JP2696316B2 - ヒルジンの発現のためのベクター、形質転換細胞及びヒルジンの製造方法 - Google Patents
ヒルジンの発現のためのベクター、形質転換細胞及びヒルジンの製造方法Info
- Publication number
- JP2696316B2 JP2696316B2 JP60501396A JP50139685A JP2696316B2 JP 2696316 B2 JP2696316 B2 JP 2696316B2 JP 60501396 A JP60501396 A JP 60501396A JP 50139685 A JP50139685 A JP 50139685A JP 2696316 B2 JP2696316 B2 JP 2696316B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hirudin
- variant
- gene
- variants
- encoding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒルジン及びヒルジン類縁体をコードする
DNA配列のクローニング及び発現のためのベクター、こ
れらのベクターで形質転換された微生物、並びに醗酵に
よりヒルジンを得ることを可能にする方法及び得られた
ヒルジンに関する。 医薬的ヒルであるヒルド メデイシイナリス（Hirudo
medicinalis）の唾液腺に存在する抗凝血性の活性は、
ヒルジンとして知られる小さいポリペプチドに由来す
る。この非常に特異的で非常に効果的なトロンビンイン
ヒビターは、もしかすると非常に有用な治療薬であると
表明されたので、最近広く研究されている。しかしなが
ら、分離及び精製における極度の困難とコストのため、
それがより広く使用されること又は臨床レベルで研究さ
れることさえも妨げられていた。この物質のコストは、
2000U当り1300から1600フラン（1983年）のオーダーで
ある。 本発明は、ヒルジンの生物的特性を有する大量のポリ
ペプチドを得るために、異種の宿主細胞において組換え
DNA技術により遺伝子をクローニングし、それを発現さ
せることによりヒルジンを製造する方法にに関する。 ヒルの唾液腺から得られる抗トロンビン活性を持つポ
リペプチドは、1950年代の中頃に始めて分離された
（１、２）。このヒルジンとして知られるタンパクは、
ヒルの頭から出発してほぼ650倍に精製され１ミリグラ
ム当り8500ユニットの比活性（specific activity）が
得られている。 このタンパクの分子量は、ほぼ16000と推定された。
このタンパクは熱変性に対して安定で、等電点は4.8で
ある。紙上での電気泳動において、精製されたプロダク
トは単一のバンドの形で移動する。そしてアミノ酸分析
は、この物質が酸性アミノ酸即ちアスパラギン酸及びグ
ルタミン酸に非常に富むことを示す。 更なる精製（３）により、比活性は10400U/mgに増加
し、Ｎ−末端アミノ酸としてイソロイシンが同定された
（３、４）。 ヒルジン活性は、タンパク分解酵素のプラスミン、キ
モトリプシンＡ及びトリプシンによる消化に抵抗する
が、パパイン、ペプシン及びズブチロペプチダーゼ（su
btilopeptidase）Ａによる消化に対して感受性であるこ
とを示すことが可能であつた（３）。 推定分子量は、今では、当初の文献におけるものより
もやや小さく、この分子量は1000ダルトンのオーダーで
あると考えられている。そして、1:1のトロンビン−ヒ
ルジン コンプレツクスの解離定数の最初の推定（0.8
×10-10）は、これらの２つの分子間の極めて強い会合
を示している（５）。実際上の理由から、これら２つの
分子間の非共有結合コンプレツクスはインビボ非解離と
みなし得る。 ヒルジンの抗凝血剤としての活性のメカニズムは、理
解され始めたばかりである（５）。ヒルジンの結合のた
めの基質はトロンビンであり、トロンビンはタンパク分
解酵素であり、そのチモーゲン（酵素源）の形であるプ
ロトロンビンからの活性化（活性化フアクターＸによ
る）により、循環流中のフイブリノーゲンを開裂してフ
イブリンに変換する。フイブリンは、血餅の形成に必要
なものである。 ヒルジンは非常に特異的なトロンビンインヒビターで
あり、フイブリノーゲンによりも急速にトロンビンと反
応する。更に、他の凝固因子や他の血漿成分の存在は、
必要ではない。２つの分子間の相互作用は、トロンビン
のフリーのアミノ基のアセチル化がヒルジンの結合の喪
失を生ずることから、少なくとも部分的にはイオン相互
作用によるものである。更に、ヒルジンはフイブリノペ
プチドによつて占められるのと同じ部位で結合する。と
いうのは、アセチル化トロンビンはヒルジンにより阻害
されないエステラーゼ活性を保持しており、又トロンビ
ン中のセリン活性中心をリン酸化するDFP（ジイソプロ
ピルフルオロフオスフエート）で処理したトロンビン
は、ヒルジンと結合し続けるからである。 ヒルジン研究の次の進展は、ヒルの頭を切取るという
不便な方法に代えて、ヒル全体からヒルジンを抽出する
方法が開発されたことである（16）。この方法により得
られる最終生成物は、頭から得られたヒルジンと類似し
た生物学的活性を有しているが、抗トロンビンの比活性
は、ミリグラム当り6500ユニットである。 この化合物の推定のサイズは、平衡沈降（equilibriu
m sedimentation）により測定して12000である。しか
し、この方法と先の方法との間の重要な違いは、Ｎ−末
端アミノ酸として、以前に見出されたイソロイシンに代
つて、バリンが同定されたことである。この違いの原因
は、Ｎ−末端の二番目の成分がバリンであることが示さ
れたときに明白に説明された。ダンシル化ジペプチドの
val-valは酸加水分解に抵抗性であるので、それは第１
に、val-valのジペプチドを有する当初のＮ−末端がイ
ソロイシン誘導体と混同されたものと考えられた
（７）。というのは、これらの成分は、使用されたクロ
マトグラフイーの分離では充分には分解されないからで
ある。 動物全体からのヒルジンの調製は、第１図に示された
タンパクのアミノ酸配列の決定に使用された（８、
９）。ヒルジンに炭水化物は付加していないようである
が、63の位置のチロシン残基がＯ−サルフエートエステ
ル基で修飾されている。 この修飾の機能は知られていないが、多くの種類の動
物のフイブリノペプチドＢにおいても類似の修飾が起つ
ていることは重要である（９）。 最近の研究（10）によれば、サルフエート エステル
を完全に消失させたとき、活性は当初のヒルジン活性の
わずか55％に減少することが示されている。 ヒルジンのＮ−末端の性質の問題は、いくつかの研究
で再度取り上げられ（12、13）、ヒルジンには二種の異
なつた形態があることが示された。一つの形態は、活性
が低く、シユードヒルジンとして知られており、ヒルの
体から抽出されると考えられており、Ｎ−末端がval-va
l配列である。そして、頭において優勢である形態は、
活性が高く且つＮ−末端がイソロイシン基（radical）
を有していると思われる。 ヒルジンの特異的で非常に本質的な抗トロンビン活性
は、直ちに臨床上の用途即ち抗凝血剤としての用途を示
唆する。 ヒルジンは、その抗凝血特性について、動物において
非常に広汎に研究されてきた。最も詳細な研究（14）
は、ラツトにおける静脈血栓症（venous thrombose
s）、血管閉塞症（vascular occulsions）及び播種性血
管内凝固症（disseminated intravascular coagulation
s）（DIC）の予防においてのヒルジンの活性について記
載している。ヒルジンは、高度に精製された形で静脈内
に注射されたとき、ラツト、イヌ、ウサギ及びマウスに
よつて良く耐容される。マウスでのLD50は、より大き
く、体重1kg当り500000U（即ち60mg/kg）である。他の
研究（15）によれば、マウスは1kg当り1gの投与範囲に
耐容で、ウサギは静脈内及び皮下のいずれでも10mg/kg
までの耐容であることが示されている。マウスにおい
て、２週間にわたる繰返し注入は、感作反応（sensitiz
ation reactions）を惹起しない。２つの他の独立の研
究は、一つは犬を用い（16）、そして他は（17）ラツト
でのDICの予防におけるヒルジンの活性を示しており、
マークワルド（Markwardt）及びその共同研究者の肯定
的な結果と一致する。 ヒルジンは、ブタにおけるDICにより誘発された内毒
素を中和することも示されており、それによりブタでの
高い死亡率をもたらす内毒素症（endotoxinemias）によ
つて起こされる非常に深刻な問題の可能な解決策を構成
する。更に、実験動物中のヒルジンは、尚生物学的に活
性な形のままで腎臓から急速に排出される（半減期は１
時間のオーダー）。 この研究は、ヒルジンは抗凝血剤としての有用な臨床
薬を構成し得ることを示唆する。更に血液凝固の前段階
（pre-phase）はヒルジンの作用の高度な特異性の故に
影響されない。抗トロンビン活性は投与量に依存し、ヒ
ルジンの効果はその急速な腎性の排出故に急速に可逆的
である。DICがアンチトロンビンIII（ヘパリンの作用の
ために必要な補因子）の減少及び非常に効果的な抗ヘパ
リン剤である血小板因子（platelet factor）４の塩析
を伴うという事実から予測される様に、ヒルジンはDIC
の治療用としてヘパリンよりもはるかに優れていること
が示されている（14、17）。 一つの研究は、得られた結果の解釈が幾分困難なまま
であるが、ヒトの皮膚によりヒルジンが吸収され得ると
いう可能性を示している（19）。 粗ヒル抽出物の市販の製剤が入手可能である〔ヒルク
レイム（Hirucreme）、イクシルドーブルトゲル（Exhir
ud-Blutgel）〕が、これが有用な投与経路であるか否か
を確立するためには高度に精製された大量の投与量での
更なる試験を必要としている。 一般的に好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内及び経
皮的な経路である。ヒルジンのための他の投与経路、特
に経口の経路が報告されている（BSM 3792M）。 他の成分と組合せて、この製品は乾癬（psoriasis）
及び他の同じタイプの皮膚病（cutaneous disorders）
の治療に使用することもできることがDOS 2101393に記
載されている。 ヒルジンは、加えて、実験室での臨床試験における抗
凝血方法として及び研究道具として使用できる。この場
合、血液の凝固における単一の段階についての高い特異
性が、最も一般的に使用されその作用の特異性が劣る抗
凝血剤にまさつて本質的に有利である。 更に、ヒルジンは体外循環及び透析系における抗凝血
剤として非常に有用である。それは、特にこれらの人工
の循環システムの表面に活性な形で固定できれば、他の
抗凝血剤にまさつて本質的に有利である。 最後に、標識化されたヒルジンの使用は、トロンビン
及びプロトロンビンのレベルの測定のための簡易な且つ
効果的な方法を構成できる。 まとめると、ヒルジンは非常に多くの可能な次の如き
用途を有している： １）存在している血栓が拡がるのを予防及び防止するた
めの重大な血栓状態（critical thrombotic conditio
n）での抗凝血剤として； ２）実質的に生きたヒルの使用となるので、顕微鏡手術
（microsurgery）後の血腫及び腫張の減少のための抗凝
血剤として； ３）体外循環システムにおける抗凝血剤として及び被覆
合成生物学的物質のための抗凝血剤として； ４）試験室での実験における血液試料の臨床試験におけ
る抗凝血剤として； ５）凝固の臨床研究における抗凝血剤として及び実験道
具として； ６）痔（hemorrhoids）、拡張蛇行静脈（varicose vein
s）及び浮腫（edema）の治療における皮膚への適用のた
めの可能な局所剤として；並びに ７）乾癬及び他の関連した病気の治療における成分とし
て。 最後に、ヒルジンはトロンビンが干渉を起こす媒体中
でトロンビンと結合させるために使用できる（例えば、
アツセイ、実験又は処理血液）。特に、ヒルジンは体外
循環での凝固の制限を可能にする。 標識化されたヒルジンは、加えて、血餅の形成の検出
のために使用し得る。実際上、血餅形成は循環するプロ
トロンビンのトロンビンへの変換を必要とし、トロンビ
ンにはヒルジンが選択的に結合するようになる。患者の
体のあるポイントでの標識化されたヒルジンの蓄積の検
出は血餅の形成を視覚化し得る。 抗凝血剤としての多くの利点にもかかわらず、ヒルジ
ンは今まで臨床の研究においてさえも広くは使用されて
いない。これは、天然の物質が純粋な形で得るのが非常
に困難であり、就中可能な用途を示すべく臨床的な試み
を始めるためにさえも著るしく高価であるという事実に
よる。非常に純粋な試料を得るための適当な精製方法は
ある（20、21）が、基礎的物質（ヒル）を充分な量得る
ことが困難であるという大きな障害が残されている。 ヒルジンは様々の会社〔シグマ（Sigma）、プラント
オーガン（Plantorgan）、ペントフアーム（Pentophar
m）〕から商業的に販売されているが、かかる製剤は途
方もなく変動する活性を示し、又それらの純度は大いに
変動する。 この理由から、ヒルジンの組換えDNA工学による生産
は、このタイプの生産物を試験し使用するために、この
物質を合理的なコストで大量に得るための特に魅力的な
解決策である。 以下の記載において、「ヒルジン」という用語が最も
使用されるであろう。上述した事項及び本研究から現わ
れる他の因子とに照らし、ヒルジンにはいくつかの形態
があることが明らかであり、従つて「一つのヒルジン
（a hirudin）」という用語がより正しいであろう。 この理由から、以下の記載において、「ヒルジン」は
天然又は合成のヒルジンの形態のいずれか即ちヒルジン
としてインビボで同じ活性を有する生産物と理解され、
又時々は「ヒルジン類縁体」と称する。 更に、細菌から得られた「ヒルジン類縁体」と称され
る生産物はＯ−サルフエート エステル フアンクシヨ
ンに欠けているが、その一方で「細菌のヒルジンは天然
のヒルジンには現われないアミノ酸のメチオニンをＮ−
末端に含んでいるかも知れないということに注意するの
が適当である。しかし、「ヒルジン類縁体」はそれが生
産された後に特に化学反応又は酵素反応により修飾され
たところの保護された生物起源の生産物であるとも理解
されることが明らかである。 本発明は、ヒルジンまたはヒルジン類縁体をコードす
る遺伝子含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIle
およびThrをコードする配列から始まることを特徴とす
る宿主細胞でヒルジンまたはヒルジン類縁体をクローニ
ングおよび発現させるベクターに関し、これらのベクタ
ーは該遺伝子を宿主細胞で発現するのに必要な要素を含
んでいる。 発現の要素の性質は、宿主細胞の性質に応じて変化さ
せることができる。従つて、細菌細胞では、発現要素
は、少なくとも一つの細菌プロモーターとリボソーム結
合部位（該部位は、時々は翻訳開始のためのコーデイン
グ領域と称されものを構成する）を含むであろう。 一般に、本発明によるベクターは、ヒルジンをコード
する遺伝子に加えて、次のものを含むであろう； −細菌プラスミドの複製開始起源（origin of replicat
ion）、 −プロモーター、特にバクテリオフアージλプロモータ
ー:PL、PR又はＰ′Ｒの全部又は一部； −翻訳開始をコードする領域、これはヒルジン遺伝子の
５′端又は他のタンパクと５′サイドで融合したヒルジ
ン遺伝子の５′端のATGを含有する；この融合の理由は
E.コリ（E.Coli）中でより小さいものに分解する高分子
量のタンパクを発現させるのを可能にするためである。 プラスミドの複製開始起源が存在することは、相当す
る細菌細胞中でベクターを複製させるのに必須である。
そして、特にE.コリの場合にはおいては、プラスミドpB
R322の複製開始起源を好ましく使用できるであろう。プ
ラスミドpBR322は、実際上、高いコピー数を与え、そし
てそれにより所望のタンパクを生産するプラスミドの量
が増加するという利点を有している。 バクテリオフアージλプロモーターの中で、λPLと呼
ばれる主要な左向きプロモーターが好ましく使用できる
であろう。PLは、λの初期転写（early transcriptio
n）に関与する強力なプロモーターである。 他のバクテリオフアージλプロモーター、特に右向き
プロモーターPR又は第二の右向きプロモーターＰ′Ｒを
使用することも可能である。 非常に種々の翻訳開始配列の使用が可能であるが、バ
クテリオフアージλタンパクcII（以下、λcIIrbsとい
う）のリボソーム結合部位の全部又は一部を使用するの
が好ましい。 以下に示される様に、合成配列特に下記配列の全部又
は一部のようなものも使用できる： ATAACACAGGAACAGATCT▲▼。 問題のベクターは、加えて、例えばλのＮ遺伝子（λ
Ｎという）によりコードされた転写の終結阻害機能（an
titermination function）を含むのが好ましい。遺伝子
Ｎ転写生産物の存在下では、PLから出発した転写は、大
部分の停止シグナルを越えて、続いていく。 これにより、クローン化した外来遺伝子が停止シグナ
ルを持つ場合に起り得る早過ぎる停止（premature stop
ping）により引き起こされる問題を回避できる。加え
て、PLから開始した発現はN+の状況下（N+ environmen
t）で改善されることが示された。 大量の外来タンパクの継続的な生産を行なう場合の宿
主／ベクター系における毒性と不安定性の問題を避ける
ためには、誘導発現（inducible expression）系特に温
度誘導系の全部又は一部をプロモーターに結合させるこ
とによりプロモーターの活性の制御を可能とすることが
必要である。 外来タンパク合成の温度による制御は、宿主細菌中に
コードされた温度感受性のリプレッサー例えばcI857に
より転写のレベルで好ましく達成される。cI857は、28
℃ではPLの活性を抑制するが、42℃では不活性化され
る。該リプレツサーは、プロモーターPLに隣接したオペ
レーターOLに作用する。上記の場合において温度誘導発
現系の一部は宿種細菌の絶対必要な（integral）部分で
あるが、この系をベクター自体の部分を形成するように
することが可能である。 問題のベクターは、抗生物質抵抗性の遺伝子を含むこ
ともできる。例えば、pBR322の場合はアンピシリン抵抗
性であるが、テトラサイクリン（Tetr）又はクロラムフ
エニール（Cmr）に抵抗性である他の抵抗性遺伝子も使
用できる。 このようなマーカーの導入は、クローニングの実験の
間、本発明のプラスミドを保持する形質転換体を含む細
菌の選択のために必要である。 抵抗性遺伝子の導入は、醗酵の間選択の圧力を負わせ
ることにより（by imposing a selection pressure）プ
ラスミドの安定性を増加させることを可能にし、また更
に形質転換体の分離を容易にする。 クローニングのためには、外来DNAのプラスミドへの
挿入を検出できる系を使用するのが有利である。 例えば、E.コリβ−ガラクトシダーゼ（lacZ′）のＮ
−末端フラグメントとλcII由来の翻訳開始領域とを融
合することによりクローニングゾーンに該フラグメント
を供給することができ、これによりαフラグメントの翻
訳をcII配列の制御下に置くことができる。 該αフラグメントは、宿主中にコードされたＣ−末端
ωフラグメントの発現により補われ（conplemented）、
これが細胞中でのβ他−ガラクトシダーゼ活性を惹起す
る。このβ−ガラクトシダーゼ活性は、色素生産基質で
ある５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼの存在下で青色のコロニーを生ずる。 28℃では、PLプロモーターは不活性化され、αフラグ
