JP2659525B2 - Ｈｕｓｉ−ｉ型インヒビターの生物学的活性を有するタンパク質および前記タンパク質を含む製剤組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＨＵＳＩ−Ｉ型インヒ
ビターの生物学的活性を有するタンパク質、そのような
タンパク質の製造方法およびそのようなタンパク質を含
む製剤組成物に関する。

【０００２】

【従来技術】生体細胞および生物中で、酵素の活性は最
初に酵素のドゥノボ合成および化学修飾により調節され
る。細胞または生物の改変環境態および同時に高活性の
特異性酵素に対する速い適応が必要であるときに、常に
この酵素が多量にドゥノボ合成されることを意味しな
い。しばしば既に存在する酵素のプールが活性化され
る。例えば消化酵素（プロテアーゼ）がそれらの貯蔵形
態、いわゆるチモーゲンから活性プロテアーゼに転移さ
れる。必要なときに血液凝固因子が同様に不活性貯蔵形
態から生物学的活性形態に転移される。貯蔵酵素の公知
活性機構は特異性ペプチダーゼによる開裂、プロティン
キナーゼによるリン酸化、ベシクルからの遊離およびア
ロステリック配位子によるタンパク質立体配座の変更で
ある。過度の上記活性化反応および活性化酵素の長時間
効果はこれらの酵素の制御された分解または特異的阻害
により防がれる。例えば活性化プロティナーゼの生物学
的活性はしばしば特異的プロティナーゼインヒビターに
より阻害される。

【０００３】過去数年に種々のプロティナーゼインヒビ
ターの臨床および病因の関連が認められた（１、２）。
リソソームプロティナーゼインヒビターが敗血症、リウ
マチ型の慢性疾患並びに上肺系の疾患の療法に適するこ
とが認められた。しかし現在、これらの疾患の治療に使
用できたと知られるプロティナーゼインヒビターは存在
しない。差当り、プロティナーゼインヒビターアプロチ
ニンが療法に使用されるだけである。アプロチニンは高
フィブリン溶解により生ずる術後出血の処置およびショ
ックの早期処置に使用される。

【０００４】上記疾患の療法にはＨＵＳＩ（ヒト−精漿
インヒビター）−Ｉ型インヒビターが適当であることが
できよう。それらはタンパク質である。ＨＵＳＩ−Ｉ型
インヒビターの群はプロティナーゼインヒビターＨＵＳ
Ｉ−Ｉ、ＣＵＳＩ−Ｉ（子宮頚分泌インヒビター）およ
びＢＳＩ（気管支分泌インヒビター）である。ＨＵＳＩ
−Ｉはヒト精漿からの酸耐性プロティナーゼインヒビタ
ーであり、グラニュロザイト（dranulozyt) のリソソー
ム顆粒からのプロティナーゼ例えばエラスターゼを阻害
する。ＨＵＳＩ−Ｉは単に他の細胞内または細胞外プロ
ティナーゼに対し低い阻害活性を示す。その分子量は約
１1,０００である。ＨＵＳＩ−Ｉの部分アミノ酸配列は
フリッツ（Fritz)（４８）により発表された。

【０００５】ＨＵＳＩ−Ｉのほかに、ヒト精漿中にさら
に酸耐性プロティナーゼインヒビター、すなわちＨＵＳ
Ｉ−IIが存在する（３）。その分子量は約6,５００であ
る。ＨＵＳＩ−ＩおよびＨＵＳＩ−IIは全く異なる阻害
スペクトルを有する。ＨＵＳＩ−IIの阻害活性はトリプ
シンおよびアクロシンに限定されるけれども、ＨＵＳＩ
−Ｉの最も顕著な性質はグラニュロザイトのリソソーム
顆粒からのプロテアーゼ例えばエラスターゼの特異的不
活性化である。その異なる生物学的活性のためにＨＵＳ
Ｉ−IIは従って非ＨＵＳＩ−Ｉ型インヒビターである。

【０００６】酸耐性インヒビターＣＵＳＩ−Ｉは子宮頚
分泌物から分離された（４）。ＣＵＳＩ−Ｉの分子量は
ＨＵＳＩ−Ｉとほゞ等しい。さらにＨＵＳＩ−Ｉおよび
ＣＵＳＩ−Ｉは同様の阻害スペクトルを有する。オッテ
ルロニー免疫拡散試験においてＨＵＳＩ−ＩおよびＣＵ
ＳＩ−Ｉは抗ＨＵＳＩ−Ｉ抗体と免疫交差反応を示す
（５、６）。最後に、ＨＵＳＩ−ＩおよびＣＵＳＩ−Ｉ
のアミノ酸分析は単に断片的に知られた限りほゞ等しい
（４７）。

【０００７】気管支分泌インヒビター（ＢＳＩ）は気管
支分泌物から分離された（４１、４４、４５、４６）。
ＢＳＩの初めの２５個のアミノ酸配列は（４１）に不完
全に発表された。ＢＳＩは約１0,０００の分子量を有す
る。免疫試験において、ＢＳＩはウサギ抗ＨＵＳＩ−Ｉ
抗体と交差反応を示す（４７）。ＢＳＩは酸耐性であ
り、プロティナーゼロイコザイト（leukozyte)エラスタ
ーゼ、カテプシンＧ、トリプシンおよびキモトリプシン
を阻害する。ＨＵＳＩ−Ｉ型インヒビターの生物学的活
性は実質的に知られているけれども、今までのところ、
これらのインヒビターはそれらが実質的に純粋な形態で
十分な量入手できなかったので治療目的に使用できなか
った。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ＨＵ
ＳＩ−Ｉ型インヒビターの生物学的活性を有するタンパ
ク質を生物工学的方法により製造することを目的とす
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記課題は哺乳動物のゲ
ノムから、殊にヒトのゲノムから誘導されるＤＮＡ配列
を提供することにより解決され、それは、好ましくは緊
縮条件下に図４および図５、および（または）図６およ
び図７記載のＤＮＡ配列にハイブリッド形成し、またＨ
ＵＳＩ−Ｉ型インヒビターの生物学的活性を有するタン
パク質をコードする。

【００１０】本発明における「ＨＵＳＩ−Ｉ型インヒビ
ターの生物学的活性を有するタンパク質」という語はイ
ンヒビターＨＵＳＩ−Ｉ、ＣＵＳＩ−ＩまたはＢＳＩの
生物学的活性、すなわち、例えば天然タンパク質の免疫
特性および（または）天然タンパク質の特異的阻害性を
有する融合タンパク質および非融合タンパク質に関す
る。ＨＵＳＩ−Ｉ型インヒビターの生物学的活性を有す
る本発明のタンパク質の阻害活性は後に酵素キモトリプ
シンの抑制の測定により決定される。「緊縮条件下のハ
イブリッド形成」および「普通のハイブリッド形成条
件」という語に関しては（２８）第３８７〜３８９頁お
よびボンナー（Bonner) ほか（２８）が参照される。一
般にＴ_m −１５〜Ｔ_m −３０、好ましくはＴ_m −２０〜
Ｔ_m −２７が使用される。ＨＵＳＩ−Ｉ、ＣＵＳＩ−Ｉ
およびＢＳＩのアミノ酸配列の単に一部を含む融合タン
パク質および非融合タンパク質は本発明においてＨＵＳ
Ｉ−Ｉ型インヒビターの生物学的活性を有するタンパク
質と称される。タンパク質のアミノ酸配列の部分領域は
また「ドメイン」と称される。

【００１１】本発明の好ましい態様において、ＣＵＳＩ
−Ｉタンパク質の生物学的活性を有するタンパク質は、
図６および図７に示されるＤＮＡ配列によりコードされ
る。本発明のさらに好ましい態様において、ＤＮＡ配列
によりコードされる。本明細書においては、ＰstＩフラ
グメントの形態で pＲＨ３１および pＲＨ３４中に含ま
れる図４および図５および、図６および図７に示される
ＤＮＡ配列についても言及する。

【００１２】プラスミド pＲＨ３１および pＲＨ３４は
ドイッチェ・サムルング・フュア・ミクロオルガニスメ
ン〔Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen (DSM) 〕
にそれぞれ寄託番号ＤＳＭ３６３４およびＤＳＭ３６３
５で寄託された。プラスミドpＲＨ３１および pＲＨ３
４またはそれらから誘導されたフラグメントおよび合成
オリゴヌクレオチドはＨＵＳＩ−Ｉ型インヒビターの生
物学的活性を有するタンパク質、例えばＨＵＳＩ−Ｉお
よびＢＳＩをコードする他のＤＮＡ配列の同定および分
離に対するプローブとして適する。この結論は、今まで
のところ利用できるインヒビターＨＵＳＩ−ＩおよびＢ
ＳＩの一次構造データが不完全であるけれども大きい類
似を示すので専門家には可能である。これからＤＮＡレ
ベルにおける高い配列同族関係が予想される。この高い
配列同族関係に基いて単に１つの遺伝子が３つのインヒ
ビターのすべてをコードすること、および個々のインヒ
ビターが組織特異性発現生成物であることを排除できな
い。

【００１３】本明細書において、緊縮条件下の、前記Ｄ
ＮＡ配列の１つへのＤＮＡ配列ハイブリッド形成につい
ても言及する。該ＤＮＡ配列は天然、半合成または合成
由来であり、それらは突然変異、ヌクレオチド置換、ヌ
クレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはヌクレオチド
領域の逆位による前記ＤＮＡ配列の１つに関し、それら
はＨＵＳＩ−Ｉ型インヒビターの生物学的活性を有する
タンパク質をコードする。

【００１４】本明細書においては、さらに前記ＤＮＡ配
列のクローニングおよび発現のためのベクターについて
も言及する。本発明において「ベクター」という語は例
えばプラスミド例えば pＢＲ３２２、 pＵＣ１８、 pＵ
Ｒ２９０、 pＷＨ７０１およびｐＳＰ６、あるいはウィ
ルスのゲノムおよびそのフラグメントまたは誘導体、例
えばλファージまたはファージＭ１３のゲノムに関す
る。本発明の発現ベクター中に、前記ＤＮＡ配列が表現
制御配列に適切に結合される。好ましい態様において遺
伝子の５′端における表現ベクターは次の配列：

【００１５】

【化５】

【００１６】を有するＤＮＡフラグメントを含む。本発
明による表現制御配列（プロモーター系）として大腸菌
（E. coli) lacプロモーター、大腸菌trp プロモータ
ー、大腸菌リポタンパク質プロモーター、アルカリ性ホ
スファターゼプロモーター、λＰ_L プロモーター、λＰ
_R プロモーター、酵母表現制御配列または他の真核細胞
表現規制配列を用いることができる。本発明の殊に好ま
しいプラスミドはプラスミド pＲＨ３１（ＤＳＭ３６３
４）および pＲＨ３４（ＤＳＭ３６３５）である。他の
殊に好ましいプラスミドはプラスミド pＲＨ３１、 pＲ
Ｈ３４および pＲＨ１８１０（ＤＳＭ３９０５）で構築
することができるプラスミド pＲＨ２４、 pＲＨ２１お
よび pＢＡ１７である。

【００１７】さらに、前記ベクターで形質転換された好
ましい宿主生物としては種大腸菌（E. coli) の株、バ
シラス・サブチリス（Bacillus subtilis)または他の細
菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cere
visiae）、他の顕微鏡的小真菌、動物またはヒト細胞が
あげられる。本発明の主題はさらにＨＵＳＩ−Ｉ型イン
ヒビターの生物学的活性を有するタンパク質である。本
発明のタンパク質はＣＵＳＩ−Ｉタンパク質の生物学的
活性を示す。殊に好ましい態様において、ＣＵＳＩ−Ｉ
タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質は図６お
よび図７に示されるアミノ酸配列を示す。他の殊に好ま
しい態様において、ＣＵＳＩ−Ｉタンパク質の生物学的
活性を有するタンパク質は次のアミノ酸配列：

