HU204888B - Process for producing dns sequences coding proteins, vectors, transformed host cells and proteins having biological effectivity of i type husi inhibitor, as well as pharmaceutical preparatives containing said agents - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás rekombináns DNS-technológia alkalmazásával emlős genomből, különösen humán genomból származó olyan DNS-szekvenciák előállítására, amelyek I típusú HUSI-inhibitor hatékonyságú fehérjéket kódolnak. A találmány ezenkívül azokra a kiónozó és expressziős vektorokra is vonatkozik, amelyek ilyen DNS-szekvenciákat tartalmaznak.

A találmány továbbá az említett vektorokkal transzformált gazdaszervezetekre is vonatkozik, valamint I típusú HUSI-inhibitor biológiai hatékonyságú fehérjék termelésére az illető transzformált gazdaszervezetek felhasználásával.

Végül a találmány azokra a fehérjékre is vonatkozik, amelyek I típusú HUSI biológiai hatékonysággal rendelkeznek és azokra a gyógyszerkészítményekre is, amelyek ilyen fehérjéket tartalmaznak.

Az élő sejtekben és szervezetekben az enzimek aktivitását elsősorban az enzimek de novo szintézise és kémiai módosulásai szabályozzák.

Ha egy sejtnek vagy szervezetnek a megváltozott környezeti tényezőkhöz való gyors alkalmazkodására és ezzel egyszerre egy specifikus enzim nagyobb aktivitására van szüksége, ez nem azt jelenti mindig, hogy éhből az enzimből de novo nagyobb mennyiség szintetizálódik, hanem gyakran egy már meglévő enzimkészlet aktiválódása következik be.

Például az emésztőenzimek (proteinázok) elraktározott formái, az ún. zimogének, aktív proteinázokká alakulnak. Ha szükséges, a véralvadási faktorok is ugyanígy, az inaktív raktározott formából biológiailag aktív formává alakulnak át.

Az elraktározott enzimek ismert aktiválási mechanizmusai a következők lehetnek: hasítás specifikus peptidázokkal, foszforiláciő proteinkinázok révén, kiszabadulás vezikulákból és a protein konformáciőjá- nak megváltozása alloszterikus ligandumok képződése révén.

Azt, hogy az említett aktiválódási reakciók ne jussanak túlsúlyba és hogy az aktivált enzimek hatása ne legyen hosszan tartó, az enzimek szabályozott lebom- ^z lása és specifikus gátlása akadályozza meg. Például az aktíváit proteinázok biológiai hatékonyságát gyakran specifikus proteináz inhibitorok blokkolják.

Az elmúlt néhány évben különböző proteináz-inhi- bitorok klinikai és patogenetikai fontosságát ismerték 4 fel (1, 2). Azt találták, hogy a lizoszomális proteinázinhibitorok a szepszis, reumás típusú krónikus betegségek és a tüdő felső légúti rendszere (upper pulmonary system) megbetegedéseinek gyógyítására alkalmasak. Jelenleg azonban nincs olyan ismert proteináz-inhibi- 5 tor, amelyet e betegségek kezelésére lehetne használni. Eddig csak az aprotonin nevű proteináz-inhibitort alkalmazták a terápiában. Az aprotomnt a hiperfibrinolízis okozta műtét utáni vérzések és a sokkállapotok korai kezelésére használják. 5:

A fent említett betegségek kezelésére a HUSI-I inhibitorok (Humán Seminalplasma Inhibitor) lennének alkalmasak. Ezek proteinek. Példák az I típusú HUSI-inhibitorcsoportból: HUSI-I, CUSI-I (Cervix-UterusSecretion Inhibitor) és BSI (Bronchial Secretion hthi- 6( bitor) proteináz-inhibitor. (Humán Seminalplasma-humán ondófolyadék; Cervix-Uterus Secretion=méhnyak-méh váladék; Bronchial Secretion-hörgőváladék.)

A HUSI-I a humán ondófolyadékban lévő savra rezisztens proteináz-inhibitor, amely gátolja a granulociták lizoszomális granuláíban lévő proteinázokat, mint például az elasztázt. Más intracelluláris vagy extracelluláris proteinázokkal ellentétben a HUSI-I igen ala0 csony gátlóhatást fejt ki. Molekulatömege körülbelül 11 000. A HUSI-I részleges aminosav-szekvenciáját Friíz közölte (48).

A HUSI-I-en kívül a humán ondófolyadékban egy további savrezisztens proteináz-inhibitor található, a 5 HUSI-H (3), amelynek molekulatömege körülbelül

6500.

A HUSI-I és a HUSI-H inhibitorspektruma egymástól teljesen különböző. Míg a HUSI-H inhibitor aktivitása a tripszinre és akrozinra korlátozódik, addig a ) HUSI-I legfigyelemreméltóbb tulajdonsága az, hogy a granulociták lizoszomális granulálnak proteázait, például az elasztázt, specifikusan inaktiválja. Biológiai aktivitásuk különbözősége miatt a HUSI-Π nem I típusú HUSI-inhibitor.

i A CUSI-I savrezisztens inhibitort a cervix-uterus (méhnyak-méh) szekrétumből izolálták (4). A CUSI-I molelkulatömege majdnem azonos a HUSI-I molekulatömegével, ezenfelül a HUSI-I és CUSI-I inhibitorspektrumok azonosak. Ouchterlony-féle immundiöüziós vizsgálatban a HUSI-I és HUSI-H keresztreakciőt ad antiHUSI-I antitesttel (5,6). Végül a HUSI-I és HUSI-Π aminosav-analízisük eredménye alapján - melyet eddig csak részleteiben ismertünk-majdnem identikusak (47).

A bronchiális szekréció inhibitorát (BSI) bronchus szekrétumból izolálták (41, 44, 45, 46). A BSI első 25 aminosavának szekvenciáját nem közölték részletesen (41). A BSI molekultömege körülbelül 10 000. Immunológiai vizsgálatokban a BSI-keresztreakciót ad a nyúl anti-HUSI-I antitestekkel (47). A BSI- savrezisztens és a következő proteinázokat gátolja: Ieukocita elasztáz, katepszin G, tripszin és kimotripszin.

Bár az I típusú HUSI-inhibitorok biológiai hatékonysága lényegében ismert volt, ezeket az inhibitorokat eddig azért nem lehetett terápiásán alkalmazni, mivel eddig nem voltak hozzáférhetők megfelelő mennyiségben és lényegében tisztán előállított formában.

A jelen találmány feladata tehát az, hogy I típusú HUSI-inhibitor biológiai hatékonyságú fejérjéket kódoló DNS-szekvenciák előállítására szolgáltasson eljárást, és hogy a DNS-szekvenciák felhasználásával biotechnológiai módszerekkel - olyan fehérjék termelése váljék lehetővé, amelyek I típusú HUSI-inhibitor biológiai hatékonyságúak.

Aproblémát a találmány úgy oldja meg, hogy emlős genomból, főként humán genomból származó olyan DNS-szekvenciákat állít elő, amelyek - lehetőleg szigorúan meghatározott körülmények között - a 4. és/vagy 5. ábra szerinti DNS-szekvenciával hibridizálnak és amelyek I típusú HUSI-inhibitor biológiai aktivitást kifejtő proteineket kódolnak.

HU 204 888 Β

A jelen találmányban az „I típusú HUSI-inhibitor biológiai hatékonyságú fehérjék” kifejezés olyan fuzionált és nem fuzionált proteinekre vonatkozik, amelyek olyan biológiai aktivitást fejtenek ki, mint a HUSI-I, CUSI-I vagy BSI-inhibitorok, azaz például a természetes fehérjék immunológiai tulajdonságaival és/vagy a természetes fehérjék specifikus gátlóhatásával rendelkeznek. Az I típusú inhibitor biológiai hatékonyságú, találmány szerinti fehérjék gátlóhatását a következőkben a kimotripszinenzim gátlásának mérésével határozzuk meg. Ami a „szigorúan meghatározott körülmények közötti hibridizáció” és a „szokásos hibridizációs körülmények” kifejezéseket illeti, lásd T. Maniatis és munkatársai kiadványát (28.a) (387-389. oldal) és Τ. I. Bonner és munkatársai közleményét (28.b). Általában a Tm-15 - Tm-30, előnyösen a Tm20 - Tm-27 a használatos (51).

Mind a fúziós proteineket, mind a nem fúziós proteineket, amelyek a HUSI-I, CUSI-I és BSI aminosav-szekvenciájából akárcsak egy részt tartalmaznak, a találmányban I típusú HUSI-inhibitor biológiai tulajdonságú fehérjéknek nevezzük. E proteinek aminosav-szekvenciájának részszakaszait „domén”-eknek is nevezik.

A jelen találmány egy előnyös megvalósítási változatában a DNS-szekvenciák olyan proteineket kódolnak, amelyek a CUSI-I proteinekre jellemző biológiai aktivitást fejtenek ki.

A jelen találmány egy másik előnybe helyezett változatában a DNS-szekvencia az 5. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú fehérjét kódolja.

A jelen találmány egy különösen előnyös kiviteli változatában a 4. és 5. ábrán bemutatott DNS-szekvenciákat a pRH31 és a pRH34 elnevezésű plazmidok tartalmazzák, PstI fragmentumok alakjában. A pRH31 és pRH34 plazmidot a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM) intézménynél helyeztük letétbe DSM 3634, illetve DSM 3635 letéti szám alatt. A pRH31 és a pRH34 plazmidok, vagy a belőlük származó fragmentumok és szintetikus oligonukleotidok próbaanyagként alkalmazhatók további olyan DNS-szekvenciák meghatározására és izolálására, amelyek I típusú HUSI-inhibitor biológiai aktivitású proteineket kódolnak, azaz például a HUSI-I-et és a BSI-t kódolják. A szakember számára ez a következtetés elfogadható, mivel a HUSI-I és BSI primer szerkezetéről meglévő adatok - bár az eddig rendelkezésre álló adatok nem teljesek - nagymértékű hasonlóságot mutatnak. Ebből következtetve, igen nagy fokú szekvencia-homológia várható DNS-szinten e két proteinnél. E nagyfokú szekvencia-homológia miatt nem lehet kizárni azt sem, hogy csupán egyetlen gén kódolja mindhárom inhibitort és hogy az egyedi inhibitorok szövetspecifikus expressziós termékek,

A jelen találmány céljaira azok a DNS-szekvenciák is megfelelnek, amelyek a fenti DNS-szekvenciák egyikével hibridizálnak, előnyösen szigorúan meghatározott körülmények között. Az említett DNS-szekvenciák, legyenek akár természetes, akár szemiszintetikus vagy szintetikus eredetűek, rokonságban vannak a fent említett DNS-szekvenciák valamelyikével mutációk, nukleotidszakaszok inszerciója vagy inverziója révén, nukleotid-szubsztitúciók, nukleotid-deléciók által és olyan fehérjéket kódolnak, amelyek I típusú HUSI-inhibitor biológiai aktivitást fejtenek ki.

A találmány tárgyát képezik továbbá a fent említett DNS-szekvenciák klónozására és expressziójára szolgáló vektorok. A találmányban a „vektor” kifejezés például a következő plazmidokra vonatkozik, mint a pBR322, _PUC18, pUR290, pWH701 és pSP6 plazmidokra vagy vírusgenomokra és ezek fragmentumaira vagy származékaira, ilyen például a lambda-fág vagy az M13 fág genomja. A jelen találmány szerinti expressziós vektorokban a jövevény DNS-szekvencia mesterségesen hozzá van kapcsolva egy expressziót szabályozó szekvenciához.

Egy előnyös kiviteli változatban az expressziós vektor a következő szekvenciájú DNS-fragmentumot tartalmazza a gén 5’ végén:

5’ AATTCGGAGGTGTCGACTATGAAGTCCAGCGG 3’ GCCTCCACAGCTGATACITCAGGTCGCC

A találmány szerinti expressziót szabályozó szekvenciák (promotor rendszer) a következők lehetnek: E.coli lac promotor, E.coli trp promotor, E.coli lipoprotein promotor, az alkalikus foszfatáz promotora, lambda-PL promotor, lambda-PR promotor, az élesztő egy expressziószabályozó szekvenciája vagy más eukarióta expressziószabályozó szekvenciák.

A jelen találmány különösen előnyösnek tartott plazmidjai a pRH31 (DSM 3634) és pRH34 (DSM 3635) plazmidok. A többi igen előnyös plazmid a következő: a pRH24, pRH21 és a pBA17 plazmid, amelyeket a pRH31, pRH34 és pRH1810 (DSM 3905) plazmidok segítségével szerkeszthetünk.

A találmány további tárgyát képezik azok a gazdaszervezetek, amelyeket a fent említett vektorokkal transzformáltunk. Előnyös gazdaszervezetek az E.coli faj törzsei, a Bacillus subtilis vagy más baktériumok, a Saccharomyces cerevisiae és más mikroszkóposán kis gombák, továbbá az állati és emberi sejtek.

Ezenfelül a találmány tárgyát képezik azok a fehérjék is, amelyek I típusú HUSI-inhibitor biológiai aktivitást fejtenek ki. Atalálmány szerinti fehérjék előnyösen CUSI-I proteinre jellemző biológiai aktivitást fejtenek ki.

Egy különösen előnyös megvalósítási változatban a CUSI-I fehérje biológiai hatékonyságával rendelkező protein aminosav- szekvenciája a következő: Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-ProGly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-MetLeu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Aso-GlyGln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-GlyMet-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-LysAla-OH.

Egy további, különösen előnyös megvalósítási változatban a CUSI-I fehérje biológiai aktivitásával rendelkező protein aminosav-szekvenciája a következő:

Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-ArgLys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys3

HU 204 888 Β

Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-GIu-MetAsp-GIy-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-CysMet-Gly-Met-Cys-GIy-Lys-Ser-Cys-Vaí-Ser-Pro-ValLys-Ala-OH.

A találmány szerinti proteinek - előnyösen - lénye- 5 gében tisztán előállított proteinek.