メントは合成されず、そしてコロニーは無色のままであ
る。温度を42℃に上げたとき、PLプロモーターは活性化
され、αフラグメントは合成され、そしてコロニーが青
色になる。 この検出系中に位置するクローニングサイトへの外来
DNAの挿入により、β−ガラクトシダーゼの合成が妨げ
られ、そしてそのため28℃と42℃のいずれでも無色のコ
ロニーが生じるようになる。lacZ′遺伝子の検出を達成
するのを可能にする他の遺伝子で置換することも可能で
ある。 本発明により調製及び使用できる異なつたヒルジンの
中で、以下のものを挙げねばならない： ａ）HV2として知られ、バリアント２（variant 2）に相
当するヒルジンであつて、その構造は第１図において−
SO3H基を有し又は有しないもので示されるものに相当す
る； ｂ）バリアント２の修飾体に相当するヒルジンで、val-
valN末端配列がile-thrで置き換えられたもの； ｃ）HV1として知られ、バリアント１に相当するヒルジ
ンであつて、その構造は第18b図に示されるものに相当
するもの。 相当する遺伝子の構造は、実施例に示されるように、
アミノ酸の構造から演繹され得る；これらの遺伝子は公
知の合成DNA調製法のいずれの方法によつても合成でき
る。 Ｎ−末端の構造がile-thrに相当するヒルジンが好ま
しく使用されるだろう；相当する遺伝子の異なつた構造
が実施例に示されるであろう。 本発明は、細胞特に細菌殊にE.コリの菌株であつて、
公知の技術を用いて、本発明のベクターで形質転換され
たものに関する。該公知技術のいくつかは実施例におい
て記載されるであろう。 最後に、本発明は、上記の如く形質転換された細菌を
培養培地で培養し、次いで生成したヒルジン又はその類
縁体を回収する、ヒルジン又はその類縁体の製造法に関
する。 使用される培養培地は、当業者にとり公知のものであ
り、培養される各菌株に適したものとすべきである。培
養は、形質転換された菌株が耐性を示す抗生物質の存在
下で行なうのが好ましい。 ヒルジン又はその類縁体は、醗酵混合物を酸性pHに
て、特に50〜80℃、pH1〜３の条件下、殊に70℃、pH2.8
の条件下で加熱し、該ヒルジンを含有する上清を回収す
ることにより精製又は予備精製（prepurified）され
る。 また、トロンビンが結合された樹脂を用いて、トロン
ビンに対するヒルジンの親和性を利用し、ヒルジンを含
有する該混合物を上記の如き樹脂上を通過させると、ヒ
ルジンは結合される。これは、次いで、ヒルジンに対す
る競合剤を含有する溶液で溶離される。 本発明は、最後に、本発明の方法を実施することによ
り得られるヒルジン又はその類縁体、即ち、細菌由来の
ヒルジン又はその類縁体のみならず、細菌による産物か
ら化学反応又は酵素反応、例えば化学的又は酵素的開裂
又は−SO3H基を結合するための化学的又は酵素的反応に
より得られたヒルジン類又はその類縁体にも関するもの
である。 特に、本発明は、次式の全部又は一部を含有するペプ
チドに関する。 上記ペプチドは、対応するコーデイング配列と共に示
されているが、該配列は、ペプチドの一部を構成するも
のではない。 また、本発明は、第18図に示す如く、ヒルジンHV1及
びHV2の変異種にも関する。 本発明は、活性成分としてヒルジン又はその類縁体を
含有する薬理作用を有する医薬組成物として使用でき
る。 これら組成物は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投
与、皮下投与、経口投与又は局所的皮膚投与により適用
される。 これら組成物は、この分野で公知の賦形剤、及び必要
に応じて他の活性成分を含有する。 本発明は、当然に、他の側面、特に実施例に記載され
るある種のプラスミド及びその変異種及び誘導体をも含
有し、また、一般に、上記形質転換された細菌の醗酵方
法及びそれにより得られた産物を包含する。 本発明の他の特徴及び利点は、下記実施例及び添附図
面を読むことにより、より一層充分理解されるであろ
う。 図面において、 ・第１図は、ヒル全体（whole leech）から抽出された
ヒルジンのアミノ酸配列を示す。 ・第２図は、スクリーニングのために設計された48量体
オリゴヌクレオチドプローブを示す。 ・第３図は、クローンpTG717のヒルジン配列を示す。 ・第４図は、標識化プローブと各種pTG717制限（restri
ction）とのハイブリダイゼーシヨン混合物のオートラ
ジオグラフを示す。 ・第５図は、pTG717における挿入物（insert）の制限地
図を示す。 ・第６図は、ヒルジンの発現のための二つのベクター、
即ちpTG927から誘導されたpTG718及びpTG951から誘導さ
れたpTG719の構造を詳細に示す。 ・第７図は、上記二つのベクターに対するE.コリ抽出物
中のヒルジン活性の経時変化をグラフとして示すもので
ある。 ・第８図は、ヒルジン活性を含有する標識化E.コリ抽出
物の分析を示す。 ・第９図は、第８図と同一の抽出物ではあるが酸性pHに
て熱処理後のものの分析を示す。 各図中に表わされている各種ヌクオレチド配列は、本
記載の明白な一部を構成するものと考えなければなら
ず、該配列が明細書本分中に再現されていないのは、明
細書を不必要に煩雑化させないためであることを説明し
ておくのが適切である。 下記実施例で使用されている手法の多くは、当業者に
公知のものであり、そのいくつかは添附参考文献中に記
載されている。従つて、特殊な手法に限り以下の記載に
記載する。使用した菌株の性質は一般的情報により記載
する。 ａ）細菌菌株 本発明で使用される細菌菌株は次の通りである。 ・TGE900、これは次の特徴を有するE.コリ株である:su-
F-his ilv bio（λcI857ΔBamΔHI）。 ・N6437、これは次の特徴を有するE.コリ株である:F-hi
s ilv gal+ 8proC+:tn10lacΔm15（λcI857ΔBamΔHI） ・Jm103、これは、次の特徴を有するE.コリ株である：
Δ（lac-pro）supE thi endA sbc B15 sttA rk- nk+/F1
traD36 proAB+ lacia lacZΔm15。 上記株は入手可能であつたため使用したが、詳細な説
明中に記載される或る必須の特徴を有する限り他の菌株
を使用することも可能である。 下記実施例は、次の段階から本質的になつている。 １）mRNA分子の製造とcDNAライブラリーの形成、 ２）プローブの製造、 ３）このプローブによる上記ライブラリーの選別及びヒ
ルジンをコードする配列を含有するプラスミドの同定、 ４）ヒルジンをコードする遺伝子の発現のためのベクタ
ーの製造、 ５）得られた結果の検討。 RNAの製造 ヒルド・メデイシナリス（Hirudo medicinalis）種に
属する生存ヒルを、フランス国のボルドー地方（Bordea
ux region）にて集める。これらは最低４週間絶食さ
せ、次いで断頭し、頭部を直ちに液体窒素中で凍結させ
る。液体窒素中で頭部を微細粉末となるまで磨砕するこ
とにより、全頭部RNAを抽出する。この粉末1gに、NETS
緩衝液（10mM Tris HCl、pH7.5、100mM NaCl、1mM EDT
A、0.5％SDS）5ml及び再蒸留したフエノール5mlを加
え、両者を95℃に予備加熱する。次いで、この溶液を渦
巻き攪拌により混合し、30,000gにて遠心分離し、水層
をNETS緩衝液1mlで再抽出し、水層を合せて新しいフエ
ノール5mlで再抽出する。RNAは、２容量のエタノールを
添加することにより沈澱し、混合物を−20℃にて４時間
放置した後、遠心分離により集められる。暗褐色ペレツ
トを蒸留水2.5mlに溶解させ、5M LiCl2.5mlを添加し、
混合後、該溶液を４℃にて一夜放置する。次いで、該溶
液を、3M LiCl5mlで濃厚化し、４℃、20,000gにて10分
間遠心分離を行なう。上清を除去し、淡色のRNAペレツ
トを水1ml中に入れる。これを0.25M NaCl中に入れ、２
容量のエタノールで該RNAを沈澱させる。この最終RNAペ
レツトを遠心分離により回収し、次いで蒸留水に溶解さ
せ、−80℃にて保存する。該RNA濃度は、260nmにおける
吸収により測定される。 ポリアデニル化メツセンジヤーRNAを、オリゴ（dT）
−セルロースを用い、標準的方法（22）を用いて製造す
る。mRNAの収率は、出発物質の全RNA量の約２〜５％で
ある。 相補的なDNAの製造及びベクタープラスミドpBR322にお
けるcDNAライブラリーの構築 使用した手法は、ヒト肝臓mRNAライブラリーの構築に
用いられた、参考文献23に記載の方法と全く同一であ
る。ヒル頭部mRNA分子を、オリゴ（dT）“プライマー”
及び逆転写酵素を用いてDNAの形に複製する。第２のDNA
鎖はDNAポリメラーゼを用いて合成され、ヘアピンはS1
ヌクレアーゼを用いて開かれ、二重鎖cDNAはスクロース
グレーデイエントにより精製される。特定のサイズのcD
NA分子を、酵素ターミナルデオキシトランスフエラーゼ
を用いて少量のdC延長を伴い、３′末端で停止させ、次
いでPstIIにより切断されポリＧ末端を有するpBR322ベ
クターに結合される。得られるプラスミドは、E.コリ株
（1106株）を形質転換するのに用いられ、テトラサイク
リン耐性形質転換体（二重鎖cDNA1ng当り500〜1000の効
率で得られる）は、テトラサイクリン150μg/mlを含有
するＬ−寒天プレート上で生育される。43,000個の形質
転換体を含むcDNAクローンのライブラリーが確立され、
細胞は、コロニーからかき集めて回収され、テトラサイ
クリンを含有するＬ−ブロス中に再懸濁される。懸濁液
は、50％強度（strength）のグリセロール中で製造さ
れ、−20℃にて保存される。 ライブラリーのスクリーニングのためのDNAプローブの
製造 ヒルジンにつき公表されたアミノ酸配列（第１図）
は、メチオニン又はトリプトフアン、即ち、単一のコド
ンによりコードされたアミノ酸を有しないことを考慮す
ると、その蛋白質配列は、一般にクローン化された配列
を同定するのに用いられる戦略（strategy）を構成する
特に単鎖のオリゴヌクレオチドプローブを製造するのに
殊に好ましい領域を有しない（24）。このため、単一で
あるが、大きなオリゴヌクレオチドプローブを用いる異
なつた手法を採用することが決定され、これにより、特
にヒト凝血因子（human clotting factor）IX（23）の
ためのcDNAクローンを単離することが可能となつた。こ
の戦略において、アミノ酸配列領域が選択されるが、こ
れに関しては、コドンの重複性（redundancy）は三番目
の塩基の選択に限定され（即ちアルギニン、ロイシン及
びセリンは除外される）、該三番目の塩基が選択され
る。このコドンの該三番目の塩基を選択するための当該
パラメーターは公知であり、これは、G/T相互作用（int
eraction）の可能性を最大にし、プローブ配列において
ヘアピンとパリンドロームを避けること、そして勿論ヒ
ルに関する公知の遺伝子配列を考慮することにかかつて
いる。 ヒルに関する遺伝子配列は全く公表されていなかつた
ので、進化論的な見地からヒルに最も近い生体に関する
知見を利用することが必要であつた。そして、このため
には、多くの公表されたDNA配列が存在し、即ち、昆虫
である。昆虫DNA分子に対する全てのコーデイング配列
が分析され、最も頻繁に生じるコドンに関する表が作製
された。他のパラメーターと共に、これが、ヒルジン配
列中の34の位置から49の位置までの16個のアミノ酸に対
応する、48塩基の長さのオリゴヌクレチオドを設計する
のに用いられた、。この配列領域は、各コドンの第三番
目の位置においてのみ重複性を示す。 このオリゴヌクレオチドは、第２図に示されており、
参考52量体（23）について既に記載された無機固体支持
体（25）上で、フオスフオジエステル法により化学合成
された。 48量体オリゴヌクレオチドによるcDNAのスクリーニング ヒルの頭部mRNA分子から形成されたcDNAライブラリー
を、テトラサイクリン15μg/mlを含有するＬ−寒天プレ
ート上でに、13cmプレート当り約4,000コロニーのコロ
ニー密度で平板培養し、該コロニーを、37℃にて直径１
〜2mmの大きさとなるまで生育させる。該コロニーを、
次いでニトロセルロースフイルター上に移す。維持され
たプレート上のコロニーは生育され、該プレートは次い
で４℃にて保持される。上記フイルターは、クロラムフ
エニコール170μg/mlを含有するＬ−寒天のプレート上
に置かれ、細菌コロニー中のプラスミドを増大させるべ
く、37℃で一夜インキユベートされる。該フイルターを
次いで標準的な方法で処理し、該細菌コロニーを溶解
し、DNAをニトロセルロースに結合させる。次いで、該
フイルターは完全に洗浄され、100mlの６×ssc（１×ss
c＝0.15％NaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウム）、５×
デンハーツ（Denhardts）（１×デンハーツ溶液＝0.02
％フイコール（Ficoll）、0.02％のポリビニルピロリド
ン、0.02％の牛血清アルブミン）100μg/mlのイースト
転移RNA及び0.05％のソデイウム・ピロフオスフエート
の容量中でプレハイブリダイズされる。 該48量体オリゴヌクレオチドのアリコート（30pmol）
は、15ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼの存在下で
γ〔32P〕ATPと共にインキユベートすることにより、そ
の５′末端において〔32P〕で標識される。該標識化プ
ローブは、遊離のγ〔32P〕ATPからDEAE−セルロース上
を通過させることにより精製される。 該標識化プローブは、フイルター上で、20mlの６×ss
c、１×デンハーツ（Denhardts）、100μg/mlのイース
トtRNA、0.05％のソデイウム・ピトフオスフエートの量
にて、42℃で16時間緩かに攪伴してハイブリダイズされ
る。 該フイルターは、次いで、６×ssc、0.1＃のドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）中、37℃、42℃及び50℃の温度
にて洗浄され、次いで２×ssc、0.1％SDSを用いて50℃
で10分間最終的に洗浄される。該フイルターは、次いで
乾燥され、Ｘ線フイルム上に露出される。Ｘ線フイルム
上のポジテイブのスポツトとマスタープレートとを比較
することにより、標識化プレートから、ポジテイブの結
果を与えるコロニーが同定される。これらクローンの一
つ（そのプラスミドを以下「pTG700」と呼ぶ）は、標識
化プローブとの第二回目のハイブリダイゼーシヨンによ
りポジテイブであることが確認され、多量培養され、プ
ラスミドDNAは標識的な方法で精製される。 ヒルジンをコードする配列を含有するものとのpTG700の
同定 pTG700のcDNA挿入物は、約235塩基対を有する。このD
NAフラグメントは単離され、ベクターフアージm13mp8中
に転移され、該挿入物のDNA配列が鎖停止（chain termi
nation）（26）により決定される。この配列の一部が、
ヒルジンの蛋白質配列と非常に類似する蛋白質配列をコ
ードする。該配列のこの領域は、第２図に示すプローブ
の領域に対応する。 この第２図において： （ａ）は、参考文献２に示されるglu49からgly34までの
ヒルジン配列に対応する。 （ｂ）は、合成され、ハイブリダイゼーシヨンに用いら
れた48量体プローブの配列に対応する。 （ｃ）は、この領域におけるクローンpTG700の配列に対
応し、ドツトは相同関係（homology）を示す。 （ｄ）は、pTG700のこの領域においてコードされるアミ
ノ酸配列に対応する。 留意すべきは、pTG700のcDNA配列は不完全であり、フ
エーズの合つた停止コドンの後の３′−非翻訳配列の10
1塩基に加えて、ヒルジンのｃ−末端アミノ酸の内の28
個のみをコードするにすぎないことである。ヒルジンに
対する公表された蛋白質配列との相違点の一つが、この
クローンにおいて観察される。なぜならば、位置49にお
いてグルタミン酸がグルタミンを置換しているからであ
る。 より大きなヒルジンcDNAのクローンの単離 DNA配列からpTG700挿入物がヒルジンをコードするこ
とが確認されるので、該挿入物は公知の“ニツク翻訳
（nick translation）”の方法により〔32P〕で放射性
を付与され、cDNAライブラリーについての新たな試験に
用いられる。数種の他のポジテイブのコロニーが見出さ
れ、その一つは、pTG717と呼ばれるプラスミドを含有
し、pTG717は長さ約450塩基対の挿入物を含有する。こ
の挿入物の制限分析は、中心の領域にTaq1制限部位が存
在することを示す。 このため、精製フラグメントをtaq1て消化し、生じる
５′及び３′フラグメントを、PstI/AccIで開裂された
配列ベクターm13中に結合する。m13の構造は、いずれも
同定可能で配列分析（sequential analysis）に供し得
るフラグメントを含有する。この分析の結果は、第３図
に示される。pTG717挿入物のDNA配列から、操作のクロ
ーニングの間に鎖末端に導入されたポリG/C末端を差引
くと、長さ379塩基となり、該塩基の219個が、公表され
たヒルジンの配列と非常に類似する配列のペプチドをコ
ードする。 該配列においては、各種の事項が留意されなければな
らない。 １）該フラグメントによりコードされたアミノ酸配列
は、天然のヒルジンについて公表された蛋白質配列のそ
れとは同一ではない。pTG717から単離されたヒルジン配
列と公表されたヒルジン配列との間には、９個のアミノ
酸の相違がある。次の変更が認められる： Val1-ile;val2-thr;gln24-lys;asp33-asn;glu35-lys;ly
s36-gly;lys47-asn;gln49-glu及びasp53-asn。これは、
該配列における大きな変更を構成する。なぜなら、これ
ら変更の内７つがチヤージにおける変更を含んであるか
らである。従つて、該クローン化されたコーデイング配
列と公表されている蛋白質配列との間の相同性（homolo
gy）は、46/65、即ち、約70％である。これら二つのア
ミノ酸配列間で観察された相違点には、二つの理由が考
えられる。 １−ヒルジン分子の正確な配列間で、種（species）、
亜種（subspecies）更には個々の動物の変異（variatio
n）が認められる。本研究で用いたヒルが、アミノ酸配
列を公表するのに用いられたヒルと同一の種又は亜種で
あるか否かを確認することはできない。しかも、ヒルに
は、１種のみならず各種の形態のヒルジンがあり、同様
な生物学的活性を有するが基本的なアミノ酸配列におい
て変異を有する可能性もある。この意味において、ヒル
ジンのＮ−末端アミノ酸に関する文献上の結果における
相違点について言及するのが有意義である（当初、ile
は頭部からの物質中に見出された。次いで、valが動物
全体において見出された。その一方で、最近ileは、頭
部由来の物質に対し再び示された。イソロイシンは、pT
G717配列において、成熟蛋白Ｎ−ターミナル末端に対応
する位置に存在する。 ヒルジンに異なる形態が存在するという考え方は、DN
Aレベルの予備的研究によつても支持される。ヒルの全D
NAを、標準的な方法で磨砕凍結ヒルから抽出し、各種制
限酵素で消化し、アガロースゲル上で電気泳動処理を
し、次いでニトロセルロースに移し、プローブとしての
pTG717挿入物とハイブリダイズする場合、ハイブリダイ
ズする多量のフラグメントが観察される。 即ち、第４図の結果は、次の如くして得られる。 −ヒルの全DNAの10μｇを制限酵素で消化し、１％アガ
ロースゲル上で電気泳動に圧し、ニトロセルロースフイ
ルター上に移し、〔32P〕−標識pTG717のPstI挿入物で
ハイブリダイズする。該フイルターを完全に洗浄し（0.