【００１８】Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Ar
g-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-
Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gl
y-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-
Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala-OH を有する。他の殊に好ましい態様においてＣＵＳＩ−Ｉ
タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質は次のア
ミノ酸配列：

【００１９】Asp-Pro-Val-Asp-Tyr-Pro-Asn-Pro-Thr-Ar
g-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-
Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-As
p-Gly-Glu-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-
Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala-OH を有する。本発明のタンパク質は、好ましくは実質上純
粋なタンパク質である。本発明はさらに、前記形質転換
した宿主生物の１つを普通の栄養培地中で培養し、場合
により遺伝子生成物の発現を誘発し、培養から、すなわ
ち培養細胞からおよび（または）普通培地から発現生成
物を分離し、場合により発現生成物をさらに制御酸加水
分解条件下に処理して部分加水分解し、ゲルクロマトグ
ラフィーにより水解物から所望の生物学的活性タンパク
質を分離することを含む前記タンパク質の製造方法に関
する。それらの用途により、得られたタンパク質を好ま
しくはクロマトグラフィー、例えばアフィニティークロ
マトグラフィーまたは高性能液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）あるいはこれらの方法の組合せによりさら
に精製することができる。

【００２０】本発明により製造されたタンパク質および
タンパク質フラグメントは、特に慢性気管支炎、慢性頚
部炎症の治療、並びに過剰の粘液分泌に関連する他の慢
性炎症過程およびそれから生ずる急性緊急状態の治療に
適する。それらはさらにショックの初期治療および、例
えば高フィブリン分解に基く術後出血の治療に適する。
相応して、ＨＵＳＩ−Ｉ型インヒビターの生物活性を有
するタンパク質有効量並びに普通の担体および（また
は）希釈剤および（または）アジュバントを含む製剤組
成物もまた本発明の主題である。上記有効量は、0.１mg
/kg/日〜２０mg/kg/日である。治療にはＨＵＳＩ−Ｉ型
インヒビターの生物学的活性を有するタンパク質は無菌
等張溶液の形態で、筋肉内、静脈内または皮下注射によ
り炎症領域に、場合により注入により投与することがで
きる。本発明において、スプレーの形態の製剤組成物ま
たは吸入製剤が好ましい。それらは活性成分の気管支の
管および肺の疾患部への直接適用により気道の疾患の治
療に殊に適する。

【００２１】異質タンパク質を合成できる宿主生物を構
築するために多くの実験段階を行なうことが必要であ
る。最初に所望タンパク質の生合成に対する情報をもつ
遺伝子を同定して分離する。遺伝子の同定および分離に
は種々の方法がある。例えばＣＵＳＩ−Ｉタンパク質の
生物学的活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配
列の分離には、まずＨＵＳＩ−Ｉタンパク質の部分タン
パク質配列データに基く合成オリゴヌクレオチドの２つ
の混合物を調製する。これらのオリゴヌクレオチドは６
個のアミノ酸をエンコード（encode) するＤＮＡ配列に
相補性である（図１ ＲＨ１およびＲＨ２参照）。

【００２２】ＣＵＳＩ−Ｉ、ＨＵＳＩ−Ｉ（４８）およ
びＢＳＩ（４１）の一次構造に関する不完全なデータを
基にして適当なオリゴヌクレオチド混合物を合成するこ
とができなかった。アミノ酸配列の公知データに対しト
リプシンフラグメント、ブロモシアノフラグメントまた
はＮＨ₂ 末端の化学的に不均一な混合物を基にして得ら
れた（４８）。そのように得られた部分配列はさらに本
発明により決定されたＣＵＳＩ−Ｉタンパク質のアミノ
酸配列から３０％以上偏位する。アミノ酸の配列中の既
に１つの簡単な不正確に決定されたアミノ酸がこのアミ
ノ酸配列から誘導されるオリゴヌクレオチドプローブの
作用を生じないことができることは十分に立証されてい
る。（４８）中には例えばＲＨ２の領域中のアミノ酸配
列がＣys−Ｓer−Ｍet−Ｇly−Ｍet−Ｃysであると記載
されているが、しかしこの領域中の本発明により決定さ
れたアミノ酸配列はＣys−Ｃys−Ｍet−Ｇly−Ｍet−Ｃ
ysである（図４参照）。

【００２３】本発明によれば、 cＤＮＡライブラリーは
合成オリゴヌクレオチドの前記混合物を用いてスクリー
ンされる。これらの cＤＮＡライブラリーは出発物質と
してヒト頚部組織から mＲＮＡで調製された。本発明に
よる cＤＮＡライブラリー調製の出発物質として、また
ヒト肺の上部気道（死後１０時間にとった剖検物質）の
組織からの mＲＮＡを用いることができる（７）。供与
組織から分離された mＲＮＡは常法で相補性ＤＮＡ（ c
ＤＮＡ）分子の合成に使用され、それは最後にプラスミ
ド pＢＲ３２２のＰstＩ部位に挿入される。そのように
調製された cＤＮＡ分子で宿主生物、例えば大腸菌Ｋ１
２ＤＨ１、を形質転換し、常法でテトラサイクリンを含
む寒天平板上で培養する。ＣＵＳＩ−Ｉタンパク質の生
物学的活性を有するタンパク質をコードする cＤＮＡ配
列を有するプラスミドを含む形質転換宿主細菌のコロニ
ーはハイブリッド形成実験、いわゆるコロニーハイブリ
ッド法で同定される。

【００２４】この実験には、レプリカニトロセルロース
フィルターを寒天平板上に成長する細菌コロニーから調
製する、サヤー（Thayer) （８）参照。レプリカニトロ
セルロースフィルターを次いでワリス（Wallace)（９）
に従い２つの前記オリゴヌクレオチド混合物でハイブリ
ッド形成する。陽性コロニーから、組換え体 cＤＮＡ含
有プラスミドを分離する。プラスミド中の cＤＮＡ挿入
の大きさが決定され、適当な大きさの挿入体を有するプ
ラスミドは cＤＮＡ挿入体のＤＮＡ配列の分析により一
層詳細に確認される。従って組換え体プラスミド pＲＨ
３１が分離される。

【００２５】それはＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３６３４で
寄託されている。さらに頚部組織試料の mＲＮＡからプ
ラスミド pＲＨ３１のＤＮＡ配列から誘導されたオリゴ
ヌクレオチドで調製した cＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングし、ハイブリッド形成中のプローブとして作用
させることにより組換え体プラスミド pＲＨ３４を分離
する（図４、ＲＨ５参照）。組換え体プラスミド pＲＨ
３４の挿入体のＤＮＡ配列を決定すると、このプラスミ
ドがＣＵＳＩ−Ｉタンパク質をコードする全領域を含む
ことを知ることができる。組換え体プラスミド pＲＨ３
４はＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３６３５で寄託された。

【００２６】プラスミド pＲＨ３１および pＲＨ３４中
に含まれる cＤＮＡ配列の援助で次に発現ベクターが構
築される。最初の組換え体プラスミド pＲＨ２４は中間
体として作用する組換え体プラスミド pＲＨ１８１０か
ら調製される。組換え体発現プラスミド pＲＨ２４はＣ
ＵＳＩ−Ｉタンパク質の生物学的活性を有するタンパク
質をコードするプラスミド pＲＨ３４の領域、並びにシ
ャイン−ダルガルノ配列および翻訳由来をともに含む合
成ＤＮＡフラグメントを含む。組換え体発現ベクター p
ＲＨ２４から誘導された発現生成物は図６及び図７に示
される全アミノ酸を含む。

【００２７】さらに組換え体発現プラスミド pＲＨ２１
が調製される。このため、ＳauIIIＡフラグメントがプ
ラスミド pＲＨ３１から切り出され、プラスミド pＵＲ
２９０のＢamＨＩ制限部位中へ挿入される。そのように
構築された組換え体発現プラスミド pＲＨ２１から誘導
された発現生成物はＮ末端がβ−ガラクトシダーゼのア
ミノ酸配列からなり、５９Ｃ−末端アミノ酸がＣＵＳＩ
−Ｉタンパク質の最後の５９アミノ酸に相当する融合タ
ンパク質である（図６及び図７参照）。５８アミノ酸の
長さを有するポリペプチドを常法で、この発現生成物か
らアスパラギン酸−プロリン結合の酸加水分解により
（例えば１０〜７０％の酢酸またはギ酸、好ましくは約
３０％酢酸または７０％ギ酸で、約１０〜３０℃の範囲
内の温度、好ましくは室温で、２０〜４０時間処理する
ことにより）分離する。次いでゲルクロマトグラフィー
により精製する。この５８アミノ酸の長さを有するポリ
ペプチドはＣＵＳＩ−Ｉタンパク質の生物学的活性を有
する図６及び図７に記載されるタンパク質のＣ−末端ド
メインに相当する。

【００２８】プラスミド pＢＡ１７は他の組換え体発現
プラスミドとして構築される。このためＢamＨＩ／Ｈin
f Ｉフラグメントがプラスミド pＲＨ１８１０から切り
出され、末端を満たした後発現プラスミド pＳＰ６に連
結される。発現プラスミドは連結のためにＨind III 開
裂並びに次のムングビーン（Mungbean) ヌクレアーゼお
よびアルカリ性ホスファターゼによる処理により調製さ
れる。生じた組換え体発現プラスミド pＢＡ１７から得
られる発現生成物は５９個のアミノ酸からなる。その配
列は図６及び図７中の５９Ｃ−末端アミノ酸の１つに相
当する。発現生成物はＣＵＳＩ−Ｉタンパク質の生物学
的活性を示す。

【００２９】相当する形質転換した宿主生物による前記
タンパク質の発現は免疫沈殿１０により、またはウエス
ターンプロット（Westerblot) 分析１１、１２により示
される。発現生成物の生物学的活性はプロティナーゼキ
モトリブシンの阻害により決定される。図面には次のよ
うに示される。

【００３０】図１：ＨＰＬＣにより精製し、トリプシン
によるタンパク質の酵素開裂により得られた天然ＣＵＳ
Ｉ−Ｉタンパク質のフラグメントのアミノ酸配列。 合成オリゴヌクレオチドの２混合物が誘導された配列領
域はＲＨ１およびＲＨ２と称される。それらはアンダー
ラインされている。 図２：プラスミド pＲＨ３１の制限地図。 組換え体プラスミド pＲＨ３１が制限部位、Ｐ＝Ｐst
Ｉ、Ｅ＝ＥcoＲＩ、Ｂ＝ＢamＨＩ、Ｈ＝Ｈind III 、と
ともに示される。黒バーは cＤＮＡ挿入体を示し、円中
の矢はテトラセイクリン耐性遺伝子(tet^r ) および中断
アンピシリン耐性遺伝子(amp^s ) を示す。

【００３１】図３：プラスミド pＲＨ３１の cＤＮＡ挿
入の配列化方策の図式。 黒バーはプラスミド pＲＨ３１の５００bp−ＰstＩフラ
グメントを示し、黒矢はそれぞれの場合において配列反
応に相当する。白色非充填矢はＣＵＳＩ−Ｉをコードす
る cＤＮＡ挿入体上の領域を示す。 図４及び図５：プラスミド pＲＨ３１のＣＵＳＩ−Ｉ−
cＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列。

