために、Ｃ−末端の59個の
アミノ酸をコードするDNA配列がプラスミドpUR290（2
5）のβ−ガラクトシダーゼのＣ−末端をエンコードす
るDNA配列で正しい読取り枠中に連結される。クローニ
ング図式は第10図に示される。

プラスミドpRH31、10μｇを制限エンドヌクレアーゼS
au3Aで開裂し、５％ポリアクリルアミドゲル中で調製的
に分離し、320bp CSUI−Ｉ部分フラグメントをゲルから
溶離する。pUR290（10μｇ）を酵素BamH Iで開裂し、ア
ルカリ性ホスファターゼで処理し、320bpフラグメント
で連結する。第３の連結DNAをCaCl₂処理大腸菌K12JM101
細胞に導入する。クローンはLB−amp寒天平板〔10g/
酵素消化カゼイン（シグマ）、8g/ NaCl、5g/酵母
エキス（シグマ）、pH7.5、100μg/mlアンピシリン〕上
で選択する。CUSI−Ｉ部分フラグメントの２配向が組換
え体プラスミド中に可能であるので、プラスミド迅速分
析を次のHind III制限で行なう。プラスミドが165bp Hi
nd IIIフラグメントを含むクローンをさらに分析する。
これらのプラスミドの１つがpRH21として示される。融
合タンパク質発現の導入のため、100μg/mlアンピシリ
ンを含む100mg LB培地に、プラスミドpRH21で形質転換
した一夜培養からの大腸菌K12JM101菌を接種する。培養
を37℃でインキューベートし、細胞成長を578nmでモニ
ターする。0.5の光学密度（578nm）で培養を500μmol I
PTGに調整し、さらに37℃でインキュベートする。融合
タンパク質の導入は時間に依存し、SDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分析する。導入後、最初に排他的に
CUSI−Ｉ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質が、後
にまたβ−ガラクトシダーゼが形成される。抗−CUSI−
Ｉ抗体との免疫反応を示すために、SDSゲル上で電気泳
動的に分離した大腸菌粗抽出物のタンパク質をニトロセ
ルロースに移動させる。融合タンパク質の特異的検出の
ためウエスターンブロット分析を実施例４（ａ）記載の
ように行なう。融合タンパク質は次のように分離し、精
製する：（37）に従い、IPTGアナログTPEGをCH−セファロース
に結合させる。CUSI−Ｉ−β−ガラクトシダーゼ融合タ
ンパク質を精製するために、プラスミドpRH21を含む種
大腸菌K12JM101を50μg/mlアンピシリンを有する１LB
培地中で培養し、培地を0.5m mol IPTGに調整すること
により0.5A₅₇₈単位/mlの細胞密度で誘発させる。１時間
後誘発相を、培養を４℃に急冷することにより停止させ
る。細胞を沈降させ（5.5g重量、湿性）、溶解緩衝液
（20mM−Tris−HCl、pH7.4、20mM−MgCl₂、20mMβ−メ
ルカプトエタノール）中に懸濁させ、超音波処理により
破壊する。粗抽出物を約20mg/mlタンパク質濃度および
1.6mol NaClに調整し、TPEG−セファロース−クロマト
グラフィにかける。カラム物質を20mM−Tris−HCl、pH
7.4、10mMβ−メルカプトエタノール、10mM−MgCl₂、1.
6M NaClで洗浄した後、CUSI−Ｉ−β−ガラクトシダー
ゼ融合タンパク質を100mMホウ酸ナトリウム、10mMβ−
メルカプトエタノール、pH10で溶離する。クロマトグラ
フィーはβ−ガラクトシダーゼ活性の測定（43）により
モニターする。１培養が8mgの純CUSI−Ｉ−β−ガラ
クトシダーゼ（90％）を生じた。さらに精製融合タンパ
ク質がまた抗HUSI−Ｉ抗体と反応することが示された。

Ｃ−末端CUSI−Ｉドメインを開裂するため、そのよう
に精製された融合タンパク質を10％または30％酢酸ある
いは70％ギ酸に溶解する。酸感受性アスパラギン酸−プ
ロリン結合の存在（CUSI−Ｉのアミノ酸配列参照）が室
温で24〜36時間の反応後にＣ−末端CUSI−Ｉドメインの
40〜60％の除去を生ずる。この酸処理後、この完全なCU
SI−ＩドメインをＧ−75でゲル濾過により分離し、精製
することができる。

発現Ｃ−末端CUSI−Ｉドメインのアミノ酸配列は次の
とおり読み取る： Pro−Val−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−Arg−
Lys−Pro−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−Gly−
Gln−Cys−Leu−Met−Leu−Asn−Pro−Pro−Asn−Phe−
Cys−Glu−Met−Asp−Gly−Gln−Cys−Lys−Arg−Asp−
Leu−Lys−Cys−Cys−Met−Gly−Met−Cys−Gly−Lys−
Ser−Cys−Val−Ser−Pro−Val−Lys−Ala−OH。