1×ssc、0.1％SDS、65℃）、ハイブリダイズしたバンド
をオートラジオグラフイーにて顕現化する。 レーン1:EcoRIで消化されたDNA レーン2:HindIIIで消化されたDNA レーン3:BamHIで消化されたDNA レーン4:BalIIで消化されたDNA EcoRIフラグメントのkbによる大きさが右側に示され
ている。 EcoRI消化フラグメントに関し、計40kbの６フラグメ
ントが非常に厳重な（stringent）洗浄条件下で認めら
れる。たとえ、このスキームが非常に広いモザイク遺伝
子を示していることが理論的に可能であるとしても、40
0を下回る塩基をコードする単一の小さな配列が40kbの
ゲノムに分布しているとは考えにくい。しかも、部分的
な挿入フラグメントを含有するプローブでの予備実験
は、そうではないことを示唆している。 また、同一のcDNAライブラリーから単離されたヒルジ
ンの異なるクローンにおける配列にも相異があることが
観察された。例えば、pTG700において、lysは公表され
ているアミノ酸配列と同様に位置47に見出される（第２
図）がpTG717においてはこの位置にasnが存在する。 上記理由により、これら全てのデーターは、蛋白のレ
ベルで多様な形態を示す異なる構造のヒルジン遺伝子の
概念に一致する。 最後に重要な点は、全ヒルジンmRNA配列が、確かにpT
G717には存在しないことである。事実、オープンリーデ
イングがクローンの５′末端まで続き、この領域にはメ
チオニンは含まれない。ヒルジンは、唾液腺細胞から分
泌される蛋白であるので、そのＮ末端にリーダー（lead
er）配列（分泌に必要な）を有していると考えられ、ま
たプロ配列（pro-sequence）の存在が考えられる。次い
で、最終的に活性な分子が、多くのチモーゲン及び前躯
体における場合のように、蛋白分解の開裂段階（proteo
lytic cleavage stage）で生産されるのであろう。 ヒルジンmRNAの大きさを決定し、クローンpTG717は、
その完全なコピーではないことを確かめた。ヒルジンの
全頭部RNAを、ホルムアルデヒド変性アガロースゲル上
電気泳動にかけ（27）、ニトロセルロースに移し、pTG7
17挿入物でハイブリダイズした。単一の、640塩基対の
ハイブリッドRNA種が観察される。pTG717は全３′mRNA
配列（ポリＡ部分が観察される）、及びポリＡから約20
塩基重複する２つのポリＡ付加サイトを有していると考
えられるので、160bpの３′非−翻訳領域が見られる
（第３図）。このcDNAクローンは、その５′末端に160
個の塩基対を欠失している。これは目的蛋白のＮ末端の
残り、イニシエーターのメチオニン及び該mRNAの５′非
−翻訳領域を有する。ヒルジンが他の生物学的に活性な
ペプチドをコードし得る、より大きい全躯体の形態でそ
のＣ−末端から切断されることは排除できないが、この
仮説の前躯体の最大のサイズは、少なくとも110〜120の
アミノ酸（即ち成熟ヒルジンのサイズのほぼ２倍）に相
当すると考えられる。 pTG717より長いcDNAクローンを生成することは可能で
はなく、またmRNAの５′末端における二次構造（second
ary structure）は、この点を越えるmRNAの逆転写を防
止すると考えられる。ヒルジンのゲノムの配列の分析か
らこの遺伝子の５′末端のデーターが得られるであろ
う。 クローンpTG717によりコードされたヒルジンのアミノ
酸配列をE.コリー（E.coli）細胞内で発現されるよう
に、以下の手法により適合させた。 ヒルジンのE.コリー内での発現 pTG717の制限分析（第５図）から、アミノ酸をコード
する配列のすべてが、225bpのHinfI-AhaIIIフラグメン
トの形態で存在していることが明らかである。このフラ
グメントを、制限で単離し、プラスミド発現ベクターpT
G951及びpTG927に、合成オリゴヌクレオチドアダプター
分子を用いて挿入した。該アダプターは、HinfI制限に
よりＮ末端から除去された７つのアミノ酸からなり、ま
た発現ベクターに挿入されることを要求されるイニシエ
ーター メチオニン フラグメントと制限酵素エンドヌ
クレアーゼNde及びBglIIのためのサイトとが追加されて
いる。 metイニシエーターの後の２つのアミノ酸は置換され
ている。即ちpTG717cDNAクローンに見られるile-thrフ
ラグメントは、公知のヒルジン蛋白配列のval-valによ
り置換されている。 pTG717cDNAクローンは、ヒルジンにつき公表された配
列であるval-val配列の代りにile-thr配列を有している
が、Ｎ−末端にval-val配列を有する分子を発現させる
ことが、最初に決定された。この選択には下記２つの理
由がある。 −cDNAクローンは確かに不完全であり、おそらく転写を
防止するmRNAに二次構造があると考えられる。これは
「人工物」の転写及びクローン化を考慮すれば、該cDNA
配列の５′末端を、不正確にする、 −全動物から抽出された活性なヒルジン分子のＮ−末端
がval-valから始まつていることは、一般に認められて
いる（８、11）。 発現ベクターpTG951は、γ−インターフエロン遺伝子
の発現用にデザインされたプラスミド発現ベクターであ
る。その合成は本記載の終わりに詳述する。 実際上、それは、要素として、温度感受性宿主c1857
によつてコードされたリプレツサーで制御されるバクテ
リオフアージの左向きプロモーターPL、次いでインタク
トの又は切断されたλのＮ遺伝子を含有している。次い
で合成リボソームに結合するサイトが存在し、これは、
リボゾームの最適な結合を与えるようにデザインされて
いる。単一のBglII制限サイトが、リボソーム結合サイ
トとγ−インターフエロンをコードする配列のATGとの
間に存在する。このベクターは、BglIIサイト及びγ−
インターフエロンをコードする配列の下流の単一のPvuI
サイトで消化され、次いでアガロースゲル上電気泳動で
回収される。このベクターフラグメントを、第６図に示
すように、アダプター オリゴヌクレオチド結合体（as
sembly）及びHinfI-AhaIIIフラグメントを含有するヒル
ジン配列と結合させる。 発現ベクターpTG927は、本記載の終わりに記載する発
現ベクターpTG908と密接に関連している。これは単にpB
R322のテトラサイクリン遺伝子由来の付加的SalI-PvuII
フラグメントを含む点において異なるのみである。発現
ベクターpTG927は、プロモーターPL、インタクトのＮ遺
伝子及びλCII蛋白のリボソーム結合サイト、次いでATG
及びβ−ガラクトシダーゼのlacZフラグメントをコード
する配列を含んでいる。NedIサイトは、このコード配列
のATG上に認められる。該ベクターはNedI及びPvuIIで消
化され、ベクターフラグメントが精製され、他のオリゴ
ヌクレオチド アダプターの組合せ及びヒルジンのHinf
I-AhaIIIフラグメントと共に用いて、第６図に示す第二
のヒルジン発現ベクターを構築する。これらの２つの発
現ベクターは、天然のヒルジン分子（ATGイニシエータ
ーの直後のＮ−末端にval-val配列を有する）を発現す
るようにデザインされている。 アダプター オリゴヌクレオチドにおいて、第３番目
の塩基のコドンは、翻訳を高度に促進するように、そし
てこの領域のレベルでmRNAに二次構造が形成されること
を回避するように選択される。 ２つのベクターは以下の手法により組み合される。即
ち、オリゴヌクレオチド相互を、ポリヌクレオチド キ
ナーゼを用いてその５′末端でリン酸化し、次いで等モ
ル混合物として処理（65℃で10分間加熱後、15℃で15時
間）する。ベクター及びヒルジン フラグメントを、ベ
クター／ヒルジン フラグメント／アダプター フラグ
メントのモル比が1:20:50となる量で添加し、混合物をT
4DNAリガーゼを用いて連結させる。該リゲーシヨン混合
物を用いてＥ・コリー株TG900を形質転換させ、プラス
ミドを担う形質転換体を、アンピシリン（100μg/ml）
を含む寒天プレート上で選別し、ヒルジンをコードする
配列を含むものを、プローブとして標識化したpTG171挿
入物を用いてコロニーハイブリダイゼーシヨンにより同
定する。多数のポジテイブクローンから各６株と共に１
株のネガテイブ（親株）を選別し、650nmでの光学密度
が0.3となるまで30℃でＬ−ブロス液体培地で培養す
る。PLプロモーターから始まる発現を、次いで、温度を
37℃に上昇させて誘発し、インキユベーシヨンを６時間
続ける。次いで細胞を遠心分離により収穫し、TGE（25m
Mトリス塩酸、pH8、50mMグルコース、10mM EDTA）の1/5
容積に懸濁させ、超音波粉砕する。遠心分離による抽出
物の清澄化の後、上清のアリコート（aliquot）をその
抗トロンビン活性試験に供する。６つのpTG 927構築物
の内５つに、高レベルの抗トロンビン活性が認められ、
また６つのpTG951構築物の内４つに、弱いものであつた
が、活性が認められた。 コントロールには如何なる有意な活性も認められなか
つた。プラスミドの直接配列化（direct sequencing）
によりホジテイブの結果を与えるクローンのDNA配列の
分析によつて、活性を示す全ての構築物に所望の配列が
存在することが明らかとなつた。 ポジテイブの発現を示す２つのクローン、pTG951由来
のクローンpTG719及びpTG917由来のクローンpTG718を、
誘導の６時間に渡つて分析する。30℃で光学密度が0.3
になるまで培養物を生育させた後、温度を37℃に上昇さ
せて発現を誘発させ、上記で調製した抽出物から６時間
に渡つて毎時間アリコートを取り出し、ヒルジン活性を
測定する（29）。その結果（第７図）から、クローンpT
G719は、最初の生育に次いで３〜４時間後に活性のプラ
トー（plateau）を示し、これは650での光学密度で370U
/lのレベルである。 これに対し、クローンpTG718は、より強い活性を示
し、これは上記誘導期間の全般に渡つて上昇を続けた。 ６時間後に得られた活性のレベルは、クローンpTG719
のほぼ５倍強いものであり、培養物当りの全活性は7300
μg/lであつた。もし上記ヒルジン組換体が天然のval-v
al産物と同様の特異活性を示すなら、最も活性な抽出物
で得られる生成物は、ほぼ1mg/l培養物に相当するであ
ろう。 生成ヒルジンの性質 E.コリーから得られたヒルジンを特徴付けるために、
誘導後の培養物サンプルにつき分析を行なつた。これ
は、70℃で15分間加熱するか又は塩酸でpHを2.8に下げ
た後70℃で加熱して行なつた。後者の場合、抽出物のpH
を、分析に先だつて中性に戻した。上記と同様にして処
理した天然のヒルジンは、公表された該分子の性質（2
0）に照らし予想されるように、活性の消失を認めなか
つた。抽出物の場合、上記処理後活性の消失は見られな
かつた。実際には、上記処理後、約２倍の活性増加が認
められた。このことはヒルジンの活性を阻害していた抽
出物成分の分解又は不活性化を反映するものと考えら
れ、また比較的低いpH及び加熱段階が、ある場合には、
ヒルジンが最大の活性を示すのに必要なジスルフイド結
合のより完全な再形成を与えるためとも考えられる。対
照の抽出物は、上記処理の前及び後のいずれも活性を示
さない。 細菌抽出物を、セフアロース樹脂に結合させたトロン
ビンを用いてプレインキユベートし、トロンビン−セフ
アロースを遠心分離により除去すると、実質的に全ての
最初のヒルジン活性が抽出物から除去される。本発明に
より得られるヒルジンは、トロンビン−セフアロース樹
脂に非常に効果的に結合すると思われ、このことから上
記細菌性ヒルジンの可能な精製手段が提供され得る。 発現ベクターpTG718を含む細胞の細菌性培養物を、30
℃で光学密度が0.3になるまで培養し、次いで37℃で誘
導し、毎時間毎にそのアリコートを回収し、最小培地上
で100μCi/mlの［35S］メチオニンでラベルする。該細
菌を遠心分離により集め、ラベルされた細菌性蛋白の組
合せをSDS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、
次いでフルオログラフイーで分析する。 ベクター構築物によりかなりの量で誘発された少なく
とも２つのポリペプチドが、約６〜8,000ダルトンにて
認められる（第８図のレーン５〜10）。 非誘導pTG718培養物由来の標識化物質及び誘導後３及
び５時間の培養物由来の標識化物質を、70℃及びpH2.8
で15分間処理し、遠心分離により変性蛋白を除去し、SD
S−ポリアクリルアミドゲル上で分析すると、標識化し
たE.コリー蛋白質の大部分がサンプルから除去されるこ
とが明らかである（第９図のレーン１及び２）。この方
法は、ヒルジン発現ベクター中で誘導される低分子量の
２つのバンドの非常に有効な精製法を与える。 全てのヒルジン活性が上清中に認められた。 ベクタープラスミドpTG951及びpTG927の製造 これらのベクタープラスミドは、γ−インターフエロ
ンのクローニングで用いられたものであるか又は上記の
如きベクターの製造に関与するプラスミド由来のもので
ある。上記合成を添附の各図面に関連して簡単に述べ
る。 −第10図はpTG907の製造を示す。 −第11図はM13TG910の製造を示す。 −第12図はpTG908の製造を示す。 −第13図はpTG909の製造を示す。 −第14図はpTG941の製造を示す。 −第15図はpTG951の製造を示す。 上記各ベクタープラスミドの製造は、基本的には、a-
PL、Ｎ及びCIIrbsを含むベクターpTG908の製造 ｂ−合成リボソームに対する結合サイトを含むベクター pTG951の製造 を包含している。 pTG907の製造（第10図） 使用した親プラスミドは、プラスミドpBR322である。
しかしながら、該プラスミドpBR322は、ampR遺伝子中に
PstI制限サイトを有する不利がある。なぜなら、引きつ
づき同じ性質のサイトを、クローニングゾーンにおい
て、単一の制限サイトとして用いるからである。従つ
て、上記PstI制限サイトを、プラスミドpBR322の変異体
であるプラスミドpUC8を用いて消失させるのが適当であ
る。該pUC8においてアンピシリン耐性遺伝子は、PstI制
限サイトを有していない（このサイトはインビトロでの
変異により除去されている）。pBR322は特にベテスダ
リサーチ ラボラトリーズ（Bethesda Research Labora
tories）から市販されており、pUC8は、参考文献30とし
て示した文献に記載されている。 上記目的のため、pBR322の1,669bpのPvuI-PvuIIフラ
グメントを、プラスミドpUC8の同様のPvuI-PvuIIフラグ
メントと交換する。この交換を実施するために、プラス
ミドpBR322及びpUC8をPvuI及びPvuIIで順次処理し、次
いでリガーゼの作用により環化させる。 もはやPstI制限サイトを有さず、またpBR322に始めに
存在していたNdeI制限サイト（図示せず）をもまた欠失
しているプラスミドpTG902を、かくして得る。更に、プ
ラスミドpTG902は、PvuIIサイトが存在するlaci′配列
に相当する50kbのフラグメントを保有している。 PLプロモーター及びλＮ遺伝子（フアージλ由来、λ
Ｎ遺伝子は転写の終結阻害機能をコードする）を、プラ
スミドpKC30から単離し、pTG902に挿入する。これは第1
0図に示すように、pTG902をEcoRI、S1、BamHIで処理
し、pKC30をPvuＩ、S1、BamHIで処理し、連結させるこ
とにより行なわれる。 TGE900株の形質転換後に得られたプラスミドの内のひ
とつpTG906を、処理してPvuII-SalIセグメントを除去す
る。この目的のために、pTG906をSalI、S1ヌクレアー
ゼ、PvuII及びリガーゼを用いて順次処理する。pTG907
をかくして収得する。 M13TG910の製造（第11図） λcIIrbsリボソーム結合領域、（ribosome binding r
egion、これもフアージλ由来である）を、次いでAvaI-
TaqIフラグメントの形態でLacZ′遺伝子（β−ガラクト
シダーゼのαフラグメント）の始めに挿入する。該遺伝
子はM13tg110として知られるフアージM13内でクローン
化されている。上記戦略（strategy）はrbsのための簡
単な機能的試験、即ちlacZ′蛋白の生成試験を行なうこ
とを可能とし、その結果IPTG及びXgalの存在下でブルー
プラークを得ることを可能とする。また所謂ジデオキシ
法を利用する構築物の急速な配列化を可能とする。 コンピテント細菌内での選別の後、クローンM13tg910
を得る。その全構造は図面の下に示した。 pTG908の製造（第12図） フアージM13tg910のcIIrbs-lacZ′フラグメントを、
先に製造したベクタープラスミドpTG907に転移させる。 この目的のために、cIIrbsから上流のEcoRI、BamHI及
びAvaIサイトを除去し、次いでBglIIサイトを挿入す
る。 上記条件下、cIIrbsはBglII-BalIIフラグメントの形
態で取り出され、PLプロモーター及びpTG907のλＮ遺伝
子から下流のBamHIサイトに置かれる。 フアージM13tg910をEcoRIで消化させ、次いでBal31で
処理し、クレノーポリメラーゼ（klenow polymerase）
で処理する。得られたフラグメントに、次いで非−ホス
ホリル化BglIIアダプターの存在下にリガーゼを作用さ
せる。得られたリゲーシヨン混合物をコンピテントJM10
3細胞の形質転換に用いる。 次いで、ブルー領域を選別する。これらのクローンを
次いでこれらがBglIIサイトを含み、且つ上流にEcoRI又
はBamHIサイトを含まないことを確かめるために分析す
る。その構造を示したM13tg912のようなクローンを、か
くして収得する。 Bal31を用いた処理により、EcoRI、BamHI及びAvaIサ
イトの除去と同時にlacATG及びlacシヤイン／ダルガル
ノ配列の除去を伴う101bpの削除が行なわれた。挿入さ
れたBglIIサイトは、cIIATGの約100bp上流及びPlacの10
bp下流に位置している。 pTG907のBamHI-SphIフラグメント、cIIrbs及びlacZ′
を保有するBglII/HpaIフラグメント及びホスホリン化ア
ダプターをモル比1:2:1でプレハイブリダイズし、次い
でT4リガーゼで処理した。アリコートを、6150株コンビ
テント細胞の３℃での形質転換に用いる。 形質転換株を32PでラベルしたcIIrbs/lacZ′フラグメ
ントを用いて選別することにより興味のある細胞を同定
し、得られた構築物を制限酵素研究により確かめる。 発現系の異なるエレメントが所望の行動をとるという
当初の指示を得るために、得られたプラスミドpTG908を
N6437宿主株に転移させる。該宿主はc1857及びβ−ガラ
クトシターゼのωフラグメントを有しており、該フラグ
メントはプラスミドによつてコードされるαフラグメン
トと相補的なものである。 IPTG＋Xgalを含むデイツシユに置かれた上記で得た形
質転換体は28℃で無色であり、次いで42℃に移すと、約
30分後に青色に変わる。 ヒルジンのクローニングに用いる前に、このベクター
をヒトγ−インターフエロン、即ちγ−INFのクローン
化に適合させた。実際上、ヒルジンのクローン化のため
に、クローン化された中間体蛋白の性質は重要ではない
が、上記ベクターを下記スキームに従い製造した。 制限サイトについてのγ−IFNヌクレオチド配列の分
析から、成熟蛋白の開始点の8bp下流にEcoRIIサイト
が、また停止コドンの285bp下流にSau3Aサイトがあるこ
とが判り、結果的に、EcoRII-Sau3Aフラグメント上に成
熟蛋白をコードする全配列が単離される。ライブラリー
から得られたγ−IFNクローンをpTG11とする。 pTG909の構築（第13図） 合成アダプター分子が最初に用いられ、これにより次
の事が可能となる。 ａ）EcoRII末端とNdeＩ末端との間で結合が行なわれる
こと。 ｂ）成熟γ−IFNをコードする配列に関し、欠損してい
る8bpが導入されること、及び ｃ）cIIrbsATG開始コドンが、再構成されるため、成熟
γ−IFN蛋白質をコードする配列が、F-metイニシエター
を除き、融合アミノ酸を伴うことなく翻訳されること。 このアダプターは、化学的に合成され、その構成は図
に示されている。 pTG11はEcoRII及びSau3Aで消化され、pTG908はNdeＩ
及びBamHIで消化される。 適当なフラグメントはゲル上で精製され、等モル量の
アダプターと混合され、予備ハイブリダイズされ、連結
される。該混合物は、受容能力のある（competent）TGE
900細胞を形質転換するのに使用し、形質転換体は、ニ
ツク−翻訳された、32P−標識化pTG11のPstI挿入物を該
形質転換体とハイブリダイズすることにより選択され
る。 13のクローンが選択され、マツピング（mapping）に
よりモニターされ、これらの一つであるpTG909が配列化
（sequencing）により確認される。 ベクターpTG941の構築（第14図） pTG909は、二つのNdeＩサイトを含有し、その一方は
γ−IFNの開始コドンに、他方はγ−IFN配列から22bp下
流に存在する。 これらサイト間の領域は、γ−IFNの最初の７つのア
ミノ酸をコードする領域であるが、NdeＩで処理して除
去され、図示する合成オリゴヌクレオチドで置換され
た。 この反応は、下流のNdeＩサイトを破壊し、NdeＩサイ
トを上流に再構成する一方で、特異なBamHIサイトを導
入する。ベクターpTG941は、こうして得られる。 pTG951の構築（第15図） 第15図は、pTG941から誘導されるpTG951の構築を図式
的に示すものである。pTG941においては、cIIrbsを含有
するフラグメントが、E.コリlacオペロンrbsと呼ばれる
E.コリlacオペロンの翻訳開始領域の配列に基づく合成
配列で置換されている。この合成オリゴヌクレオチド
は、γ−IFNをコードする配列の開始コドンの単一のNde
Ｉサイトと、Ｎ遺伝子中に挿入されたClaIサイトとの間
のHgaIサイトにおいて挿入された。 その結果、NdeＩ及びClaＩで処理することにより、プ
ラスミドpTG951は切断されたＮ遺伝子のみを含有してお
り（Ｎ遺伝子の翻訳とフエーズの合つている（in phas
e）停止コドンは、新たにrbsサイトのすぐ上流に位置し
ている）、pTG909及びpTG941に存在する転写ターミネー
ターtL1及びtR1を有しない。 主な結果を、下記の表に示す。 以下の実施例は、そのＮ−末端で修飾された変異体HV
2の製造を示すものである。 添附図面において： ・第16図は、pTG720を含有するE.コリTG900培養物にお
いて誘発されたヒルジン活性の曲線を示す。 ・第17図は、pTG720を含有するE.コリTG900の抽出物か
らの35S−標識化蛋白質の分析のフペクトルを示す。 修飾HV2の製造 本発明のヒルジンを発現するプラスミドpTG720の構築
は、pTG717及びpTG927を出発物質として、上記したプラ
スミドpTG718の場合と同じ方法に従い行なわれる。 pTG927のNdeI-PvuIIフラグメントは、ヒルジンのＮ−末
端におけるile-thr配列を再構成するために、下記のア
ダプターオリゴヌクレオチドによりpTG717のHinfI-AhaI
IIフラグメントに合体される。 リゲーシヨン混合物は、E.コリTG900を形質転換する
のに用いられ、プラスミドを含有する形質転換体は、ア
ンピシリン100μg/mlを含有する寒天−Ｌプレート上で
選択される。ヒルジン配列を含有する構築物は、プロー
ブとして標識化pTG717挿入物を用いて該コロニーをハイ
ブリブイズすることにより同定される。 最終プラスミドのDNA配列は、発現プラスミドにおけ
るDNAの直接配列（direct sequencing）によりモニター
された。 pTG720によるヒルジン活性の発現 プラスミドpTG720を含有するE.コリTG900を、LB培地
及び50μg/mlのアンピシリン中で30℃にて、600におけ
る光学密度が0.3となるまで増殖させる。 該細胞培養物は、次いで、37℃にて、PLプロモーター
からの転写を誘発すべく転移される。 1mlのアリコート（aliquot）を１時間毎に取出し、60
0nmにおける密度を測定し、細胞を遠心分離により集め
る。 遠心分離ペレツトは、200μｌのTGE〔25mM Tris HC
l、pH8.0、50mMグルコース、10mM EDA〕中に再懸濁さ
せ、該細胞は音波処理により溶解される。 清澄化後、上清を集め、その抗トロンビン活性を、凝
集試験（coaqulation test）により又はトロンビンの標
準溶液による、基質、トシルグリシルプロリルアルギニ
ン ４−ニトロアニリド アセテート（Chromozym TH、
ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・
ベシユレンクター・ハフツング、Boehringer Mannheim
GmbH）の開裂阻害についての比色定量試験により測定す
る。 該反応は、1mlの反応容量において、100mM Tris HC
l、pH8.0、0.15M KCl及び0.1％のポリエチレングリコー
ル6000からなる緩衝液に溶解させた13μＭの基質を用い
て行なう。 0.25Uのトロンビンとの反応を、405nmにて分光光度計
を用いて２分間追跡し、反応速度を光学密度の上昇スロ
ープから測定する。 標準ヒルジン又は未知の抽出物をこのトロンビン反応
混合物に添加し、阻害の程度乃至は抗トロンビン活性を
測定する。 添附の第16図は、pTG720を含有する細胞の培養物中の
抗トロンビン活性の誘導（induction）効果を、培養物
１当りの600の光学密度に対する抗トロンビン単位と
して示す。該誘導は６時間にわたるものである。 破線は、同一時間に600の光学密度で測定されたE.コ