【００３２】二重鎖ＤＮＡ配列が示される。ＣＵＳＩ−
Ｉ配列の読取り枠は cＤＮＡ挿入体の５′（Ｇ：Ｃ）ホ
モポリマー尾の直後に始まる。読取り枠は３文字記号で
示される９０個のアミノ酸をエンコードする。さらに停
止コドンＴＧＡの後に１７８個の塩基が示される。 図６及び図７：プラスミド pＲＨ３４のＣＵＳＩ−Ｉ−
cＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列。 二重鎖ＤＮＡ配列が示される。ＤＮＡ配列から誘導され
たアミノ酸が３文字記号で示される。位置５９〜１３３
のヌクレオチドはＣＵＳＩ−Ｉタンパク質のシグナルペ
プチドをエンコードする。

【００３３】図８： pＲＨ１８０７（プラスミド pＲＨ
３４のＣＵＳＩ−Ｉ cＤＮＡフラグメントを含む）のＰ
stＩ挿入の配列化方策。 各矢は配列実験を示す。 Ｈ＝Ｈind III 、Ｐ＝ＰstＩ、Ｂ＝ＢamＨＩ。 図９：調節可能プロモーターλＰ_L の３′端にＣＵＳＩ
−Ｉ遺伝子をもつ発現ベクター pＲＨ２４の構築図式。

【００３４】amp^r ：アンピシリン耐性遺伝子 Ｎ−ＣＵＳＩ−Ｉ：ＣＵＳＩ−Ｉ−Ｎ末端をコードする
ＤＮＡフラグメント Ｃ−ＣＵＳＩ−Ｉ：ＣＵＳＩ−Ｉ−Ｃ末端をコードする
ＤＮＡフラグメント Ｏ_L Ｐ_L ：バクテリオファージλの左オペレーターおよ
びプロモーター領域 ＳＤ ：シャインーダルガルノ配列またはリボソーム
結合部位 制限エンドヌクレアーゼの略号： Ｂ＝ＢamＨＩ、Ｅ＝ＥcoＲＩ、Ｈ＝Ｈind III 、Ｈae＝
ＨaeIII 、 Ｐ＝ＰstＩ、Ｓph＝ＳphＩ。

【００３５】図１０：プラスミド pＲＨ３４の制限地
図。 組換え体プラスミド pＲＨ３４が制限部位、Ｐ＝Ｐst
Ｉ、Ｅ＝ＥcoＲＩ、Ｂ＝ＢamＨＩ、Ｈ＝Ｈind III 、Ｈ
ae＝ＨaeIII とともに示されている。黒バーは cＤＮＡ
挿入の位置を示し、円内の矢はテトラサイクリン耐性遺
伝子(tet^r ) および破壊アンビシリン耐性遺伝子(am
p^s ) の位置を示す。 図１１：アミノ酸配列分析が生ずる興味ある観点。 配列の２つのシフトを無視すると分子中に存在する全シ
スティン残基が、タンパク質を２つに分け、それらを相
互の上に記したときに重ねることができる（アミノ酸１
〜５４と５５〜１０７）。

【００３６】さらに、隣接アミノ酸がシスティン残基に
関してしばしば保存されることが認められる。この観察
に対して２つの異なる説明が存在する： （ｉ） ＣＵＳＩが２つのほぼ等しくたたまれたインヒ
ビター活性セグメント、すなわちトリプシンに対するも
のとロイコザイトエラスターゼまたはキモトリプシンに
対するもの、を含むことができる。 （ii) タンパク質はおそらく存在するドメインからの遺
伝子コードのレベル上で形成され、従って両ドメインが
互いに無関係に生じた。

【００３７】図１２：β−ガラクトシダーゼ融合タンパ
ク質として部分ＣＵＳＩ−Ｉ配列の発現に対するクロー
ニング方策。 黒バーは部分ＣＵＳＩ−Ｉ配列を、非充填バーはβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子(lacＺ）を表わし、円内の矢はテ
トラサイクリル耐性遺伝子(tet^r ) またはアンビシリン
耐性遺伝子(amp^r ) を示す。 Ｐ＝ＰstＩ、Ｓ＝Ｓau３Ａ、Ｅ＝ＥcoＲＩ、Ｈ＝ＨindI
II、 Ｂ＝ＢamＨＩ、ｐ＝lac プロモーター、ｏ＝lac オ
ペレーター。

【００３８】図１３：Ｃ−末端ＣＵＳＩ−Ｉドメイン
（＝ＣＵＳＩ−Ｉ第２ドメイン）の発現のための発現ベ
クター pＢＡ１７の構築図式。 Ａmp^r ＝アンピシリン耐性遺伝子 Ｐtac ＝tac プロモーター Ｔet^s ＝不活性テトラサイクリン耐性残基遺伝子 rrnBT₁T₂＝リポソームＲＮＡ遺伝子の転写ターミネータ
ーシグナル

【００３９】用いた次の略号は次の意味を有する： Ａ₅₇₈ ５７８nmにおける吸収 ＤＴＴ ジチオトレイトール Ｂis Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−メチレンビスアクリル
アミド bp、 塩基対 Ｄ ドルトン ＤＥ（ＤＥＡＥ） ジエチルアミノエチル ds cＤＮＡ 二重鎖 cＤＮＡ dＮＴＰ デオキシヌクレオシド−５′−三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＩｇＧ 免疫グロブリン

【００４０】ＩＰＴＧ イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド³² Ｐ 相対質量３２のリンの同位体 ＲＰＭ 回転毎分³² Ｓ 相対質量３５の硫黄同位体 ＳＤＳ ドデシル硫黄ナトリウム ss cＤＮＡ 一重鎖 cＤＮＡ ＴＰＥＧ ｐ−アミノフェニル−Ｉ−チオ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド

【００４１】Ｔris トリスヒドロキシメチルア
ミノメタン Ｕ 酵素活性の単位 サルコシン Ｎ−ラウリルサルコシン α−（³²P)−dCTP αリン酸残基中に同位体³²Ｐを
有するデオキシシチジル−５′−三リン酸 ＬＢ培地 １０ｇ／ｌ 酵素消化カゼイン〔シグマ
（Sigma)〕、５ｇ／ｌ酵母エキス（シグマ）、８ｇ／ｌ
NaCl、pH7.5 に調整。

【００４２】実施例において、下記の方法および示した
物質が使用される。物質および方法はさらにマニアティ
ス（T. Maniatis)ほか２８に記載されている。 （ｉ）酵素 制限エンドヌクレアーゼ〔ベテスダ・リサーチ・ラボラ
トリー（Bethesda Research Laboratory)(ＢＲＬ）〕お
よびＴ４−ＤＮＡリガーゼ〔ベーリンガー・マンハイム
（Boehringer Mannheim)〕並びに仔ウシ腸アルカリ性ホ
スファターゼ（ベーリンガー・マンハイム）、Ｔ４−ポ
リヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー・マンハイム）
およびムングビーンヌクレアーゼ〔ファルマシア（Phar
macia)〕は商業的に入手でき、製造者の指図書に従って
使用される。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼ（ＢＲＬ）はセクション（vii)記載のように使用
される。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）、リポヌ
クレアーゼＨ（ＢＲＬ）並びにＡＭＶ逆転写酵素〔ライ
フ・サイエンス（Life Science) は（１３）に従って使
用される。大腸菌ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメン
ト）（ベーリンガー・マンハイム）は（１４）記載のよ
うに使用される。

【００４３】（ii）微生物 グラム陰性およびグラム陽性株、例えば大腸菌またはバ
シラス・サブチリス（Bacillus subtillis) の株はとも
にＣＵＳＩ−Ｉの生物学的活性を有するタンパク質の発
現のための微生物として使用できる。ＣＵＳＩ−Ｉの生
物学的活性を有するタンパク質に対する構造遺伝子を含
む適当なベクターとともに真核生物例えばサッカロミセ
ス・セレビシェ（Saccharomyces cerivisiae) あるいは
哺乳動物細胞に対する通常の発現系も同様に使用でき
る。

【００４４】本発明によれば大腸菌株Ｋ１２ＭＣ１０６
１λ１５（ＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３６３１で寄託）が
完全天然ＣＵＳＩ−Ｉタンパク質の直接発現に使用され
る。その遺伝子型は次のように規定することができる：
ara Ｄ１３９、△（ara 、leu)７６９７、△lac Ｘ７4、
galＵ^- 、 galＫ^- 、 hsr^- 、 hsm⁺ 、 strＡ。本発明
によれば大腸菌株Ｋ１２ＪＭ１０１〔アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション(American Type Culture
Collection)（ＡＴＣＣ）に寄託番号ＡＴＣＣ３３８７
６で寄託〕がβ−ガラクトシダーゼとＣＵＳＩ−Ｉタン
パク質のＣ−末端ドメインとの間の融合タンパク質の発
現に使用される。その遺伝子型は次のように規定するこ
とができる：△(lac pro)、 thi、 Str Ａ、Sup Ｅ、end
Ａ、sbcＢ、hsd Ｒ^- 、Ｆ′tra 、Ｄ３6、 proＡＢ、 lac
Ｉｇ、Ｚ△Ｍ１５。

【００４５】合成 cＤＮＡの挿入後（実施例１(c) 参
照）に得られた組換え体プラスミドの分離には大腸菌Ｋ
１２ＤＨ１（ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ３３８４９で
寄託）が使用される（１７）。その遺伝子型は次のとお
り規定することができる：Ｆ^-、rec Ａ１、end Ａ１、g
yr Ａ９６、thi −１、hsd Ｒ１７（ｒ_K ^- 、 m
Ｋ⁺ ）、sup Ｅ４４、rel Ａ１。プラスミドおよびλフ
ァージのプロモーターＰ_L を含む新に構築された組換え
体プラスミドを分離するために、大腸菌Ｋ１２野性型Ｗ
６菌を初めに形質転換する。これらの宿主細菌中でλＰ
_L プロモーターは絶えず温度耐性λリプレッサーにより
ブロックされる。大腸菌Ｋ１２野性型Ｗ６はＤＳＭに寄
託番号ＤＳＭ３６３２で寄託される。

【００４６】(iii) ベクター 大腸菌の形質転換には、次の公知プラスミドが使用され
る。それらの若干は市販されている。 pＢＲ３２２〔ＡＴＣＣ３１３４４、（２３）、ファル
マシア（Pharmacia 、Freiburg) 〕 pＵＣ１８〔ＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３４２４で寄託、
（２４）、ファルマシア（Pharmacia 、 Freiburg) pＵＲ２９０〔ＤＳＭ３４１７、（２５）〕 pＷＨ７０１〔ＤＳＭ３６３３、（２６）〕 大腸菌Ｋ１２ＪＭＢ９中の pＲＫ２４８ cＩts〔ＡＴＣ
Ｃ３３７６６、（２７）、（４９）〕 pＳＰ６（ＤＳＭ３９０４）、および pＲＨ１８１０
（ＤＳＭ３９０５）。

【００４７】当業者はまた当業者に知られた宿主生物と
の関連で本発明に使用できる他の適当なベクターに明る
い。 （iv) ゲル電気泳動 ＤＮＡの長さにより、アガロースまたはポリアクリルア
ミドゲルがＤＮＡフラグメントの分離に使用される。８
００bp以上のＤＮＡフラグメントはＴＡＥ緩衝液（４０
mM−Tris−酢酸塩、 pH 8.３、２mM−ＥＤＴＡ）中の
１〜1.２％アガロースゲルで、８００bp以下のＤＮＡフ
ラグメントはＴＢＥ緩衝液（６０mM−Tris−塩基、６０
mMホウ酸、１mMＥＤＴＡ、pH 8.3）中の５％ポリアクリ
ルアミドゲル〔アクリルアミド／ビスアクリルアミド
（１９：１）〕で分離される。 cＤＮＡの分離のための
変性アガロースゲル電気泳動は例えばマクドネル（McDo
nnell)ほか（１９）による1.２％アルカリ性アガロース
ゲル中で行なわれる。