A találmány a továbbiakban a fent említett proteinek termelési eljárására is vonatkozik, amely magában foglalja az egyik fent említett transzformált gazdaszervezet tenyésztését valamilyen szokásos táptalajban, 10 amely adott esetben a géntermék expresszióját indukálja, továbbá az expressziős tennék izolálását a táptalajból, azaz a tenyésztett sejtből és/vagy a tápfolyadékból, ezenkívül tartalmazza az expressziós tennék további, szabályozott, részleges hidrolízist eredményező savas 15 hidrolízissel való kezelését, majd a kívánt biológiailag aktív proteinfragmentumnak a hidrolizátumból való elkülönítését gélkromatográfiával. Az így kapott protein - felhasználásától függőén - tovább tisztítható, előnyösen kromatografálással, például aőínitás-kromatográfi- 20 ával vagy HPLC-vel (high performance liquid chromatography) vagy e módszerek kombinációjával.

A találmány szerint előállított proteinek és proteinfragmentumok különösen alkalmasak krónikus bronchitis, krónikus méhnyakgyulladások, valamint más olyan 25 krónikus gyulladásos folyamatok kezelésére, amelyek bőséges nyálkakiválasztással járnak és az ezekből kialakult akut állapotok (emergency situation) kezelésére. Ezek a termékek alkalmasak még sokkos állapotok korai kezelésére és például hiperfibrinolízis okozta 30 műtét utáni vérzések kezelésére. Ennek megfelelőén, azok a gyógyszerkészítmények, amelyek I típusú HUSl-inhibitor biológiai aktivitású fehérjékből hatásos mennyiségeket tartalmaznak a szokásos hordozókkal és/vagy hígítőszerekkel és/vagy adjuvánsokkal, szintén 35 a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

Az I típusú HUSI-inhibitor biológiai hatású proteinek gyógykezelés céljára steril, izotóniás oldat formájában alkalmazhatók, intramuszkulárisan, intravénásán vagy szubkután injiciálva a gyulladásos területre vagy 40 alkalmanként infúzióban beadva. A találmány szerint előnyösek a spray vagy inhalálásra szolgáló kiszerelésben előállított gyógyszerkészítmények. Ezek különösen a légzőszervi megbetegedések kezelésére használhatók, amikor is az aktív hatóanyagot a hörgők és a 45 tüdő érintett részeire közvetlenül adagoljuk.

Az alábbiakban a szabadalom ismertetése következik.

Ha egy idegen fehérjét szintetizálni képes gazdaszervezetet kívánunk szerkeszteni, akkor számos kísér- 50 letet szükséges elvégeznünk. Először a kívánt protein bioszintézisének információját hordozó gént kell azonosítanunk és izolálunk. A gének azonosítására és izolálására különböző módszereket ismerünk.

Például: ha CUSI-I protein biológiai aktivitást kifejtő 55 proteint kódoló DNS-szekvenciát óhajtunk izolálni, először két szintetikus oligonukleotid-keveiéket kell készítenünk a HUSI-I proteinről rendelkezésre álló részleges proteinszekvencia-adatok alapján. Ezek az oligonukleotidok egy 6 aminosavat kódoló DNS-szekvenciával 60 komplementerek és gén próbaanyagként használhatók (lásd az 1. ábrát; RHI és RHH).

Mivel a CUSI-I, HUSI-I (48) és BSI (41) primer szerkezetére vonatkozóan hiányosak voltak az adatok, ennek alapján nem lehetett alkalmas oligonukleotidkeverékeket szintetizálni. Ami az aminosav-szekvenciák ismert adatait illeti, azokat tripszines fragmentumok, bróm-cián-fragmentumok vagy az aminoterminálisok kémiailag nem egységes keverékei alapján határozták meg (48). Az így kapott részleges szekvenciák több, mint 30%-os eltérést mutattak a CUSI-I protein találmány szerint meghatározott aminosav-szekvenciájától. Jól megalapozott az a nézet, hogy egy aminosavszekvenciában egyetlen pontatlanul meghatározott aminosav oda vezet, hogy az ennek az aminosav-szekvenciának az alapján készített oligonukleotid-próbaanyag működésképtelen lesz.

Az idézett közleményben (48) például az RH2 szakaszban lévő aminosav-szekvenciára a Cys-Ser-MetGly-Met-Cys-szekvenciát állapították meg, ugyanakkor a találmány szerint megállapított aminosav-szekvencia ebben a szakaszban Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys (lásd a 4. ábrát).

A találmány szerint a cDNS-gyűjteményeket a fent említett szintetikus oligonukleotíd-keverékekkel szűrtük. A cDNS-gyűjteményeket olyan mRNS segítségével létesítettük, melynek kiindulási anyaga humán méhnyakszövet volt A jelen találmány szerinti cDNS-gyűjtemény előállításához az emberi tüdő felső légúti traktusából származó szövetből (a halál után 10 órával kivett autopsziás anyag) izolált mRNS-t is fel lehet használni kiindulási anyagként (7). A donor szövetből izolált mRNS-t a szokásos módon használjuk fel a komplementer DNS (cDNS) molekulák szintetizálására, amelyeket végül a pBR322plazmid Psű helyére építünk be. Az így készített cDNS-molekulákkal gazdaszervezeteket, például E.coli K12 DH1 sejteket transzformálunk, s a sejteket a szokásos módszerrel, tetraciklintartalmú agarlemezekre széleszíjük. A CUSI-I protein biológiai aktivitású fehérjét kódoló cDNS-szekvenciát magában foglaló plazmidot tartalmazó transzformált gazdabaktérium-telepeket hibridizációs kísérletekkel az ún. telephibridizáciős módszerrel azonosítjuk. Az agarlemezeken nőtt baktériumtelepek vizsgálatához párhuzamos nitrocellulőz-szúrőket készítünk Thayer szerint (8). A duplikátum niírocellulóz-szűrőket ezután a fent említett két oligonuWeotid-keverékkel hibridizáljuk Wallace szerint (9). A pozitív telepekből a rekombináns cDNS-t tartalmazó plazmidokat izoláljuk.

A plazmidban lévő cDNS-inszertum méretét meghatározzuk és a megfelelő nagyságú inszertumot tartalmazó plazmidokat részletesen megvizsgáljuk úgy, hogy meghatározzuk a cDNS-inszertum DNS-szekvenciájáL Ennek alapján izoláltuk a pRH31 plazmidot, amelyet letétbe helyeztünk a Deutsche Sammlung fúr Mikrooiganismen intézménynél DSM 3634 letéti szám alatt.

A méhnyakszővet-minták mRNS-éből készített cDNS-gyűjtemény további szűrésével, amelyet a pRH31 plazmid DNS-szekvenciájából származtatott oligonukleotiddal végeztünk - amikor is a hibridizációnál próbaanyagként hsználtuk - a pRH34 rekombi4

HU 204 888 Β náns plazmidot izoláltuk Qásd a 4. ábrát; RH5). Ha a pRH34 rekombináns plazmid inszertumának DNSszekvenciáját meghatározzuk, láthatjuk, hogy ez a plazmid a CUSI-I fehérje teljes kódoló szakaszát magában foglalja.

A pRH34 rekombináns plazmidot letétbe helyeztük a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen intézménynél DSM 3635 letéti szám alatt.

A pRH31 és pRH34 plazmidban lévő cDNS-szekvenciák segítségével ezután expressziós vektorokat szerkesztünk. Először a pRH24 rekombináns plazmidot állítottuk elő az intermedierként szereplő rekombináns pRH1810 plazmidból. A pRH24 rekombináns expressziós plazmid a pRH34 plazmidnak azt a szakaszát tartalmazza, amely CUSI-I protein biológiai hatékonyságú fehérjét kódol és tartalmaz még egy olyan szintetizált DNS-fragmentumot, amelyben mind a Shine-Dalgamo szekvencia, mind a transzláció kezdőpontja jelen van. A pRH24 rekombináns expressziós vektorból származó expressziós termék az 5. ábrán látható összes aminosavat tartalmazza.

Ezután még a pRH21 rekombináns plazmidot szerkesztjük meg. Ebből a célból kihasítunk a pRH31 plazmidból egy Sau3A fragmentumot, amelyet beépítünk a pUR290 plazmid BamHI restrikciós helyére. Az ilyen módon szerkesztett pRH21 rekombináns expressziós plazmidból származó expressziós termék egy fuzionált protein, amelynek N-terminális vége a β-galaktozidáz aminosav-szekvenciájából áll és amelyben 59 C-terminális aminosav a CUSI-I protein utolsó 59 aminosavának felel meg (lásd az 5. ábrát). Egy 58 aminosav hosszúságú polipeptidet választunk le erről az expressziós termékről a szokásos módszerrel úgy, hogy az aszparaginsav-prolin kötést savval elhidrolizáljuk (például: a terméket 20-40 órán át 10-70%-os ecetsavval vagy hangyasavval kezeljük, előnyösen 30%-os ecetsavval vagy 70%-os hangyasavval, 10-30 ’C hőmérséklettartományban, előnyösen szobahőmérsékleten). A terméket ezt követően gélkromatográfiával tisztítjuk. Ez az 58 aminosav hosszúságú polipeptid megfelel az

5. ábrán leírt, a CUSI-I protein biológiai aktivitását kifejtő protein C-terminális doménjének.

Egy további rekombináns expressziós plazmidot is szerkesztünk, a pBA17 plazmidot. Erre a célra a pRH1810 plazmidból kihasítjuk a BamHI/HinfI fragmentumot és miután a végeit betöltöttük, bekapcsoljuk a pSP6 expressziós plazmidba ligáz segítségével. Az expressziós plazmidot úgy készítjük elő a ligázreakcióhoz, hogy HindlII-mal hasítjuk, s ezután Mungbean nukleázzal és alkalikus foszfatázzal kezeljük. A keletkezett pB A17 rekombináns expressziós plazmidból kapott expressziós tennék 59 aminosavból áll, s szekvenciája megfelel az 5. ábrán látható 59 aminosavból álló C-terminális szekvenciának. Az expreszsziós termék olyan biológiai aktivitást fejt ki, amint a CUSI-I protein.

A megfelelő transzformált gazdaszervezetek által kifejezett fent említett fehérjéket immunprecipitációval (10) vagy Western biot analízissel (11,12) mutatjuk ki. Az expressziós termékek biológiai hatékonyságának meghatározását a proteináz-kimotripszin gátlása alapján végezzük.

Az alábbiakban ismertetjük az ábrákat.

1. ábra: a természetes CUSI-I protein fragmentumainak aminosav-szekvenciáját ábrázolja. A fragmentumokat, (T1-T4), melyeket a protein tripszines hasításával állítottunk elő, HPLC-vel tisztítottuk. Azokat a szekvenciaszakaszokat, amelyekből a két szintetikus oligonukleotid-keveréket származtattuk, RH1 és RH2 elnevezéssel láttuk el. E szakaszokat aláhúztuk.

2. ábra: a pRH31 plazmid restrikciós térképét ábrázolja. A pRH31 rekombináns plazmidon a következő restrikciós helyeket tüntetjük fel: P=PstI, E=EcoRI, B=BamHI, H=HindIIL A fekete keret a cDNS-inszertumot jelzi, a körben lévő nyilak a tetraciklin-rezisztenciagént (tét¹) és a megszakított ampicillin-rezisztenciagént (amp^s) mutatják.

3. ábra: a pRH31 plazmid cDNS-inszertumának szekvenálási stratégiáját ábrázolja sematikusan. A fekete vonal a pRH31 plazmid 500 bp (bázispár) hosszú PstI fragmentumát jelenti, a fekete nyilak a mindenkori szekvenálási reakciónak felelnek meg. A fehér, üres nyíl a cDNSinszertumon a CUSI-I-et kódoló szakaszt jelzi.

4. ábra: apRH31 plazmid CUSI-I cDNS fragmentumának nukleotidszekvenciáját mutatja be. Egy kettős szálú DNS-szekvenciát látunk. A CUSI-I szekvencia nyílt leolvasási rendszere közvetlenül a cDNS-inszertum 5’-(G:C) homopolimer farka után kezdődik. A leolvasási keret 90 aminosavat kódol, s ezeket a hárombetűs kóddal jelöljük. A TGA-stopkodon után még 178 bázispár következik az ábrán.

5. ábra: a pRH34 plazmid CUSI-I cDNS fragmentumának nukleotidszekvenciáját, egy kettős szálú DNSszekvenciát, mutatja be. A DNS-szekvenciából levezetett aminosavakat a hárombetűs kóddal jelezzük. Az 59-133 helyzetű nukleotidok kódolják a CUSI-I protein szignálpeptidjét.

6. ábra: a pRH1807 plazmid (a pRH34 plazmid CUSI-I cDNS fragmentumát tartalmazza) PstI inszertumának szekvenálási stratégiáját ábrázolja. Mindegyik nyíl egy-egy szekvenálási folyamatot jelent. H-Hindm, P-PstI, B=BamHI.

7. ábra: a pRH24 expressziős vektor szerkesztésének vázlatos ábrázolása. Ez a vektor hordozza a regulálható lambda-Pi. promotor 3’ végén a CUSI-I gént.

amp^r: ampicillin-rezisztenciagén

N-CUSI-I: a CUSI-I N-tenninálisát kódoló DNS-fragmentum

C-CUSI-I: a CUSI-I C-teiminálisát kódoló DNS-fragmentum

OiJPl: a lambda-bakteriofág bal operátor és promotor szakasza

SD: Shine-Dalgamo szekvencia vagy riboszómakötő hely

A restrikciós endonukleázok rövidítései: B-BamHI, E-EcoRI, H-HindIH, Hae-HaeHI, P-PstI, Sph-SphI.

8. ábra: a pRH34 plazmid restrikciós térképét ábrázolja. A pRH34 rekombináns plazmidon az alábbi restrikciós helyeket tüntetjük fel: P-PstI, E-EcoRI,

HU 204888 Β

B=BamHI, H-HindlH, Hae=HaeHI. A fekete keret a cDNS-inszertum helyzetét jelzi, a körben lévő nyilak mutatják a tetracikhn-rezonanciagén (tét¹) helyzetét és az elbontott ampicillin-rezisztenciagént (amp^s).

9. ábra: az aminosav-szekvencia analízisekor egy érdekes körülmény merült fel: ha nem veszünk figyelembe a szekvenciában két eltolódást (a molekulában lévő mindegyik ciszteincsoport egymás fölé helyezhető) és a fehérjét két félre osztjuk és egymás fölé újuk fel az 1-54 és 55-107 pozíciójú aminosavakat. Az is megjegyzendő, hogy a ciszteincsoportokkal szomszédos aminosavak gyakran azonosak. Ere a megfigyelésre két különböző magyarázat szolgál:

1. A CUSI-I két majdnem azonos, összehajtott inhibitoraktív szegmentumból állhat, az egyik a tripszin, a másik a leukocita elasztáz vagy a kimotripszin gátlása céljára.