この配列は全CUSI−Ｉタンパク質の位置50〜107と等
しい。

参考例４大腸菌K12JM101中のＣ−末端CUSI−Ｉドメインの発現参考例３から知見できるように、Ｃ末端CUSI−Ｉドメ
インを大腸菌K12JM101中にβ−ガラクトシダーゼ融合タ
ンパク質として発現できる。第11図に示されるように、
Ｃ−末端59アミノ酸をエンコードするcDNAを、Ｃ−末端
CUSI−Ｉドメインを生タンパク質として発現させるため
に読取り枠中にプラスミドpSP6のアルカリ性ホスファタ
ーゼ遺伝子のシグナル配列に連結させる。プラスミドpS
P6はDSMに寄託番号DSM3904で寄託された。

プラスミドpRH1860、30μｇをBamH IおよびHinf Iで
開裂する。DNAフラグメントを８％ポリアクリルアミド
ゲル中で分離する。Ｃ−末端ドメインをコードする175b
p CUSI−Ｉ−DNAフラグメントをゲルから溶離する。突
出DNA端をDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントによ
り満たす。ブラントエンドを有する182bp二重鎖DNA分子
が得られる。

ベクターpSP6、３μｇを制限エンドヌクレアーゼHind
IIIで開裂する。突出一重鎖DNA端をムングビーンヌク
レアーゼで分解し、５′−末端リン酸残基をアルカリ性
ホスファターゼで除去する。

そのように処理したベクター0.3pmolをＣ−末端CUSI
−Ｉ−DNAフラグメント1pmolで連結する。株大腸菌K12D
H1の形質転換コンピテント（17）細胞を、得られた連結
生成物の1/2で形質転換する。クローンをLB−Amp寒天平
板上で選択する。４クローンをオリゴヌクレチオドAH12
とのコロニーハイブリッド形成により同定する。クロー
ンのプラスミドDNAは用いたプローブと相補性のDNA配列
を含む。オリゴヌクレチオドAH12はCUSI−Ｉ−cDNAクロ
ーンのヌクレチオド配列241〜258と相補性である。それ
は配列：５′CCTGTTGACACCCCAAAC3′ を有する。

プラスミド迅速分析並びにDNAのHind IIIおよびBamH
Iによる開裂により、クローンは挿入体として540bp DNA
フラグメントを含むと同定される。このDNAフラグメン
トはプロモーター領域Ptac、アルカリ性ホスファターゼ
の、Ｃ−末端CUSI−Ｉドメインに対するcDNA配列のシグ
ナルペプチド配列からなる。そのように構築されたプラ
スミドはpBA17と称される。次いでコンピテント大腸菌K
12JM101細胞を構築発現プラスミドpBA17のDNAで形質転
換する。Ｃ−末端CUSI−Ｉドメインを発現するため、LB
−Amp培地250mlに、得られた形質転換細胞を接種する。
次いでインキュベーションを37℃で行なう。細胞成長を
578nmにおける濁りの測定によりモニターする。0.97の
光学密度で、発現を誘発するためにIPTGを0.5mMの最終
濃度に加える。1A₅₇₈単位細胞のアリコートを発現の誘
発前後に種々の時間でとり（第II表参照）、12,000gで
３分間遠心分離し、細胞沈降物を−20℃で貯蔵する。発
現生成物は次の配列で59個のアミノ酸を有する： Asp−Pro−Val−Asp−Thr−Pro−Asn−Pro−Thr−Arg−
Arg−Lys−Pro−Gly−Lys−Cys−Pro−Val−Thr−Tyr−
Gly−Gln−Cys−Leu−Met−Leu−Asn−Pro−Pro−Asn−
Phe−Cys−Glu−Met−Asp−Gly−Gln−cys−Lys−Arg−
Asp−Leu−Lys−Cys−Cys−Met−Gly−Met−Cys−Gly−
Lys−Ser−Cys−Val−Ser−Pro−Val−Lys−Ala−OH。

大腸菌中に発現されたＣ−末端CUSI−Ｉドメインの阻害
活性試験キモトリプシン阻害試験（39）を実施例４記載のよう
に行なう。キモトリプシンに対する大腸菌阻抽出物の阻
害活性の増加を時間に依存してモニターする。それぞれ
の場合に大腸菌リゼイト（100μ）の半分を阻害活性
について試験する。結果は表IIに示される。