【００４８】mＲＮＡの電気泳動分離は1.４％アガロー
スゲルおよび１５mM水酸化メチル水銀で行なわれる。試
料は電気泳動にかけ、ベイレイ（Bailey) ほか（２０）
の方法により変性することができる。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル中のタンパク質の分離にはレムリ（Laem
mli)（２１）の方法が使用される。

【００４９】（ｖ）ゲル溶離法 1,０００bp以下のＤＮＡフラグメントの調製分離は５％
ポリアクリルアミドゲル中で行なわれる。フラグメント
の溶離はマクサム・アンド・ギルバート（２２）に従っ
て行なわれる。そのように分離されたフラグメントをそ
れぞれサブクローニングおよび配列分析に用いた。

【００５０】（vi) ＲＮＡの分離 ヒト組織からの全ＲＮＡはマニアチス（Maniatis) ほか
（２８）の方法により分離される。全ＲＮＡの抽出の次
にCsCl−勾配遠心分離し、ＤＮＡを分離する（２９）。
このため5.７Ｍ−CaCl ３ml、１００mM−ＥＤＴＡを１
６mlベックマン（Beckman)−ＳＷ２７遠心分離管に入
れ、ＲＮＡ溶液（１％Ｎ−ラウリルサルコシン中３〜４
mg核酸、５mM−Tris−HCl 、pH 7.5 、１mMＥＤＴＡ、
４ｇ／４mlCsCl ）４mlで覆い、ベックマンＳＷ−２７
ローター中で１５℃で１7,０００rpm で１７時間遠心分
離にかける。

【００５１】ＲＮＡ沈降物をＴＥ緩衝液（10 mM −Tris
−HCl 、pH 8.0、１mM−ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、エタ
ノールで沈殿させ、最後にアビブほか（Aviv and Lede
r) （３０）に従いオリゴ（dT) セルロース（タイプ
９、ファルマシア）よるポリ（Ａ ⁺ ） mＲＮＡの強化の
ためにクロマトグラフィーにかける。 mＲＮＡを溶離液
からエタノールで沈殿させ７０％エタノール中に−７０
℃で保持する。 mＲＮＡ分離物の生存力はウサギ網状赤
血球リゼイト中の試験管内翻訳により（セクション（xv
i)参照）、または変性ゲル電気泳動により調べることが
できる。そのように分離された mＲＮＡは次いで cＤＮ
Ａ合成およびノザンブロット（Northern blot)分析に使
用される。

【００５２】（vii) cＤＮＡ合成 相補性一重鎖または二重鎖ＤＮＡはガブラー（Gubler)
ほか（１３）に従って合成される。合成収率はα−〔³²
Ｐ〕− dＣＴＰの挿入によりスクリーニングし、生じた
cＤＮＡ分子の長さは1.２％アルカリ性アガロースおよ
び放射性標識標準ＤＮＡ分子により決定される。 cＤＮ
Ａの３′末端のオリゴ（dC) ホモポリマーによるテーリ
ングは次の条件下に全量４０μl で行なわれる：１００
mM−Ｋ−カコジレート、pH 7.2、１０mM−CoCl₂ 、１mM
−ＤＴＴ、５００μM dＣＴＰ、１〜２mg／ml cＤＮ
Ａ、６００Ｕ／ml末端デオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼ。反応混合物を２０℃で５０分間インキュベ
ートし、反応をＥＤＴＡの添加（最終濃度２０mM）によ
り停止させる。

【００５３】0.３Ｍ酢酸ナトリウム溶液からエタノール
で沈殿させた後、沈殿した cＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０
mM−Tris−HCl 、pH8.0 、１mM−ＥＤＴＡ）中に懸濁さ
せ、ＰstＩ−開裂３′−オリゴ（ｄＧ）テールプラスミ
ド pＢＲ３２２でハイブリッド形成する（１００mM−Na
Cl、１０mM−Tris−HCl 、pH 7.8、0.１mM−ＥＤＴＡ、
0.１〜0.３ng／μl cＤＮＡ、1.２ng／μl プラスミド
ＤＮＡ）。ハイブリッド形成にはこの混合物を次いで６
５℃で５分間、５６℃で４５分間、４３℃で４５分間お
よび室温で１５分間インキュベートする。次いでそれを
形質転換に直接使用する（セクション（ix）参照）。

【００５４】（viii) ノザンブロット分析 ＲＮＡを変性ゲル電気泳動にかけ、トーマス（Thomas)
（３１）に従いニトロセルロースフィルターに移す。前
ハイブリッド形成および５′−標識オリゴヌクレオチド
とのハイブリッド形成は（９）記載のように行なうこと
ができる（セクション（xi) 参照）。非特異的に結合し
たオリゴヌクレオチドはハイブリッド形成後ニトロセル
ロースフィルターの洗浄により、例えばフィルターを室
温で１５分間、ＳＳＣ緩衝液（９００mM−NaCl、９０mM
クエン酸ナトリウム、pH 7.0) 中の融点の２℃下で３分
間洗浄することにより除去することができる。融点はサ
グス（Suggs)ほか（３２）に従って算出される。

【００５５】（ix) 大腸菌の形質転換およびプラスミド
の分離 ドウノボ合成した cＤＮＡを含む組換え体プラスミド
（実施例１(c) 参照）による形質転換のため大腸菌Ｋ１
２ＤＨ１のコンピテント細胞をハナハン（Hanahan)（１
７）に従って調製する。大腸菌Ｋ１２種ＪＭ１０１、Ｗ
６およびＭｃ１０６１の細胞をマンデルほか（Mandel a
nd Higa)（３３）に従い形質転換する。プラスミドＤＮ
Ａは（３４）記載の方法に従い１リットル培養から調製
される。プラスミドの迅速分析はホルメス（Holmes) ほ
か（３５）に従って行なわれる。

【００５６】（ｘ）オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドはホスホアミダイト（phosphoamidi
te) 法（３６）により合成される。オリゴヌクレオチド
は、例えばシャンドン・ハイパーシル（Shandon-Hypers
il) ＯＤＳ（登録商標)(粒径５μm 、カラムサイズ4.６
×２５０mm）上の逆相クロマトグラフィーにより精製す
る。トリチル基を８０％酢酸で除去した後、生成物を再
び上記カラム物質上でクロマトグラフィーにかけ、５′
端に標識した後２０％ポリアクリルアミド中で分析する
（セクション（xi) 参照）。

【００５７】この方法により２つのオリゴヌクレオチド
混合物、すなわちＲＨ１およびＲＨ２が合成される。こ
れらのオリゴヌクレオチド混合物はともにプローブとし
て使用される。２混合物中のオリゴヌクレオチド分子の
配列はＨＵＳＩ−Ｉタンパク質のトリプシンフラグメン
トの適当なアミノ酸配列から誘導される（図１参照）。
これらのフラグメントのアミノ酸配列はマチレイト（W.
Machleidt) （５０）に従って決定された。単に若干の
トリプシンフラグメントおよび若干のブロモシアノフラ
グメントの分析により公知ＨＵＳＩ−Ｉ配列を補正する
ことにより、本発明のオリゴヌクレオチド混合物に到達
することが可能になった。

【００５８】オリゴヌクレオチド混合物はいわゆる「混
合プローブ」、すなわち遺伝子コードの退化に基く規定
された位置中で異なるオリゴヌクレオチドの混合物であ
る（９）。通常の「混合プローブ」の不利益はＨＰＬＣ
によるオリゴヌクレオチドの高精製により、並びにその
定量的³²Ｐリン酸化により補うことができた。オリゴヌ
クレオチド混合物ＲＨ１はＣＵＳＩ−Ｉタンパク質のト
リプシンフラグメントＴ２のアミノ酸配列に相当する
（図１参照）。従って、オリゴヌクレオチド混合物は各
１７塩基の長さを有する１６種の異なるオリゴヌクレオ
チドを含む。配列は次のとおりである。

【００５９】

【化６】

【００６０】オリゴヌクレオチド混合物ＲＨ２はＨＵＳ
Ｉ−Ｉタンパク質のトリプシンフラグメントＴ３のアミ
ノ酸配列に相当する（図１参照）。従って、各１７塩基
の長さを有する３２種の異なるオリゴヌクレオチドが合
成される。それらは次の配列を有する：

【００６１】

【化７】

【００６２】（xi) ＤＮＡの放射性標識化 化学合成オリゴヌクレオチドおよび二重鎖脱リン酸化Ｄ
ＮＡフラグメントのリン酸化は酵素Ｔ４−ポリヌクレオ
チド−キナーゼで２０〜５０μl 反応体積〔５０mM−Tr
is−HCl 、 pＨ9.５、２０mM−MgCl₂ 、１mM−ＥＤＴ
Ａ、１０〜２０pmol ５′−ＯＨ端基質、８μl γ−〔
³²Ｐ〕−ＡＴＰ（〜8,０００ Ci/mmol）、0.２Ｕ／μl
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ〕中で行われ、次に非
転化γ−〔 ³²Ｐ〕−ＡＴＰが調製用ゲル電気泳動、次に
ゲル溶離およびＤＥ５２（ジアミノジエチルセルロー
ス）〔ワットマン (Whatman)〕上のイオン交換クロマト
グラフィーにより分離される。ＤＮＡ制限フラグメント
の５′−突出端をフォルケルト(Volkert)ほか（１４）
に従って相補性α−〔³²Ｐ〕−デオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸の存在下に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノウフラグメントで満たすことができる。組込まれな
いα−〔³²Ｐ〕−ｄＮＴＰ₃ はセファデックス（Sephad
ex）Ｇ−５０上のゲルパーミエーションクロマトグラフ
ィーにより分離され、溶離画分を減圧下に濃縮する。

【００６３】(xii) ＤＮＡ配列分析 ＤＮＡ分子の配列はマクサム・アンド・ギルバート(Max
am and Gilbert）（２２）に従って決定される。 (xiii)β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の精製 ＣＵＳＩ−Ｉ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質は
ウルマン (Ulmann）（３７）に従ってアフィティークロ
マトグラフィーにより精製される。 (xiv) タンパク質のニトロセルロースフィルターへの移
動 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分離されたタンパ
ク質はトウビン（Towbin) ほか（１２）に従いニトロセ
ルロースフィルターに移される。

【００６４】(xv)ＣＵＳＩ−Ｉ阻害試験 ＣＵＳＩ−Ｉの生物学的活性を有するタンパク質の活性
はトリプシン（３8 ）およびキモトリプシン（３９）の
阻害の測定により示される。 (xvi) ｍＲＮＡの無細胞翻訳 網状赤血球リゼイト中のｍＲＡの無細胞翻訳はペルハム
(Pelham）ほか（４０）に従って、放射性標識アミノ酸
として１２００Ｃi/mmolの比活性を有する³⁵Ｓ−メチオ
ニンを用いて行われる。

【００６５】

【実施例】実施例は発明の例示である。 参考例１ 部分ＣＵＳＩ−Ｉタンパク質−特異性ｃＤＮＡクローン
のクローニングおよび同定

【００６６】（ａ）ｍＲＮＡの分離および確認 全ＲＮＡまたはｍＲＮＡをヒト頸部組織（生検物質）か
らセクション (vi) 記載のように分離する。約1.６〜2.
２mgの全ＲＮＡが１４〜１７ｇの頸部組織から得られ
る。オリゴ（ｄＴ）−セルロース（タイプ９、ファルマ
シア）でアフィニティークロマトグラフィーによりポリ
（Ａ⁺ ）−ｍＲＮＡを強化後、２０〜２５μg ｍＲＮＡ
／mg全ＲＮＡが得られる。これは約2.０〜2.５％ｍＲＮ
Ａの収率に相当する。変性アガロースゲル中のゲル電気
泳動分析によりＲＮＡが分離中に分解しないことが示さ
れる。相当する結果はまたウサギ網状赤血球リゼイト中
の全およびポリ（Ａ⁺ ）−ｍＲＮＡの試験管内翻訳から
得られる。