2. A fehérje valószínűleg egy már meglévő doménből alakult ki a genetikai kőd szintjén, s ezután a két dómén egymástól függetlenül fejlődött tovább.

10. ábra: klónozó stratégiát mutat be a részleges CUSI-I szekvenciának, mint pgalaktozidáz fúziós proteinnek a kifejeződéséhez. A fekete keret a részleges CUSI-I szekvenciákat jelöli, az üres keret a β-galaktozidázgént (lacZ) és a körben lévő nyilak a tetradklinrezisztenciagént (tét¹) vagy ampicillin-rezisztenciagént (amp¹) mutatják. P-PstI, S-Sau3A, E-EcoRI, H-HindlH, B-BamHI, p-lac promotor, o-Iac operátor.

11. ábra: a pBA17 expressziős vektor szerkesztésének vázlatos ábrázolását látjuk. A vektor a CUSI-I C-terminális doménjének (-CUSI-I második dómén) kifejeződését biztosítja.

Ampf - ampicillin-rezisztenciagén

Piac -tac promotor !

Tet^s - inaktív tetraciklin-rezisztenciagén maradék rmBTiTz - a riboszomális RNS-gének transzkripciós terminátor szignálja

12. ábra: a 4. a) példa szerinti HUSI-I meghatározás ^z elektroferogramja.

R sáv: ondófolyadékból izolált HUSI-I protein;

S sáv: molekulatömeg-markerokhelye:

borjúalbumin (66 kD), tojásalbumin (45 kD), karbonsav-anhidráz (29 kD), trip- 4 szininhrbitor (20,1 kD) és alfa-laktalbumin (14,2 kD);

l.sáv: E.coli MC1061/pRK248/pRH24-ből származó nyers extraktum-indukció előtt;

2-9. sávok: ugyanabból a tenyészetből preparált nyers 50 exíraktumok az indukció után 30 perccel (2. sáv), 1 órával (3. sáv), 2 órával (4. sáv), órával (5. sáv), 6 órával (6. sáv), 22 órával (7. sáv), 28 órával (8. sáv) és 47 órával (9. sáv). 55

A találmányban használt rövidítések jelentése:

A₅7j 578 nm-nél mért adszorbció

DTT: diíiotreitol bisz: N,N,N’,N’-metiIén-bisz-akriIamid 60

bp: bázispár
D:	dalion
DE(DEAE):	dietil-amino-etil
dscDNS:	kétszálú (dupla szálú) cDNS
dNTP:	dezoxinukIeozid-5’-trifoszfát
EDTA:	etilén-diamin-tetraecetsav
IgG:	immunglobulin G
IPTG	izopropil-3-D-tiogalakto-piranozid
32p.	32 atomtömegű foszforizotőp
rpm:	percenkénti fordulatszám (ford/perc)
3ÍS:	35 atomtömegű kénizotóp
SDS:	nátrium-dodecil-szulfát
sscDNS:	egyszálú (szimpla szálú) cDNS
TPEG:	p-amino-fenil-l-tio-P-D-galaktopira- nozid
Tris:	trisz-hidroxi-metil-amino-metán
E:	enzimaktivitás egysége
szarkozil:	N-Iauril-szarkozin

d-(³²P)-dCTP: dezoxicitidil-5’-trifoszfát, amelyben ) a-helyzetben³²P-izotóp van.

LB-táptalaj: 10 g/1 enzimmel emésztett kazein (Sigma), 5 g/1 élesztőkivonat (Sigma), 8 g/1 NaCl, pH-ja 7,5-re beállítva.

A példákban az alábbi módszereket és anyagokat ϊ használjuk. Az anyagok és módszerek egyébként megtalálhatók T. Maniatis és munkatársai kiadványában (28.a).

1. Enzimek

A restrikciós endonukleázok [Bethesda Research ¹ Laboratory (BRL)], a T4-DNS-ligáz (Boehringer Mannheim), a T4-polinukleotidkináz (Boehringer Mannheim) és a Mung bean nukleáz (Pharmacia) a kereskedelemben kaphatók és felhasználásuk a gyártó cégek előírásai szerint történik. A terminális dezoxinukleotid- transzferázt (BRL) a 7. pontban leírt módon használjuk. Az E.coli DNS-polimerázt (BRL), s ribonunkleáz H-t (BRL), továbbá az AMV reverz transzkriptázt (Life Science) Gubler és Hoffman (13) szerint alkalmazzuk. Az E.coli DNS-polimeráz-I-et (Klenowffagment; Boehringer Mannheim) úgy használjuk, ahogy azt Volkaert és munkatársai leírták (14).

2. Mikroorganizmusok

A Gram-negatív és Gram-pozitív törzseket, például az E.colit és a Bacillus subtilist, egyaránt fel lehet használni CUSI-I biológiai aktivitást kifejtő fehérjéknek mikroorganizmusokban való kifejezésére.

Az eukariótáknak, azaz például a Saccharomyces cerevisiae-nek vagy az emlős sejteknek megfelelő expressziós rendszerek ugyancsak felhasználhatók olyan megfelelő vektorokkal, amelyek egy CUSI-I biológiai hatékonyságú protein strukturális génjét tartalmazzák.

A találmány szerint az E.coli K12 MC1061 15 törzset (letétbe helyezve DSM 3631 letéti szám alatt) a teljes természetes CUSI-I protein direkt kifejezésére használjuk. A törzs genotípusa a következőképpen definiálható: araD139, Δ (ara, leu) 7697, Δ lacX74, galU, galk', hsr, hsm⁺, strA.

A jelen találmány szerint az E.coli K12 JM101 törzset (letétbe helyezve az American Type Culture Col6

HU 204 888 B lection intézményben ATCC 33876 letéti szám alatt) a β-galaktozidáz és a CUSI-I protein C-terminális doménje alkotta fúziós protein kifejezésére használjuk. A törzs genotípusa a következőképpen jellemezhető: Δ (lac, pro), thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR', F’tra D36, pro AB, laclq, ΖΔΜ15. Szintetikus cDNS beépítése után kapott rekombináns plazmidok izolálására [vö. az 1. c) példával is] az E.coli K12 DH1 törzset (letétbe helyeztve ATCC 33849 letéti szám alatt) használjuk (17). A törzs genotípusa a következőképpen definiálható: P, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17 (ri, mi), supE44, relAl.

Plazmidok és újonnan szerkesztett olyan rekombináns plazmidok izolálása céljából, amelyek a lambdafág Pl promotorát tartalmazzák, az E.coli K12 W6 vad típusú baktériumokat először transzformáljuk (28.a; 249-255. old.). Ezekben a gazdabaktériumokban a lambda-PL promotort állandóan blokkolt állapotban tartja egy hőmérsékletrezisztens lambda-processzor. Az E.coli K12 W6 vad típus törzset letétbe helyeztük a Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen intézménynél DSM 3632 letéti szám alatt.

3. Vektorok

Az E.coli baktériumok transzformálására az alábbi ismert plazmidokat használjuk. Néhány közülük a kereskedelemben is kapható.

pBR322 [ATCC 31344 (23), Pharmacia, Freiburg] pUC18 [letétbe helyezve DSM 3424 letéti szám alatt (24), Pharmacia, Freiburg] pUR290 [DSM 3417 (25)] pWH701 [DSM 3633 (26)] pRK248 clts E.coli K12 JMB9 sejtben [ATCC 33766 (27,49)] pSP6 (DSM 3904) pRH1810 (DSM 3905)

Az ezen szakterületet ismerő szakemberek előtt további olyan megfelelő vektorok is ismeretesek, amelyeket fel lehet használni a találmány szerint az általuk ugyancsak jól ismert gazdaszervezetekben.

4. Gélelektroforézis

A DNS-molekula hosszától függően agaróz- vagy poliakrilamid-géleket használunk a DNS-fragmentumok elválasztására. A >800 bp nagyságú DNS-fragmentumokat 1-1,2%-os agarózgélben, TAE-pufferben [40 mM triszacetát (pH=8,3), 2 mM EDTA], a <800 bp nagyságú DNS-fragmentumokat 5%-os poliakrilamidgélben (akrilamid:biszakrilamid-19:l), TBE-pufferben [60 mM triszbázis, 60 mM bórsav, 1 mM EDTA (pH-8,3)] választjuk el. A cDNS elválasztásához denaturáló agaróz-gélelektroforézist végzünk, például 1,2%-os alkalikus agarózgélben, McDonnell és munkatársai szerint (19).

A mRNS elektroforetikus elválasztása 1,4%-os agarózgél és 15 mM metil-merkuri-hidroxid használatával történik. A mintákat elektroforetizáljuk és Bailey és munkatársai módszere (20) szerint denaturáljuk. A proteinek elválasztása SDS-poliakrilamid-gélekben, Laemmli (21) módszerével történik.

5. Gélelúciós módszerek

A <1000 bp nagyságú DNS-fragmentumok preparatív elválasztását 5%-os poliakrilamid-gélekben végezzük. A fragmentumok kioldása Maxam és Gilbert (22) szerint történik. Az ilyen módon izolált fragmentumokat használjuk szubklónozáshoz, illetve szekvenciaanalízishez.

6. RNS-izolálás

Az emberi szövet össz-RNS-tartalmát Maniatis és munkatársai (28) módszere szerint izoláljuk. Az összRNS kivonása után CsCl-gradiens centrifiigálás következik, amikor is elkülönül a DNS (29). Ekkor 3 ml 5,7 M CsCl és 100 mM EDTA-tartalmú oldatot mérünk Beckman-SW27 centrifuga 16 ml-es centrifuga csövébe, fölé rétegezünk 4 ml RNS-oldatot [3-4 mg nukleinsav 1%-os N-laurin-szarkozinban, 5 mM trisz-HCl (pH=7,5), 1 mM EDTA, 4 g/4 ml CsCl], majd 17 órán át centrifugáljuk 15 ’C-on, 17 000 ford/perc mellett, Beckman-SW-27 rotorban. Az RNS-üledéket TE-pufferben [10 mM trisz-HCl (pH=8,0), 1 mM EDTA] reszuszpendáljuk, etanollal kicsapjuk, majd oligo(dT)cellulózon (9-es típus, Pharmacia, Freiburg) kromatografáljuk a poli(A⁺)-mRNS feldúsítása érdekében, Aviv és Leder (30) szerint. Az eluátumból etanollal csapjuk ki a mRNS-t, majd 70%-os alkoholban, -70 ’C-on tartjuk el. Az izolált mRNS működőképességét in vitro transzlációval, nyúl retikulocita lizátumban (lásd a 16. pontot) ellenőrizhetjük vagy denaturáló gélelektroforézissel. Az ilyen módon izolált mRNS-t használjuk ezután a cDNS szintéziséhez és a Northern biot analízishez.

7. cDNS-szintézis

A komplementer szimpla szálú vagy dupla szálú DNS-t Gubler és munkatársai (13) szerint szintetizáljuk. A szintézis kitermelését a-³²P-dCTP beépítéssel vizsgáljuk, míg a kapott cDNS-molekulák hosszát 1,2%-os alkalikus agarózgélben, radioaktív jelzett standard DNS-molekulák segítségével határozzuk meg. A cDNS 3’ végeit oligo-(dC) homopolimer farkakkal látjuk el, összesen 40 pl reakcióelegyben a következő feltételek mellett: az elegy 100 mM kálium-kakodilátot (pH=7,2), 10 mM kobalt-kloridot, 1 mM DTT-t, 500 μΜ cCTP-t, 1-2 mg/ml cDNS-t és 600 E/ml terminális dezoxinukleotid-transzferázt tartalmaz. A reakcióelegyet 50 percig 20 °C-on Ínkubáljuk és a reakciót EDTA hozzáadásával (20 mM végkoncentrációig) állítjuk le. Az elegyhez 0,3 M nátrium-acetátot adunk és a cDNS-t etanollal kicsapjuk. A cDNS-precipitátumot TE-pufferben [10 mM trisz-HCl (pH-8,0), 1 mM EDTA] szuszpendáljuk, majd Pstl-gyel hasított, 3 ’-oligo(dG) farokkal ellátott pBR322 plazmiddal hibridizáljuk. A reakcióelegy 100 mM NaCl-ot, 10 mM triszHCl-ot (pH-7,8), 0,1 mM EDTA-t 0,1-0,3 ng/μΐ plazmid DNS-t tartalmaz. Ezt a hibridizálandó keveréket egymás után 5 percig 65 ’C-on, 45 percig 56 ’C-on, 45 percig 43 ’C-on és 15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután az elegyet közvetlenül használjuk fel transzformáláshoz (lásd a 9. pontot).

HU 204888 Β

8. Northern biot analízis

Az RNS-t denaturáló gélelektroforézisnek vetjük alá, majd nitrocellulóz-szűrokre visszük át Thomas (31) szerint Előhibridizálást és hibridizálást végzünk 5’-jelzett oligonukleotidokkal a 9. pontban (vő. a 11. 5 ponttal is) leírt módon. Hibridizáció után a nem specifikusan kötött oligonukleotidokat mosással távolíthatjuk el a nitrocellulőz-szűrókről például úgy, hogy a szűrőket 15 percig mossuk szobahőmérsékleten és 3 percig 2 ’C-on - az olvadáspont alatt - SSC-pufferben 10 (900 mM NaCl, 90 mM nátrium-citrát, pH=7,0). Az olvadási hőmérséklet Suggs és munkatársai szerint számítjuk ki (32).

9. E.coli transzformálása és a plazmidok izolálása

E.coli K12 DH1 kompetens sejteket készítünk elő

Hanshan (17) szerint (lásd az 1. c) példát), s a sejteket de novo szintetizált cDNS-t tartalmazó rekombináns plazmidokkal transzformáljuk. Az E.coli K12 JM101,

W6 és MC1061 törzseket Mandel és Higa (33) szerint transzformáljuk.

A plazmid DNS-t egy liter tenyészetből izoláljuk, Hardies és munkatársai (34) által leírt módszerrel. A plazmidok gyors vizsgálatát Holmes és munkatársai (35) szerint végezzük el.