表IIIにブダペスト条件に従って寄託した微生物が示
される。

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【図面の簡単な説明】

第１図はHUSI−Ｉのトリプシンフラグメントのアミノ酸
配列を示す図であり、第２図はプラスミドpRH31の制限地図であり、第３図はプラスミドpRH31のcDNA挿入の配列化方策を示
す図式であり、第４図はプラスミドpRH31のCUSI−ＩのcDNAフラグメン
トのヌクレオチド配列を示す図であり、第５図はプラスミドpRH34のCUSI−Ｉ−cDNAフラグメン
トのヌクレオチド配列を示す図であり、第６図はpRH1807のPst I挿入の配列化方策を示す図であ
り、第７図は発現ベクターpRH24の構築図式であり、第８図はプラスミドpRH34の制限地図であり、第９図はCUSI−Ｉインヒビターの遺伝子内重複に対する
相同アプローチを示す図であり、第10図はβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として部
分CUSI−Ｉ配列の発現に対するクローニング方策を示す
図であり、第11図はＣ−末端CUSI−Ｉドメイン（＝CUSI−Ｉ第２ド
メイン）の発現のための発現プラスミドpBA17の構築図
式である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125）Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125）Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者ヴェルネルマッハライトドイツ連邦共和国8000 ミュンヘン83 コーボルトストラーセ63 (72)発明者ウルズラーゼーミュレルドイツ連邦共和国7290 フロイデンシュタットシュトゥムペンガルテンヴェーク14 (56)参考文献Ｈｏｐｐｅｒ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓＺｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔｆｕｅｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅＣｈｅｍｉｅ，Ｖｏｌ．357 Ｎｏ．10〔1976〕Ｐ. 1333−1337 ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｖｏｌ．75〔1980〕Ｐ．351−379

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】CUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有
し、かつ下記アミノ酸配列１を有するタンパク質をコー
ドすることを特徴とするDNA配列。アミノ酸配列1:
【請求項２】CUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有
し、かつ下記アミノ酸配列２を有するタンパク質をコー
ドすることを特徴とするDNA配列。アミノ酸配列2:
【請求項３】CUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有す
るタンパク質をコードし、かつ下記DNA配列３を有する
ことを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載のDNA
配列。 DNA配列3:
【請求項４】CUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有す
るタンパク質をコードし、かつ下記DNA配列４を有する
ことを特徴とする特許請求の範囲第（２）項記載のDNA
配列。 DNA配列4:
【請求項５】DNA配列３が組換え体プラスミドpRH31（DS
M3634）中にPst Iフラグメントとして含まれることを特
徴とする特許請求の範囲第（３）項記載のDNA配列。
【請求項６】DNA配列４が組換え体プラスミドpRH34（DS
M3635）中にPst Iフラグメントとして含まれることを特
徴とする特許請求の範囲第（４）項記載のDNA配列。
【請求項７】CUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有
し、かつアミノ酸配列１又はアミノ酸配列２を有するタ
ンパク質をコードするDNA配列の発現のための最適リボ
ソーム結合部位を有する、以下の配列５を有するDNAフ
ラグメント。アミノ酸配列1: アミノ酸配列2: 配列5:
【請求項８】CUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有
し、かつアミノ酸配列１又はアミノ酸配列２を有するタ
ンパク質をコードするDNA配列を含むことを特徴とする
組換え体クローニングベクター。アミノ酸配列1: アミノ酸配列2:
【請求項９】CUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有
し、かつアミノ酸配列１又はアミノ酸配列２を有するタ
ンパク質をコードするDNA配列に表現制御配列を適切に
連結させてなる組換え体ベクター。アミノ酸配列1: アミノ酸配列2:
【請求項１０】表現制御配列が大腸菌lacプロモータ
ー、大腸菌trpプロモーター、大腸菌リポタンパク質プ
ロモーター、λP₁プロモーターまたはλP_Rプロモータ
ー、酵母表現制御配列および他の真核細胞表現制御配列
から選ばれることを特徴とする、特許請求の範囲第
（９）項記載の組換え体ベクター。
【請求項１１】プラスミドpRH31（DSM3634）である特許
請求の範囲第（８）項記載の組換え体ベクター。
【請求項１２】プラスミドpRH34（DSM3635）である特許
請求の範囲第（８）項記載の組換え体ベクター。
【請求項１３】CUSI−Ｉタンパク質の生物学的活性を有
し、かつアミノ酸配列１又はアミノ酸配列２を有するタ
ンパク質をコードするDNA配列を含む組換え体クローニ
ングベクターにより形質転換されることを特徴とする細
菌。アミノ酸配列1: アミノ酸配列2:
【請求項１４】細菌が、種大腸菌の株又はバシラス・サ
チリス（B.subtilis）である特許請求の範囲第（13）項
記載の細菌。