リ細胞の増殖曲線を示す。 誘導の結果、有意なレベルを示すヒルジン型の活性が
観察される。 ヒルジン配列を有しないプラスミドを含有する培養物
の対照溶菌産物は、活性を示さない。 これら細菌溶菌産物を、HClでpH2.8に酸性化した後15
分間70℃に加熱すると、かなりの量の蛋白質が変性さ
れ、沈澱する。後者を冷却抽出物から遠心分離により除
去し、上清をTris HCl緩衝液（最終濃度100mM、pH8.0）
を添加することにより中和すると、当初の活性の少なく
とも100％の活性、しばしばそれ以上の活性が上清中に
再び現れる。 典型的実験において、当初の活性の130％の活性が上
清に再び現れる。 ペレツトとして沈澱した物質には、残留活性は認めら
れない。 冷却、遠心分離及び中和後、加熱され酸性化された細
菌抽出物（ヒルジン5ATUを含有する200μｌ）を、37℃
にて15分間、（標準的方法で調製した）セフアロース樹
脂に共有結合的に結合されたトロンビンの50％強度スラ
リー100μｌと共にインキユベートし、且つ該セフアロ
ース・トロンビンを遠心分離により除去する場合には、
上清中にヒルジン型の活性は認められない。 従つて、pTG720により産生されるヒルジンは、天然の
分子と同一の一般的性質を有し、またpTG717及びpTG718
により得られる物と同一の一般的性質を有する。 pTG720培養物中に特異的に誘導され、〔35S〕メチオ
ニンで標識化し、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳
動による分離及び蛍光間接撮影法（fluorography）によ
る顕現化を行なつた後のポリペプチドは第２図に示され
ている。一連の低分子量（５〜10,000ダルトン）のポリ
ペプチドが、特に誘導される。 第17図において、 ・レーン１は、非誘導細胞を示し ・レーン２は、０時間での誘導を示し、 ・レーン３は、１時間の誘導を示し、 ・レーン４は、２時間の誘導を示し、 ・レーン５は、分子量マーカーを示し、 ・レーン６は、３時間の誘導を示し、 ・レーン７は、４時間の誘導を示し、 ・レーン８は、５時間の誘導を示し、 ・レーン９は、６時間の誘導を示し、 ・レーン10は、７時間の誘導を示す。 以下に示す実施例は、ヒルジンHV1の製造を示すもの
である。 HV1遺伝子の研究及び合成の戦略 ヒルジンHV1のための遺伝子を製造するための合成の
作戦は、各種の段階を包含する。 まず、第18図に示されるように、アミノ酸53の後はHV
1とHV2とでアミノ酸の相違はなく、また、アミノ酸56に
中心を有する、pTG717中でクローン化されたHV2のcDNA
中のTaqIサイトは一つであるため（第19図）、アミノ酸
56の後の変異体HV1のDNA配列はpTG717のTaqI-PstIフラ
グメントにより供給され得る。 この理由から、HV1の最初の56個のアミノ酸をコード
するDNAのみを、化学的に合成しなければならない。 このDNAは、２つの別個のブロツクとして合成され
た。第20図に示す第一のブロツクは、まず、主としてク
ローニングを目的とするEcoRI粘着末端から始まり、次
いで直ちに、HV1をコードする配列の前のATG開始コドン
を含有するNdeIサイトが続く。完全な遺伝子は、５′末
端におけるNdeIサイトを用い、E.コリ中での発現ベクタ
ー中への挿入のために回収（withdraw）することができ
る。この部分に続いて、HV1〜32のアミノ酸をコードす
るDNAが延長しており、BamHI粘着末端で終了することが
できる。なぜなら、アミノ酸31及び32はgly及びserであ
り、下記に示す如く、BamHIサイトによりコードされる
からである。 この109bpを有する合成DNA部分は、その構成オリゴヌ
クレオチドを縮合することにより組立てられ、次いでリ
ゲーシヨンにより、EcoRI/BamHIで切断されたフアージM
13mp8中に置かれ、斯くしてM13TG724が構築される。該
合成DNAは、フアージM13のポリリンカー領域に存在する
ので、この第１の合成ブロツクが正しく組立てられてい
ることを確認するべく、即座に配列化（sequenced）す
ることができる。 第２の合成ブロツクは、アミノ酸33〜56に対応するも
のであり、その一端にはBamHI粘着サイトがあり、他端
にはTaqIサイトがある（第21図）。この69pbの合成ブロ
ツクは、やはり、その構成オルゴヌクレオチドから組立
てられ、次いで第21図に示すように、pTG717由来のTaqI
-PstIフラグメントと共に、PamHI/PstIで切断されたM13
TG724中に挿入される。これにより、完全なHV1をコード
する配列を含有するフアージM13TG725が得られる。上記
の如く、この構築が正確に組立てられているか否かは、
配列化（sequencing）により即座に確認できる。 次の段階は、ヒルジン配列のATGから始まり、３′末
端の非翻訳領域で終了するNdeI-AhaIIIフラグメント
を、NdeI/PvuIIで切断されたプラスミドpTG927へ転移さ
せることからなる。この発現ベクターはヒルジンHV2発
現ベクターpTG720の構築に使用されたものと同一であ
り、その構造及び構築法は既述の通りである。変異体HV
1をコードする最終発現ベクターは、pTG726として知ら
れ、第22図に示されている。 これら２つのブロツクを構築するのに用いられたオリ
ゴヌクレオチドの正確な配列は、第23図に示されてい
る。ブロツク１は、EcoRIサイトからBamHIサイトへと延
び、22〜32塩基の大きさを有する８個のオリゴヌクレオ
チドから成る。ブロツク２は、BamHIサイトからTaqIサ
イトへと延び、19〜30塩基の大きさを有する６個のオリ
ゴヌクレオチドから成る。 該ヌクレオチドは、シリカ支持体上でマニユアル・フ
オスフオトリエステル法（参考文献31）により合成さ
れ、HPLC法又はポリアクリルアミドゲルからの溶離を用
いて精製された。 該遺伝子の合成部分に用いられたオリゴヌクレオチド
の正確な配列は、次のパラメーターを考慮して選択され
た。 ａ）コドンの選択は、可能な場合、E.コリにおいて非常
に高いレベルで発現される遺伝子のそれによる。この選
択は、発表されているデータ（参考文献32、33）を用い
てなされる。 ｂ）各オリゴヌクレオチドを個々に、次いで完全な配列
においてコンピユーター分析し、こうして“ヘアピン”
を形成し得る構造を除去する。 ｃ）ヒルジン分子のＮ−末端の選択はこの領域における
或る位置において該塩基が得られるようにすべく或るコ
ドンを優先的に使用することに対応する。該領域におい
ては、之等塩基がE.コリにおいて外部蛋白質を高いレベ
ルで発現するのに重要であることが示されている。 合成遺伝子の組立て 第１のブロツク このブロツクを形成するオリゴヌクレオチド１〜８
（第23図）は、２つの端部オリゴヌクレオチド１およひ
及び８を除いて、標準的条件下に、ポリヌクレオチドキ
ナーゼで５′末端においてリン酸化される。これは、引
続くリゲーシヨンの段階において合成ブロツクの二量化
又は重合体の生成を避けることを企画するものである。
500ピコモルの各オリゴヌクレオチドに対し、最終25μ
ｌ容量の60mM Tris HCl、pH 7.5、10mM MgCl2、8mMジチ
オスレイトールであつて、且つ3.3pmolの32P γ−ATP
（その特異的活性は5000Ci/mmolである）を含有するも
のの中で、２ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼを用
いて、キナーゼを作用させる。次いで、37℃にて15分間
インキユベート後、冷ATP5mmolを添加することにより、
該オリゴヌクレオチドは完全にリン酸化される。更に37
℃で15分間インキユベート後、該ヌクレオチドは、変性
条件（denaturing conditions）で行なわれる20％ポリ
アクリルアミドゲル上での電気泳動により精製される。
標準化オリゴヌクレオチドは、オートラジオグラフイー
により検出され、該ゲルの適当な領域が切り取られ、該
オリゴヌクレオチドは、37℃にて一夜インキユベートし
つつ水で溶離される。 次いで、該オリゴヌクレオチドは、DEAE−セルロース
のカラム上で、1Mトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝
液、pH8を用いて溶離し、凍結乾燥される。 キナーゼの作用を受けず、また標準化されなかつたオ
リゴヌクレオチド１及び８については、ゲル精製を上記
の如く行なうが、該オリゴヌクレオチドはUV吸収により
検出される。 該相補性のあるフラグメント（１＋５、２＋６等）
は、最終50μｌ容量の66mM Tris HCl、pH7.5、6mM MgCl
2、100mM NaCl、0.5mMスペルミジン（spermidine）及び
8mMジチオスレイトール中、等モル量、即ち各オリゴヌ
クレオチドの100ピコモルを用いて、混合される。これ
ら混合物は、100℃まで加熱し、２時間で37℃まで徐冷
する。これら溶液を混合して、100μｌ中４種のオリゴ
ヌクレオチドのハイブリツドを得る。これら混合物は最
終的に合され、該８種のオリゴヌクレオチドは、ペアを
形成すべく、最終容量200μｌ中、37℃にて終夜放置さ
れる。ペアを形成したオリゴヌクレオチドの0.005ピコ
モルを、66mM Tris pH 7.5、6.6mM MgCl2、10mMジチオ
スレイトール及び0.5mM ATPを含有する、最終20μｌ容
量のリゲーシヨン混合物中において、BamHI/EcoRIで消
化され、ゲル上で精製されたM13mp9の25ngと連結させ
る。 該リゲーシヨンを、15℃にて24時間続け、再び４℃に
て24時間行なう。リゲーシヨン混合物を、次いで、E.コ
リ・JM103を形質転換するのに用いる。形質転換により
得られた多くの無色プラークから、８つの候補を選択
し、該フアージから一重鎖DNAを調製し、これをジデオ
キシ・チエイン・ターミネーシヨン法（参考文献34）に
より直接DNA配列化（sequencing）にかける。これら候
補から、２つが、第23図のブロツク１に対応するオリゴ
ヌクレオチドが正確に組立てられたものを含有すること
が見出され、その１つはM13TG724と命名され、次の段階
で使用される。 第２の合成ブロツク及び全遺伝子のアセンブリー 第２の合成ブロツクをアセンブルするために、上記の
方法と基本的に同様の手順を採用した。但し、オリゴヌ
クレオチド成分は、ペアリング段階前には精製せず、キ
ナーゼに接触させ（但し第23図における末端オリゴヌク
レオチド９及び14は除く）、次いで直接ペアリングさせ
た。ペアリング条件は、上記と同様であり、最終体積15
0μｌ中に各オリゴヌクレオチドが100ピコモルとなる様
にした。 ペアリング段階後、混合物は、２％アガロースゲル
（低融点アガロース）上に注入され、電気泳動に供され
た。オリゴヌクレオチドは、エチジウム ブロマイドに
よる染色により検出され、アセンブルされたブロツク
（69bp）に対応するバンドがゲルから切り出され、常法
により溶離された。 第２の合成ブロツク（2ng）が次いでフアージM13TG72
4（50ng）と混合され、PstI/BamHIにより切断され、ゲ
ル上で精製され、pTG717のTaqI/PstIフラグメント（2n
g）がゲル上で精製された。これ等エレメントの組合せ
が、66mMトリスHCl、pH7.5及び6.6mM MgCl2を含む液20
μｌ中でアセンブルされ、65℃で５分間加熱され、更に
DTT10mM、ATP0.5mM及びT4リガーゼ５単位を加えた。リ
ゲーシヨンを15℃で16時間継続し、リゲーシヨン混合物
をE.コリ JM 103の形質転換に使用した。 被形質転移体中の無色のプラーク群から、単一鎖フア
ージを直接連鎖（sequening）させるために12のプラー
クを選んだ。更に、二本鎖型のフアージをも作り（参考
文献35）、正しくアセンブルされた組換体（recombinat
es）中に存在する筈の単一BamHIサイトの存在を調べ
た。これ等クローンの大多数は、BamHIサイト、及びHV1
をコードする全遺伝子の正確なアセンブリーに対応する
DNA配列を含んでいた。これ等の１つでM13TG725と名付
けられたものが、選択された。 発現ベクターへのHV1遺伝子の転移 HV1の蛋白質を発現することができるベクタープラス
ミドを作り出す為の最終段階は、M13TG725の248bp NdeI
-AhaIIIセグメントを、NdeI/PvuIIにより切断されたpTG
927（第22図）に転移させることである。しかしなが
ら、この種の消化によるフアージの再現型は、第２のM1
3フラグメントとなり、これは、所望のフラグメントと
実質上同一のサイズを有するが発現ベクター中でより効
率良くクローンを形成するので、まずヒルジンHV1配列
全体を含むAvaII-BalIIフラグメント（1.71Kb）を作
り、次いでこれをNdeI/AhaIIで消化する必要があつた。
この消化生成物は、それ以上の精製を行なうことなく、
NdeI/PvuIIで切断された後の発現ベクターpTG927内にリ
ゲートされた。E.コリTGE900の形質変換体中で、正しい
構造のpTG726は、HV1遺伝子の配列から得られる単一Bam
HIサイトの存在により、次いでDNA配列の直接分析によ
り確認された。 pTG726によるヒルジンHV1の生物学的活性の発現 発現ベクターpTG726は、温度誘導性のプロモーター、
PLプロモーター、即ちバクテリオフアージλの主左方プ
ロモーター（major leftward promoter）を有してい
る。このプロモーターは、ホストによりエンコードされ
た温度に敏感なリプレツサーによりブロツクされている
ので、ヒルジンHV1遺伝子は、30℃での成長期間中には
転写されない。しかしながら、温度が37℃を超えると、
この遺伝子の転写が誘発される。 第24図は、30℃で且つ600nmでの光学密度0.3で成育さ
れ、次いで37℃で誘発されたE.コリpTG726培地における
成長曲線及び抗トロンビン活性の誘発曲線を示す。 ヒルジン活性は、バクテリア細胞の超音波抽出物（so
nicated extracts）が、色素基体（chromogenic substr
ates）を開裂（cleave）させる能力に関して、ウシのト
ロンビン活性を抑制する能力により測定した。 相当な量のヒルジンがpTG726培地中で生成しているこ
とが明らかである。約３〜4000抗トロンビン単位/OD/l
培地が認められるが、この活性は、時間の経過とともに
急速に低下する。この効果は、容易に再現可能であり、
誘発後３時間で活性がピークとなり、次いで活性低下段
階に入る。 この誘発曲線の特性は、極めて特徴的で且つ再現性が
高く、発現ベクターpTG720により従来観察されている特
性とは、著るしく異なる。即ち、pTG720の場合には、誘
発によりヒルジンの変種HV2を発現する。この変種は、
約２時間の潜時（latency period）を伴つてよりゆつく
りと誘発され（第25A図）、次いでその活性は、pTG726
の活性（第25B図）とほぼ同等のレベルに達した後、低
下することなく一定値にとどまる。同一のE.コリTGE900
ホスト細胞中で全く同一の発現ベクターを使用しつつ
も、２つのヒルジン変種が得られたのだから、この誘発
と安定化におけるこの差異は、HV1とHV2との間の一次構
造の相違に関連するに違いない。更に、このことは、２
つの変種間の蛋白質消化に対する抵抗の相違を反映する
ものかも知れないし、また、２種の変種の異なる生物学
的活性又は異なる生物学的役割の表われかも知れない。
安定性及び他の生物学的特性における相違は、これ等ヒ
ルジンの使用に際して、恐らく考慮されることになろ
う。 E.コリにおけるHV1及びHV2の発現の相違は、２種の異
なる発現ベクターにより形質転換されたE.コリTGE900細
胞のパルス−ラベリング分析（pulse-labeling analysi
s）によつても、観察される。２種のヒルジン変種は、
システインに極めて富むので（分子の約10％）、又この
アミノ酸は、E.コリ蛋白質中ではむしろ一般的ではない
ので、〔35S〕システインが、ヒルジンの発現に関する
放射性マーカーとして極めて有用である。pTG726により
形質転換されたE.コリ細胞が、LB＋アンピシリン（100
μg/ml）中で測定される光学密度が0.3となるまで30℃
で培養され、次いで37℃まで温度を上昇させることによ
り変種HV1を発現させるようにした。 定期的に１時間毎に、培地から200μｌのアリクウオ
ツトを取出し、〔35S〕システイン（比重1000Ci/mmol）
70μCiを加え、２分間にわたりラベリングを行なつた。
大過剰（約2ml）のリン酸塩を含む冷緩衝食塩水を更に
加え、遠心分離により細胞を集め、SDSゲル用の負荷バ
ツフアー（50mMトリスHCl、pH6.8,SDS1.3％、グリセロ
ール５％、β−メルカプトエタノール2.5％、ブロモフ
エノールブルー0.004％）40μｌ及び15％SDS−ポリアク
リルアミドゲル５μｌ中で５分間ペレツトを沸騰させる
ことにより、全細胞中の標識された蛋白質を分析した
（ラエムリによる手順：参考文献36）。電気泳動後、ゲ
ルを蛍光間接撮影及びオートラジオグラフイーに供し
た。 得られた結果は、ヒルジンに対応する6000〜12000ダ
ルトンの領域における一連のバンド群の生成を示してい
る。E.コリpTG726からの抽出物（変種HV1）について
は、これ等のバンドは極く弱く標識されているに過ぎな
いのに対し、E.コリpTG720抽出物については、これ等の
バンドは極めて強く標識されている。 標識パターンにおけるこの著るしく明確な差異は、２
種の培養物がほぼ同様の抗トロンビン活性を示すという
事実にもかかわらず、示されたものである。 ヒルジン組換体HV1の他の特性 天然のヒルジン及びE.コリから得られた変種HV2の特
性の一つは、極めて低いpH条件下での熱処理に対する抵
抗性である。E.コリから得られた変種HV1についても、
同様の現像が認められる。pTG726により形質転換された
E.コリ細胞の３時間経過後の培地を遠心分離した後、培
地体積の1/5のTGE（トリス HCl 50mM、pH8.0、グルコ
ース50mM、EDTA10mM）に再度懸濁させ、細胞を超音波に
より破壊した。細胞残渣を遠心分離によつて除去し、上
澄の一部を抗トロンビン活性の測定に直接使用した。 上澄の他の部分を希薄HClによりpH2.8に調整し、70℃
で15分間加熱した。希釈液を氷中で30分間冷却し、変性
した不溶性蛋白質を遠心分離により除去した。上澄を希
薄NaOHを加えることにより中和し、次いで抗トロンビン
活性を測定した。酸性化及び中和による量のわずかの変
化を考慮に入れた上で、当初の活性が、この酸／熱処理
によつても、100％そのまま残存していることが計算に
より明らかとなつた。このことから、変種HV1は、天然
のヒルジン及び変種HV2と同一である。 ヒルジンHV2活性は、セフアローズ ビーズ（Sepharo
se beads）に共有結合的に結合されたトロンビンを使用
することにより、微生物抽出物から完全に除くこともで
きる。酸及び熱により処理され、次いで中和されたE.コ
リ/pTG726抽出物（200μｌ中に抗トロンビン活性7.7単
位を含む）を、濃度50％のトロンビン−セフアローズ懸
濁液50μｌ中37℃で15分間培養した。シロンビン−セフ
アローズ ビーズを遠心分離により除去し、上澄の抗ト
ロンビン活性を検査した。当初の抗トロンビン活性の95
％以上が、セフアローズ−トロンビン処理により、除去
された。E.コリ細胞により得られた変種HV1は、従つ
て、セフアローズ ビーズに結合するトロンビンに結合
することができる。 下記の菌株が、1985年３月26日に75724 パリ リユ
・デユ・ドクトウール ルー 28のコレクシオン ナシ
ヨナル ド クルトウル ド ミクロオルガニスム（CN
CM）に寄託された： pTG718により形質転換されたE.コリTGE900 No.I-427 pTG720により形質転換されたE.コリTGE900 No.I-428 pTG726により形質転換されたE.コリTGE900 No.I-429 参考文献 1.エフ．マルクバルト（F.Markwardt）（1955）ナツ−
アヴイツセンシヤフテン（Naturwissenshaften）42,58
7。 2.エフ．マルクバルト（F.Markwardt）（1957）ホツペ
−ザイラーズ ツアイトシユリフト フユア フイジオ
ローギツシユ ヘミー（Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Ch
em.）308,147-156。 3.エフ．マルクバルト（F.Markwardt）及びピー．バル
スマン（P.Walsman）（1967）ホツペ−ザイラーズ ツ
アイトシユリフト フユア フイジオローギツシユ ヘ
ミー（Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.）348,1381-13
86。 4.テルトリン シー．デ ラ ロサ（Tertrin C.de La
Llosa）及びエム．ユテイス（M.Jutisz）（1963）ビユ
ルタン デ ラ ソシエテ デ シミー ビオロジク
（Bull.Soc.Chim.Biol.）45,67-74。 5.エフ．マルクバルト（F.Markwardt）（1970）メソー
ズ イン エンザイモロジー（Methods in Enzymology,
eds.）ジー．イー．パールマン（G.E.Perlman）及びエ
ル．ローランド（L.Lorand）編、アカデミツク プレス
（Academic Press.），第19巻,924-932。 6.デイー．バクデイ（D.Bagdy）、イー．バラバス（E.B
arabas）及びエル．グラフ（L.Graf）（1973）トロンボ
ウシス リサーチ（Thrombosis Research）２,229-23
8。 7.エル．グラフ（L.Graf）、エー．パツチー（A.Path
y）、イー．ビー．バラバス（E.B.Barabas）及びデイ
ー．バグデイ（D.Bagdy）（1973）バイオシミカ エト
バイオフイジカ アクタ（Biochim.Biophys.Acta）31
0,416-417。 8.テイー．イー．ピーターセン（T.E.Petersen）、エツ
チ，アール．ロバーツ（H.R.Roberts）、エル．ソトラ
ツプ−イエンセン（L.Sottrup-Jensen）、エス．マグヌ
ソン（S.Magnusson）及びデイー．バグデイ（D.Bagdy）
（1976）プロタイズ オブ ザ バイオロジカル フル
ーイツズ、ブロシーデイング オブ ザ コロキニウム
（Protides Biol.Fluids,Proc.Colloq.）第23巻 145-1
49。 9.ジエイ．ドツト（J.Dodt）、エツチ．−ピー．ミユラ
ー（H.−P.Muller）、ユー．ジーミユラー（U.Seemulle
r）ジエイ．−ワイ．チヤン（J.−Y.Chang）（1984）フ
エブス レターズ（Febs Lett.）165,180-183。 10.テイー．クラジエスキー（T.Krajewski）及びビー．
ブロンベツク（1968）アクタ ケミカ スカンジナビカ
（Acta.Chem.Scand.）22,1339-1346。 11.ジエイ．−ワイ．チヤン（J.−Y.Chang）（1983）フ
エブス レターズ（Febs Lett.）164,307-313。 12.アイ．ピー．バスコワ（I.P.Baskova）、デイー．ユ
ー．チエルケソワ（D.U.Cherkesova）、ブイ．ブイ．モ
ゾロフ（V.V.Mosolov）、イー．エル．マウロワ（E.L.M
avlova）及びエル．エー．ベリヤノワ（L.A.Belyanov
a）（1980）ビオキミヤ（Biokhimiya）45,463-467。 13.アイ．ピー．バスコワ（I.P.Baskova）、デイー．ユ
ー．チエルケソワ（D.U.Cherkesova）及びブイ．ブイ．
モゾロフ（V.V.Mosolov）（1983）トロンボウシス リ
サーチ（Thrombosis Research）30,459-467。 14.エフ．マルクバルト（F.Markwardt）、ジエイ．ハウ
プトマン（J.Hauptman）、ジー．ノバツク（G.Nowa
k）、シーエツチ．クレツセン（Ch.Klessen）及びピ
ー．バルスマン（P.Walsmann）（1982）トロンボウシス
アンド ヘモスタシス，シユトツトガルト（Thrombos
is and Hemostasis,Stuttgart）47,226-229。 15.ピー．バルスマン（P.Walsmann）及びエフ．マルク
バルト（1981）デイー フアルマツイー（Die Pharmazi
e）10,653-660。 16.テイーエツチ．クロス（Th.Kloss）及びユー．ミツ
トマン（U.Mittmann）（1982）Longenbecks Arch.Chiru
rg.358,548。 17.エー．イシカワ（A.Ishikawa）、アール．ハフター
（R.Hafter）、ユー．ジーミユラー（U.Seemuller）、
ジエイ．エム，ゴケル（J.M.Gokel）及びエム．グラエ
フ（M.Graeff）（1980）トロンボウシス リサーチ（Th
rombosis Research）19,351-358。 18.ジー．ノバツク（G.Nowak）及びエフ．マルクバルト
（F.Markwardt）（1980）Expt.Path.18,438-443。 19.エー．エツチ．ストール（A.H.Sutor）、エス．クノ
ツブ（S.Knop）及びデイー．アドラー（D.Adler）（198
1）コントローレ アンチトロンボンチカ、第23回シン
ポジウム ブルートゲリング、ハンブルグ（Kontrolle
Antithrombotica,23rd Symp.Blutgerinnung,Hamburg）1
17-123。 20.デイー．バグデイ（D.Bagdy）、イー．バラバス（E.