10. Oligonukleotid-szintetizálás

Oligonukleotidokat foszfoamidit módszerrel (36) szintetizálunk. Az oligonukleotidokat például reverz fázisú kromatográfiával, Shandon-Hypersil ODS® (szemcsenagyság 5 pm, oszlopméret.· 4,6*250 mm) használatával tisztítjuk. A tritilcsoportot 80%-os ecetsavval távolítjuk el, ezután a terméket a már említett töltettel ellátott oszlopon kromatografáljuk, majd az 5’ végek jelzése után 20%-os poliakrilamid-gélben analizáljuk (lásd a 11. pontot). Eszerint a módszer szerint két oligonukleotid-keveréket szintetizálunk, nevezetesen az RH1 és RH2 keveréket. Mindkét oligonukleotid-keveréket próbaanyagként használjuk. A két keverékben lévő oligonukleotid-molekulák szekvenciáját a HUSI-I protein tripszines fragmentumainak (lásd az 1. ábrát) megfelelő amínosav-szekvenciákból származtattuk. E fragmentumok aminosav-szekvenciáját W. Machleidt (50) módszere szerint határoztuk meg. Kizárólag úgy vált lehetségessé a találmány szerinti oligonukleotid-keverékek előállítása, hogy számos tripszines fragmentum és számos bróm-cián-fragmentum alanlízise alapján pontosan megismertük a HUSI-I szekvenciákat.

Az olígonukleotid-keverékek, az ún. „kevert próbaanyagok” olyan oligonukleotidok keveréke, amelyek meghatározott pozíciókban különböznek egymástól, a genetikai kód megváltozásának következtében (9). A szokásos „kevert próbaanyagok” hátrányait úgy küszöböljük ki, hogy az oligonukleotidokat nagymértékben tisztítjuk HPLC-vel és kvantitatív ³²P-foszforilálás segítségével. Az RH1 oligonukleotid-keverék a CUSI-I protein T2 tripszines fragmentuma aminosav szekvenciájának felel meg (1. ábra). Tehát az oligonukleotidkeverék 16 különböző oligonukleotidból áll, s ezek mindegyike 17 bázis hosszú. A szekvenciák a következők:

3’AAGACGCTTTACCTGCC5’

A A C A

Az RH2 oligonukleotid-keverék a HUSI-I protein T3 tripszines fragmentuma aminosav szekvenciájának felel meg (1. ábra). így ez az oligonukleotid-keverék 32 különböző oligonukleotidot foglal magában, s mindegyik 17 bázis hosszú. Szekvenciáik a következők:

3’ACAACATACCCATACAC5’

G G G

C T

11. A DNS radioaktív jelzése A kémiai úton szintetizált oligonukleotidok és a kétszálú defoszforilált DNS-fragmentumok foszforilálása T4-polinukIeotid-kináz-enzim segítségével történik, 2050 pl reakciótérfogatban [50 mM trisz-HCl (pH-9,5), 20 mM MgCfe,1 mM ED1A, 10-20 pmól 5’-OH végű szubsztrátum, 8 pl γ-³²Ρ-ΑΤΡ (-8000 Ci/mmól), 0(2 E/pl » T4-polinukleotid-kináz]. Ezután a nem konvertált γ- ³²PATP-t preparatív gélelektroforézissel választjuk el, majd a gél eluálása következik és ioncserélő kromatográfia DE-52 diamino-dietil cellulózon (Whatman). A restrikciós DNS-fragmentumok túlnyomó 5’ végeit az E.coli DNS-polimeráz-I Klenow-fragmentje segítségével tölthetjük be komplementer cc-³²P-dezoxiribonukleozid-trifoszfátok jelenlétében, Volkaert és munkatársai szerint (14). A be nem épült a-³²P-dNIP-ket Sephadex G50-nel való gélkromatográfíával választjuk el és a kioldott frakciókat alacsony nyomáson koncentráljuk.

12. DNS-szekvenciaanalízis

A DNS-molekulák szekvenciáját Maxam és Gilbert szerint (22) határozzuk meg.

13. A β-galaktozidázfáziósproteinek tisztítása

A CUSI-I-P-galaktozidáz fúziós proteint affinitáskromatográfiával tisztítjuk Ullmann szerint (37).

14. A proteinek átvitele nitrocellulóz-szűrőkre

Az SDS-poliakrilamid-gélekben elválasztott fehérjéket Towbin és munkatársai szerint (12) visszük át nitrocellulóz-szűrőkre.

15. CUSI-I gátlást tesztek

CUSI-I biológiai aktivitású fehérjék hatékonyságát úgy vizsgáljuk, hogy mérjük a tripszin (38) vagy a kimotripszin (39) gátlást.

16. A mRNS sejtmentes transzlációja

A mRNS sejtmentes transzlációját Pelham és munkatársai (40) szerint végezzük retikulocita lizátumban, amikor is radioaktív jelzett aminosav gyanánt ³⁵S-metinnint (specifikus aktivitása 1200 Ci/mmól) használunk.

HU 204 888· Β

A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg, azonban a találmány oltalmi körét nem korlátozzuk a példákra.

l.példa

Részleges CUSI-I proteinspecifikus cDNS-klón klónozása és azonosítása

a) A mRNS izolálása és vizsgálata

Az össz-RNS-t vagy mRNS-t emberi méhnyakszövetből (biopsziás anyag) izoláljuk a 6. pontban fent leírt módon. Körülbelül 1,6-2,2 mg össz-RNS-t kapunk 14-17 g cervix szövetből. Ezután oligo(dT)-cellulózon (9-es típus; Pharmacia) való affinitás- kromatográfiával feldúsítjuk a poli(A⁺)-mRNS-t, s így 20-25 pg mRNS-t kapunk az össz-RNS 1 mg-jából. Ez körülbelül 2,0-25%-os mRNS-kihozatalnak felel meg. Egy denaturáló agarózgélben végzett elektroforetikus vizsgálat azt mutatta, hogy az RNS nem degradálódott az izolálás folyamán. Ugyancsak ennek megfelelő eredményeket kapunk az össz-mRNS és poli(A⁺)-mRNS nyúl retikulocita lizátumban való in vitro transzlációjánál.

b) Az izolált mRNS Northern biot analízise szintetikus oligonukleotiddal, CUSI-I proteinspecifikus szekvenciák kimutatására

A Northern biot analízist abból a célból végeztük el, hogy specifikus mRNS-szekvenciákat azonosítunk az izolált cervix mRNS-ben (méhnyak mRNS). Hibridizációs próbaanyagként az RH1 oligonukleotid-keveréket használtunk, amely a Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly aminosavakat (lásd az 1. ábrát) kódoló mRNS-sel komplementer. A hibridizálással kapott nitrocellulóz-szűrő röntgenfilmre (Kodak X-O-mat-AR) való exponálásánál pozitív jelet észleltünk.

Az RH2 oligonukleotid-keverékkel nem kaptunk pozitív jelet, holott az ebben a keverékben lévő egyik oligonukleotid-szekvencia bizonyult később (szekvenálás után) a megfelelő szekvenciának.

Amikor a hibridizáló mRNS-fajták molekulanagyságát denaturáló gélben standard DNS-molekulákkal hasonlítottuk össze, azt találtuk, hogy a hibridizáló mRNS hossza körülbelül 650-800 bázis.

c) cDNS-gyűjtemény készítése a pBR.322 plazmiddal

A cDNS-szintézis kiindulási anyagául 4-6 pg poli(A⁺)-RNS-t használunk. Az egyszálú cDNS kitermelése mintegy 280 ng (körülbelül 7%) volt. A szintetizálódott egyszálú cDNS-molekulák hossza körülbelül 400-2500 nukleotid volt. A szimpla szálú cDNS 280 ng-jából körülbelül 270 ng dupla szálú cDNS-t kapunk a második szál szintetizálásakor. Tehát a dupla szál szintetizálásánál a kitermelés körülbelül 50%. A cDNS-molekulák 3’ végeire homopolimer (dC)szakaszokat építünk. Az így kapott cDNS-molekulákat olyan molekulákkal hibridizáljuk, amelyeket úgy kaptunk, hogy a pBR322 plazmidot Pstl-gyel hasítottuk, majd a 3’ végeket homopolimer (dG)-farkakkal láttuk el. Ezt az addíciós terméket használjuk E.coli K12 DH1 sejtek transzformálására. Ezután a transzformált sejteket tetraciklin-rezisztencia és ampicillinérzékenység szempontjából szelektáljuk. A felhasznált cDNS 1 ng-jára 120 transzformált sejt (12 000 transzformált sejt/100 ng dupla szálú cDNS) esik. A tetraciklin-rezisztens és ampicillinérzékeny transzformált sejtek vagy telepek aránya mintegy 80%. A transzformált sejteket, mint alaptenyészeteket, mikrotitráló lemezekre (98 tartályos lemezekre) visszük [táptalaj: LB-táptalaj, 10 g/1 enzimmel emésztett kazein (Sigma), 8 g/1 NaCl, pH=7,5, 5 g/1 élesztőkivonat (Sigma), 20 pg/ml tetraciklin, 20% glicerin] és a lemezeket -20 °C-on tároljuk.

d) Rekombináns plazmid azonosítása egy CUSI-I proteinspecifikus cDNS-sel

A fent leírtak szerint kapott 6000 transzformált sejtnél telephibridizációs vizsgálatot végeztünk az RH1 oligonukleotid-keveiék felhasználásával. Az oligonukleotidkeverék aktivitása a hibridizációs reakciótérfogatban körülbelül 1·10⁶ beütés/perc, 0,8 pCi/pmól specifikus aktivitás mellett. A hibridizációnál kapott szűrőket röntgenfilmre exponáljuk 12 órán át -70 °C-on, erősítőszűrők jelenlétében. Pozitív jelet észleltünk a megfelelően transzformált sejteknél (28.a; 309-328. old.).

A megfelelően transzformált sejtek alaptenyészeteiből kiindulva, a pRH31 elnevezésű plazmidot 0,5 liter tenyészetből [LB-táptalaj, 10 g/1 enzimmel emésztett kazein (Sigma), 10 g/1 NaCl, 5 g/1 élesztőkivonat (Sigma), pH-7,5, 20 pg/ml tetraciklin] állítottuk elő. A PstI, EcoRI, BamHI és HindlH restrikciós endonukleázok használatával elkészítettük az izolált pRH31 rekombináns plazmid restrikciós térképét (lásd a 2. ábrát). A cDNS-inszertum hossza 500 bp (lásd a 2. ábrát).

A pRH31 plazmidot letétbe helyeztük a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen intézményben, DSM 3634 letéti szám alatt.

e) A pRH31 plazmid cDNS-inszertumának szekvenciaanalízise

A Maxam és Gilbert (22) szerinti szekvenáláshoz a pRH31 plazmid PstI fragmentumát (500 bp) beklónoztuk a pUC18 plazmidba. Ebből a célból a pRH31 DNS-ének 10 pg-ját 30 E PstI restrikciós endonukleázzal hasítjuk, preparatív elválasztást végzünk agarózgélben és a kapott 500 bp fragmentumot a gélből kioldjuk. Emellett a pUC18 plazmid DNS-ének 10 pg-ját PstI restrikciós endonukleázzal hasítjuk, defoszforiláljuk, fenollal és dietiléterrel extraháljuk, végül etanollal kicsapjuk egy 0,3 M nátrium-acetátot tartalmazó oldatból. Ezt követi a T4DNS-ligáz reakció, amelyhez 0,2 pmól plazmid DNS-t és 0,4 pmól PstI fragmentumot használunk fel. Az itt kapott rekombináns DNS-molekulákat használjuk az E.coli K12 JM101 sejtek transzformálásához. Ampicillintartalmú LB-lemezeken (10 g/1 kazein, 8 g/1 NaCl, 5 g/1 élsztőkivonat, 100 pg/ml ampicillin) végezzük a szelektálást. Az ampicillin-rezisztens transzformált sejtekben lévő rekombináns plazmidokat gyors plazmid analízissel (28.a; 365-370. old.) vizsgáljuk. A kapott pRH181 és pRH182 rekombináns plazmidok a pRH31 PstI fragmentumát az ellenkező orientációban tartalmazták. A 3. ábrán bemutatott szekvenálási stratégia ezeknek a plazmidoknak a

I

HU 204888 Β szerkezetéből következett, s ezek csak, mint kisegítő szerkezetek szerepelnek a DNS-szekvenálás megkönnyítésében.

A pRH31 plazmid 500 bp hosszú nukleotidszekvenciáját, melyet a szekvenálással (22) határoztunk meg, a 5 4. ábra ábrázolja. A szekvencia 5’ vége 20 (dG)-csoporttal indul. Ezt követi egy nyílt leolvasási keret, mely 273 bp-ra terjed ki (a 4. ábrán a 25-297 pozíciók). Ez a nyílt leolvasási rendszer 90 aminosavat kódol és a TGA-stopkodonnal végződik (lásd a 4. ábrát). A nukle- 10 otidszekvenciából látható, hogy az RH1 oligonukleotid-keverék oligonukleotidjai a nukleotidszekvencia 208-224 pozícióival komplementer és hogy az RH2 oligonukleotid-keverék oligonukleotidjai a nukleotidszekvencia 247-263 pozícióival komplementer. 15

ATGA-stopkodont további 178 bp követi.