【００６７】（ｂ）ＣＵＳＩ−Ｉタンパク質−特異配列
の検出のための合成オリゴヌクレオチドによる分離した
ｍＲＮＡのノザンブロット分析 ノザンブロット分析は頸部ｍＲＮＡ分離物中の特異ｍＲ
ＮＡ配列の確認のために行われる。アミノ酸Ｐhe−Ｃys
−Ｇlu−Ｍet−Ａsp−ＧlyをコードするｍＲＮＡと相補
性であるオリゴヌクレオチド混合物ＲＨ１（図１参照）
はハイブリッド形成プローブとして作用する。

【００６８】ハイブリッド形成中に得られたニトロセル
ロースフィルターにＸ線フィルム（「コダック (Kodak)
−Ｘ−ｏ−mat −ＡＲ」〕にさらすことにより特異性シ
グナルが検出される。オリゴヌクレオチド混合物ＲＨ２
で陽性シグナルが認められなかったけれども、混合物の
オリゴヌクレオチド配列の１つは後に（配列化後）右配
列であると示された。ハイブリッド形成ｍＲＮＡ種の分
子の大きさをＤＮＡ標準分子と変性ゲル中で比較すると
ハイブリッド形成ｍＲＮＡの長さが約６５０〜８００塩
基であることが認められる。

【００６９】（ｃ）プラスミドｐＢＲ３２２によるｃＤ
ＮＡライブラリーの調製 ４〜６μg のポリ（Ａ⁺ ）−ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成の
出発物質として用いる。一重鎖ｃＤＮＡは約２８０ｎg
（約７％）である。合成一重鎖ｃＤＮＡ分子は約４００
〜2,５００ヌクレオチドの大きさを有する。２８０ｎg
のＳＳｃＤＮＡから、約２７０ｎg の二重鎖ｃＤＮＡが
第２鎖を合成するときに得られる。従って、二重鎖合成
の収率は約５０％である。ｃＤＮＡ分子の３’端がホモ
ポリマー（ｄＣ）領域でテーリングされる。得られたｃ
ＤＮＡ分子はハイブリッド形成反応中に、ＰstＩ開裂さ
れ３’端にホモポリマー（ｄＧ）領域でテーリングされ
たプラスミドｐＢＲ３２２の分子に付加する。

【００７０】付加生成物は大腸菌Ｋ１２ＤＨ１の形質転
換に使用される。次いで形質転換細胞をテトラサイクリ
ン耐性およびアンピシリン感受性について選択する。用
いた毎ｎg ｃＤＮＡ当り１２０形質転換細胞（１2,００
０形質転換細胞／１００ｎgｄs ｃＤＮＡ）が得られ
る。テトラサイクリン耐性およびアンピシリン感受性形
質転換細胞またはコロニーの割合は約８０％である。こ
れらの形質転換細胞は貯蔵培養（培地：ＬＢ培地、１０
ｇ／リットル酵素消化カゼイン（シグマ）、８ｇ／リッ
トルNaCl、 pＨ7.５、５ｇ／リットル酵母エキス（シグ
マ）、２０μg ／mlテトラサイクリン、２０％グリセリ
ン）としてミクロタイタープレート（９８ウエル／プレ
ート）中で培養し、−２０℃で保つ。

【００７１】（ｄ）ＣＵＳＩ−Ｉタンパク質特異性ｃＤ
ＮＡによる組換え体プラスミドの同定 上記のように得られた6,０００形質転換細胞の分析のた
め、コロニーハイブリッド形成がオリゴヌクレオチド混
合物ＲＨ１で行なわれる。オリゴヌクレオチド混合物の
活性は0.８μＣi/pmolの比活性でハイブリッド形成体積
中約１×１０⁶cpm である。Ｘ線フィルムをハイブリッ
ド形成中に得られたフィルターの各−７０℃で、２補強
スクリーンの存在下に１２時間さらす。陽性シグナルが
検出される。

【００７２】相当する形質転換細胞の貯蔵培養から出発
し、ｐＲＨ３１と称される組換え体プラスミドが0.５リ
ットル培養〔ＬＢ培地、１０ｇ／リットル酵素消化カゼ
イン（シグマ）、１０ｇ／リットルNaCl、５ｇ／リット
ル酵母エキス（シグマ）、 pＨ7.５、２０μg ／mlテト
ラサイクリン）から精製される。制限エンドヌクレアー
ゼＰstＩ、ＥcoＲ１，ＢamＨＩ並びにＨind III の使用
により組換え体プラスミドｐＲＨ３１の制限地図が得ら
れる（図２参照）。ｃＤＮＡ挿入体は５００bpの長さを
有する( 図２参照）。プラスミドｐＲＨ３１はＤＳＭに
寄託番号３６３４で寄託された。

【００７３】（ｅ）ｐＲＨ３１のｃＤＮＡ挿入体の配列
分析 マクサム・アンド・ギルバート（２２）に従う配列化の
ためにプラスミドｐＲＨ３１からのＰstＩフラグメント
（５００bp）をプラスミドｐＵＣ１８中へ再クローンす
る。このためｐＲＨ３１のＤＮＡ１０μg を制限エンド
ヌクレアーゼＰstＩ３０Ｕで開裂し、アガロースゲル上
で調製的に分離し、得られた５００bpフラグメントをゲ
ルから溶離する。さらにプラスミドｐＵＣ１８のＤＮＡ
１０μgを制限エンドヌクレアーゼＰstＩで開裂し、脱
リン酸し、フェノールおよびジエチルエーテルで抽出
し、最後に0.３mol 酢酸ナトリウム溶液からエタノール
で沈殿させる。

【００７４】次のＴ４−ＤＮＡリガーゼ反応には0.２pm
olのプラスミドＤＮＡおよび0.４pmolのＰstＩフラグメ
ントを用いる。得られた組換え体ＤＮＡ分子を大腸菌Ｋ
１２ＪＭ１０１の形質転換に用いる。アンピシリンを含
むＬＢ平板（１０ｇ／リットルカゼイン、８ｇ／リット
ルNaCl、５ｇ酵母エキス、１００μg ／mlアンピシリ
ン）上で選択を行なう。アンピシリン耐性形質転換細胞
中に含まれる組換え体プラスミドはプラスミド迅速分析
により確認される。ｐＲＨ３１のＰstＩフラグメントを
反対配向で含む組換え体プラスミドｐＲＨ１８１および
ｐＲＨ１８２が得られる。

【００７５】図３に示される配列化方策はこれらのプラ
スミドの構築から生じ、それは単に容易なＤＮＡ配列化
のための補助構築として作用する。配列化（２２）によ
り決定されたプラスミドｐＲＨ３１の５００bp ＰstＩ
フラグメントのヌクレオチド配列が図４及び図５に示さ
れる。配列は２０（ｄＧ）−残基で５’−端で出発す
る。その後に２７３bpにわたって延びる読取り枠が続く
（図４及び図５、位置２５〜２９７参照）。この読取り
枠は９０個のアミノ酸をコードし、停止コドンＴＧＡで
終る（図４及び図５参照）。ヌクレオチド配列から、オ
リゴヌクレオチド混合物ＲＨ１のオリゴヌクレオチドが
ヌクレオチド配列の位置２０８〜２２４と相補性である
こと、およびオリゴヌクレオチド混合物ＲＨ２のオリゴ
ヌクレオチドがヌクレオチド配列の位置２４７〜２６３
と相補性であることを知見できる。停止コドンＴＧＡに
はさらに１７８bpが続く。ヌクレオチド配列の分析はＣ
ＵＳＩ−Ｉタンパク質のＮ末端セグメントをコードする
領域がヌクレオチド配列中に含まれないことを示す。

【００７６】参考例２ 全ＣＵＳＩ−Ｉタンパク質をコードするｃＤＮＡフラグ
メントによる組換え体プラスミドの分離 （ａ）オリゴヌクレオチドＲＨ５の合成 ＣＵＳＩ−Ｉタンパク質をコードする全領域を含むｃＤ
ＮＡフラグメントを分離するためにオリゴヌクレオチド
ＲＨ５をホスファミダイト法（３６）に従って合成す
る。オリゴヌクレオチドＲＨ５は２０塩基の長さを有す
る。それは図４及び図５に示されるコーディングＤＮＡ
鎖の位置３１〜５０と相補性であり、次の配列を有す
る：

【００７７】 ５’C A C T C A G G T T T C T T G T A T C T 3' オリゴヌクレオチドＲＨ５を放射性標識し、ｃＤＮＡフ
ラグメントがその５’端に少なくともプラスミドｐＲＨ
３１の５’−末端領域を含む組換え体プラスミドを含む
形質転換細胞を新ｃＤＮＡライブラリー中で同定するた
めにプローブとして使用される。

【００７８】（ｂ）ＣＵＳＩ−Ｉタンパク質の全コーテ
ィング領域による組換え体プラスミドを含む新ｃＤＮＡ
遺伝子ライブラリーの調製 プラスミドｐＢＲ３２２を用いる大腸菌中の新ｃＤＮＡ
ライブラリーを調製するためＣＵＳＩ−Ｉタンパク質を
コードするｍＲＮＡを分離する。このためヒト頸部組織
からの全ＲＮＡ２５０μg を、その大きさにより１５ m
Ｍ水酸化メチル水銀を含む変性1.４％「低融点（ＬＭ
Ｐ）」アガロース中で電気泳動的に分離する（セクショ
ン(iv)参照) 。約７００〜８５０塩基の長さを有するｍ
ＲＮＡ約１０μg がこのゲルから抽出により分離され
る。このｍＲＮＡ４μg をｃＤＮＡ合成に用い（セクシ
ョン (vii)参照) 、大腸菌Ｋ１２ＤＨ１中へ導入する
（セクション(ix)参照) 。

【００７９】５３ｎg 二重鎖ｃＤＮＡを有する4,３００
形質転換細胞が得られる。形質転換細胞は５’標識オリ
ゴヌクレオチドＲＨ５とのコロニーハイブリッド形成に
より分析される（参施例２（ａ）参照）。ハイブリッド
形成溶液中のオリゴヌクレオチドの活性は0.７２μＣi/
pmolの比活性で２×１０⁵ cpm ／mlである。１２形質転
換細胞が分離され、その組換え体プラスミドはオリゴヌ
クレオチドＲＨ５とハイブリッド形成する。形質転換細
胞の貯蔵培養のアリコートで組換え体プラスミドを調製
し、ＰstＩ、ＢamＨＩおよびＨind III による制限開裂
により地図が作られる。これらのプラスミドの１１個が
プラスミドｐＲＨ３１とほぼ同様の制限パターンを有
し、すなわちそれらは各３８０bpの１つのＢamＨＩ／Ｐ
stＩフラグメントおよび約１２５bpの１フラグメント、
並びに約２９０bpの１つのＨind III ／ＰstＩフラグメ
ントおよび約２００bpの１フラグメントを含む。

【００８０】ＰstＩフラグメントの長さはそれぞれの場
合に約５００bpである。１つのプラスミドのみが異なる
制限地図を示し、すなわちそれは２８５bpの１つのＢam
ＨＩ／ＰstＩフラグメントおよび約２７５bpの１フラグ
メント、並びに約４５０bpの１つのＨind III ／ＰstＩ
フラグメントおよび約１０５bpの１フラグメントを含
む。偏位組換え体プラスミドの挿入体の長さは約５５０
bpである。この組換え体プラスミドはｐＲＨ３４と称さ
れる。その制限地図は図１０に示される。プラスミドｐ
ＲＨ３４はＤＳＭに寄託番号ＤＳＭ３６３５で寄託され
た。