Barabas）、エル．グラフ（L.Graf）、テイー．イー．
ピーターセン（T.E.Petersen）及びエス．マグヌソン
（S.Magnusson）（1976）メソーズ インエンザイモロ
ジー パート ビー（Methods in Enzymology part
B）、第45巻、669-678。 21.ピー．バルスマン（P.Walsman）（1981）フアマツイ
ー（Pharmazie）36,860-861。 22.エツチ．アビブ（H.Aviv）及びピー．レダー（P.Led
er）（1972）プロシーデイングズ オブ ザ ナシヨナ
ル アカデミー オブ サイエンス オブ ユー．エ
ス．エー．（Proc.Matl.Acad.Sci.USA）69,1408-1412。 23.エム．ジヤイエ（M.Jaye）、エツチ．デ ラ サー
レ（H.De La Salle）、エフ．シヤンバー（F.Schambe
r）、エー．バランド（A.Balland）、ブイ．コウリ（V.
Kohli）、エー．フインデリ（A.Findeli）、ピー．トル
ストシエフ（P.Tolstoshev）及びジエイ．ピー．ルコツ
ク（J.P.Lecocq）（1983）ヌクレイツク アシツズ リ
サーチ（Nucleic Acids Res.）11,2325-2335。 24.ジエイ．ダブリユ．ゾスタツク（J.W.Szostak），エ
イ．アイ．スタイルズ（J.I.Stiles），ビー．−ケー．
タイ（B.−K.Tye），ピー．チユウ（P.Chiu），エフ．
シヤーマン（F.Sherman）及びアール．ウー（R.Wu）（1
979）メソーズ イン エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）、第68巻、419-428。 25.ブイ．コウリ（V.Kohli）、エー．バランド（A.Ball
and），エム．ウインゼリス（M.Wintzerith），アー
ル．サウエルバルト（R.Sauerwald），エー．スタウブ
（A.Ataub）及びジエイ．ピー．ルコツク（J.P.Lecoc
q）（1982）ヌクレイツク アシツズ リサーチ（Nucl.
Acids Res.）10,7439-7448。 26.エフ．サンガー（F.Sanger），エス．ニツクレン
（S.Nicklen）及びエー．アール，コールソン（A.R.Cou
lson）（1977）プロシーデイングス オブ ザ ナシヨ
ナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユ
ー．エス．エー．（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）74,5463-
5467。 27.ピー．トマス（P.Thomas）（1980）プロシーデング
ス オブ ザ ナシヨナル アカデミー オブ サイエ
ンス オブ ザ ユー．エス．エー（Proc.Natl.Acad.S
ci.USA）77,5201-5205。 28.エツチ．カールカー（H.Kalckar）（1947）ジヤーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Che
m.）167,461。 29.ジエイ．ケイン（J.Caen）、エム．ジエイ，ラリー
エ（M.J.Larrieu）及びエム．サママ（M.Samama）（197
5）レエモスターズ メトド デクスプロラシオン エ
デイアグノステイク プラテイク（Ｌ′ Hemostase,M
ethode,d′ exploration et diagnostic Pratique）第
２版，出版レクスパシオン シアンテイフイーク，パリ
（Ｌ′ Expansion Scientifique,Paris） 30.ジエイ．ビエイラ（J.Vieira）及びジエイ．メツシ
ング（J.Messing）ジーン（Gene）19,259-268。 31.ブイ．コウリ（V.Kohli），エー．バランド（A.Ball
and），エム．ウインゼリス（M.Wintzerith），アー
ル．サウエルバルド（R.Sauerwald），エー．スタウブ
（A.Staub）及びジエイ．ピー．ルコツク（J.P.Lecoc
q）（1982）ヌクレイツク アシツズ リサーチ（Nucl.
Acid.Res.）10,7439-7448。 32.アール．グランサン（R.Grantham），シー．ゴーチ
エ（C.Gauthier），エム．ゴウイ（M.Gouy），イー．エ
ム．ジヤコブソン（E.M.Jacobzon）及びアール．マーシ
ア（R.Mercier）（1981）ヌクレイツク アシツズ リ
サーチ（Nucl.Acids Res.）９,143-174。 33.テイー．イケムラ（T.Ikemura）（1981）ジヤーナル
オブ モレキユラー バイオロジー（J.Molec.Bio
l.）151.389-409。 34.エフ．サンガー（F.Sanger）．エー．アール．コー
ルソン（A.R.Coulson），ビー．ジー．バレル（B.G.Bar
rel），エー．ジエイ．エツチ．スミス（A.J.H.Smith）
及びビー．エー．ロエ（B.A.Roe）ジヤーナル オブ
モレキヤラー バイオロジー（J.Mol.Biol.）（1980）1
61-178。 35.エツチ．シー．ビーンボイム（H.C.Birnboim）及び
エス．ドリー（S.Doly）（1979）ヌクレイツク アシツ
ズ リサーチ（Nucl.Acids Res.）７,1513。 36.ユー．ラエムリ（U.Laemli）ネイチヤー（Nature）
（1970）227,680-685。
DNA配列のクローニング及び発現のためのベクター、こ
れらのベクターで形質転換された微生物、並びに醗酵に
よりヒルジンを得ることを可能にする方法及び得られた
ヒルジンに関する。 医薬的ヒルであるヒルド メデイシイナリス（Hirudo
medicinalis）の唾液腺に存在する抗凝血性の活性は、
ヒルジンとして知られる小さいポリペプチドに由来す
る。この非常に特異的で非常に効果的なトロンビンイン
ヒビターは、もしかすると非常に有用な治療薬であると
表明されたので、最近広く研究されている。しかしなが
ら、分離及び精製における極度の困難とコストのため、
それがより広く使用されること又は臨床レベルで研究さ
れることさえも妨げられていた。この物質のコストは、
2000U当り1300から1600フラン（1983年）のオーダーで
ある。 本発明は、ヒルジンの生物的特性を有する大量のポリ
ペプチドを得るために、異種の宿主細胞において組換え
DNA技術により遺伝子をクローニングし、それを発現さ
せることによりヒルジンを製造する方法にに関する。 ヒルの唾液腺から得られる抗トロンビン活性を持つポ
リペプチドは、1950年代の中頃に始めて分離された
（１、２）。このヒルジンとして知られるタンパクは、
ヒルの頭から出発してほぼ650倍に精製され１ミリグラ
ム当り8500ユニットの比活性（specific activity）が
得られている。 このタンパクの分子量は、ほぼ16000と推定された。
このタンパクは熱変性に対して安定で、等電点は4.8で
ある。紙上での電気泳動において、精製されたプロダク
トは単一のバンドの形で移動する。そしてアミノ酸分析
は、この物質が酸性アミノ酸即ちアスパラギン酸及びグ
ルタミン酸に非常に富むことを示す。 更なる精製（３）により、比活性は10400U/mgに増加
し、Ｎ−末端アミノ酸としてイソロイシンが同定された
（３、４）。 ヒルジン活性は、タンパク分解酵素のプラスミン、キ
モトリプシンＡ及びトリプシンによる消化に抵抗する
が、パパイン、ペプシン及びズブチロペプチダーゼ（su
btilopeptidase）Ａによる消化に対して感受性であるこ
とを示すことが可能であつた（３）。 推定分子量は、今では、当初の文献におけるものより
もやや小さく、この分子量は1000ダルトンのオーダーで
あると考えられている。そして、1:1のトロンビン−ヒ
ルジン コンプレツクスの解離定数の最初の推定（0.8
×10-10）は、これらの２つの分子間の極めて強い会合
を示している（５）。実際上の理由から、これら２つの
分子間の非共有結合コンプレツクスはインビボ非解離と
みなし得る。 ヒルジンの抗凝血剤としての活性のメカニズムは、理
解され始めたばかりである（５）。ヒルジンの結合のた
めの基質はトロンビンであり、トロンビンはタンパク分
解酵素であり、そのチモーゲン（酵素源）の形であるプ
ロトロンビンからの活性化（活性化フアクターＸによ
る）により、循環流中のフイブリノーゲンを開裂してフ
イブリンに変換する。フイブリンは、血餅の形成に必要
なものである。 ヒルジンは非常に特異的なトロンビンインヒビターで
あり、フイブリノーゲンによりも急速にトロンビンと反
応する。更に、他の凝固因子や他の血漿成分の存在は、
必要ではない。２つの分子間の相互作用は、トロンビン
のフリーのアミノ基のアセチル化がヒルジンの結合の喪
失を生ずることから、少なくとも部分的にはイオン相互
作用によるものである。更に、ヒルジンはフイブリノペ
プチドによつて占められるのと同じ部位で結合する。と
いうのは、アセチル化トロンビンはヒルジンにより阻害
されないエステラーゼ活性を保持しており、又トロンビ
ン中のセリン活性中心をリン酸化するDFP（ジイソプロ
ピルフルオロフオスフエート）で処理したトロンビン
は、ヒルジンと結合し続けるからである。 ヒルジン研究の次の進展は、ヒルの頭を切取るという
不便な方法に代えて、ヒル全体からヒルジンを抽出する
方法が開発されたことである（16）。この方法により得
られる最終生成物は、頭から得られたヒルジンと類似し
た生物学的活性を有しているが、抗トロンビンの比活性
は、ミリグラム当り6500ユニットである。 この化合物の推定のサイズは、平衡沈降（equilibriu
m sedimentation）により測定して12000である。しか
し、この方法と先の方法との間の重要な違いは、Ｎ−末
端アミノ酸として、以前に見出されたイソロイシンに代
つて、バリンが同定されたことである。この違いの原因
は、Ｎ−末端の二番目の成分がバリンであることが示さ
れたときに明白に説明された。ダンシル化ジペプチドの
val-valは酸加水分解に抵抗性であるので、それは第１
に、val-valのジペプチドを有する当初のＮ−末端がイ
ソロイシン誘導体と混同されたものと考えられた
（７）。というのは、これらの成分は、使用されたクロ
マトグラフイーの分離では充分には分解されないからで
ある。 動物全体からのヒルジンの調製は、第１図に示された
タンパクのアミノ酸配列の決定に使用された（８、
９）。ヒルジンに炭水化物は付加していないようである
が、63の位置のチロシン残基がＯ−サルフエートエステ
ル基で修飾されている。 この修飾の機能は知られていないが、多くの種類の動
物のフイブリノペプチドＢにおいても類似の修飾が起つ
ていることは重要である（９）。 最近の研究（10）によれば、サルフエート エステル
を完全に消失させたとき、活性は当初のヒルジン活性の
わずか55％に減少することが示されている。 ヒルジンのＮ−末端の性質の問題は、いくつかの研究
で再度取り上げられ（12、13）、ヒルジンには二種の異
なつた形態があることが示された。一つの形態は、活性
が低く、シユードヒルジンとして知られており、ヒルの
体から抽出されると考えられており、Ｎ−末端がval-va
l配列である。そして、頭において優勢である形態は、
活性が高く且つＮ−末端がイソロイシン基（radical）
を有していると思われる。 ヒルジンの特異的で非常に本質的な抗トロンビン活性
は、直ちに臨床上の用途即ち抗凝血剤としての用途を示
唆する。 ヒルジンは、その抗凝血特性について、動物において
非常に広汎に研究されてきた。最も詳細な研究（14）
は、ラツトにおける静脈血栓症（venous thrombose
s）、血管閉塞症（vascular occulsions）及び播種性血
管内凝固症（disseminated intravascular coagulation
s）（DIC）の予防においてのヒルジンの活性について記
載している。ヒルジンは、高度に精製された形で静脈内
に注射されたとき、ラツト、イヌ、ウサギ及びマウスに
よつて良く耐容される。マウスでのLD50は、より大き
く、体重1kg当り500000U（即ち60mg/kg）である。他の
研究（15）によれば、マウスは1kg当り1gの投与範囲に
耐容で、ウサギは静脈内及び皮下のいずれでも10mg/kg
までの耐容であることが示されている。マウスにおい
て、２週間にわたる繰返し注入は、感作反応（sensitiz
ation reactions）を惹起しない。２つの他の独立の研
究は、一つは犬を用い（16）、そして他は（17）ラツト
でのDICの予防におけるヒルジンの活性を示しており、
マークワルド（Markwardt）及びその共同研究者の肯定
的な結果と一致する。 ヒルジンは、ブタにおけるDICにより誘発された内毒
素を中和することも示されており、それによりブタでの
高い死亡率をもたらす内毒素症（endotoxinemias）によ
つて起こされる非常に深刻な問題の可能な解決策を構成
する。更に、実験動物中のヒルジンは、尚生物学的に活
性な形のままで腎臓から急速に排出される（半減期は１
時間のオーダー）。 この研究は、ヒルジンは抗凝血剤としての有用な臨床
薬を構成し得ることを示唆する。更に血液凝固の前段階
（pre-phase）はヒルジンの作用の高度な特異性の故に
影響されない。抗トロンビン活性は投与量に依存し、ヒ
ルジンの効果はその急速な腎性の排出故に急速に可逆的
である。DICがアンチトロンビンIII（ヘパリンの作用の
ために必要な補因子）の減少及び非常に効果的な抗ヘパ
リン剤である血小板因子（platelet factor）４の塩析
を伴うという事実から予測される様に、ヒルジンはDIC
の治療用としてヘパリンよりもはるかに優れていること
が示されている（14、17）。 一つの研究は、得られた結果の解釈が幾分困難なまま
であるが、ヒトの皮膚によりヒルジンが吸収され得ると
いう可能性を示している（19）。 粗ヒル抽出物の市販の製剤が入手可能である〔ヒルク
レイム（Hirucreme）、イクシルドーブルトゲル（Exhir
ud-Blutgel）〕が、これが有用な投与経路であるか否か
を確立するためには高度に精製された大量の投与量での
更なる試験を必要としている。 一般的に好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内及び経
皮的な経路である。ヒルジンのための他の投与経路、特
に経口の経路が報告されている（BSM 3792M）。 他の成分と組合せて、この製品は乾癬（psoriasis）
及び他の同じタイプの皮膚病（cutaneous disorders）
の治療に使用することもできることがDOS 2101393に記
載されている。 ヒルジンは、加えて、実験室での臨床試験における抗
凝血方法として及び研究道具として使用できる。この場
合、血液の凝固における単一の段階についての高い特異
性が、最も一般的に使用されその作用の特異性が劣る抗
凝血剤にまさつて本質的に有利である。 更に、ヒルジンは体外循環及び透析系における抗凝血
剤として非常に有用である。それは、特にこれらの人工
の循環システムの表面に活性な形で固定できれば、他の
抗凝血剤にまさつて本質的に有利である。 最後に、標識化されたヒルジンの使用は、トロンビン
及びプロトロンビンのレベルの測定のための簡易な且つ
効果的な方法を構成できる。 まとめると、ヒルジンは非常に多くの可能な次の如き
用途を有している： １）存在している血栓が拡がるのを予防及び防止するた
めの重大な血栓状態（critical thrombotic conditio
n）での抗凝血剤として； ２）実質的に生きたヒルの使用となるので、顕微鏡手術
（microsurgery）後の血腫及び腫張の減少のための抗凝
血剤として； ３）体外循環システムにおける抗凝血剤として及び被覆
合成生物学的物質のための抗凝血剤として； ４）試験室での実験における血液試料の臨床試験におけ
る抗凝血剤として； ５）凝固の臨床研究における抗凝血剤として及び実験道
具として； ６）痔（hemorrhoids）、拡張蛇行静脈（varicose vein
s）及び浮腫（edema）の治療における皮膚への適用のた
めの可能な局所剤として；並びに ７）乾癬及び他の関連した病気の治療における成分とし
て。 最後に、ヒルジンはトロンビンが干渉を起こす媒体中
でトロンビンと結合させるために使用できる（例えば、
アツセイ、実験又は処理血液）。特に、ヒルジンは体外
循環での凝固の制限を可能にする。 標識化されたヒルジンは、加えて、血餅の形成の検出
のために使用し得る。実際上、血餅形成は循環するプロ
トロンビンのトロンビンへの変換を必要とし、トロンビ
ンにはヒルジンが選択的に結合するようになる。患者の
体のあるポイントでの標識化されたヒルジンの蓄積の検
出は血餅の形成を視覚化し得る。 抗凝血剤としての多くの利点にもかかわらず、ヒルジ
ンは今まで臨床の研究においてさえも広くは使用されて
いない。これは、天然の物質が純粋な形で得るのが非常
に困難であり、就中可能な用途を示すべく臨床的な試み
を始めるためにさえも著るしく高価であるという事実に
よる。非常に純粋な試料を得るための適当な精製方法は
ある（20、21）が、基礎的物質（ヒル）を充分な量得る
ことが困難であるという大きな障害が残されている。 ヒルジンは様々の会社〔シグマ（Sigma）、プラント
オーガン（Plantorgan）、ペントフアーム（Pentophar
m）〕から商業的に販売されているが、かかる製剤は途
方もなく変動する活性を示し、又それらの純度は大いに
変動する。 この理由から、ヒルジンの組換えDNA工学による生産
は、このタイプの生産物を試験し使用するために、この
物質を合理的なコストで大量に得るための特に魅力的な
解決策である。 以下の記載において、「ヒルジン」という用語が最も
使用されるであろう。上述した事項及び本研究から現わ
れる他の因子とに照らし、ヒルジンにはいくつかの形態
があることが明らかであり、従つて「一つのヒルジン
（a hirudin）」という用語がより正しいであろう。 この理由から、以下の記載において、「ヒルジン」は
天然又は合成のヒルジンの形態のいずれか即ちヒルジン
としてインビボで同じ活性を有する生産物と理解され、
又時々は「ヒルジン類縁体」と称する。 更に、細菌から得られた「ヒルジン類縁体」と称され
る生産物はＯ−サルフエート エステル フアンクシヨ
ンに欠けているが、その一方で「細菌のヒルジンは天然
のヒルジンには現われないアミノ酸のメチオニンをＮ−
末端に含んでいるかも知れないということに注意するの
が適当である。しかし、「ヒルジン類縁体」はそれが生
産された後に特に化学反応又は酵素反応により修飾され
たところの保護された生物起源の生産物であるとも理解
されることが明らかである。 本発明は、ヒルジンまたはヒルジン類縁体をコードす
る遺伝子含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIle
およびThrをコードする配列から始まることを特徴とす
る宿主細胞でヒルジンまたはヒルジン類縁体をクローニ
ングおよび発現させるベクターに関し、これらのベクタ
ーは該遺伝子を宿主細胞で発現するのに必要な要素を含
んでいる。 発現の要素の性質は、宿主細胞の性質に応じて変化さ
せることができる。従つて、細菌細胞では、発現要素
は、少なくとも一つの細菌プロモーターとリボソーム結
合部位（該部位は、時々は翻訳開始のためのコーデイン
グ領域と称されものを構成する）を含むであろう。 一般に、本発明によるベクターは、ヒルジンをコード
する遺伝子に加えて、次のものを含むであろう； −細菌プラスミドの複製開始起源（origin of replicat
ion）、 −プロモーター、特にバクテリオフアージλプロモータ
ー:PL、PR又はＰ′Ｒの全部又は一部； −翻訳開始をコードする領域、これはヒルジン遺伝子の
５′端又は他のタンパクと５′サイドで融合したヒルジ
ン遺伝子の５′端のATGを含有する；この融合の理由は
E.コリ（E.Coli）中でより小さいものに分解する高分子
量のタンパクを発現させるのを可能にするためである。 プラスミドの複製開始起源が存在することは、相当す
る細菌細胞中でベクターを複製させるのに必須である。
そして、特にE.コリの場合にはおいては、プラスミドpB
R322の複製開始起源を好ましく使用できるであろう。プ
ラスミドpBR322は、実際上、高いコピー数を与え、そし
てそれにより所望のタンパクを生産するプラスミドの量
が増加するという利点を有している。 バクテリオフアージλプロモーターの中で、λPLと呼
ばれる主要な左向きプロモーターが好ましく使用できる
であろう。PLは、λの初期転写（early transcriptio
n）に関与する強力なプロモーターである。 他のバクテリオフアージλプロモーター、特に右向き
プロモーターPR又は第二の右向きプロモーターＰ′Ｒを
使用することも可能である。 非常に種々の翻訳開始配列の使用が可能であるが、バ
クテリオフアージλタンパクcII（以下、λcIIrbsとい
う）のリボソーム結合部位の全部又は一部を使用するの
が好ましい。 以下に示される様に、合成配列特に下記配列の全部又
は一部のようなものも使用できる： ATAACACAGGAACAGATCT▲▼。 問題のベクターは、加えて、例えばλのＮ遺伝子（λ
Ｎという）によりコードされた転写の終結阻害機能（an
titermination function）を含むのが好ましい。遺伝子
Ｎ転写生産物の存在下では、PLから出発した転写は、大
部分の停止シグナルを越えて、続いていく。 これにより、クローン化した外来遺伝子が停止シグナ
ルを持つ場合に起り得る早過ぎる停止（premature stop
ping）により引き起こされる問題を回避できる。加え
て、PLから開始した発現はN+の状況下（N+ environmen
t）で改善されることが示された。 大量の外来タンパクの継続的な生産を行なう場合の宿
主／ベクター系における毒性と不安定性の問題を避ける
ためには、誘導発現（inducible expression）系特に温