A nukleotidszekvencia analízise azt mutatja, hogy az a szakasz, amely a CUSI-I fehérje N-terminális szegmentumát kódolja, nincs benne a nukleotidszekvenciában. 20

2. példa

A teljes CUSI-I proteint kódoló cDNS-fragmentumot tartalmazó rekombínáns plazmid izolálása 25

a) Az RH5 oligonukleotid szintézise A CUSI-I proteint kódoló teljes szakaszt magában foglaló cDNS-fragmentum izolálása céljából foszfamidit módszerrel (36) szintetizáljuk az RH5 oligonukleotidot. Az RH5 oligonukleotid hossza 20 bázis és a 4. 30 ábrán látható kódoló DNS-szál 31-50 pozícióval komplementer. Az oligonukleotid szekvenciája a kővetkező:

5’CACTCAGGTTTCTTGTATCT3’ 35

A RH5 oligonukleotidot radioaktív jelezzük és mint prőbaanyagot használjuk arra, hogy egy új cDNS-gyújteményben olyan rekombináns plazmidokat tartalmazó transzformált sejteket azonosítsunk, amelyekben a 40 cDNS-fragmentumok 5’ végein legalább is a pRH31 plazmid 5’-teimináIÍs szakasza található.

b) A CUSI-I protein teljes kódoló szdkaszát tartalmazó rekombináns plazmidot magában. 45 foglaló új cDNS-géntár előállítása

Ahhoz, hogy E.coliban a pBR322 plazmid segítségével új cDNS-gyújteményt létesítsünk, a CUSI-I fehérjét kódoló mRNS-t kell izolálnunk. Erre a célra humán cervix szövetből 250 gg össz-RNS-t izolálunk 50 elektroforézissel, a molekulaméretek alapján, 1,4%os denaturáló, alacsony dermedéspontú (Low Melting Pont-LMP) agarőzgélben, amely 15 mM metil-merkuri-hidroxidot tartalmaz (lásd a 4. pontot). A gélből körülbelül 10 gg 700-850 bázishosszúságú mRNS-t 55 izolálunk extrahálással. A kapott mRNS 4 gg-ját használjuk fel a cDNS szintéziséhez (lásd a 7. pontot), amelyet E.coli K12 DHI sejtekbe juttatunk be (lásd a 9. pontot). Ekkor 4300 transzformált sejtet kaptunk, 53 mg dupla szálú cDNS-sel. A transzfor- 60 máit sejteket telephibridizációs módszerrel vizsgáljuk az 5’-jelzett RH5 oligonukleotid segítségével [lásd a 2. a) példát]. Ahibridizálő oldatban lévő oligonukleotid aktivitása 240⁵ beütés ml-enként, specifikus aktivitása 0,72 gCi/pmól. Itt 12 olyan transzformált sejtet izoláltunk, amelyekben a rekombináns plazmidok az RH5 oligonukleotiddal hibridizáltak. A transzformált sejtek tenyészeteinek alikvot részéből izoláltuk a rekombináns plazmidokat és elkészítettük restrikciós térképüket Pstl-gyel, BamHT-gyel és HindlII-mal való hasítás alapján. Azt találtuk, hogy a plazmidok közül 11-nek a restrikciós képe majdnem azonos volt a pRH31 plazmádéval, azaz mindegyik tartalmazott egy 380 bp és egy 125 bp BamHEPstl fragmentumot, valamint egy körülbelül 290 bp és egy körülbelül 200 bp Hindin/Pstl fragmentumot A PstI fragmentumok hossza minden esetben 500 bp volt. Csak egyetlen plazmidnak különbözött a restrikciós térképe, azaz ez egy 285 bp és egy 275 bp BamHPPstl fragmentumot, valamint egy körülbelül 450 bp és egy körülbelül 105 bp HindlH/Pstl fragmentumot tartalmazott. Az eltérő rekombináns plazmidban lévő inszertum hossza mintegy 550 bp volt Ezt a rekombináns plazmidot pRH34 elnevezéssel láttuk el, s restrikciós térképét a 8. ábrán mutatjuk be. A pRH34 plazmidot letétbe helyeztük a Deutsche Sammlung fürMikroorganismen intézményben DSM 3635 letéti szám alatt.

c)ApRH34 rekombináns plazmid inszertumának nuldeotidszekvenciája

A pRH3 4-ből a PstI cDNS-fragmentumot és a pRH34 mindkét BamHI/Pstl fragmentumát beklőnozzuk a pUC18 plazmid DNS-ébe, miután e DNS-t Pstlgyel vagy Pstl-gyel és BamHI-gyel hasítottuk és alkalikus foszfatázzal kezeltük. Az így szerkesztett rekombináns plazmidokat - melyek csupán kisegítő szerkezetekként szolgálnak a DNS-szekvenáláshoz - a következőképpen neveztük el: pRH1807 (PstI fragmentum), pRH1808 (N-terminális BamHI/Pstl fragmentum) és pRH1809 (C-teiminális BamHt/Pstl fragmentum). A beklónozott DNS-fragmentum szekvenciáját Maxam és Giibert (22) szerint analizáltuk. A rekombináns plazmid szekvenálási stratégiája a 6. ábrán látható.

A pRH34 cDNS-fragmentumának nukleotidszekvenciáját az 5. ábra mutatja be. Ez a szekvencia a pRH31 cDNS-inszertumából a 25-308 pozíciók szekvenciájával azonos (lásd a 4. ábrát). Azonban a pRH34 cDNS-inszertuma 184 bp-ral hosszabb 5’ végén, amelyből 143 bp megfelel a mRNS-sel komplementer szekvenciának és 41 bp a cDNS dCTP-t tartalmazó homopolimer farkából származik, s magában foglalja a Pstr restrikciós helyet +1

Megállapítottuk, hogy a Ser-Gly-Lys-Ser-Phe aminosavak a HUSI-I inhibitor N-terminális végét alkotják. Ha az izolált DNS-szekvencia 5’-terminális nukleotidjaiból következtetjük az aminosav-kodonokat, a leolvasási keretnek ezen a részén nem találtunk stopkodont A leolvasási keretben megjelenő ATG felelős az

HU 204 888 Β iniciációért és a CUSI-I protein kezdetét kódolja. Tudjuk, hogy a szekretoros proteinek szignálpeptid szerkezetei ritkán hosszabbak, mint 25 aminosav, ezenkívül a szignálpeptidek és a megfelelő természetes fehérjék közti restrikciós helyek igen gyakran találhatók az alanin, szerin és glicin aminosavak mögött; tehát a GlySer pár eléggé gyakori.

A humán méhnyakszekrétum CUSI-I fehérjéjének primer szerkezete tehát 107 aminosavból áll. A meghatározott nukleotidszekvencia által kódolt aminosavszekvenica alapjában véve azonos a bronchus antileukproteázának N-terminális aminosav-szekvenciájával, s ez a találmányt megelőzően csak részben volt ismeretes (41).

3. példa

A CUSI-I fehérje kifejeződése E.coliban a) Expressziós plazmid szerkesztése, amely - a szabályozható lambda-P\. promotor alatt magában foglalja a teljes CUSI-I cDNS-t Legelőször két szintetikus oligonukleotidot szintetizálunk, amelyeknek RH6 és RH7 elneveztést adunk. Ezek az oligonukleotidok egymással komplementerek, az optimális riboszómakötéshez megfelelő szekvenciákat hordoznak (42), továbbá egy Sáli és EcoRI restrikciós helyet, valamint a CUSI-I kódoló szakaszának nukleotidszekvenciájából az 1-14 pozíciókat tartalmazzák. Mindkét oligonukleotid 5'-terminálisát foszforiláljuk T4-polinukleotid-kináz-enzim segítségével, preparatív elektroforézissel választjuk el őket 12%-os poliakrilamid-gélben és a gélből való eluálás után DE52-vel kromatografálunk. Ezután Sephadex G50-en kromatografálunk, majd mindegyik oligonukleotidból 10-10 pmólt összekeverünk, 90 ’C-on denaturáljuk és lassan szobahőmérsékletre hűtve a keveréket, egymással hibridizáljuk. Ilyen módon a következő dupla szálú DNS-fragmentumhoz jutunk:

MetLysSerSer 10 20

RH6 5’ AATTCGGAGGTGTCGACTATGAAGT30

CCAGCGG3’

RH7 GCCTCCACAGCTGATACTTCAGGTCGCC

EcoRI SD Sáli HaelII

A második komponens a pRH34 plazmidból izolált 210 bp hoszú (HaelH/BamHI) fragmentum, amely a további N-terminális szakaszt kódolja. Előállításához a pRH34 plazmid 10 gg-ját a HaelII és a BamHI restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, majd 5%-os poliakrilamid-gélelektroforézissel elválasztást végzünk. Ezután a 210 bp fragmentumot a poliakrilamid-gélból kioldjuk.

A harmadik komponens a pRH1807 plazmid (6. ábra), mely vektorként is szolgál (7. ábra). Erre a célra e plazmidból 10 pg-ot EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel hasítunk. A vektorfragmentumot alkalikus foszfatázzal kezeljük, majd fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A három komponens összekapcsolása úgy történik (7. ábra), hogy az egymással hibridizált szintetikus oligonukleotidokból 1 pmólt, az N-terminális HaelH-BamHI fragmentumból 0,2 pmólt és a vektor DNS-ből 0,03 pmólt összekeverünk és összekapcsolásuk 30 pl reakciótérfogatban történik 5 egység T4DNS-ligázzal. Transzformáláshoz az E.coli K12 JM101 törzset használjuk.

A transzformált sejtek plazmidjait a radioaktív jelzett RH6 oligonukleotiddal való hibridizálással szűrjük. Ezenkívül vizsgálunk a Sáli, EcoRI és BamHI restrikciós helyek jelenlétére és meghatározzuk a megfelelő fragmentumok hosszát. A megfelelő újonnan szerkesztett plazmidot pRH1810-nek neveztük el (DSM 3905; 7. ábra).

Expressziós plazmid szerkesztése céljából a pWH701 vektor (26) 10 gg-ját EcoRI-gyel és SphI-gyel hasítjuk, defoszforiláljuk, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A pRH1810 plazmidból úgy állítjuk elő az EcoRISphl fragmentumot, hogy a DNS 10 gg-ját EcoRI-gyel és SphI-gyel hasítjuk. A kapott 525 bp hosszú fragmentumot a vektortól 5%-os poliakrilamid-gélben, elektroforézissel választjuk el, majd a gélből kioldjuk. Ezután az EcoRI-gyel és SphI-gyel hasított pWH701 vektor 0,2 pmólját és az EcoRI-Sphl fragmentum 1 pmólját egymással összekapcsoljuk - ligázzal - és bevisszük az E.coli K12 W6 vad típusú sejtekbe. A kapott transzformált sejtek plazmidjait gyors plazmidanalízissel, majd eztkövetően agaróz-gélelektroforézissel vizsgáljuk. Arekombináns expressziós plazmidok 280 bp-ral hosszabbak, mint az inszertum nélküli expressziós plazmidok. Az újonnan előállított rekombináns expressziős plazmidot pRH24 jelzéssel láttuk el és ezt használjuk a következő expressziós kísérletekhez. A 7. ábra a pRH24 rekombináns expressziós plazmid szerkesztésének vázlatát ábrázolja.

b) CUSI-I cDNS kifejezése pRH24 expressziós plazmiddal E.coli K12 MC1061lpRK248 clts sejtekben (15,27)

A gazdabaktérium-törzs nem lizogén, azaz nem tartalmaz lambda-cl represszort. A hőmérséklet érzékeny lambda-cl 857 represszor genetikus információjának helye a pRK24 clts plazmidon van, amely a gazdabaktériumot egyben tetraciklin-rezisztenssé is teszi (27). A lambda-Pi. promotor által szabályozott transzkripció 30 ’C-on teljesen gátolt. A hőmérséklet érzékeny cl 857 represszor 42 ’C-on inaktív formában van és a P_L promotor alatt fekvő gének átíródnak.

Az E.coli K12 MC1061/pRK248 clts törzset a pRH24 rekombináns expressziós plazmiddal transzformáljuk. A lambda-Pi. promotor szabályozása alatt lévő CUSI-I gén kifejeződésének megindításához az E.coli K12 MC1061/pRK248, cIts/pRH24 törzs egy éjszakás tenyészetének 3 ml-ével beoltunk 200 ml LB-táptalajt (20 gg/ml tetraciklin, 50 gg/ml ampicillin) és a baktériumsejteket 28 ’C-on tenyésztjük, míg a sejtek sűrűsége a 0,7 Aj78 egység/ml értéket eléri. Ezután a tenyészetet 42 ’C-on tovább rázzuk. Abból a célból, hogy proteinmeghatározást végezhessünk, a sejtekből mintát veszünk az expresszió indukciója előtt, majd a kifejező11

HU 204 888 Β dés megindulása után különböző időközönként A sejteket (körülbelül 1·10⁹ sejt) 1 Aj78 egységre töltjük fel, percig 12 000 g mellett centrifugáljuk és a sejtüledéket -20 ’C-on fagyasztva tartjuk el a további feldolgozásig. 5

4. példa

A CUSI-I fehérjének E.coli KT2 MCI061lpttK248 cIís!pKH24 sejtekben való kifejeződése révén kapott nyers proteinkivonat vizsgálata 10

a) Immunológiai keresztréakciő-tesztelés nyúl-anti-HUSl-I antiszérummal A sejtüledéket 60 pl feltáró pufferben [50 mM triszHC1 (ρΗ=8,0), 1 mM EDTA, 2% Triton-X-100] szuszpendáljuk, s ehhez 40 pl redukáló puffért (4% SDS, 40% 15 β-merkapto-etanol, 20% glicerin, 0,1% brómfenolkék) adunk. Amintákat ezután 5 percig 100 °C-on, majd 5 percig ultrahangos fürdőben, szobahőmérsékleten, majd újból 5 percig 100 ’C-on inkubáljuk. A feltárt sejtek 20 plnyi mennyiségét 13,5%-os SDS-poliakrilamid-gélben 20 elektroforézissel választjuk el, majd nitrocellulózra visszük, immunológiai vizsgálat céljából. A niírocellulőz-szurőt 1 órán át 37 'C-on inkubáljuk „blokkoló” pufferben [50 mM trisz-HCl φΗ-7,4), 200 mM NaCI, 0,05% Tween 20, 15% zselatin], hogy a szűrőn a nem 25 specifikus kötőhelyeket telítsük. A proteint antitest-reakciókkal jellemezzük, amelyek közül az elsőben nyúl-anti-HUSI-I antiszérumot (a „blokkoló” puffeiral 1:6000 hígításban) használunk (inkubálás: 2 óra szobahőmérsékleten), második antitestként pedig juh-anti-nyúl-IgE-pe- 30 roxidáz konjugátumot (Sigma; Cat. No. A 6154) alkalmazunk. A toima-peroxidáz szubsztrát reakcióját diamino-benzidinneí hajtjuk végre (52). Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy az E.coli K12 MC1061/pRK248 cIts/pRH24 töizsben lévő lambda-Pj, promotor rendszer 35 termikus indukciója az indukció utáni 2 és 6 óra közötti időszakban stabil HUSI-I expressziős terméket eredményez, amely specifikusan ieagál-nyúl-anti-HUSI-Ι antiszérummal, és amelynek molekulatömege hasonló a humán ondőfolyadékokból izolált HUSI-I nagy molekula- 40 tömegű formájáéhoz. Hosszabb (20 óránál tovább tartó) inkubálás során az expressziós tennék Iebomlik (emésztődik) a tenyészetben, és többé nem mutatható ki, amint az a 12. ábrán bemutatott elektroferogramből látható.

b) Az E.coliban kifejeződöttproteináz-inhibitor gátló hatékonyságának vizsgálata

Az indukált sejtmintákat (az indukció megindítása után 6 órával) és a nem indukált sejtmintákat feltárjuk és teszteljük. A sejtüledékeket (1 Aj₇g egységnyi 50 sejt) 5 pl Iizozimes feltáró pufferben [50 mM triszHCl (pH=8,0), 1 mM EDTA, 1 mg/ml lizozim] szuszpendáljuk, 10 percig szobahőmérsékleten indkubáljuk, 150 pl 50 mM trisz-HCl-t (pH-8,0) és 1 mM EDTA-t tartalmazó oldattal hígítjuk, majd 5 percig 55 szobahőmérsékleten ultrahangos fürdőben inkubáljuk. A nem indukált és az indukált sejtek nyers kivonatainak 20, illetve 80 pl-ét viszgáljuk a kimotripszin gátlási teszt (39) segítségével, inhibitorhatékonyságra. Az eredményeket az I. táblázatban foglaljuk össze. 60

I. táblázat

E.coliban kifejeződött CUSI-I fehérje inhibitorhatékonyságának meghatározása

Vizsgálandó inhibitoroldat	2pmól kimotripszínenzim %-ban
E.coli kivonat (μ)	indukált hatékony- sága	nem indukált
		__	100
20	—	+	99,2
80	—	+	89,7
20	+	-	91,2
80		-	56,4

Az eredmények összehasonlítása alapján látjuk, hogy az E.coliból nyert indukált sejtek nyers sejtkivonata által kifejtett gátlás 8, illetve 37%-kaI magasabb, mint a nem indukált sejtkivonattal kapott kimotripszinaktivitásgátlás.