【００８１】（ｃ）組換え体プラスミドｐＲＨ３４の挿
入体のヌクレオチド配列 ｐＲＨ３４からのＰstＩ−ｃＤＮＡフラグメントおよび
ｐＲＨ３４からの両ＢamＨＩ／ＰstＩフラグメントはＤ
ＮＡをＰstＩまたはＰstＩとＢamＨＩで開裂し、アルカ
リ性ホスファターゼで処理した後プラスミドｐＵＣ１８
のＤＮＡ中でサブクローンする。そのように構築したＤ
ＮＡ配列分析のための補助構築物である組換え体プラス
ミドはｐＲＨ１８０７（ＰstＩフラグメント）、ｐＲＨ
１８０８（Ｎ−末端ＢamＨＩ／ＰstＩフラグメント）お
よびｐＲＨ１８０９（Ｃ−末端ＢamＨＩ／ＰstＩフラグ
メント）と称される。

【００８２】サブクローンしたＤＮＡフラグメントの配
列はマクサム・アンド・ギルバート（２２）に従って分
析する。組換え体プラスミドの配列化方策は図８から知
ることができる。ｐＲＨ３４からのｃＤＮＡフラグメン
トのヌクレオチド配列は図６及び図７に示される。それ
は位置２５〜３０８のｐＲＨ３１のｃＤＮＡ挿入体の配
列に等しい（図４及び図５参照）。しかし、ｐＲＨ３４
のｃＤＮＡ挿入体は５’−端で１８４bp長い。これらの
１４３bpはｍＲＮＡと相補性の配列に相当し、４１bpは
ＰstＩ制限部位を含むｄＣＴＰによるｃＤＮＡのホモポ
リマーテーリングに由来する。 アミノ酸

【００８３】

【化８】

【００８４】はＨＵＳＩ−１のインヒビターのＮ−末端
と同定された。アミノ酸コドンは分離されたＤＮＡ配列
の５’−末端ヌクレオチドから推論すると読取り枠のこ
の部分中に停止コドンが認められない。従って、読取り
枠中に出現するＡＴＧは開始に関与し、ＣＵＳＩ−Ｉタ
ンパク質の出発をコードする。さらに、分泌タンパク質
のシグナルペプチド構造は稀に２５個のアミノ酸より長
い。シグナルペプチド間の制限部位および相当する天然
タンパク質は最もしばしばアミノ酸アラニン、セリンお
よびグリシンの後に認められ、従って、配列Ｇly＊Ｓer
が全く普通である。頸部分泌物からのヒトＣＵＳＩ−Ｉ
タンパク質の一次構造は従って１０４個のアミノ酸から
なる。決定されたヌクレオチド配列によりエンコードさ
れるアミノ酸配列は、本発明以前に単に不完全に知られ
た気管支抗ロイコプロテアーゼのＮ−末端アミノ酸配列
（４１）に実質的に等しい。

【００８５】実施例１大腸菌中のＣＵＳＩ−Ｉタンパク質の発現 （ａ）調節可能λＰ_l プロモーターの下流に全ＣＵＳＩ
−ＩｃＤＮＡを含む発現プラスミドの構築 開始するために、ＲＨ６およびＲＨ７と称される２つの
合成オリゴヌクレオチドを合成する。それらは互いに相
補性であり、最適リポソーム結合部位（４２）に対する
配列、ＳalＩおよびＥcoＲ１制限部位並びに位置１〜位
置１４のＣＵＳＩ−Ｉのコーディング領域のヌクレオチ
ド配列をもつ。

【００８６】両オリゴヌクレオチドを酵素Ｔ４−ポリヌ
クレオチド−キナーゼで５’−末端をリン酸化し、１２
％のポリアクリルアミドゲル中で調製的に電気泳動的に
分離し、ゲルから溶離し、ＤＥ５２でクロマトグラフィ
ーにかける。次のセファデックス（Sephadex）Ｇ−５０
上のゲルパーミエーションクロマトグラフィー後、各オ
リゴヌクレオチド１０pmolを混合し、９０℃で変性し、
室温で徐冷することにより相互にハイブリッド形成させ
る。この方法で次の二重鎖ＤＮＡフラグメントが得られ
る：

【００８７】

【化９】

【００８８】第２分離成分はプラスミドｐＲＨ３４の２
１０bp（Ｈae III／ＢamＨＩ）フラグメントであり、そ
れはさらにＮ−末端領域をコードする。このため、プラ
スミドｐＲＨ３４、１０μg を制限エンドヌクレアーゼ
Ｈae IIIおよびＢamＨＩで開裂し、５％ポリアミドゲル
中で電気泳動的に分離する。２１０bpフラグメントを次
いでポリアクリルアミドゲルから溶離する。プラスミド
ｐＲＨ１８０７（図８）は第３成分として、従ってベク
ターとして作用する（図９）。このため、このプラスミ
ド１０μg を制限酵素ＥcoＲ１およびＢamＨＩで開裂す
る。ベクターフラグメントをアルカリ性ホスファターゼ
で処理し、次いでフェノールで抽出し、エタノールで沈
殿させる。

【００８９】３成分を連結するため（図９）、合成オリ
ゴヌクレオチド１pmolを互いにハイブリッド形成させ、
Ｎ−末端Ｈae III−ＢamＨＩフラグメント0.２pmolおよ
びベクターＤＮＡ0.０３pmolと混合し３０μl の反応体
積で５ＵＴ４−ＤＮＡリガーゼで互いに連結させる。大
腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０１を形質転換に使用する。得られ
た形質転換細胞のプラスミドを放射性標識オリゴヌクレ
オチドＲＨ６でハイブリッド形成することによりスクリ
ーニングする。さらにＳalＩ、ＥcoＲ１およびＢamＨＩ
に対する制限部位を調べ、相当するフラグメントの長さ
を決定する。正しい新に構築されたプラスミドはｐＲＨ
１８１０（ＤＳＭ３９０５）と称される（図９）。

【００９０】発現プラスミドを構築するため、ベクター
ｐＷＨ７０１（２６）１０μg をＥcoＲ１およびＳphＩ
で開裂し、脱リン酸し、フェノールで抽出し、エタノー
ルで沈殿させる。プラスミドｐＲＨ１８１０からＥcoＲ
１−ＳphＩフラグメントを調製するため、ＤＮＡ１０μ
g をＥcoＲ１およびＳphＩで開裂する。生じた５２５bp
フラグメントをゲル電気泳動により５％ポリアクリルア
ミドゲルでベクターから分離し、ゲルから溶離する。次
いで0.３pmolのベクターｐＷＨ７０１および１pmolのＥ
coＲ１−ＳphＩフラグメントを互いに連結し、大腸菌Ｋ
１２野性型Ｗ６へ案内する。生じた形質転換細胞のプラ
スミドをプラスミド迅速分析および次のアガロースゲル
電気泳動により確認する。組換え体発現プラスミドは挿
入のない発現プラスミドより２８０bp長い。新同定組換
え体発現プラスミドはｐＲＨ２４と称され、次の発現実
験に使用される。図９に組換え体発現プラスミドｐＲＨ
２４の構築図式が示される。

【００９１】（ｂ）発現プラスミドｐＲＨ２４によるＣ
ＵＳＩ−ＩｃＤＮＡの大腸菌Ｋ１２ＭＣ１０６１／ｐＲ
Ｋ２４８ cＩts中の発現（１５、２７） 宿主菌株単独はλ−溶原でなく、すなわち、それはλｃ
Ｉリプレッサーを含まない。温度感受性リプレッサーλ
ｃＩ８５７に対する遺伝子情報はプラスミドｐＲＫ２４
８ cＩts上に局在化され、それはまた宿主細菌にテトラ
サイクリン耐性を与える（２７）。３０℃で、λＰ_L プ
ロモーター支配転写が完全に抑圧される。４２℃で温度
感受性 cＩ８５７リプレッサーがその不活性化形態中に
存在し、Ｐ_L プロモーターの下流にある遺伝子が転写さ
れる。この大腸菌Ｋ１２ＭＣ１０６１／ｐＲＫ２４８ c
Ｉtsを組換え体発現プラスミドｐＲＨ２４で形質転換す
る。

【００９２】λＰ_L プロモーターの下流にあるＣＵＳＩ
−Ｉ遺伝子の発現を誘発するため、ＬＢ培地（２０μg
／mlテトラサイクリン、５０μg ／mlアンピシリン）２
００mlに大腸菌Ｋ１２ＭＣ１０６１／ｐＲＫ２４８ cＩ
ts／ｐＲＨ２４の一夜培養３mlを接種し、２８℃で0.７
Ａ₅₇₈ 単位／mlの細胞密度まで培養する。次いで培養を
さらに４２℃で振とうする。タンパク質分析を行なうた
め、発現の誘発前および誘発開始後種々の間隔で細胞試
料をとり、細胞（約１×１０⁹ 細胞）を１Ａ_{57 8} 単位当
りに満たし、３分間１2,０００ｇで遠心分離し、細胞沈
降物を、さらにプロセッシングするまで−２０℃に凍結
する。

【００９３】実施例２ 大腸菌Ｋ１２ＭＣ１０６１／ｐＲＫ２４８ cＩts／ｐＲ
Ｈ２４中のＣＵＳＩ−Ｉタンパク質発現後の粗タンパク
質抽出物の確認 （ａ）ラビット抗ＨＵＳＩ−Ｉ抗血清との免疫交差反応
試験 細胞沈降物を６０μl 破壊緩衝液（５０mM−Tris−HCl
、 pＨ8.０、１mM−ＥＤＴＡ、２％トリトン−Ｘ−１
００）中に再懸濁し、４０μl 還元緩衝液（４％ＳＤ
Ｓ、４０％β−メルカプトエタノール、２０％グリセリ
ン、0.１％ブロモフェノールブルー）を加える。次に試
料を１００℃で５分間、次いで超音波浴中室温で５分
間、再び１００℃で５分間インキュベートする。細胞破
壊体積２０μlを１3.５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
中で電気泳動的に分離し、免疫検定のためにニトロセル
ロース上に移す。

【００９４】ニトロセルロースフィルターを、フィルタ
ー上の非特異的結合部位を飽和するために「ブロッキン
グ」緩衝液（５０mM−Tris−HCl 、 pＨ7.４、２００mM
−NaCl、0.０５％ツイーン２０、1.５％ゼラチン）で３
７℃で１時間インキュベートする。ウサギ抗ＨＵＳＩ−
Ｉ抗血清（「ブロッキング」緩衝液中１：６００希釈）
を第１抗体反応に用い（インキュベーション：室温で２
時間）、ヒツジ抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合
体を第２抗体として用いる。ホースラディッシュ(horse
radish) ペルオキシダーゼの基質反応をジアミノベンジ
ジンで行なう。

【００９５】（ｂ）大腸菌中に発現されたプロティナー
ゼインヒビターの阻害活性試験 誘発（誘発開始６時間後）、および非誘発細胞試料を破
壊し、試験した。細胞沈降物（１Ａ₅₇₈ 単位細胞）を５
０μl のリゾチーム破壊緩衝液（５０mM−Tris−HCl 、
pＨ8.０、１mM−ＥＤＴＡ、１mg／mlリゾチーム）中に
懸濁し、室温で１０分間インキュベートし、１５０μl
の５０mM−Tris−HCl 、 pＨ8.０、１mM−ＥＤＴＡで希
釈し、超音波浴中で室温で５分間インキュベートする。
非誘発および誘発細胞の粗抽出物のそれぞれ２０μl お
よび８０μl をキモトリプシン試験（３９）で阻害活性
について試験する。試験結果は表１に示される。