度誘導系の全部又は一部をプロモーターに結合させるこ
とによりプロモーターの活性の制御を可能とすることが
必要である。 外来タンパク合成の温度による制御は、宿主細菌中に
コードされた温度感受性のリプレッサー例えばcI857に
より転写のレベルで好ましく達成される。cI857は、28
℃ではPLの活性を抑制するが、42℃では不活性化され
る。該リプレツサーは、プロモーターPLに隣接したオペ
レーターOLに作用する。上記の場合において温度誘導発
現系の一部は宿種細菌の絶対必要な（integral）部分で
あるが、この系をベクター自体の部分を形成するように
することが可能である。 問題のベクターは、抗生物質抵抗性の遺伝子を含むこ
ともできる。例えば、pBR322の場合はアンピシリン抵抗
性であるが、テトラサイクリン（Tetr）又はクロラムフ
エニール（Cmr）に抵抗性である他の抵抗性遺伝子も使
用できる。 このようなマーカーの導入は、クローニングの実験の
間、本発明のプラスミドを保持する形質転換体を含む細
菌の選択のために必要である。 抵抗性遺伝子の導入は、醗酵の間選択の圧力を負わせ
ることにより（by imposing a selection pressure）プ
ラスミドの安定性を増加させることを可能にし、また更
に形質転換体の分離を容易にする。 クローニングのためには、外来DNAのプラスミドへの
挿入を検出できる系を使用するのが有利である。 例えば、E.コリβ−ガラクトシダーゼ（lacZ′）のＮ
−末端フラグメントとλcII由来の翻訳開始領域とを融
合することによりクローニングゾーンに該フラグメント
を供給することができ、これによりαフラグメントの翻
訳をcII配列の制御下に置くことができる。 該αフラグメントは、宿主中にコードされたＣ−末端
ωフラグメントの発現により補われ（conplemented）、
これが細胞中でのβ他−ガラクトシダーゼ活性を惹起す
る。このβ−ガラクトシダーゼ活性は、色素生産基質で
ある５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼの存在下で青色のコロニーを生ずる。 28℃では、PLプロモーターは不活性化され、αフラグ
メントは合成されず、そしてコロニーは無色のままであ
る。温度を42℃に上げたとき、PLプロモーターは活性化
され、αフラグメントは合成され、そしてコロニーが青
色になる。 この検出系中に位置するクローニングサイトへの外来
DNAの挿入により、β−ガラクトシダーゼの合成が妨げ
られ、そしてそのため28℃と42℃のいずれでも無色のコ
ロニーが生じるようになる。lacZ′遺伝子の検出を達成
するのを可能にする他の遺伝子で置換することも可能で
ある。 本発明により調製及び使用できる異なつたヒルジンの
中で、以下のものを挙げねばならない： ａ）HV2として知られ、バリアント２（variant 2）に相
当するヒルジンであつて、その構造は第１図において−
SO3H基を有し又は有しないもので示されるものに相当す
る； ｂ）バリアント２の修飾体に相当するヒルジンで、val-
valN末端配列がile-thrで置き換えられたもの； ｃ）HV1として知られ、バリアント１に相当するヒルジ
ンであつて、その構造は第18b図に示されるものに相当
するもの。 相当する遺伝子の構造は、実施例に示されるように、
アミノ酸の構造から演繹され得る；これらの遺伝子は公
知の合成DNA調製法のいずれの方法によつても合成でき
る。 Ｎ−末端の構造がile-thrに相当するヒルジンが好ま
しく使用されるだろう；相当する遺伝子の異なつた構造
が実施例に示されるであろう。 本発明は、細胞特に細菌殊にE.コリの菌株であつて、
公知の技術を用いて、本発明のベクターで形質転換され
たものに関する。該公知技術のいくつかは実施例におい
て記載されるであろう。 最後に、本発明は、上記の如く形質転換された細菌を
培養培地で培養し、次いで生成したヒルジン又はその類
縁体を回収する、ヒルジン又はその類縁体の製造法に関
する。 使用される培養培地は、当業者にとり公知のものであ
り、培養される各菌株に適したものとすべきである。培
養は、形質転換された菌株が耐性を示す抗生物質の存在
下で行なうのが好ましい。 ヒルジン又はその類縁体は、醗酵混合物を酸性pHに
て、特に50〜80℃、pH1〜３の条件下、殊に70℃、pH2.8
の条件下で加熱し、該ヒルジンを含有する上清を回収す
ることにより精製又は予備精製（prepurified）され
る。 また、トロンビンが結合された樹脂を用いて、トロン
ビンに対するヒルジンの親和性を利用し、ヒルジンを含
有する該混合物を上記の如き樹脂上を通過させると、ヒ
ルジンは結合される。これは、次いで、ヒルジンに対す
る競合剤を含有する溶液で溶離される。 本発明は、最後に、本発明の方法を実施することによ
り得られるヒルジン又はその類縁体、即ち、細菌由来の
ヒルジン又はその類縁体のみならず、細菌による産物か
ら化学反応又は酵素反応、例えば化学的又は酵素的開裂
又は−SO3H基を結合するための化学的又は酵素的反応に
より得られたヒルジン類又はその類縁体にも関するもの
である。 特に、本発明は、次式の全部又は一部を含有するペプ
チドに関する。 上記ペプチドは、対応するコーデイング配列と共に示
されているが、該配列は、ペプチドの一部を構成するも
のではない。 また、本発明は、第18図に示す如く、ヒルジンHV1及
びHV2の変異種にも関する。 本発明は、活性成分としてヒルジン又はその類縁体を
含有する薬理作用を有する医薬組成物として使用でき
る。 これら組成物は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投
与、皮下投与、経口投与又は局所的皮膚投与により適用
される。 これら組成物は、この分野で公知の賦形剤、及び必要
に応じて他の活性成分を含有する。 本発明は、当然に、他の側面、特に実施例に記載され
るある種のプラスミド及びその変異種及び誘導体をも含
有し、また、一般に、上記形質転換された細菌の醗酵方
法及びそれにより得られた産物を包含する。 本発明の他の特徴及び利点は、下記実施例及び添附図
面を読むことにより、より一層充分理解されるであろ
う。 図面において、 ・第１図は、ヒル全体（whole leech）から抽出された
ヒルジンのアミノ酸配列を示す。 ・第２図は、スクリーニングのために設計された48量体
オリゴヌクレオチドプローブを示す。 ・第３図は、クローンpTG717のヒルジン配列を示す。 ・第４図は、標識化プローブと各種pTG717制限（restri
ction）とのハイブリダイゼーシヨン混合物のオートラ
ジオグラフを示す。 ・第５図は、pTG717における挿入物（insert）の制限地
図を示す。 ・第６図は、ヒルジンの発現のための二つのベクター、
即ちpTG927から誘導されたpTG718及びpTG951から誘導さ
れたpTG719の構造を詳細に示す。 ・第７図は、上記二つのベクターに対するE.コリ抽出物
中のヒルジン活性の経時変化をグラフとして示すもので
ある。 ・第８図は、ヒルジン活性を含有する標識化E.コリ抽出
物の分析を示す。 ・第９図は、第８図と同一の抽出物ではあるが酸性pHに
て熱処理後のものの分析を示す。 各図中に表わされている各種ヌクオレチド配列は、本
記載の明白な一部を構成するものと考えなければなら
ず、該配列が明細書本分中に再現されていないのは、明
細書を不必要に煩雑化させないためであることを説明し
ておくのが適切である。 下記実施例で使用されている手法の多くは、当業者に
公知のものであり、そのいくつかは添附参考文献中に記
載されている。従つて、特殊な手法に限り以下の記載に
記載する。使用した菌株の性質は一般的情報により記載
する。 ａ）細菌菌株 本発明で使用される細菌菌株は次の通りである。 ・TGE900、これは次の特徴を有するE.コリ株である:su-
F-his ilv bio（λcI857ΔBamΔHI）。 ・N6437、これは次の特徴を有するE.コリ株である:F-hi
s ilv gal+ 8proC+:tn10lacΔm15（λcI857ΔBamΔHI） ・Jm103、これは、次の特徴を有するE.コリ株である：
Δ（lac-pro）supE thi endA sbc B15 sttA rk- nk+/F1
traD36 proAB+ lacia lacZΔm15。 上記株は入手可能であつたため使用したが、詳細な説
明中に記載される或る必須の特徴を有する限り他の菌株
を使用することも可能である。 下記実施例は、次の段階から本質的になつている。 １）mRNA分子の製造とcDNAライブラリーの形成、 ２）プローブの製造、 ３）このプローブによる上記ライブラリーの選別及びヒ
ルジンをコードする配列を含有するプラスミドの同定、 ４）ヒルジンをコードする遺伝子の発現のためのベクタ
ーの製造、 ５）得られた結果の検討。 RNAの製造 ヒルド・メデイシナリス（Hirudo medicinalis）種に
属する生存ヒルを、フランス国のボルドー地方（Bordea
ux region）にて集める。これらは最低４週間絶食さ
せ、次いで断頭し、頭部を直ちに液体窒素中で凍結させ
る。液体窒素中で頭部を微細粉末となるまで磨砕するこ
とにより、全頭部RNAを抽出する。この粉末1gに、NETS
緩衝液（10mM Tris HCl、pH7.5、100mM NaCl、1mM EDT
A、0.5％SDS）5ml及び再蒸留したフエノール5mlを加
え、両者を95℃に予備加熱する。次いで、この溶液を渦
巻き攪拌により混合し、30,000gにて遠心分離し、水層
をNETS緩衝液1mlで再抽出し、水層を合せて新しいフエ
ノール5mlで再抽出する。RNAは、２容量のエタノールを
添加することにより沈澱し、混合物を−20℃にて４時間
放置した後、遠心分離により集められる。暗褐色ペレツ
トを蒸留水2.5mlに溶解させ、5M LiCl2.5mlを添加し、
混合後、該溶液を４℃にて一夜放置する。次いで、該溶
液を、3M LiCl5mlで濃厚化し、４℃、20,000gにて10分
間遠心分離を行なう。上清を除去し、淡色のRNAペレツ
トを水1ml中に入れる。これを0.25M NaCl中に入れ、２
容量のエタノールで該RNAを沈澱させる。この最終RNAペ
レツトを遠心分離により回収し、次いで蒸留水に溶解さ
せ、−80℃にて保存する。該RNA濃度は、260nmにおける
吸収により測定される。 ポリアデニル化メツセンジヤーRNAを、オリゴ（dT）
−セルロースを用い、標準的方法（22）を用いて製造す
る。mRNAの収率は、出発物質の全RNA量の約２〜５％で
ある。 相補的なDNAの製造及びベクタープラスミドpBR322にお
けるcDNAライブラリーの構築 使用した手法は、ヒト肝臓mRNAライブラリーの構築に
用いられた、参考文献23に記載の方法と全く同一であ
る。ヒル頭部mRNA分子を、オリゴ（dT）“プライマー”
及び逆転写酵素を用いてDNAの形に複製する。第２のDNA
鎖はDNAポリメラーゼを用いて合成され、ヘアピンはS1
ヌクレアーゼを用いて開かれ、二重鎖cDNAはスクロース
グレーデイエントにより精製される。特定のサイズのcD
NA分子を、酵素ターミナルデオキシトランスフエラーゼ
を用いて少量のdC延長を伴い、３′末端で停止させ、次
いでPstIIにより切断されポリＧ末端を有するpBR322ベ
クターに結合される。得られるプラスミドは、E.コリ株
（1106株）を形質転換するのに用いられ、テトラサイク
リン耐性形質転換体（二重鎖cDNA1ng当り500〜1000の効
率で得られる）は、テトラサイクリン150μg/mlを含有
するＬ−寒天プレート上で生育される。43,000個の形質
転換体を含むcDNAクローンのライブラリーが確立され、
細胞は、コロニーからかき集めて回収され、テトラサイ
クリンを含有するＬ−ブロス中に再懸濁される。懸濁液
は、50％強度（strength）のグリセロール中で製造さ
れ、−20℃にて保存される。 ライブラリーのスクリーニングのためのDNAプローブの
製造 ヒルジンにつき公表されたアミノ酸配列（第１図）
は、メチオニン又はトリプトフアン、即ち、単一のコド
ンによりコードされたアミノ酸を有しないことを考慮す
ると、その蛋白質配列は、一般にクローン化された配列
を同定するのに用いられる戦略（strategy）を構成する
特に単鎖のオリゴヌクレオチドプローブを製造するのに
殊に好ましい領域を有しない（24）。このため、単一で
あるが、大きなオリゴヌクレオチドプローブを用いる異
なつた手法を採用することが決定され、これにより、特
にヒト凝血因子（human clotting factor）IX（23）の
ためのcDNAクローンを単離することが可能となつた。こ
の戦略において、アミノ酸配列領域が選択されるが、こ
れに関しては、コドンの重複性（redundancy）は三番目
の塩基の選択に限定され（即ちアルギニン、ロイシン及
びセリンは除外される）、該三番目の塩基が選択され
る。このコドンの該三番目の塩基を選択するための当該
パラメーターは公知であり、これは、G/T相互作用（int
eraction）の可能性を最大にし、プローブ配列において
ヘアピンとパリンドロームを避けること、そして勿論ヒ
ルに関する公知の遺伝子配列を考慮することにかかつて
いる。 ヒルに関する遺伝子配列は全く公表されていなかつた
ので、進化論的な見地からヒルに最も近い生体に関する
知見を利用することが必要であつた。そして、このため
には、多くの公表されたDNA配列が存在し、即ち、昆虫
である。昆虫DNA分子に対する全てのコーデイング配列
が分析され、最も頻繁に生じるコドンに関する表が作製
された。他のパラメーターと共に、これが、ヒルジン配
列中の34の位置から49の位置までの16個のアミノ酸に対
応する、48塩基の長さのオリゴヌクレチオドを設計する
のに用いられた、。この配列領域は、各コドンの第三番
目の位置においてのみ重複性を示す。 このオリゴヌクレオチドは、第２図に示されており、
参考52量体（23）について既に記載された無機固体支持
体（25）上で、フオスフオジエステル法により化学合成
された。 48量体オリゴヌクレオチドによるcDNAのスクリーニング ヒルの頭部mRNA分子から形成されたcDNAライブラリー
を、テトラサイクリン15μg/mlを含有するＬ−寒天プレ
ート上でに、13cmプレート当り約4,000コロニーのコロ
ニー密度で平板培養し、該コロニーを、37℃にて直径１
〜2mmの大きさとなるまで生育させる。該コロニーを、
次いでニトロセルロースフイルター上に移す。維持され
たプレート上のコロニーは生育され、該プレートは次い
で４℃にて保持される。上記フイルターは、クロラムフ
エニコール170μg/mlを含有するＬ−寒天のプレート上
に置かれ、細菌コロニー中のプラスミドを増大させるべ
く、37℃で一夜インキユベートされる。該フイルターを
次いで標準的な方法で処理し、該細菌コロニーを溶解
し、DNAをニトロセルロースに結合させる。次いで、該
フイルターは完全に洗浄され、100mlの６×ssc（１×ss
c＝0.15％NaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウム）、５×
デンハーツ（Denhardts）（１×デンハーツ溶液＝0.02
％フイコール（Ficoll）、0.02％のポリビニルピロリド
ン、0.02％の牛血清アルブミン）100μg/mlのイースト
転移RNA及び0.05％のソデイウム・ピロフオスフエート
の容量中でプレハイブリダイズされる。 該48量体オリゴヌクレオチドのアリコート（30pmol）
は、15ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼの存在下で
γ〔32P〕ATPと共にインキユベートすることにより、そ
の５′末端において〔32P〕で標識される。該標識化プ
ローブは、遊離のγ〔32P〕ATPからDEAE−セルロース上
を通過させることにより精製される。 該標識化プローブは、フイルター上で、20mlの６×ss
c、１×デンハーツ（Denhardts）、100μg/mlのイース
トtRNA、0.05％のソデイウム・ピトフオスフエートの量
にて、42℃で16時間緩かに攪伴してハイブリダイズされ
る。 該フイルターは、次いで、６×ssc、0.1＃のドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）中、37℃、42℃及び50℃の温度
にて洗浄され、次いで２×ssc、0.1％SDSを用いて50℃
で10分間最終的に洗浄される。該フイルターは、次いで
乾燥され、Ｘ線フイルム上に露出される。Ｘ線フイルム
上のポジテイブのスポツトとマスタープレートとを比較
することにより、標識化プレートから、ポジテイブの結
果を与えるコロニーが同定される。これらクローンの一
つ（そのプラスミドを以下「pTG700」と呼ぶ）は、標識
化プローブとの第二回目のハイブリダイゼーシヨンによ
りポジテイブであることが確認され、多量培養され、プ
ラスミドDNAは標識的な方法で精製される。 ヒルジンをコードする配列を含有するものとのpTG700の
同定 pTG700のcDNA挿入物は、約235塩基対を有する。このD
NAフラグメントは単離され、ベクターフアージm13mp8中
に転移され、該挿入物のDNA配列が鎖停止（chain termi
nation）（26）により決定される。この配列の一部が、
ヒルジンの蛋白質配列と非常に類似する蛋白質配列をコ
ードする。該配列のこの領域は、第２図に示すプローブ
の領域に対応する。 この第２図において： （ａ）は、参考文献２に示されるglu49からgly34までの
ヒルジン配列に対応する。 （ｂ）は、合成され、ハイブリダイゼーシヨンに用いら
れた48量体プローブの配列に対応する。 （ｃ）は、この領域におけるクローンpTG700の配列に対
応し、ドツトは相同関係（homology）を示す。 （ｄ）は、pTG700のこの領域においてコードされるアミ
ノ酸配列に対応する。 留意すべきは、pTG700のcDNA配列は不完全であり、フ
エーズの合つた停止コドンの後の３′−非翻訳配列の10
1塩基に加えて、ヒルジンのｃ−末端アミノ酸の内の28
個のみをコードするにすぎないことである。ヒルジンに
対する公表された蛋白質配列との相違点の一つが、この
クローンにおいて観察される。なぜならば、位置49にお
いてグルタミン酸がグルタミンを置換しているからであ
る。 より大きなヒルジンcDNAのクローンの単離 DNA配列からpTG700挿入物がヒルジンをコードするこ
とが確認されるので、該挿入物は公知の“ニツク翻訳
（nick translation）”の方法により〔32P〕で放射性
を付与され、cDNAライブラリーについての新たな試験に
用いられる。数種の他のポジテイブのコロニーが見出さ
れ、その一つは、pTG717と呼ばれるプラスミドを含有
し、pTG717は長さ約450塩基対の挿入物を含有する。こ
の挿入物の制限分析は、中心の領域にTaq1制限部位が存
在することを示す。 このため、精製フラグメントをtaq1て消化し、生じる
５′及び３′フラグメントを、PstI/AccIで開裂された
配列ベクターm13中に結合する。m13の構造は、いずれも
同定可能で配列分析（sequential analysis）に供し得
るフラグメントを含有する。この分析の結果は、第３図
に示される。pTG717挿入物のDNA配列から、操作のクロ
ーニングの間に鎖末端に導入されたポリG/C末端を差引
くと、長さ379塩基となり、該塩基の219個が、公表され
たヒルジンの配列と非常に類似する配列のペプチドをコ
ードする。 該配列においては、各種の事項が留意されなければな
らない。 １）該フラグメントによりコードされたアミノ酸配列
は、天然のヒルジンについて公表された蛋白質配列のそ
れとは同一ではない。pTG717から単離されたヒルジン配
列と公表されたヒルジン配列との間には、９個のアミノ
酸の相違がある。次の変更が認められる： Val1-ile;val2-thr;gln24-lys;asp33-asn;glu35-lys;ly
s36-gly;lys47-asn;gln49-glu及びasp53-asn。これは、
該配列における大きな変更を構成する。なぜなら、これ
ら変更の内７つがチヤージにおける変更を含んであるか
らである。従つて、該クローン化されたコーデイング配
列と公表されている蛋白質配列との間の相同性（homolo
gy）は、46/65、即ち、約70％である。これら二つのア
ミノ酸配列間で観察された相違点には、二つの理由が考
えられる。 １−ヒルジン分子の正確な配列間で、種（species）、
亜種（subspecies）更には個々の動物の変異（variatio
n）が認められる。本研究で用いたヒルが、アミノ酸配
列を公表するのに用いられたヒルと同一の種又は亜種で
あるか否かを確認することはできない。しかも、ヒルに
は、１種のみならず各種の形態のヒルジンがあり、同様
な生物学的活性を有するが基本的なアミノ酸配列におい
て変異を有する可能性もある。この意味において、ヒル
ジンのＮ−末端アミノ酸に関する文献上の結果における
相違点について言及するのが有意義である（当初、ile
は頭部からの物質中に見出された。次いで、valが動物
全体において見出された。その一方で、最近ileは、頭
部由来の物質に対し再び示された。イソロイシンは、pT
G717配列において、成熟蛋白Ｎ−ターミナル末端に対応
する位置に存在する。 ヒルジンに異なる形態が存在するという考え方は、DN
Aレベルの予備的研究によつても支持される。ヒルの全D
NAを、標準的な方法で磨砕凍結ヒルから抽出し、各種制
限酵素で消化し、アガロースゲル上で電気泳動処理を
し、次いでニトロセルロースに移し、プローブとしての
pTG717挿入物とハイブリダイズする場合、ハイブリダイ
ズする多量のフラグメントが観察される。 即ち、第４図の結果は、次の如くして得られる。 −ヒルの全DNAの10μｇを制限酵素で消化し、１％アガ
ロースゲル上で電気泳動に圧し、ニトロセルロースフイ
ルター上に移し、〔32P〕−標識pTG717のPstI挿入物で
ハイブリダイズする。該フイルターを完全に洗浄し（0.