5. példa

A C-terminális CUSI-I dómén kifejeződése $-galaktozidázzalfuzionált proteinként E.coli K12

JM101 sejtekben

A 9. ábrából kitűnik, hogy a CUSI-I inhibitort olyan fehérjemolekulaként írhatjuk le, amely két doménből tevődik össze, s a domének génen belüli duplikációk révén alakultak ki. A C-terminális doménnek E.coliban való kifejezése érdekében a C-terminális 59 aminosavat kódoló DNS-szekvenciát összekapcsoljuk ligáz segítségével - a megfelelő leolvasási keretben - a pUR290 plazmidban (25) lévő β-galatozidáz C-terminálisát kódoló DNS-szekvenciával. A klónozás vázlatát a 10. ábra tartalmazza.

A pRH31 plazmidból 10 pg-ot Sau3A restrikciós endonukleázzal hasítjuk, preparatív elválasztást végzünk 5%-os poliakrilamid-gélben és a CUSI-I 320 bp hosszú részfragmentumát a gélből kioldjuk. A pUR290 plazmid 10 pg-ját BamHI enzimmel hasítjuk, alkalikus foszfatázzal kezeljük és összekapcsoljuk a 320 bp fragmentummal (ligázzal). Az összekapcsolt DNS egyharmadát bevezetjük kalciumkloriddal kezelt E.coli K12 JM101 sejtekbe. A kiónokat LB-amp agarlemezeken [10 g/1 enzimmel emésztett kazein (Sigma), 8 g/1 élesztőkivonat (Sigma), 100 pg/ml ampicillint; pH-7,5] szelektáljuk. Minthogy a CUSI-I részfragmentumát kétféle orientációban tartalmazhatja a rekombináns plazmid, gyors plazmidanalízist végzünk, majd HindlH-mal való hasítást. Azokat a klőnokat, amelyekben a plazmid 165 bp hosszú Hűidül fragmentumot tartalmaz, tovább analizáljuk. Az egyik ilyen plazmidot pRH21-nek neveztük el. A fuzionált protein kifejeződésének indukálására 100 pg/ml ampicillint tartalmazó 100 ml LB-táptalajt beoltunk olyan E.coli K12 JM101 sejtek egy éjszakás tenyészetével, amelyeket pRH21 plazmáddal transzformáltunk. A tenyészetet 37 ’C-on inkubáljuk és a növekedést 578 nm-en való méréssel

HU 204 888 Β ellenőrizzük. A 0,5 optikai sűrűségű (578 nm) tenyészethez 500 pmól IPTG-t adunk, majd tovább inkubáljuk 37 'C-on. A fúziós protein indukcióját az idő függvényében követjük és SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel ellenőrizzük. Az indukció után először kizárólag a CUSI-I β-galaktozidáz fúziós fehérje képződik, később β-galaktozidáz is. Abból a célból, hogy immunológiai reakciót végezhessünk anti-CUSI-I ellenanyaggal, az E.coli nyers kivonatának fehérjéit SDS-géielektroforézissel választjuk el és nitrocellulózra visszük fel. A fuzionált protein specifikus kimutatását szolgáló Western biot analízist az (53)ban leírtak szerint végezzük. A fúziós fehérjét izoláljuk és a következőképpen tisztítjuk.

Ullmann szerint (37) az IPTG analogonja, a TPEG, hozzákötődik a CH-Sepharose-hoz. A CUSI-1-βgalaktozidáz fúziós protein tisztítása érdekében az E.coli K12 JM101 törzset, mely a pRH21 plazmidot tartalmazza, 1 liter 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-táptalajban tenyésztjük és 0,5 (Aj7s) egység/ml optikai sűrűség elérésekor úgy indukáljuk a tenyészetet, hogy a táptalajhoz 0,5 mmól IPTG-t adunk. Egy óra múlva az indukciós fázist úgy állítjuk meg, hogy a tenyészetet gyorsan lehűtjük 4 °C-ra. A sejteket ülepítjük (5,5 g nedves tömeget kapunk), lizáló pufferben [20 mM trisz-HCl (pH-7,4), 20 mM MgCl₂, 20 mM β-merkapto-etanol] szuszpendáljuk és ultrahangos kezeléssel tárjuk fel. A nyers kivonatot 20 mg/ml protein és 1,6 M NaCl-koncentrációra állítjuk be, majd TPEG-Sepharose-on kromatografáljuk. Az oszlopot ekkor 20 mM trisz-HCl (pH-7,4), 10 mM β-merkapto-etanol, 10 mM MgCl₂ és 1,6 M NaCl-tartalmú oldattal mossuk, majd a CUSI-I β-galaktozidáz fúziós proteint 100 mM nátrium-borátot és 10 mM β-merkapto-etanolt (pH-10) tartalmazó oldattal eluáljuk. A kromatografálást β-galaktozidázaktivitás meghatározással (43) ellenőrizzük. A tenyészet 1 litere 8 mg tiszta CUSI-I^-galaktozidáz terméket eredményez (90%). Kimutattuk tovább, hogy a tisztított, fuzionált fehérje is reagál az anti-HUSI-I ellenanyaggal.

A CUSI-I C-terminális doménjének lehasításához a fenti módon tisztított fehérjét 10-30%-os ecetsavban vagy 70%-os hangyasavban oldjuk fel. Egy savérzékeny aszparaginsav-prolin kötés (lásd a CUSI-I aminosav-szekvenciáját) jelenléte 24-36 órán át szobahőmérsékleten folyó reakcióidő után azt eredményezi, hogy a CUSI-I C-terminális doménje leválik. A savas kezelés után ezt az intakt CUSI-I domént gélszűréssel (G75) választjuk el, majd tisztítjuk.

A kifejeződött CUSI-I C-terminális doménjének aminosav-szekvenciája tehát a következő: Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-ProGly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-MetLeu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-GlyGln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-GlyMet-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-LysAla-OH.

Ez a szekvencia a teljes CUSI-I protein 50-107 pozíciójának szekvenciájával azonos.

6. példa

A C-terminális CUSI-I dómén kifejeződése E.coli

K12JM101 sejtekben

Az 5. példából kitűnik, hogy a CUSI-I C-terminális doménje E.coli K12 JM101 sejtekben, mint β-galaktozidázzal fuzionált fehérje fejezhető ki. A 11. ábra bemutatja, hogy a C-terminális 59 aminosavat kódoló cDNS a pSP6 plazmid alkalikus foszfatázgénje szignálszekvenciájához van kapcsolva, mégpedig a leolvasási keretben úgy, hogy a CUSI-I C-terminális doménje, mint natív fehérje fejeződjék ki. A pSP6 plazmidot letétbe helyeztük a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen intézményben DSM 3904 letéti szám alatt.

A pRH1810 plazmid 30 jig-ját BamHI-gyel és Hinflgyel hasítjuk. A DNS-fragmentumokat 8%-os poliakrilamid-gélben választjuk el. A175 bp hosszú CUSI-I DNSffagmentumot, amely a C-terminális domént kódolja, kioldjuk a gélből. A túllógó DNS-végeket a DNS-polimeráz Klenow-fragmentje segítségével töltjük be. Ekkor egy 182 bp hosszú, dupla szálú DNS-molekulát kapunk, tompa végekkel.

A pSP6 vektor 3 pg-ját Hindin restrikciós endonukleázzal hasítjuk. A túllógó dupla szálú DNS-végeket Mung bean nukleázzal elbontjuk és az 5’-terminális foszfátcsoportokat alkalikus foszfatázzal távolítjuk el.

Az ilyen módon kezelt vektor 0,3 pmólját a CUSI-I DNS C-terminális fragmentumának 1 pmóljával kapcsoljuk össze (ligázzal). A kapott ligázos tennék felével az E.coli K12 DH1 törzs transzformáció-kompetens (17) sejtjeit transzformáljuk. Akiónok szelekcióját LB-amp agarlemezeken végezzük. Az AH12 oligonukleotiddal végzett telephibridizációval 4 kiónt azonosítottunk. A kiónok plazmid DNS-ei a használt próbaanyaggal komplementer DNS-szekvenciákat tartalmaztak. Az AH12 oligonukelotid a CUSI-I cDNS-klón 241-258 pozícióban lévő nukleotid szekvenciájával komplementer, melynek szekvenciája;

’ CCT GTT GAC ACC CCA AAC 3 ’.

Gyors plazmidanalízissel és a DNS-nek HindHI-mal és BamHI-gyel való hasításával egy olyan kiónt azonosítottunk, amely inszertumként egy 540 bp hosszú DNS-fragmentumot tartalmazott. Ez a DNS-fragmentum a Puc promotor szakaszból, az alkalikus foszfatáz szignálpeptidje szekvenciájából és a CUSI-I C-terminális doménjét meghatározó cDNS-szekvenciából áll. Az így szerkesztett plazmid elnevezés pBA17.

Ezután kompetens E.coli K12 JM101 sejteket transzformálunk a megszerkesztett pBA17 expressziós plazmid DNS-ével. A C-terminális CUSI-I dómén kifejezése céljából 250 ml LB-amp táptalajt oltunk be a kapott transzformált sejtekkel. Az irikubálást 37 °C-on végezzük. A sejtek növekedését úgy ellenőrizzük, hogy meghatározzuk 578 nm-en'a sűrűséget, s 0,97 optikai sűrűség elérésekor IPTG-t adunk a tenyészethez (05 mM végkoncentráciűig) az expresszió megindítása céljából. Egy A578 egység sejtmennyiséget veszünk ki különböző időközönként az expresszió indukciója előtt és után (lásd a Π. táblázatot), a mintákat 3 percig 12 000 g mellett cent13

HU 204888 Β rifügáljuk és a sejtüledékeket -20 ‘C-on tároljuk. A kifejeződött termék 59 aminosavból áll, a következő szekvenciával;

Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-LysPro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-GIy-Gln-Cys-LeuMet-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-AspGly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-MetGly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-LysAla-OH.

E.colibankifejezödött CUSI-I C-terminális donién inhibitor aktivitásának vizsgálata Akimoíripszin gátlása tesztet (39) a 4. példában leírtak szerint végezzük el. AzE.coIÍból kapott nyers kivonatkimotripszinnel szemben kifejtett gátíóhaíásának növekedését az idő függvényében vizsgáljuk. Minden esetben az E.coli lizátum felét (100 μΐ) teszteltük inhibitoraktivitásra. Az eredményeket a H. táblázatban foglaljuk össze.