【００９６】

【表１】 表 １ 大腸菌中に発現されたＣＵＳＩ−Ｉ タンパク質の阻害活性の検出 ２pmol酵素の インヒビター試験溶液 キモトリプシン活性 大腸菌抽出物 誘発 非誘発 ％ − − − １００ ２０ − ＋ ９9.２ ８０ − ＋ ８9.７ ２０ ＋ − ９1.2 ８０ ＋ − ５6.4

【００９７】大腸菌からのキモトリプシン非誘発粗抽出
物の活性と比較すると、誘発細胞の細胞抽出物による阻
害がそれぞれ８％および３７％高い。 実施例３ 大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０１中のβ−ガラクターゼ融合タン
パク質としてＣ−末端ＣＵＳＩ−Ｉドメインの発現 図１１から知見できるように、ＣＵＳＩインヒビターの
構造は遺伝子内重複により形成される２つのドメインか
らなるタンパク質分子と記載することができる。大腸菌
中のＣ−末端ドメインの発現のために、Ｃ−末端の５９
個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列がプラスミドｐＵ
Ｒ２９０（２５）のβ−ガラクトシダーゼのＣ−末端を
エンコードするＤＮＡ配列で正しい読取り枠中に連結さ
れる。クローニング図式は図１２に示される。

【００９８】プラスミドｐＲＨ３１、１０μg を制限エ
ンドヌクレアーゼＳau３Ａで開裂し、５％ポリアクリル
アミドゲル中で調製的に分離し、３２０bpＣＵＳＩ−Ｉ
部分フラグメントをゲルから溶離する。ｐＵＲ２９０
（１０μg ）を酵素ＢamＨＩで開裂し、アルカリ性ホス
ファターゼで処理し、３２０bpフラグメントで連結す
る。第３の連結ＤＮＡを CaCl₂処理大腸菌Ｋ１２ＪＭ１
０１細胞に導入する。クローンはＬＢ−amp 寒天平板
〔１０ｇ／ｌ酵素消化カゼイン（シグマ）、８ｇ／ｌNa
Cl、５ｇ／ｌ酵母エキス（シグマ）、 pＨ7.５、１００
μg ／mlアンピシリン〕上で選択する。ＣＵＳＩ−Ｉ部
分フラグメントの２配向が組換え体プラスミド中に可能
であるので、プラスミド迅速分析を次のＨind III 制限
で行なう。

【００９９】プラスミドが１６５bpＨind III フラグメ
ントを含むクローンをさらに分析する。これらのプラス
ミドの１つがｐＲＨ２１として示される。融合タンパク
質発現の導入のため、１００μg ／mlアンピシリンを含
む１００mgＬＢ培地に、プラスミドｐＲＨ２１で形質転
換した一夜培養からの大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０１菌を接種
する。培養を３７℃でインキュベートし、細胞成長を５
７８nmでモニターする。0.5 の光学密度（５７８nm）で
培養を５００μ molＩＰＴＧに調整し、さらに３７℃で
インキュベートする。融合タンパク質の導入は時間に依
存し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析す
る。導入後、最初に排他的にＣＵＳＩ−Ｉ−β−ガラク
トシダーゼ融合タンパク質が、後にまたβ−ガラクトシ
ダーゼが形成される。

【０１００】抗−ＣＵＳＩ−Ｉ抗体との免疫反応を示す
ために、ＳＤＳゲル上で電気泳動的に分離した大腸菌粗
抽出物のタンパク質をニトロセルロースに移動させる。
融合タンパク質の特異的検出のためウエスターンブロッ
ト分析を実施例２（ａ）記載のように行なう。融合タン
パク質は次のように分離し、精製する：（３７）に従
い、ＩＰＴＧアナロゴンＴＰＥＧをＣＨ−セファローズ
に結合させる。ＣＵＳＩ−Ｉ−β−ガラクトシダーゼ融
合タンパク質を精製するために、プラスミドｐＲＨ２１
を含む種大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０１を５０μg ／mlアンピ
シリンを有する１リットルＬＢ培地中で培養し、培地を
0.５m mol ＩＰＴＧに調整することにより0.５Ａ₅₇₈ 単
位／mlの細胞密度で誘発させる。１時間後誘発相を、培
養を４℃に急冷することにより停止させる。細胞を沈降
させ（5.５ｇ重量、湿性）、溶解緩衝液（２０mM−Tris
−HCl 、 pＨ7.４、２０mM−MgCl₂ 、２０mMβ−メルカ
プトエタノール）中に懸濁させ、超音波処理により破壊
する。

【０１０１】粗抽出物を約２０mg／mlタンパク質濃度お
よび1.６mol NaClに調整し、ＴＰＥＧ−セファロース−
クロマトグラフィにかける。カラム物質を２０mM−Tris
−HCl 、 pＨ7.４、１０mMβ−メルカプトエタノール、
１０mM−MgCl₂ 、1.６M NaClで洗浄した後、ＣＵＳＩ−
Ｉ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を１００mMホ
ウ酸ナトリウム、１０mMβ−メルカプトエタノール、 p
Ｈ１０で溶離する。クロマトグラフィーはβ−ガラクト
シダーゼ活性の測定（４３）によりモニターする。１リ
ットル培養が８mgの純ＣＵＳＩ−Ｉ−β−ガラクトシダ
ーゼ（９０％）を生じた。さらに精製融合タンパク質が
また抗ＨＵＳＩ−Ｉ抗体と反応することが示された。

【０１０２】Ｃ−末端ＣＵＳＩ−Ｉドメインを開裂する
ため、そのように精製された融合タンパク質を１０％ま
たは３０％酢酸あるいは７０％ギ酸に溶解する。酸感受
性アスパラギン酸−プロリン結合の存在（ＣＵＳＩ−Ｉ
のアミノ酸配列参照）が室温で２４〜３６時間の反応後
にＣ−末端ＣＵＳＩ−Ｉドメインの４０〜６０％の除去
を生ずる。この酸処理後、この完全なＣＵＳＩ−Ｉドメ
インをＧ−７５でゲル濾過により分離し、精製すること
ができる。

【０１０３】発現Ｃ−末端ＣＵＳＩ−Ｉドメインのアミ
ノ酸配列は次のとおり読み取る： Ｐro−Ｖal−Ａsp−Ｔhr−Ｐro−Ａsn−Ｐro−Ｔhr−Ａ
rg−Ａrg−Ｌys−Ｐro−Ｇly−Ｌys−Ｃys−Ｐro−Ｖal
−Ｔhr−Ｔyr−Ｇly−Ｇln−Ｃys−Ｌeu−Ｍet−Ｌeu−
Ａsn−Ｐro−Ｐro−Ａsn−Ｐhe−Ｃys−Ｇlu−Ｍet−Ａ
sp−Ｇly−Ｇln−Ｃys−Ｌys−Ａrg−Ａsp−Ｌeu−Ｌys
−Ｃys−Ｃys−Ｍet−Ｇly−Ｍet−Ｃys−Ｇly−Ｌys−
Ｓer−Ｃys−Ｖal−Ｓer−Ｐro−Ｖal−Ｌys−Ａla−Ｏ
Ｈ。 この配列は全ＣＵＳＩ−Ｉタンパク質の位置５０〜１０
７と等しい。

【０１０４】実施例４大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０１中のＣ−末端ＣＵＳＩ−Ｉドメ
インの発現 実施例３から知見できるように、Ｃ−末端ＣＵＳＩ−Ｉ
ドメインを大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０１中にβ−ガラクトシ
ダーゼ融合タンパク質として発現できる。図１３に示さ
れるように、Ｃ−末端５９アミノ酸をエンコードするｃ
ＤＮＡを、Ｃ−末端ＣＵＳＩ−Ｉドメインを生タンパク
質として発現させるために読取り枠中にプラスミドｐＳ
Ｐ６のアルカリ性ホスファターゼ遺伝子のシグナル配列
に連結させる。プラスミドｐＳＰ６はＤＳＭに寄託番号
ＤＳＭ３９０４で寄託された。

【０１０５】プラスミドｐＲＨ１８６０、３０μg をＢ
amＨＩおよびＨinf I で開裂する。ＤＮＡフラグメント
を８％ポリアクリルアミドゲル中で分離する。Ｃ−末端
ドメインをコードする１７５bpＣＵＳＩ−Ｉ−ＤＮＡフ
ラグメントをゲルから溶離する。突出ＤＮＡ端をＤＮＡ
ポリメラーゼのクレノウフラグメントにより満たす。プ
ラントエンドを有する１８２bp二重鎖ＤＮＡ分子が得ら
れる。ベクターｐＳＰ６、３μg を制限エンドヌクレア
ーゼＨind III で開裂する。突出一重鎖ＤＮＡ端をムン
グビーンヌクレアーゼで分解し、５’−末端リン酸残基
をアルカリ性ホスファターゼで除去する。

【０１０６】そのように処理したベクター0.３pmolをＣ
−末端ＣＵＳＩ−Ｉ−ＤＮＡフラグメント１pmolで連結
する。株大腸菌Ｋ１２ＤＨ１の形質転換コンピテント
（１７）細胞を、得られた連結生成物の１／２で形質転
換する。クローンをＬＢ−Ａmp寒天平板上で選択する。
4 クローンをオリゴヌクレオチドＡＨ１２とのコロニー
ハイブリッド形成により同定する。クローンのプラスミ
ドＤＮＡは用いたプローブと相補性のＤＮＡ配列を含
む。オリゴヌクレオチドＡＨ１２はＣＵＳＩ−Ｉ−ｃＤ
ＮＡクローンのヌクレオチド配列２４１〜２５８と相補
性である。それは配列： ５′C C T G T T G A C A C C C C A A A C ３′ を有する。

【０１０７】プラスミド迅速分析並びにＤＮＡのＨind
III およびＢamＨＩによる開裂により、クローンは挿入
体として５４０bpＤＮＡフラグメントを含むと同定され
る。このＤＮＡフラグメントはプロモーター領域Ｐtac
、アルカリ性ホスファターゼの、Ｃ−末端ＣＵＳＩ−
Ｉドメインに対するｃＤＮＡ配列のシグナルペプチド配
列からなる。そのように構築されたプラスミドはｐＢＡ
１７と称される。次いでコンピテント大腸菌Ｋ１２ＪＭ
１０１細胞を構築発現プラスミドｐＢＡ１７のＤＮＡで
形質転換する。Ｃ−末端ＣＵＳＩ−Ｉドメインを発現す
るため、ＬＢ−Ａmp培地２５０mlに、得られた形質転換
細胞を接種する。次いでインキュベーションを３７℃で
行なう。

【０１０８】細胞成長を５７８nmにおける濁りの測定に
よりモニターする。0.９７の光学密度で、発現を誘発す
るためにＩＰＴＧを0.５ mＭの最終濃度に加える。１Ａ
₅₇₈単位細胞のアリコートを発現の誘発前後に種々の時
間でとり（第II表参照）、１2,０００ｇで３分間遠心分
離し、細胞沈降物を−２０℃で貯蔵する。発現生成物は
次の配列で５９個のアミノ酸を有する： Ａsp−Ｐro−Ｖal−Ａsp−Ｔhr−Ｐro−Ａsn−Ｐro−Ｔ
hr−Ａrg−Ａrg−Ｌys−Ｐro−Ｇly−Ｌys−Ｃys−Ｐro
−Ｖal−Ｔhr−Ｔyr−Ｇly−Ｇln−Ｃys−Ｌeu−Ｍet−
Ｌeu−Ａsn−Ｐro−Ｐro−Ａsn−Ｐhe−Ｃys−Ｇlu−Ｍ
et−Ａsp−Ｇly−Ｇln−Ｃys−Ｌys−Ａrg−Ａsp−Ｌeu
−Ｌys−Ｃys−Ｃys−Ｍet−Ｇly−Ｍet−Ｃys−Ｇly−
Ｌys−Ｓer−Ｃys−Ｖal−Ｓer−Ｐro−Ｖal−Ｌys−Ａ
la−ＯＨ。