1×ssc、0.1％SDS、65℃）、ハイブリダイズしたバンド
をオートラジオグラフイーにて顕現化する。 レーン1:EcoRIで消化されたDNA レーン2:HindIIIで消化されたDNA レーン3:BamHIで消化されたDNA レーン4:BalIIで消化されたDNA EcoRIフラグメントのkbによる大きさが右側に示され
ている。 EcoRI消化フラグメントに関し、計40kbの６フラグメ
ントが非常に厳重な（stringent）洗浄条件下で認めら
れる。たとえ、このスキームが非常に広いモザイク遺伝
子を示していることが理論的に可能であるとしても、40
0を下回る塩基をコードする単一の小さな配列が40kbの
ゲノムに分布しているとは考えにくい。しかも、部分的
な挿入フラグメントを含有するプローブでの予備実験
は、そうではないことを示唆している。 また、同一のcDNAライブラリーから単離されたヒルジ
ンの異なるクローンにおける配列にも相異があることが
観察された。例えば、pTG700において、lysは公表され
ているアミノ酸配列と同様に位置47に見出される（第２
図）がpTG717においてはこの位置にasnが存在する。 上記理由により、これら全てのデーターは、蛋白のレ
ベルで多様な形態を示す異なる構造のヒルジン遺伝子の
概念に一致する。 最後に重要な点は、全ヒルジンmRNA配列が、確かにpT
G717には存在しないことである。事実、オープンリーデ
イングがクローンの５′末端まで続き、この領域にはメ
チオニンは含まれない。ヒルジンは、唾液腺細胞から分
泌される蛋白であるので、そのＮ末端にリーダー（lead
er）配列（分泌に必要な）を有していると考えられ、ま
たプロ配列（pro-sequence）の存在が考えられる。次い
で、最終的に活性な分子が、多くのチモーゲン及び前躯
体における場合のように、蛋白分解の開裂段階（proteo
lytic cleavage stage）で生産されるのであろう。 ヒルジンmRNAの大きさを決定し、クローンpTG717は、
その完全なコピーではないことを確かめた。ヒルジンの
全頭部RNAを、ホルムアルデヒド変性アガロースゲル上
電気泳動にかけ（27）、ニトロセルロースに移し、pTG7
17挿入物でハイブリダイズした。単一の、640塩基対の
ハイブリッドRNA種が観察される。pTG717は全３′mRNA
配列（ポリＡ部分が観察される）、及びポリＡから約20
塩基重複する２つのポリＡ付加サイトを有していると考
えられるので、160bpの３′非−翻訳領域が見られる
（第３図）。このcDNAクローンは、その５′末端に160
個の塩基対を欠失している。これは目的蛋白のＮ末端の
残り、イニシエーターのメチオニン及び該mRNAの５′非
−翻訳領域を有する。ヒルジンが他の生物学的に活性な
ペプチドをコードし得る、より大きい全躯体の形態でそ
のＣ−末端から切断されることは排除できないが、この
仮説の前躯体の最大のサイズは、少なくとも110〜120の
アミノ酸（即ち成熟ヒルジンのサイズのほぼ２倍）に相
当すると考えられる。 pTG717より長いcDNAクローンを生成することは可能で
はなく、またmRNAの５′末端における二次構造（second
ary structure）は、この点を越えるmRNAの逆転写を防
止すると考えられる。ヒルジンのゲノムの配列の分析か
らこの遺伝子の５′末端のデーターが得られるであろ
う。 クローンpTG717によりコードされたヒルジンのアミノ
酸配列をE.コリー（E.coli）細胞内で発現されるよう
に、以下の手法により適合させた。 ヒルジンのE.コリー内での発現 pTG717の制限分析（第５図）から、アミノ酸をコード
する配列のすべてが、225bpのHinfI-AhaIIIフラグメン
トの形態で存在していることが明らかである。このフラ
グメントを、制限で単離し、プラスミド発現ベクターpT
G951及びpTG927に、合成オリゴヌクレオチドアダプター
分子を用いて挿入した。該アダプターは、HinfI制限に
よりＮ末端から除去された７つのアミノ酸からなり、ま
た発現ベクターに挿入されることを要求されるイニシエ
ーター メチオニン フラグメントと制限酵素エンドヌ
クレアーゼNde及びBglIIのためのサイトとが追加されて
いる。 metイニシエーターの後の２つのアミノ酸は置換され
ている。即ちpTG717cDNAクローンに見られるile-thrフ
ラグメントは、公知のヒルジン蛋白配列のval-valによ
り置換されている。 pTG717cDNAクローンは、ヒルジンにつき公表された配
列であるval-val配列の代りにile-thr配列を有している
が、Ｎ−末端にval-val配列を有する分子を発現させる
ことが、最初に決定された。この選択には下記２つの理
由がある。 −cDNAクローンは確かに不完全であり、おそらく転写を
防止するmRNAに二次構造があると考えられる。これは
「人工物」の転写及びクローン化を考慮すれば、該cDNA
配列の５′末端を、不正確にする、 −全動物から抽出された活性なヒルジン分子のＮ−末端
がval-valから始まつていることは、一般に認められて
いる（８、11）。 発現ベクターpTG951は、γ−インターフエロン遺伝子
の発現用にデザインされたプラスミド発現ベクターであ
る。その合成は本記載の終わりに詳述する。 実際上、それは、要素として、温度感受性宿主c1857
によつてコードされたリプレツサーで制御されるバクテ
リオフアージの左向きプロモーターPL、次いでインタク
トの又は切断されたλのＮ遺伝子を含有している。次い
で合成リボソームに結合するサイトが存在し、これは、
リボゾームの最適な結合を与えるようにデザインされて
いる。単一のBglII制限サイトが、リボソーム結合サイ
トとγ−インターフエロンをコードする配列のATGとの
間に存在する。このベクターは、BglIIサイト及びγ−
インターフエロンをコードする配列の下流の単一のPvuI
サイトで消化され、次いでアガロースゲル上電気泳動で
回収される。このベクターフラグメントを、第６図に示
すように、アダプター オリゴヌクレオチド結合体（as
sembly）及びHinfI-AhaIIIフラグメントを含有するヒル
ジン配列と結合させる。 発現ベクターpTG927は、本記載の終わりに記載する発
現ベクターpTG908と密接に関連している。これは単にpB
R322のテトラサイクリン遺伝子由来の付加的SalI-PvuII
フラグメントを含む点において異なるのみである。発現
ベクターpTG927は、プロモーターPL、インタクトのＮ遺
伝子及びλCII蛋白のリボソーム結合サイト、次いでATG
及びβ−ガラクトシダーゼのlacZフラグメントをコード
する配列を含んでいる。NedIサイトは、このコード配列
のATG上に認められる。該ベクターはNedI及びPvuIIで消
化され、ベクターフラグメントが精製され、他のオリゴ
ヌクレオチド アダプターの組合せ及びヒルジンのHinf
I-AhaIIIフラグメントと共に用いて、第６図に示す第二
のヒルジン発現ベクターを構築する。これらの２つの発
現ベクターは、天然のヒルジン分子（ATGイニシエータ
ーの直後のＮ−末端にval-val配列を有する）を発現す
るようにデザインされている。 アダプター オリゴヌクレオチドにおいて、第３番目
の塩基のコドンは、翻訳を高度に促進するように、そし
てこの領域のレベルでmRNAに二次構造が形成されること
を回避するように選択される。 ２つのベクターは以下の手法により組み合される。即
ち、オリゴヌクレオチド相互を、ポリヌクレオチド キ
ナーゼを用いてその５′末端でリン酸化し、次いで等モ
ル混合物として処理（65℃で10分間加熱後、15℃で15時
間）する。ベクター及びヒルジン フラグメントを、ベ
クター／ヒルジン フラグメント／アダプター フラグ
メントのモル比が1:20:50となる量で添加し、混合物をT
4DNAリガーゼを用いて連結させる。該リゲーシヨン混合
物を用いてＥ・コリー株TG900を形質転換させ、プラス
ミドを担う形質転換体を、アンピシリン（100μg/ml）
を含む寒天プレート上で選別し、ヒルジンをコードする
配列を含むものを、プローブとして標識化したpTG171挿
入物を用いてコロニーハイブリダイゼーシヨンにより同
定する。多数のポジテイブクローンから各６株と共に１
株のネガテイブ（親株）を選別し、650nmでの光学密度
が0.3となるまで30℃でＬ−ブロス液体培地で培養す
る。PLプロモーターから始まる発現を、次いで、温度を
37℃に上昇させて誘発し、インキユベーシヨンを６時間
続ける。次いで細胞を遠心分離により収穫し、TGE（25m
Mトリス塩酸、pH8、50mMグルコース、10mM EDTA）の1/5
容積に懸濁させ、超音波粉砕する。遠心分離による抽出
物の清澄化の後、上清のアリコート（aliquot）をその
抗トロンビン活性試験に供する。６つのpTG 927構築物
の内５つに、高レベルの抗トロンビン活性が認められ、
また６つのpTG951構築物の内４つに、弱いものであつた
が、活性が認められた。 コントロールには如何なる有意な活性も認められなか
つた。プラスミドの直接配列化（direct sequencing）
によりホジテイブの結果を与えるクローンのDNA配列の
分析によつて、活性を示す全ての構築物に所望の配列が
存在することが明らかとなつた。 ポジテイブの発現を示す２つのクローン、pTG951由来
のクローンpTG719及びpTG917由来のクローンpTG718を、
誘導の６時間に渡つて分析する。30℃で光学密度が0.3
になるまで培養物を生育させた後、温度を37℃に上昇さ
せて発現を誘発させ、上記で調製した抽出物から６時間
に渡つて毎時間アリコートを取り出し、ヒルジン活性を
測定する（29）。その結果（第７図）から、クローンpT
G719は、最初の生育に次いで３〜４時間後に活性のプラ
トー（plateau）を示し、これは650での光学密度で370U
/lのレベルである。 これに対し、クローンpTG718は、より強い活性を示
し、これは上記誘導期間の全般に渡つて上昇を続けた。 ６時間後に得られた活性のレベルは、クローンpTG719
のほぼ５倍強いものであり、培養物当りの全活性は7300
μg/lであつた。もし上記ヒルジン組換体が天然のval-v
al産物と同様の特異活性を示すなら、最も活性な抽出物
で得られる生成物は、ほぼ1mg/l培養物に相当するであ
ろう。 生成ヒルジンの性質 E.コリーから得られたヒルジンを特徴付けるために、
誘導後の培養物サンプルにつき分析を行なつた。これ
は、70℃で15分間加熱するか又は塩酸でpHを2.8に下げ
た後70℃で加熱して行なつた。後者の場合、抽出物のpH
を、分析に先だつて中性に戻した。上記と同様にして処
理した天然のヒルジンは、公表された該分子の性質（2
0）に照らし予想されるように、活性の消失を認めなか
つた。抽出物の場合、上記処理後活性の消失は見られな
かつた。実際には、上記処理後、約２倍の活性増加が認
められた。このことはヒルジンの活性を阻害していた抽
出物成分の分解又は不活性化を反映するものと考えら
れ、また比較的低いpH及び加熱段階が、ある場合には、
ヒルジンが最大の活性を示すのに必要なジスルフイド結
合のより完全な再形成を与えるためとも考えられる。対
照の抽出物は、上記処理の前及び後のいずれも活性を示
さない。 細菌抽出物を、セフアロース樹脂に結合させたトロン
ビンを用いてプレインキユベートし、トロンビン−セフ
アロースを遠心分離により除去すると、実質的に全ての
最初のヒルジン活性が抽出物から除去される。本発明に
より得られるヒルジンは、トロンビン−セフアロース樹
脂に非常に効果的に結合すると思われ、このことから上
記細菌性ヒルジンの可能な精製手段が提供され得る。 発現ベクターpTG718を含む細胞の細菌性培養物を、30
℃で光学密度が0.3になるまで培養し、次いで37℃で誘
導し、毎時間毎にそのアリコートを回収し、最小培地上
で100μCi/mlの［35S］メチオニンでラベルする。該細
菌を遠心分離により集め、ラベルされた細菌性蛋白の組
合せをSDS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、
次いでフルオログラフイーで分析する。 ベクター構築物によりかなりの量で誘発された少なく
とも２つのポリペプチドが、約６〜8,000ダルトンにて
認められる（第８図のレーン５〜10）。 非誘導pTG718培養物由来の標識化物質及び誘導後３及
び５時間の培養物由来の標識化物質を、70℃及びpH2.8
で15分間処理し、遠心分離により変性蛋白を除去し、SD
S−ポリアクリルアミドゲル上で分析すると、標識化し
たE.コリー蛋白質の大部分がサンプルから除去されるこ
とが明らかである（第９図のレーン１及び２）。この方
法は、ヒルジン発現ベクター中で誘導される低分子量の
２つのバンドの非常に有効な精製法を与える。 全てのヒルジン活性が上清中に認められた。 ベクタープラスミドpTG951及びpTG927の製造 これらのベクタープラスミドは、γ−インターフエロ
ンのクローニングで用いられたものであるか又は上記の
如きベクターの製造に関与するプラスミド由来のもので
ある。上記合成を添附の各図面に関連して簡単に述べ
る。 −第10図はpTG907の製造を示す。 −第11図はM13TG910の製造を示す。 −第12図はpTG908の製造を示す。 −第13図はpTG909の製造を示す。 −第14図はpTG941の製造を示す。 −第15図はpTG951の製造を示す。 上記各ベクタープラスミドの製造は、基本的には、a-
PL、Ｎ及びCIIrbsを含むベクターpTG908の製造 ｂ−合成リボソームに対する結合サイトを含むベクター pTG951の製造 を包含している。 pTG907の製造（第10図） 使用した親プラスミドは、プラスミドpBR322である。
しかしながら、該プラスミドpBR322は、ampR遺伝子中に
PstI制限サイトを有する不利がある。なぜなら、引きつ
づき同じ性質のサイトを、クローニングゾーンにおい
て、単一の制限サイトとして用いるからである。従つ
て、上記PstI制限サイトを、プラスミドpBR322の変異体
であるプラスミドpUC8を用いて消失させるのが適当であ
る。該pUC8においてアンピシリン耐性遺伝子は、PstI制
限サイトを有していない（このサイトはインビトロでの
変異により除去されている）。pBR322は特にベテスダ
リサーチ ラボラトリーズ（Bethesda Research Labora
tories）から市販されており、pUC8は、参考文献30とし
て示した文献に記載されている。 上記目的のため、pBR322の1,669bpのPvuI-PvuIIフラ
グメントを、プラスミドpUC8の同様のPvuI-PvuIIフラグ
メントと交換する。この交換を実施するために、プラス
ミドpBR322及びpUC8をPvuI及びPvuIIで順次処理し、次
いでリガーゼの作用により環化させる。 もはやPstI制限サイトを有さず、またpBR322に始めに
存在していたNdeI制限サイト（図示せず）をもまた欠失
しているプラスミドpTG902を、かくして得る。更に、プ
ラスミドpTG902は、PvuIIサイトが存在するlaci′配列
に相当する50kbのフラグメントを保有している。 PLプロモーター及びλＮ遺伝子（フアージλ由来、λ
Ｎ遺伝子は転写の終結阻害機能をコードする）を、プラ
スミドpKC30から単離し、pTG902に挿入する。これは第1
0図に示すように、pTG902をEcoRI、S1、BamHIで処理
し、pKC30をPvuＩ、S1、BamHIで処理し、連結させるこ
とにより行なわれる。 TGE900株の形質転換後に得られたプラスミドの内のひ
とつpTG906を、処理してPvuII-SalIセグメントを除去す
る。この目的のために、pTG906をSalI、S1ヌクレアー
ゼ、PvuII及びリガーゼを用いて順次処理する。pTG907
をかくして収得する。 M13TG910の製造（第11図） λcIIrbsリボソーム結合領域、（ribosome binding r
egion、これもフアージλ由来である）を、次いでAvaI-
TaqIフラグメントの形態でLacZ′遺伝子（β−ガラクト
シダーゼのαフラグメント）の始めに挿入する。該遺伝
子はM13tg110として知られるフアージM13内でクローン
化されている。上記戦略（strategy）はrbsのための簡
単な機能的試験、即ちlacZ′蛋白の生成試験を行なうこ
とを可能とし、その結果IPTG及びXgalの存在下でブルー
プラークを得ることを可能とする。また所謂ジデオキシ
法を利用する構築物の急速な配列化を可能とする。 コンピテント細菌内での選別の後、クローンM13tg910
を得る。その全構造は図面の下に示した。 pTG908の製造（第12図） フアージM13tg910のcIIrbs-lacZ′フラグメントを、
先に製造したベクタープラスミドpTG907に転移させる。 この目的のために、cIIrbsから上流のEcoRI、BamHI及
びAvaIサイトを除去し、次いでBglIIサイトを挿入す
る。 上記条件下、cIIrbsはBglII-BalIIフラグメントの形
態で取り出され、PLプロモーター及びpTG907のλＮ遺伝
子から下流のBamHIサイトに置かれる。 フアージM13tg910をEcoRIで消化させ、次いでBal31で
処理し、クレノーポリメラーゼ（klenow polymerase）
で処理する。得られたフラグメントに、次いで非−ホス
ホリル化BglIIアダプターの存在下にリガーゼを作用さ
せる。得られたリゲーシヨン混合物をコンピテントJM10
3細胞の形質転換に用いる。 次いで、ブルー領域を選別する。これらのクローンを
次いでこれらがBglIIサイトを含み、且つ上流にEcoRI又
はBamHIサイトを含まないことを確かめるために分析す
る。その構造を示したM13tg912のようなクローンを、か
くして収得する。 Bal31を用いた処理により、EcoRI、BamHI及びAvaIサ
イトの除去と同時にlacATG及びlacシヤイン／ダルガル
ノ配列の除去を伴う101bpの削除が行なわれた。挿入さ
れたBglIIサイトは、cIIATGの約100bp上流及びPlacの10
bp下流に位置している。 pTG907のBamHI-SphIフラグメント、cIIrbs及びlacZ′
を保有するBglII/HpaIフラグメント及びホスホリン化ア
ダプターをモル比1:2:1でプレハイブリダイズし、次い
でT4リガーゼで処理した。アリコートを、6150株コンビ
テント細胞の３℃での形質転換に用いる。 形質転換株を32PでラベルしたcIIrbs/lacZ′フラグメ
ントを用いて選別することにより興味のある細胞を同定
し、得られた構築物を制限酵素研究により確かめる。 発現系の異なるエレメントが所望の行動をとるという
当初の指示を得るために、得られたプラスミドpTG908を
N6437宿主株に転移させる。該宿主はc1857及びβ−ガラ
クトシターゼのωフラグメントを有しており、該フラグ
メントはプラスミドによつてコードされるαフラグメン
トと相補的なものである。 IPTG＋Xgalを含むデイツシユに置かれた上記で得た形
質転換体は28℃で無色であり、次いで42℃に移すと、約
30分後に青色に変わる。 ヒルジンのクローニングに用いる前に、このベクター
をヒトγ−インターフエロン、即ちγ−INFのクローン
化に適合させた。実際上、ヒルジンのクローン化のため
に、クローン化された中間体蛋白の性質は重要ではない
が、上記ベクターを下記スキームに従い製造した。 制限サイトについてのγ−IFNヌクレオチド配列の分
析から、成熟蛋白の開始点の8bp下流にEcoRIIサイト
が、また停止コドンの285bp下流にSau3Aサイトがあるこ
とが判り、結果的に、EcoRII-Sau3Aフラグメント上に成
熟蛋白をコードする全配列が単離される。ライブラリー
から得られたγ−IFNクローンをpTG11とする。 pTG909の構築（第13図） 合成アダプター分子が最初に用いられ、これにより次
の事が可能となる。 ａ）EcoRII末端とNdeＩ末端との間で結合が行なわれる
こと。 ｂ）成熟γ−IFNをコードする配列に関し、欠損してい
る8bpが導入されること、及び ｃ）cIIrbsATG開始コドンが、再構成されるため、成熟
γ−IFN蛋白質をコードする配列が、F-metイニシエター
を除き、融合アミノ酸を伴うことなく翻訳されること。 このアダプターは、化学的に合成され、その構成は図
に示されている。 pTG11はEcoRII及びSau3Aで消化され、pTG908はNdeＩ
及びBamHIで消化される。 適当なフラグメントはゲル上で精製され、等モル量の
アダプターと混合され、予備ハイブリダイズされ、連結
される。該混合物は、受容能力のある（competent）TGE
900細胞を形質転換するのに使用し、形質転換体は、ニ
ツク−翻訳された、32P−標識化pTG11のPstI挿入物を該
形質転換体とハイブリダイズすることにより選択され
る。 13のクローンが選択され、マツピング（mapping）に
よりモニターされ、これらの一つであるpTG909が配列化
（sequencing）により確認される。 ベクターpTG941の構築（第14図） pTG909は、二つのNdeＩサイトを含有し、その一方は
γ−IFNの開始コドンに、他方はγ−IFN配列から22bp下
流に存在する。 これらサイト間の領域は、γ−IFNの最初の７つのア
ミノ酸をコードする領域であるが、NdeＩで処理して除
去され、図示する合成オリゴヌクレオチドで置換され
た。 この反応は、下流のNdeＩサイトを破壊し、NdeＩサイ
トを上流に再構成する一方で、特異なBamHIサイトを導
入する。ベクターpTG941は、こうして得られる。 pTG951の構築（第15図） 第15図は、pTG941から誘導されるpTG951の構築を図式
的に示すものである。pTG941においては、cIIrbsを含有