H. táblázat

A leírásban hivatkozott szakirodalmi közlemények

1. Bodmer et al., Schweiz. med. Wschr. 144,13591363 (1984)

2. Lewís, D. A., Biochem. Phannacol. 33, Π055 1714(1984)

3. Schiessler, H. et al., Bayer Symp. V, Proteinase Inhibitora, (Fritz, H., Tschesche, H., Greene, L. J. Truscheit, E., Eds.), pp. 147-155, Springer Verlag, Berlin (1974)

4. Wallner, O. and Fritz, H., Hoppe-Seyler’s Z.

Physiol. Chem. 355,709-711 (1974)

5. Fritz, H. et al. (1975) in: Proteases and Biological Control (Reich, E., Rifkin, D. B. and Shaw, E., Eds.), 737-766, Cold SpringHarborLaboratory

6. Wallner, 0. et al. in: Protides of the Biological

Fluids (Petera, H., ed.) 23, 177-182, Pergamon Press, Oxford (1975)

7. Chirgwin, J. M. et al., Biochemisüy 18, 52945299 (1979)

8. Thayer, R. E., Anal. Biochem. 98,60-63 (1979)

Az E.coliban kifejeződött CUSI-I C-terminális dómén	9. Wallace, R. B. et al., Nucl. Acids Rés. 9,879-894
inhibitor aktivitásának meghatározása		(1981)
				10. Clark, L. et al., Meth, Enzymol. 68, 436-442
Mintavétel	NE/ml	2pmől		(1979)
indukció	tenyészet	klmoíripszinenzim 25 11. Gershoni, J. M. and Palade, G. E., Anal. Bio-
előtt (óra)		aktivitása %-ban		chem. 131,1-15 (1983)
				12. Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,
2	0,624	90		4350-4354(1979)
2,5	1,88	75		13. Gubler, U, and Hofiman, B. J., Gene 25, 263-
3	2,00	77	30	1 269(1983)
indukció után				14. Volkaert, G. et al. in: Advanced Molecular Gene-
(óra)				tics, Springer Verlag, Berlin, 255-257 (1984)
1	4,83	67		15. Casadaban, M. J. and Cohen, S. N., 3. Mól. Bioi.
2	6,57	67		138, 179-207 (1980)
3	7,24	67	35	16. Messing, J. et al., Nucl. Acids Rés. 9, 309-321
4	9,56	64		(1981)
5	8,00	67		17. Hanahan, D., J. Mól. Bioi. 166,557-580 (1983)
6	10,66	60		19. McDonnell, M. W. et al., J. Mól. Bioi. 110,119
21	16,96	37		(1977)
			40	20. Bailey, J. M. and Davidson, N., Anal. Biochem.
A HL táblázatban a Budapesti Egyezmény értelmében		70,75-85 (1976)
letetébe helyezett mikroorganizmusokat soroljuk fel.		21. Laemmli, U. K., Natúré 227,680-685 (1970)
				22. Maxam, A. M. and Gilbert, W., Meth. Enzymol.
	ÜL táblázat			65,499-580 (1980)
			45	23. Bolivár, F. et al., Gene 2,95-113 (1977)
Mikroorganizmus	A letét helye	Letéti száma		24. Yanish-Perron, C. et al., Gene 33, 103-119
E.coli K12 MC1061 DSM	3631		(1985) 25. Rüther, U„ Müller-Hill, B., EMBO-J. 2, 1791-
E.coli K12 JM101	ATCC	33876		1794(1983)
E.coliK12DHl	ATCC	33849	50	26. C. Gatz, TH Darmstadt, Dissertation, 89-93
E.C0ÜK12	DSM	3632		(1985)
pBR322	ATCC	31344		27. Bemard, H. U. et al., Gene 5,59-76 (1979)
pUC18	DSM	3424		28. a) Maniatis, T. et al.: Molecular cloning: A Iabo-
pUR290	DSM	3417		ratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
pWH701	DSM	3633	55	Spring Harbor, New York, 194 (1982);
pRK248 clts	ATCC	33766		28. b) Bonner, T. I. et al., J. Mól. Bioi., 81, 123
pRH31	DSM	3634		(1973)
pRH34	DSM	3635		29. Glisin, V. et al., Biochemistry 13,2633 (1974)
pSP6	DSM	3904		30. Aviv, H. and Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci.
pRH1810	DSM	3905 ι	SO	USA 69,1408 (1972)

HU 204 888 Β

31. Thomas, P. S., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 77, 5201 (1980)

32. Suggs, S. V. et al., Developmental biology using purified genes (D. Brown, ed.), Academic Press, New York, 683 (1981)

33. Mandel, M. and Higa, A., J. Mól. Bioi. 53, 159-162 (1970)

34. Hardies, S. C. et al., J. Bioi. Chem. 254, 55275534 (1979)

35. Holmes, D. S. and Quigley, M., Anal. Biochem. 114,193-197 (1981)

36. Caruthers, Μ. H., in Chemical and Enzymatic Gene Synthesis (H. G. Gassen, A. Láng, eds.), lst ed., Verlag Chemie, Weinheim (1982)

37. Ullmann, A., Gene 29,27-31 (1984)

38. Fritz, H. et al.: Methoden dér enzymatischen Analyse (H. U. Bergmeyer, ed.), 3rd ed., 1105, Verlag Chemie, Weinheim (1974)

39. DelMar, E. G. et al., Anal. Biochem. 99, 316— 320 (1979)

40. Pelham, R. B. and Jackson, R. J., Eur. J. Biochem. 67,247-256 (1976)

41. Klasen, E. C. and Kramps, J. A., Biochem. Biophys. Rés. Comm. 128,285-289 (1985)

42. Guarente, L. et al., Science 209, 1428-1430 (1980)

43. Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratoiy, Cold Spring Harbor, New York, 433 (1972)

44. Ohlson, K. et al., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 357,1241-1244 (1977)

45. Hochstrasser, K. et al., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 362,1369-1375 (1981)

46. Smith, C. E. and Johnson, D. A., Biochem. J. 225, 463-472 (1985)

47. Schiessler, H. et al., Neutral Proteinases of Humán Polymorphnuclear Leukocytes (Havemann, K. and Janoff, A., eds.), 195-207, Urban and Schwarzenberg, Baltímore, Munich (1978)

48. Fritz, H. in: Protein Degradation in Health and Disease, Ciha Foundation Symposium 75, 351-379, publ. ExcerptaMedica, Elsvier, North Holland (1980)

49. Bemard, H. U., Methods Enzymol. 68, 482-492 (1979) 50. Machleidt, W., Modem Methods in Protein Chemistry (Tschesche, H., ed.), 267-302, Walter de Gruyter, Berlin, New York (1983)

51. Schildkraut and Lifson, Biopolymers 3,195-208 (1964)

52. Heinzel et al., Eur. J. Biochem. 160,61-67 (1986)

53. Gershoni, J. M. and Palade, G. E., Anal. Biochem., 737, 1-15 (1983); E. L. Winnacker: Gene und Klone (VCH Verlagsgesellschafft, Weinheim, 1985; 2. kiadás) 346-350. old.

Claims (24)

1. Eljárás I típusú HUSI-inhibitorok biológiai aktivitásával rendelkező proteint kódoló DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy egy emlős genom, előnyösen a humán genom DNS-gyujteményét a 4. ábrán bemutatott DNS-szekvenciával és/vagy az 5. ábrán bemutatott DNS-szekvenciával vagy legalább ezek specifikus hibridizációz elegendő hosszú ffagmensével szűrjük, és a hibridizáló DNS-szekvenciákat elkülönítjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fragmensként a

3’ AAGACACTCTACCTACC 5’ szekvenciájú RH-1 fragmenssel, a

3’ ACAACGTACCCGTACAC 5’ szekvenciájú RH-2 fragmenssel vagy az

5’ CACTCAGGTTTCTTGTATCT 3’ szekvenciájú RH-5 fragmenssel vagy egy, a genetikai kód degenerációját figyelembe véve, ezekből származó fragmenssel szűrünk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy I típusú HUSI-inhibitorok biológiai aktivitásával rendelkező valamely proteint kódoló olyan DNS-szekvenciát különítjük el, amely kódol egy, a CUSI-I biológiai aktivitásával rendelkező proteint.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkező proteint kódoló DNS-szekvenciát különítünk el.

5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 9. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkező proteint kódoló DNS-szekvenciát különítünk el.

6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával rendelkező proteint kódoló DNS-szekvenciát különítünk el.

7. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pRH31 (DSM 3634) rekombináns plazmid által PstI fragmensként tartalmazott, a 4. ábrán bemutatott DNS-szekvenciával rendelkező DNS-szekvenciát különítjük el.

8. A 3. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pRH34 (DSM 3635) rekombináns plazmid által PstI fragmensként tartalmazott, az 5. ábrán bemutatott DNS-szekvenciával rendelkező DNS-szekvenciát különítjük el.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. vagy 5. ábrán bemutatott DNS-szekvenciától - a genetikai kódok degenerációját figyelembe véve - legfeljebb 5%-ban különböző DNSszekvenciát különítünk el.

10. Eljárás rekombináns klónozó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas restrikciós enzimmel hasított vektormolekulába az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított DNS-szekvenciát viszünk be.

11. Eljárás rekombináns expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-9. igénypontok bármelyike szerint előállított DNS-szekvenciát, kívánt esetben a teljes gént helyreállító oligonukleotid-fragmenshez kapcsolva, viszünk be egy alkalmas restrikciós enzimmel hasított vektormolekulába oly módon, hogy az említett DNS-szekvenciát működőképesen kapcsol15

HU 204888 Β juk a vektormolekula egy expressziős kontrollszekvenciájához.

12. A11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát a

MetLysSerSer

5’AATTCGGAGGTGTCGACTATGAAGTCCAGCGG 3’ GCCTCCACAGCTGATACTTCAGGTCGCC szekvencíájú oligonukleotid DNS-fragmenssel kapcsolva visszük be a vektormolekulába.

13. A11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás rekombináns vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a DNSszekvenciát az E.coli lac promotor, az E.coli öp promotor, az E.coli Iipoprotein promotor, a lambda-Pi. promotor vagy a lambda-Pn promotor expressziós kontroliszekvenciához kapcsoljuk.

14. A11-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás rekombináns vektorként pRH31 (DSM 3634) plazmid, pRH34 (DSM 3635) plazmid, pRH1810 (DSM 3905) plazmid, pRH24 plazmid, pRH21 plazmid vagy pB A17 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelő DNS-szekvenciát a megfelelő restrikciós enzimmel hasított vektormolekulába viszünk be.

15. Eljárás transzformáit bakteriális gazdaszervezet előállítására, azzal jellemezve, hogy egy bakteriális gazdaszervezetet a 10-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállítható rekombináns vektorral transzformálunk.

16. A15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E.coli fajhoz tartozó törzset transzformálunk.

17. Eljárás az I típusú HUSI-inhibitorok biológiai tulajdonságaival rendelkező protein előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 15. vagy 16. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított transzformált gazdaszervezetet táptalajban tenyésztünk, kívánt esetben í indukáljuk a génteimék kifejeződését, a keletkezett expressziós terméket elkülönítjük a tenyészetből, és adott esetben szabályozott savas hidrolízisnek vetjük alá, majd a hidrolizátumból gélkromaíográfíával elkülönítjük a kívánt biológiailag aktív proteint ^ζ

18. A17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a CUSI-I típusú protein biológiai aktivitásával , rendelkező proteint különítjük el.

19. A18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy a 4. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú proteint különítjük el.

20. A18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 9. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú proteint különítjük eL

10

21. A18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú proteint különítjük el.

22. A18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az

15 Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-LysPro-GIy-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-LeuMet-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-AspGly-Gln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-MetGly-Met-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys20 Ala-OH aminosav-szekvenciájú proteint különítjük el.

23. A18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogya

Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro25 Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-GIy-Gln-Cys-Leu-MetLeu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-GlyGln-Cys-Lys-Arg-Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-GlyMet-Cys-GIy-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-LysAla-OH

30 aminosav-szekvenciájú proteint különítjük el.

24. Eljárás hatóanyagként az I típusú HUSI-inhibitor biológiai aktivitásával rendelkező proteint tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 17-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás35 sál előállított hatóanyagot a győgyszertechnológíában szokásosan használt hordozókkal és/vagy hígítókkal és/vagy egyéb segédanyagokkal keverve gyógyszerré elkészíthetjük.

HU 204 888 Β Int. Cl.⁵: C 12 N 015/15

1. ÁBRA

A HUSI-I tripszines fragmentumainak aminosav szekvenciája

1 10 15

T1 Lys-Arg-Gys-Gys-Pro-Asp-Thr-Gys-GIy-I1e-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro16 23

Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg

1 10 15

T2 Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu

16 20 29

Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Gys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Gys-Lys-Arg

3’ AAG AGG CTT TAG GTG GC 5'

A A C A 1-RH1-1

1 11 T3 Asp-Leu-Lys-Cys-Gys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys

3' AGG AGG TAG GGA TAG AC 5'