【０１０９】大腸菌中に発現されたＣ−末端ＣＵＳＩ−
Ｉドメインの阻害活性試験 キモトリプシン阻害試験（３９）を実施例２記載のよう
に行なう。キモトリプシンに対する大腸菌粗抽出物の阻
害活性の増加を時間に依存してモニターする。それぞれ
の場合に大腸菌リゼイト（１００μl ）の半分を阻害活
性について試験する。結果は表IIに示される。

【０１１０】

【表２】 表 II 大腸菌中に発現されたＣ−末端ＣＵＳＩ− Ｉ−ドメインの阻害活性の測定 ─────────────────────────────── ２pmol酵素の 誘発前試料 ｍＩＵ／ｍl キモトリプシン活性 （時間） 培 養 （％） ─────────────────────────────── 2 0.６２４ ９０ 2.５ 1.８８ ７５ 3 2.００ ７７ ────────────────────────────── 誘発後（時間） １ 4.８３ ６７ ２ 6.５７ ６７ ３ 7.２４ ６７ ４ 9.５６ ６４ ５ 8.００ ６７ ６ １0.６６ ６０ ２１ １6.９６ ３７ ──────────────────────────────

【０１１１】表III にブダペスト条約に従って寄託した
微生物が示される。

【０１１２】

【表３】 表 III 微 生 物 寄託所 寄託番号 ─────────────────────────────── B. coli K12 MC1061 DSM 3631 B. coli K12 JM101 ATCC 33876 B. coli K12 DH1 ATCC 33849 B. coli K12 W6 DSM 3632 pBR322 ATCC 31344 pUC18 DSM 3424 pUR290 DSM 3417 pWH701 DSM 3633 pRK248cIts ATCC 33766 pRH31 DSM 3634 pRH34 DSM 3635 pSP6 DSM 3904 pRH1810 DSM 3905 ─────────────────────────────

【０１１３】参照文献 （1)Bodmerほか、Schweiz, med. Wschr., １４４，１３
５９〜１３６３（１９８４） （2) Lewis, D.A., Biochem. Pharmacol. ３３，１７０
５〜１７１４（１９８４） （3) Schiessler, H. ほか, Bayer Symp. V. プロティ
ナーゼインヒビターズ(Proteinase Inhibitors), (Fri
z, H., Tschesche, H., Greene, L. J. Truscheit, E.
編), pp.１４７〜１５５、Springer Verlag,. Berlin
(１９７４）

【０１１４】（4)Wallner, O, and Fritz, H., Hopper-
Seyler's Z. Physiol. Chem., ３５５，７０９〜７１１
（１９７４） （5) Fritz., H. ほか（１９７５）：プロテアーゼおよ
び生物学的制御 (Proteases and Biological Control)
(Reich, E., Rifkin, D.B., and Shaw, E.編) 、７３７
〜７６６、Cold Spring Harbor Laboratory (6) Wallner, O.ほか：生物体液のプロタイド (Protide
s of the Biological Fluids) (Peters, H.編) 、２
３，１７７〜１８２，Pergamon Press, Oxford（１９７
５） （7) Chirgwin, J.M.ほか、Biohemistry,１８，５２９
４〜５２９９（１９７９） （8) Thayer, R.E., Anal. Biochem., ９８，６０〜６
３（１９７９） （9) Wallace, R.B., ほか、Nucl. Acids Res., ９，
８７９〜８９４（１９８１）

【０１１５】（10) Clark, L. ほか, Meth. Enzymol.,
６８，４３６〜４４２（１９７９） （11) Gershoni, J.M. and Palade, G.B., Anal. Bioc
hem., １３１，１〜１５（１９８３） （12) Towbin, H. ほか、Proc. Natl. Acad. Sci., US
A,７６，４３５０〜４３５４（１９７９） （13) Gubler, U. and Hoffman, B.J., Gene, ２５，２
６３〜２６９（１９８３） （14) Volkaert, G.ほか, 分子遺伝学の進歩 (Advanced
Molecular Genetics),Springer Verlag, Berlin,２５
５〜２５７（１９８４）

【０１１６】（15) Casadaban, M.J., and Cohen, S.
N., J. Mol. Biol．１３８，１７９〜２０７（１９８
０） （16) Messing, J. ほか, Nucl. Acids Res., ９，３０
９〜３２１（１９８１） （17) Hanahan, D., J. Mol. Biol., １６６，５５７〜
５８０（１９８３） （18) McDonnell, M.W. ほか, J. Mol. Biol.,１１０，
１１９（１９７７） （19) Bailey, J.M. and Davidson, N., Anal. Bioche
m.,７０，７５〜８５（１９７６） （20) Laemmli, U.K., Nature,２２７，６８０〜６８５
（１９７０） （21) Maxam, A.M. and Gilbert, W., Meth. Emzymol.,
６５，４９９〜５８０（１９８０）

【０１１７】（22) Boliver, F. ほか、Gene. ２，９５
〜１１３（１９７７） （23) Yanish−Perron, C.ほか, Gene. ３３，１０３〜
１１９（１９８５） （24) Ruther, U., Muller−Hill, B., EMBO-J.,２，１
７９２〜１７９４（１９８３） （25) C. Gatz., TH Darmstart, Dissertation, ８９〜
９３（１９８５） （26) Bernard, H.U. ほか, Gene. ５，５９〜７６（１
９７９） （27) Maniatis, T.ほか：分子クローニング：研究室マ
ニュアル (Molecular cloning: A laboratory manual),
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbo
r, New York, １９４（１９８２）；Bonner, T.I.ほ
か，J. Mol.Biol.,８１，１２３（１９７３）

【０１１８】（28) Glisin, V.ほか, Biochemistry, １
３，２６３３（１９７４） （29) Aviv. H. and Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA,６９，１４０８（１９７２） （30) Thomas, P.S., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,７
７，５２０１（１９８０） （31) Suggs, S.V. ほか, 精製遺伝子を用いる発生生物
学 (Developmental biology using purified genes (D.
Brown編), Academic Press, New York,６８３（１９８
１）

【０１１９】（32) Mandel, M. and Higa, A., J. Mol.
Biol., ５３，１５９〜１６２（１９７０） （33) Hardies, S.C. ほか，J. Biol. Chem., ２５４，
５５２７〜５５３４（１９７９） （34) Holmes, D.S. and Quigley, M. Anal. Biochem.,
１１４，１９３〜１９７（１９８１） （35) Caruthers, M.H., 化学的および酵素的遺伝子合
成 (Chemical and Enzymatic Gene Synthesis) (H. G.
Gassen, A. Lang 編），１版、Verlag Chemie, Weinhei
m （１９８２）

【０１２０】（36) Ullmann, A., Gene.２９，２７〜３
１（１９８４） （37) Fritz, H. ほか：酵素分析法 (Methoden der en
zymatischen Analyse)(H.U. Bergmeyer 編),３版，１１
０５，Verlag Chemie, Weinheim （１９７４） （38) DelMar, B.G., ほか, Anal. Biochem., ９９，３
１６〜３２０（１９７９） （39) Pelham, R.B. and Jackson, R.J., Bur. J. Bioc
hem., ６７，２４７〜２５６（１９７６） （40) Klasen, B.C. and Kramps, J.A., Biochem. Biop
hys. Res. Comm.,１２８，２８５〜２８９（１９８５） （41) Guarents, L.ほか, Sceince,２０９，１４２８〜
１４３０（１９８０）

【０１２１】（42) Miller, J.H., 分子生物学実験 (Ex
periments in Molecular Genetics),Cold Spring Harbo
r Laboratery, Cold Spring Harbor, New York,４４３
（１９７２） （43) Ohlson, K.ほか，Hoppe-Seyler's Z. Physiol. C
hem., ３５７，１２４１〜１２４４（１９７７） （44) Hochstrasser, K., ほか，Hoppe-Seyler's Z. Ph
ysiol. Chem., ３６２，１３６９〜１３７５（１９８
１） （45) Smith, C.B. and Johnson, D.A., Biochem. J.,
２２５，４６３〜４７２（１９８５）

【０１２２】（46) Schiessler, H.ほか, ヒト多形核球
の中性プロティナーゼ（Natural Proteinases of Human
Polymorphnuclear Laukocytes) (Havemann, K. and Ja
noff. A.編），１９５〜２０７，Urban and Schwarzenb
erg, Baltimore, Munich（１９７８） （47) Fritz. H.: 壮健および疾患中のタンパク質分解
(Protein Degradationin Health and Disease), Ciba
Foundation Symposium ７５，３５１〜３７９，発行 Ex
cerpta Medica, Elsvier North Holland （１９８０） （48) Bernard, H. -U., Methods Emzymol.,６８，４８
２〜４９２（１９７９） （49) Machlleidt, W., タンパク質化学における近代的
方法 (Modern Methods in Protein Chemistry) (Tsches
che, H. 編），２６７〜３０２, Walter deGruyter, Be
rlin, New York （１９８３）

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＵＳＩ−Ｉのトリプシンフラグメントのアミ
ノ酸配列を示す図である。

【図２】プラスミドｐＲＨ３１の制限地図である。

【図３】プラスミドｐＲＨ３１のｃＤＮＡ挿入の配列化
方策を示す図式である。

【図４】プラスミドｐＲＨ３１のＣＵＳＩ−ＩのｃＤＮ
Ａフラグメントのヌクレオチド配列を示す図である。

【図５】プラスミドｐＲＨ３１のＣＵＳＩ−ＩのｃＤＮ
Ａフラグメントのヌクレオチド配列を示す図である。

【図６】プラスミドｐＲＨ３４のＣＵＳＩ−Ｉ−ｃＤＮ
Ａフラグメントのヌクレオチド配列を示す図である。

【図７】プラスミドｐＲＨ３４のＣＵＳＩ−Ｉ−ｃＤＮ
Ａフラグメントのヌクレオチド配列を示す図である。

【図８】ｐＲＨ１８０７のＰstＩ挿入の配列化方策を示
す図である。

【図９】発現ベクターｐＲＨ２４の構築図式である。

【図１０】プラスミドｐＲＨ３４の制限地図である。

【図１１】ＣＵＳＩ−Ｉインヒビターの遺伝子内重複に
対する相同アプローチを示す図である。

【図１２】β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として
部分ＣＵＳＩ−Ｉ配列の発現に対するクローニング方策
を示す図である。

【図１３】Ｃ−末端ＣＵＳＩ−Ｉドメイン（＝ＣＵＳＩ
−Ｉ第２ドメイン）の発現のための発現プラスミドｐＢ
Ａ１７の構築図式である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＡ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ ＡＣＤ Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ヴェルネル マッハライト ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン 83コーボルトストラーセ 63 (72)発明者 ウルズラー ゼーミュレル ドイツ連邦共和国 7290 フロイデンシ ュタット シュトゥムペンガルテンヴェ ーク 14

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノ酸配列： 物学的活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 アミノ酸配列： 有するタンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２記載のタンパク
   質、並びに普通の担体および（または）希釈剤および
   （または）アジュバントを含む、過剰の粘液分泌に関連
   する慢性炎症疾患ならびにそれから生ずる緊急状態、慢
   性気管支炎及び慢性頸部炎症の治療、高フィブリン分解
   による術後の出血の治療およびショックの初期治療用の
   製剤組成物。
4. 【請求項４】 スプレーまたは吸入製剤とした、請求項
   ３記載の製剤組成物。
5. 【請求項５】 アミノ酸配列： 物学的活性を有するタンパク質。