A A G

T

G l-RH2-1

1 8 T4 Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala

HU 204888 B Int Cl.⁵: C12 N 015/15

2. ÁBRA

A pRH31 plazmid restrikciós térképé

3. ÁBRA

A pRH31 plazmid cDNS inszertuma szekvenálási stratégiájának vázlata

L-2-ΞΞ—. . .. ·., . 0 100 200 • · *

BamHI

------------ - - I

300

Hfnd'lII ,„l, ,

400 500 bp

Bell

HU 204 888 B

Int. Cl.⁵: C 12 N 015/15 un θ *-Π θ'* ΠΌ o un

OO CM «r-~ ΓΜ

CM

A pRH31 plazmid CUSI-I-cDNS fragmentumának nukleotid szekvenciája

H- X Π- C 1— UJ U3 UJ U3 X o VJ o VJ <_ VJ 1X3 >-.1X3 UJ <— 1—1 1X3 ·—· O ,_1 UZ3 UJ >» X o_ a. UO uo _1 UJ 1X3 UJ ₍_ C UJ 1X3 LZJ UJ U3 1_1 X X H- Π- c UJ 1X3 t— C H· C 1X3 VJ ΙΛ C— cu >-. >->x 1— >>1X3 1—1 -ez i—i 1X3 >-> X b- vo -X t— —. 1X3 —1 UJ 1— — -< 1X3 X H— 1— -< -< 1— 1— c 1X3 1—1 1X3 1X3 1—> . x b- 1—1 1X3 1— 1X3 UJ 1— VJ CJJ cu t— VJ >-> x l·— _ 1 c_ 1X3 UJ vo 1— -CZ UJ to OJ 1— -< >^1X3 _1 X -se — □u UJ X b- c c X b- UJ C 1— <c 1 π- UJ ua 1X3 1—1 b- X’ 1X3 UJ 1X3 I 1 J—i ιο l— VJ —i* Z3 I.JC» 4— í*>x I— >> X b~ ΓΟ b“ X ra t— c c 1— ω 1— 1— _1 > s Π* -< X b— UO UJ 1X3 UJ 1X3 VJ • X <Z 1X3 UJ h— X <C b- |_ -X UJ CT VI O o VO >-> «_ 1X3 1—1 >> X b- U UJ 1X3 u UJ U3 >> 1X3 VJ — LO x _ Q- Ο- 1—1 1X3 x b— X 1— 1—1 1X3 UJ L3 b- 1X3 l·— -< V3 UJ b~ X UJ U3 1—1 1X3 1X3 S3 >» CU νο aj aj h— «< — 1X3 1—t C 1— >> 1X3 UJ |— -X aj 1— _1 1X3 •C UJ O- 3Σ VJ O 1X3 UJ L23 UJ b™ -< t— -X _ X 1—1 U3 x b— LO t_1 LO UJ b— -X 1 J VJ o Z3 vo c: VJ >>1X3 LJ t_ VJ UO G4 b” X =>-> b- vo -< 1— >->1X3 UJ cu _1 - * -< UJ H— <C UJ LO UJ 1X3 < b- l— H- 1X3 UJ 1— -< 1—1 1X3 1X3 1—1 UJ 1X3 t— V) vo >-> o VI 1X3 1—1 >> 1X3 UJ ;>-> U3 <_1 1X3 1—1 t— UJ 1X3 >«.1X3 UJ 1—1 UJ cu VJ 1X3 UJ. Π- < b- X i ’-i UJ UJ 1X3 n- 1X3 u 1X3 1—1 |— -< 1_1 1X3 1X3 c= _ VO o CP VJ 1X3 1—1 — X 1—. >-> ’C 1—' t— UJ UO c— 1—1 1X3 >> X 1X3 —j Ο- O- _1 ό 1—1 UJ LZJ -< 1— UJ to UJ 1X3 X 1x3 UJ 1X3 UJ 1—1 1X3 1X3 UJ 1—1 1X3 1X3 CU <V νο ez =3 1X3 Ul V 1X3 t—l —« j— < < 1— vo -c 1— OJ l— Π- ►—« _1 c. _J 1X3 1—1 1— -< 1— -C b- -< 1— n~ 1X3 1—1 VJ UZ 1—1 1X3 1X3 1_ J_ -X 1_1 CU σο z? OL. 1X3 UJ VJ X t— —· U3 1_I u 1X3 UJ aj J— X VJ X x LO *C _1 X 1X3 UJ 1X3 UJ to 1_1 < i— 1—1 1X3 1X3 1X3 1_1 Π- -< b- X 1X3 UJ U3 1_> I— ι- VO σι 4 - CT 1X3 UJ ω 1X3 UJ >> U3 1_1 <— 1X3 UJ aj i— X v 1X3 un 1_1 x; X 1X3 UJ X b— b— X «£ H- C Π- fej 1X3 (—1 1X3 1_1 b— X *C b- U3 VJ 1X3 C u. u Z3 VO 1X3 UJ — X h— -£Z 1—1 1X3 .ez VJ U3 aj b— X 1X3 1- !— —j —1 1X3 UJ UJ UO < 1— -X b* j- X <C 1X3 1—1 UJ LO 1—1 1X3 ·<: b— b— X UJ VI • CL. O vo vo X H- >> 1X3 UJ vo 1— t— UJ LO UJ 1_1 >·> U3 UJ -< Q- 1—1 1_1 UJ LZ3 1— *C LO 1_1 1_» VZ5 1— X 1— 1X3 UJ 1X3 UJ Ι- X UJ O 1— uo 3 Ο CZ CZ c l·— <x —« x b- c— UJ 1X3 vo —í. t— -< 1— — c 1X3 CU C LO uo UJ LZ3 U3 1—1 1—1 1X3 «X b“ UJ 1X3 UJ

GTCACGTTCGCACTGAACTTCACAACGTACCCGTACACACCCTTT I-RH-2-1

H

O \_z <

P5

PQ

-3· co tn m

ta VJ u va -C 1— c 1— la VJ VJ ta la VJ LJ ta F— ’C f- -c -C F— I— *c F— -c H- ·< -c F— u ta U La u La VJ va F— -c va u va u t— ’C va VJ U La -c F— VJ va VJ ta F— -C u ta F— -C I— C ’C 1— va vj cn_ va o ta u u tZ) F— ’C F— ’C t— -c ta LJ ΓΟ U va F— ’C ta u ta VJ (/> <c 1— F— -c ,*c F— 1_f va —¹ -c í— F— -C La VJ VJ ta ra F— ’C ta VJ La u F— ’C f— ’C LJ La o £- vj La VJ ta ex. LJ La 1— -c VJ ta La VJ L. GJ u La -c t— GO H” <c La u F— ta VJ , - ra F— -c H— ’C >- La VJ VJ ta l_1 va 1— -c <n VJ t_r ta LJ l·— -c ta VJ gj va ta VJ G. ÚJ go l—l va < F— í— •c La VJ

HU 204888 Β Int. Cl.⁵: C12 N 015/15

1— -c ’C 1— I— ’C ’C F— 1_» ta f— c ta VJ -c F— va I_> -c 1— <c F— ta u -c F— F— <C -c F— ’C F— va VJ -c F— ta u vj La ta VJ F— ’C ta VJ -C F— 1— -C ta VJ F— -C π- ’C Π ’C ί- ’C I_> va να VJ LJ ta -c ι- 1— -c u να LJ ta u La U ta ta VJ F— ’C l— ’C ’C 1— ta VJ F— ’C ’C F— ’C H- c F— ta ,_» ta VJ l— ’C c F— 1_1 La -c 1— ’C F— u ta VJ ta F— ’C VJ ta F— ’C -C 1— F— ’C LJ ta U ta VJ ta ta VJ F— -C ta VJ 1_I La -c π- va VJ VJ ια ta 1_1 ta VJ I— ’C -c 1— 1— -C VJ ta 1_1 va -c t— -C Π- 1_1 ta va VJ ’C π- -c 1— u ια va LJ ta VJ t— -c ta u

ATAAACGAGCCTATTTCTCTTTGCACCCCCCCCCCCCCCCCCCCC

TATTTGCTCGGATAAAGAGAAACGIGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG

HU 204 888 B

Int. Cl.⁵: C 12 N 015/15 *-O «γ— Ό σ> n*i vO

CM C-*

CM <M

A pRH3^ plazmád. CUSI-I-cDNS fragmentumának nukleotid szekvenciája

F“ *C c ld F- LD Π3 1- > LD 1—1 F— ej t— <C ej < ej L. GJ UO ej LD ld <_1 ej ej =3 1—’ C GJ F- *C —* ej 1_> —J LD ej 1D id ej ej ej ej l—l 1—t ej < F— oj =3 UJ LD JD F*“ -< —— <C F— cu LD ej 1—9 F- <. ej eJ ej UD 1—J ep ej ej © —— eJ LD t_ 1—t ej ro F— ·< cu > ej LD 1—> ej ej ej ej 1—t LD ej F— -< OJ CO ej <D JD 1— *c -- - l_l ej cu -< ej 1D F- <c ej ej L3 L-l LD ej ej ej D cu ej l—l <u F- «c ej ej _D 1- ej l—> ID ej f— < ej 1—» t—l ej f— «C © i -n 1—t —' LD 1_* L·. ej ej LD CU LD LD 1_1 ej ej ej l—l LD ej -< F— C— ro ej L—t GJ LD 1_1 —- ej tz> ej LD F— ej ej ej LD l—i ej ej 1_1 u. © ej 1—í GJ LD ej OJ F— «< uo « ej t—> F- -< ej ej ej L_J LD 1 1 1—· c </> ej 1—t F— x— ej ej —1 I— ej LD 1— <C l— ej <—t LD 1_1 «< F— - j~_T >-> ej K-J GJ |- -<X —. ej ej 32 LD ej ID -< F— ej ej ej (—1 t_t ej < F— Z3 i —i l—í 1_t ej GJ 1— <C 1 ej LD -< f— ej ej ej l_1 d ej ej ej ra ej l—l F— -c 1_1 ej ej LD F— -c ej ej ej t—f 1—» ej 1— «< D ej 1—* l—J ej GJ F— < i F— LD 1_< ej ej 1_1 LD 1— << ej ej © ej <—1 t—> ej GJ F— -< _1 1— c 1—J ej ej ej

LD LD

t—1 ro ej ej CJ 1_J VQ — L-> C ej —· -C ej F- LD ej 1_1 ej 1— c. «< ej o. i_i GJ GJ LD LZJ ej e ej F- ej 1—1 F- 1— -<C -< 1— ej a. ej >> >> < —1 l·— vi -C <C j— LD t— ej ej LD ej e -< V» —I t— <u ej IZ1 ej UU 1— <c 1— F— o *£ ej c ej c. 4- 1_1 ej — -c F- • UD CL ej . l·— ld e? ej ej F— a ·< ej V, ej CU C- 1—1 Q_ ej ej ej 1_1 VG C t—> ej F— ·< F- KA <£ ej =3 <_1 o >^LD UJ ej — -< ej F— cu |—. <c ej 1_, L~> ej 1— o -C ra l— <£ t_ <_1 ce eo >-> t—1 LD ej ej ej >> F— -< V) 1— VO — LD LD ej <C _1 F~ >-x 1—t LD ej -C t— F- rs «X ej V3 <_1 cn — 1—í < ej >-»*c F— G- C LD ej -eC F- ΙΛ >- ej t— ej UJ >> ’C _> l·— >-> -«C F— 1— >-% _1 c l·— F- -c LJ GJ ej C cn 1— -XX FCU <C <- LD C ej >> —1 F- c 1— uu ej D >-> QJ l_t ej oj |— —J LD 1— <c L_J ej LD cd <_1 1—> Uí ej o >sC _t 1— >>> LD l—l 1_1 G_ CU c l— F— -c c >> F— LD C <_1 V) — ld LD ej — C LD F— LD LD 1_) LD ej

TCT CCAGGGAAGAAGAGATGTTGTC CTGACACTTGTGGCATCAAA ACAGGTCCCTTCTTCTCTACAACAGGACTGTGAACACCGTAGTTT <

tí ’C vO m

v-O m

HU 204888 Β Int CL⁵: C12 N 015/15 un un f— <c o _ t. LJ O Q_

3 13

13 3 vj >,-X i— “* -x f—

3 3

CT t_ 3 3

-X !—

13 3

CT c_ 13 <—» ^-X-X HJ~ l-J 13 *“ -X F— <. Ιο t_ 3 3 Q_

3 3

3 L3 ez

VJ —X F—

-X F—

-X F— ^Q_,3 3

3 3 t— _e; 3 3 *~_-χ f—

3 ld

CS.

V} < t— <

13 3 i— -X ra |— -X

13 3

I— -X o t_ l_J O Q3 U3

F— -X cs.

vj -X t— <.

L3 I_>

3 3 3 I— -X

3 in <_ t 3

VJ s-,3 <_j f— -X o

c_

QC

VJ «X

VJ m

1_J <_J 1_J 3 3 3 13 VJ >,-X ~^J -X 3 F— F— 3 3 13 3 3 «X F— aj l·— -X -X F— F— -X F— -X 13 O. 1— C V» -X F— -ac 3 13 13 3 3 l_) F—' -X CT 1— -X t_ 13 3f C <. F— 3 13 3 3 13 3 í— -X -X F— f— «< -X F— 1— -X 13 13 VI 3 3 13 3 3 F— C 1— —X c j_ 13 <3 c _ -X F— —- -3Z F— 13 3 13 31 13 3 13 31 13 S»-, in 3 —. 13 13 13 3 3 13 13 F— -X F— -X o_ ,-X F^- vj -X I— -X F— -X 13 1_, F— c 13 I_i 3 13 ai F— -X x: _ -X F— -X 1— 3 1_1. 13 13 3 F— -X — -X T *n J— 3 <__» l -i C23 -x F— 1— -X VO 3 13 3 CU 1_1 13 j_ «X 13 UJ 13 OJ ,3 3 -C í— Λ -X F— -x u* I— -X 3 3 F— -X 3 .·< F— vj «X 1— -X < F— -X F— 3 3 1_> 13 o '3 3 3 1_1 13 Ο- 3 3 ι_1 13

«X F— F— 13 F— 3 -X 3 -X 13 F— F— 3 -X 13 n F— <x F—· -X > 13 3 1_1 13 F— -X 13 3 o C 3 13 1— -X Q- 3 13 3 13 «3 13 3 13 c. O 3 13 F— -X SZÍ F— -X 13 3 F— -X -X F— fO F— <x 13 3 13 3 13 3 3 13 F— <c VJ 13 3 3 13 U-1 F— -c F— -X 3 13 3 13 QJ 3 13 13 3 CZ) F— <X 13 3 V) -X F— -X F— -X F— 13 3 -X F— 13 3 13 1_» -X t— >1 13 3 13 3 L3 13 3 13 3 F— «X F— -X VI 3 -X F— UJ F— -X 1— -X 13 3 -X F— cu 1— -X 1_1 13 -X F— 3 13 3 13 13 3 13 3 F— -X LO 13 3 1_1 13 13 3 3 3 GJ F— -X F— -X Σ. *x i— F— -X 3 13 -X F— V) Q. >> 13 3 O ’l3 3 uu I— -X tzi F— -X 1— -X F— -X LO Π3 13 >,13 3 3 F— -X •C 13 1_>

3 13 3 13 3 13 3 13 3 13 3 13 3 3 3 3 -X F— 3 3 3 F— -X 3 3 13 3 13 3 1— -X 1— c 3 3 -X F— 13 3 -X F— 13 3 LO 1— -X -< 3 3 U-l 3 3 O 3 3 t— «X F— uu 1_1 3 UJ 3 13 uu 1— -X U-l F— -X l_J F— -X U-J 3 3 l—9 1_1 3 cu 1— -X CJ 13 3 CJ 13 3 V cu -X F— cu 3 13 cu 3 3 cu 1- -X cu 13 3 cu 13 3 cu F— -X cu 13 3 cu

GGGGGGGGGGGGGGGGGGGACGTC

HU 204 888 Β

Int. Cl.⁵: C 12 N 015/15

6. ÁBRA

A pRH1Ö07 plazmid PstI inszertumának szekvenálási stratégiája pRH1807

8. ÁBRA

A pRH3^ plazmid restrikciós térképe

HU 204888 Β IntCl.⁵: C12N015/15 7. ÁBRA pRH 24 4700 bp

HU 204 888 B

Int. Cl.⁵: C 12 N 015/15

A CUSI—I inhibitor génen belüli duplikációja homológiájának szemléltetése

HU 204888 Β Int. CL⁵: C12 N 015/15

10. ÁBRA

A részleges CUSI-I szekvenciáknak, mint β-galaktozídáz fúziós proteinnek a kifejeződését szolgáié klónozó stratégia

HU 204 888 Β

Int. Cl.⁵: C 12 N 015/15

11. ÁBRA

A pBA17 expressziós plazmid szerkesztésének vázlata; a plazmid a CUSI-I C-terminális dóménjének (=CUSI-I második dómén) kifejeződését biztosítja

Hindin BamHI

Sáli

EcoRI

BamHI HinfI

Hincll

BamHI

Hindin Stop betöltés

HinfI vezér

HindUI nukleáz összekapcsolás ligázzal

HindHI^ Stop második •\ dómén

HU 204 888 Β IntCl.⁵: C12N015/15

123456789RS

-14.2