するフラグメントが、E.コリlacオペロンrbsと呼ばれる
E.コリlacオペロンの翻訳開始領域の配列に基づく合成
配列で置換されている。この合成オリゴヌクレオチド
は、γ−IFNをコードする配列の開始コドンの単一のNde
Ｉサイトと、Ｎ遺伝子中に挿入されたClaIサイトとの間
のHgaIサイトにおいて挿入された。 その結果、NdeＩ及びClaＩで処理することにより、プ
ラスミドpTG951は切断されたＮ遺伝子のみを含有してお
り（Ｎ遺伝子の翻訳とフエーズの合つている（in phas
e）停止コドンは、新たにrbsサイトのすぐ上流に位置し
ている）、pTG909及びpTG941に存在する転写ターミネー
ターtL1及びtR1を有しない。 主な結果を、下記の表に示す。 以下の実施例は、そのＮ−末端で修飾された変異体HV
2の製造を示すものである。 添附図面において： ・第16図は、pTG720を含有するE.コリTG900培養物にお
いて誘発されたヒルジン活性の曲線を示す。 ・第17図は、pTG720を含有するE.コリTG900の抽出物か
らの35S−標識化蛋白質の分析のフペクトルを示す。 修飾HV2の製造 本発明のヒルジンを発現するプラスミドpTG720の構築
は、pTG717及びpTG927を出発物質として、上記したプラ
スミドpTG718の場合と同じ方法に従い行なわれる。 pTG927のNdeI-PvuIIフラグメントは、ヒルジンのＮ−末
端におけるile-thr配列を再構成するために、下記のア
ダプターオリゴヌクレオチドによりpTG717のHinfI-AhaI
IIフラグメントに合体される。 リゲーシヨン混合物は、E.コリTG900を形質転換する
のに用いられ、プラスミドを含有する形質転換体は、ア
ンピシリン100μg/mlを含有する寒天−Ｌプレート上で
選択される。ヒルジン配列を含有する構築物は、プロー
ブとして標識化pTG717挿入物を用いて該コロニーをハイ
ブリブイズすることにより同定される。 最終プラスミドのDNA配列は、発現プラスミドにおけ
るDNAの直接配列（direct sequencing）によりモニター
された。 pTG720によるヒルジン活性の発現 プラスミドpTG720を含有するE.コリTG900を、LB培地
及び50μg/mlのアンピシリン中で30℃にて、600におけ
る光学密度が0.3となるまで増殖させる。 該細胞培養物は、次いで、37℃にて、PLプロモーター
からの転写を誘発すべく転移される。 1mlのアリコート（aliquot）を１時間毎に取出し、60
0nmにおける密度を測定し、細胞を遠心分離により集め
る。 遠心分離ペレツトは、200μｌのTGE〔25mM Tris HC
l、pH8.0、50mMグルコース、10mM EDA〕中に再懸濁さ
せ、該細胞は音波処理により溶解される。 清澄化後、上清を集め、その抗トロンビン活性を、凝
集試験（coaqulation test）により又はトロンビンの標
準溶液による、基質、トシルグリシルプロリルアルギニ
ン ４−ニトロアニリド アセテート（Chromozym TH、
ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・
ベシユレンクター・ハフツング、Boehringer Mannheim
GmbH）の開裂阻害についての比色定量試験により測定す
る。 該反応は、1mlの反応容量において、100mM Tris HC
l、pH8.0、0.15M KCl及び0.1％のポリエチレングリコー
ル6000からなる緩衝液に溶解させた13μＭの基質を用い
て行なう。 0.25Uのトロンビンとの反応を、405nmにて分光光度計
を用いて２分間追跡し、反応速度を光学密度の上昇スロ
ープから測定する。 標準ヒルジン又は未知の抽出物をこのトロンビン反応
混合物に添加し、阻害の程度乃至は抗トロンビン活性を
測定する。 添附の第16図は、pTG720を含有する細胞の培養物中の
抗トロンビン活性の誘導（induction）効果を、培養物
１当りの600の光学密度に対する抗トロンビン単位と
して示す。該誘導は６時間にわたるものである。 破線は、同一時間に600の光学密度で測定されたE.コ
リ細胞の増殖曲線を示す。 誘導の結果、有意なレベルを示すヒルジン型の活性が
観察される。 ヒルジン配列を有しないプラスミドを含有する培養物
の対照溶菌産物は、活性を示さない。 これら細菌溶菌産物を、HClでpH2.8に酸性化した後15
分間70℃に加熱すると、かなりの量の蛋白質が変性さ
れ、沈澱する。後者を冷却抽出物から遠心分離により除
去し、上清をTris HCl緩衝液（最終濃度100mM、pH8.0）
を添加することにより中和すると、当初の活性の少なく
とも100％の活性、しばしばそれ以上の活性が上清中に
再び現れる。 典型的実験において、当初の活性の130％の活性が上
清に再び現れる。 ペレツトとして沈澱した物質には、残留活性は認めら
れない。 冷却、遠心分離及び中和後、加熱され酸性化された細
菌抽出物（ヒルジン5ATUを含有する200μｌ）を、37℃
にて15分間、（標準的方法で調製した）セフアロース樹
脂に共有結合的に結合されたトロンビンの50％強度スラ
リー100μｌと共にインキユベートし、且つ該セフアロ
ース・トロンビンを遠心分離により除去する場合には、
上清中にヒルジン型の活性は認められない。 従つて、pTG720により産生されるヒルジンは、天然の
分子と同一の一般的性質を有し、またpTG717及びpTG718
により得られる物と同一の一般的性質を有する。 pTG720培養物中に特異的に誘導され、〔35S〕メチオ
ニンで標識化し、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳
動による分離及び蛍光間接撮影法（fluorography）によ
る顕現化を行なつた後のポリペプチドは第２図に示され
ている。一連の低分子量（５〜10,000ダルトン）のポリ
ペプチドが、特に誘導される。 第17図において、 ・レーン１は、非誘導細胞を示し ・レーン２は、０時間での誘導を示し、 ・レーン３は、１時間の誘導を示し、 ・レーン４は、２時間の誘導を示し、 ・レーン５は、分子量マーカーを示し、 ・レーン６は、３時間の誘導を示し、 ・レーン７は、４時間の誘導を示し、 ・レーン８は、５時間の誘導を示し、 ・レーン９は、６時間の誘導を示し、 ・レーン10は、７時間の誘導を示す。 以下に示す実施例は、ヒルジンHV1の製造を示すもの
である。 HV1遺伝子の研究及び合成の戦略 ヒルジンHV1のための遺伝子を製造するための合成の
作戦は、各種の段階を包含する。 まず、第18図に示されるように、アミノ酸53の後はHV
1とHV2とでアミノ酸の相違はなく、また、アミノ酸56に
中心を有する、pTG717中でクローン化されたHV2のcDNA
中のTaqIサイトは一つであるため（第19図）、アミノ酸
56の後の変異体HV1のDNA配列はpTG717のTaqI-PstIフラ
グメントにより供給され得る。 この理由から、HV1の最初の56個のアミノ酸をコード
するDNAのみを、化学的に合成しなければならない。 このDNAは、２つの別個のブロツクとして合成され
た。第20図に示す第一のブロツクは、まず、主としてク
ローニングを目的とするEcoRI粘着末端から始まり、次
いで直ちに、HV1をコードする配列の前のATG開始コドン
を含有するNdeIサイトが続く。完全な遺伝子は、５′末
端におけるNdeIサイトを用い、E.コリ中での発現ベクタ
ー中への挿入のために回収（withdraw）することができ
る。この部分に続いて、HV1〜32のアミノ酸をコードす
るDNAが延長しており、BamHI粘着末端で終了することが
できる。なぜなら、アミノ酸31及び32はgly及びserであ
り、下記に示す如く、BamHIサイトによりコードされる
からである。 この109bpを有する合成DNA部分は、その構成オリゴヌ
クレオチドを縮合することにより組立てられ、次いでリ
ゲーシヨンにより、EcoRI/BamHIで切断されたフアージM
13mp8中に置かれ、斯くしてM13TG724が構築される。該
合成DNAは、フアージM13のポリリンカー領域に存在する
ので、この第１の合成ブロツクが正しく組立てられてい
ることを確認するべく、即座に配列化（sequenced）す
ることができる。 第２の合成ブロツクは、アミノ酸33〜56に対応するも
のであり、その一端にはBamHI粘着サイトがあり、他端
にはTaqIサイトがある（第21図）。この69pbの合成ブロ
ツクは、やはり、その構成オルゴヌクレオチドから組立
てられ、次いで第21図に示すように、pTG717由来のTaqI
-PstIフラグメントと共に、PamHI/PstIで切断されたM13
TG724中に挿入される。これにより、完全なHV1をコード
する配列を含有するフアージM13TG725が得られる。上記
の如く、この構築が正確に組立てられているか否かは、
配列化（sequencing）により即座に確認できる。 次の段階は、ヒルジン配列のATGから始まり、３′末
端の非翻訳領域で終了するNdeI-AhaIIIフラグメント
を、NdeI/PvuIIで切断されたプラスミドpTG927へ転移さ
せることからなる。この発現ベクターはヒルジンHV2発
現ベクターpTG720の構築に使用されたものと同一であ
り、その構造及び構築法は既述の通りである。変異体HV
1をコードする最終発現ベクターは、pTG726として知ら
れ、第22図に示されている。 これら２つのブロツクを構築するのに用いられたオリ
ゴヌクレオチドの正確な配列は、第23図に示されてい
る。ブロツク１は、EcoRIサイトからBamHIサイトへと延
び、22〜32塩基の大きさを有する８個のオリゴヌクレオ
チドから成る。ブロツク２は、BamHIサイトからTaqIサ
イトへと延び、19〜30塩基の大きさを有する６個のオリ
ゴヌクレオチドから成る。 該ヌクレオチドは、シリカ支持体上でマニユアル・フ
オスフオトリエステル法（参考文献31）により合成さ
れ、HPLC法又はポリアクリルアミドゲルからの溶離を用
いて精製された。 該遺伝子の合成部分に用いられたオリゴヌクレオチド
の正確な配列は、次のパラメーターを考慮して選択され
た。 ａ）コドンの選択は、可能な場合、E.コリにおいて非常
に高いレベルで発現される遺伝子のそれによる。この選
択は、発表されているデータ（参考文献32、33）を用い
てなされる。 ｂ）各オリゴヌクレオチドを個々に、次いで完全な配列
においてコンピユーター分析し、こうして“ヘアピン”
を形成し得る構造を除去する。 ｃ）ヒルジン分子のＮ−末端の選択はこの領域における
或る位置において該塩基が得られるようにすべく或るコ
ドンを優先的に使用することに対応する。該領域におい
ては、之等塩基がE.コリにおいて外部蛋白質を高いレベ
ルで発現するのに重要であることが示されている。 合成遺伝子の組立て 第１のブロツク このブロツクを形成するオリゴヌクレオチド１〜８
（第23図）は、２つの端部オリゴヌクレオチド１およひ
及び８を除いて、標準的条件下に、ポリヌクレオチドキ
ナーゼで５′末端においてリン酸化される。これは、引
続くリゲーシヨンの段階において合成ブロツクの二量化
又は重合体の生成を避けることを企画するものである。
500ピコモルの各オリゴヌクレオチドに対し、最終25μ
ｌ容量の60mM Tris HCl、pH 7.5、10mM MgCl2、8mMジチ
オスレイトールであつて、且つ3.3pmolの32P γ−ATP
（その特異的活性は5000Ci/mmolである）を含有するも
のの中で、２ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼを用
いて、キナーゼを作用させる。次いで、37℃にて15分間
インキユベート後、冷ATP5mmolを添加することにより、
該オリゴヌクレオチドは完全にリン酸化される。更に37
℃で15分間インキユベート後、該ヌクレオチドは、変性
条件（denaturing conditions）で行なわれる20％ポリ
アクリルアミドゲル上での電気泳動により精製される。
標準化オリゴヌクレオチドは、オートラジオグラフイー
により検出され、該ゲルの適当な領域が切り取られ、該
オリゴヌクレオチドは、37℃にて一夜インキユベートし
つつ水で溶離される。 次いで、該オリゴヌクレオチドは、DEAE−セルロース
のカラム上で、1Mトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝
液、pH8を用いて溶離し、凍結乾燥される。 キナーゼの作用を受けず、また標準化されなかつたオ
リゴヌクレオチド１及び８については、ゲル精製を上記
の如く行なうが、該オリゴヌクレオチドはUV吸収により
検出される。 該相補性のあるフラグメント（１＋５、２＋６等）
は、最終50μｌ容量の66mM Tris HCl、pH7.5、6mM MgCl
2、100mM NaCl、0.5mMスペルミジン（spermidine）及び
8mMジチオスレイトール中、等モル量、即ち各オリゴヌ
クレオチドの100ピコモルを用いて、混合される。これ
ら混合物は、100℃まで加熱し、２時間で37℃まで徐冷
する。これら溶液を混合して、100μｌ中４種のオリゴ
ヌクレオチドのハイブリツドを得る。これら混合物は最
終的に合され、該８種のオリゴヌクレオチドは、ペアを
形成すべく、最終容量200μｌ中、37℃にて終夜放置さ
れる。ペアを形成したオリゴヌクレオチドの0.005ピコ
モルを、66mM Tris pH 7.5、6.6mM MgCl2、10mMジチオ
スレイトール及び0.5mM ATPを含有する、最終20μｌ容
量のリゲーシヨン混合物中において、BamHI/EcoRIで消
化され、ゲル上で精製されたM13mp9の25ngと連結させ
る。 該リゲーシヨンを、15℃にて24時間続け、再び４℃に
て24時間行なう。リゲーシヨン混合物を、次いで、E.コ
リ・JM103を形質転換するのに用いる。形質転換により
得られた多くの無色プラークから、８つの候補を選択
し、該フアージから一重鎖DNAを調製し、これをジデオ
キシ・チエイン・ターミネーシヨン法（参考文献34）に
より直接DNA配列化（sequencing）にかける。これら候
補から、２つが、第23図のブロツク１に対応するオリゴ
ヌクレオチドが正確に組立てられたものを含有すること
が見出され、その１つはM13TG724と命名され、次の段階
で使用される。 第２の合成ブロツク及び全遺伝子のアセンブリー 第２の合成ブロツクをアセンブルするために、上記の
方法と基本的に同様の手順を採用した。但し、オリゴヌ
クレオチド成分は、ペアリング段階前には精製せず、キ
ナーゼに接触させ（但し第23図における末端オリゴヌク
レオチド９及び14は除く）、次いで直接ペアリングさせ
た。ペアリング条件は、上記と同様であり、最終体積15
0μｌ中に各オリゴヌクレオチドが100ピコモルとなる様
にした。 ペアリング段階後、混合物は、２％アガロースゲル
（低融点アガロース）上に注入され、電気泳動に供され
た。オリゴヌクレオチドは、エチジウム ブロマイドに
よる染色により検出され、アセンブルされたブロツク
（69bp）に対応するバンドがゲルから切り出され、常法
により溶離された。 第２の合成ブロツク（2ng）が次いでフアージM13TG72
4（50ng）と混合され、PstI/BamHIにより切断され、ゲ
ル上で精製され、pTG717のTaqI/PstIフラグメント（2n
g）がゲル上で精製された。これ等エレメントの組合せ
が、66mMトリスHCl、pH7.5及び6.6mM MgCl2を含む液20
μｌ中でアセンブルされ、65℃で５分間加熱され、更に
DTT10mM、ATP0.5mM及びT4リガーゼ５単位を加えた。リ
ゲーシヨンを15℃で16時間継続し、リゲーシヨン混合物
をE.コリ JM 103の形質転換に使用した。 被形質転移体中の無色のプラーク群から、単一鎖フア
ージを直接連鎖（sequening）させるために12のプラー
クを選んだ。更に、二本鎖型のフアージをも作り（参考
文献35）、正しくアセンブルされた組換体（recombinat
es）中に存在する筈の単一BamHIサイトの存在を調べ
た。これ等クローンの大多数は、BamHIサイト、及びHV1
をコードする全遺伝子の正確なアセンブリーに対応する
DNA配列を含んでいた。これ等の１つでM13TG725と名付
けられたものが、選択された。 発現ベクターへのHV1遺伝子の転移 HV1の蛋白質を発現することができるベクタープラス
ミドを作り出す為の最終段階は、M13TG725の248bp NdeI
-AhaIIIセグメントを、NdeI/PvuIIにより切断されたpTG
927（第22図）に転移させることである。しかしなが
ら、この種の消化によるフアージの再現型は、第２のM1
3フラグメントとなり、これは、所望のフラグメントと
実質上同一のサイズを有するが発現ベクター中でより効
率良くクローンを形成するので、まずヒルジンHV1配列
全体を含むAvaII-BalIIフラグメント（1.71Kb）を作
り、次いでこれをNdeI/AhaIIで消化する必要があつた。
この消化生成物は、それ以上の精製を行なうことなく、
NdeI/PvuIIで切断された後の発現ベクターpTG927内にリ
ゲートされた。E.コリTGE900の形質変換体中で、正しい
構造のpTG726は、HV1遺伝子の配列から得られる単一Bam
HIサイトの存在により、次いでDNA配列の直接分析によ
り確認された。 pTG726によるヒルジンHV1の生物学的活性の発現 発現ベクターpTG726は、温度誘導性のプロモーター、
PLプロモーター、即ちバクテリオフアージλの主左方プ
ロモーター（major leftward promoter）を有してい
る。このプロモーターは、ホストによりエンコードされ
た温度に敏感なリプレツサーによりブロツクされている
ので、ヒルジンHV1遺伝子は、30℃での成長期間中には
転写されない。しかしながら、温度が37℃を超えると、
この遺伝子の転写が誘発される。 第24図は、30℃で且つ600nmでの光学密度0.3で成育さ
れ、次いで37℃で誘発されたE.コリpTG726培地における
成長曲線及び抗トロンビン活性の誘発曲線を示す。 ヒルジン活性は、バクテリア細胞の超音波抽出物（so
nicated extracts）が、色素基体（chromogenic substr
ates）を開裂（cleave）させる能力に関して、ウシのト
ロンビン活性を抑制する能力により測定した。 相当な量のヒルジンがpTG726培地中で生成しているこ
とが明らかである。約３〜4000抗トロンビン単位/OD/l
培地が認められるが、この活性は、時間の経過とともに
急速に低下する。この効果は、容易に再現可能であり、
誘発後３時間で活性がピークとなり、次いで活性低下段
階に入る。 この誘発曲線の特性は、極めて特徴的で且つ再現性が
高く、発現ベクターpTG720により従来観察されている特
性とは、著るしく異なる。即ち、pTG720の場合には、誘
発によりヒルジンの変種HV2を発現する。この変種は、
約２時間の潜時（latency period）を伴つてよりゆつく
りと誘発され（第25A図）、次いでその活性は、pTG726
の活性（第25B図）とほぼ同等のレベルに達した後、低
下することなく一定値にとどまる。同一のE.コリTGE900
ホスト細胞中で全く同一の発現ベクターを使用しつつ
も、２つのヒルジン変種が得られたのだから、この誘発
と安定化におけるこの差異は、HV1とHV2との間の一次構
造の相違に関連するに違いない。更に、このことは、２
つの変種間の蛋白質消化に対する抵抗の相違を反映する
ものかも知れないし、また、２種の変種の異なる生物学
的活性又は異なる生物学的役割の表われかも知れない。
安定性及び他の生物学的特性における相違は、これ等ヒ
ルジンの使用に際して、恐らく考慮されることになろ
う。 E.コリにおけるHV1及びHV2の発現の相違は、２種の異
なる発現ベクターにより形質転換されたE.コリTGE900細
胞のパルス−ラベリング分析（pulse-labeling analysi
s）によつても、観察される。２種のヒルジン変種は、
システインに極めて富むので（分子の約10％）、又この
アミノ酸は、E.コリ蛋白質中ではむしろ一般的ではない
ので、〔35S〕システインが、ヒルジンの発現に関する
放射性マーカーとして極めて有用である。pTG726により
形質転換されたE.コリ細胞が、LB＋アンピシリン（100
μg/ml）中で測定される光学密度が0.3となるまで30℃
で培養され、次いで37℃まで温度を上昇させることによ
り変種HV1を発現させるようにした。 定期的に１時間毎に、培地から200μｌのアリクウオ
ツトを取出し、〔35S〕システイン（比重1000Ci/mmol）
70μCiを加え、２分間にわたりラベリングを行なつた。
大過剰（約2ml）のリン酸塩を含む冷緩衝食塩水を更に
加え、遠心分離により細胞を集め、SDSゲル用の負荷バ
ツフアー（50mMトリスHCl、pH6.8,SDS1.3％、グリセロ
ール５％、β−メルカプトエタノール2.5％、ブロモフ
エノールブルー0.004％）40μｌ及び15％SDS−ポリアク
リルアミドゲル５μｌ中で５分間ペレツトを沸騰させる
ことにより、全細胞中の標識された蛋白質を分析した
（ラエムリによる手順：参考文献36）。電気泳動後、ゲ
ルを蛍光間接撮影及びオートラジオグラフイーに供し
た。 得られた結果は、ヒルジンに対応する6000〜12000ダ
ルトンの領域における一連のバンド群の生成を示してい
る。E.コリpTG726からの抽出物（変種HV1）について
は、これ等のバンドは極く弱く標識されているに過ぎな
いのに対し、E.コリpTG720抽出物については、これ等の
バンドは極めて強く標識されている。 標識パターンにおけるこの著るしく明確な差異は、２
種の培養物がほぼ同様の抗トロンビン活性を示すという
事実にもかかわらず、示されたものである。 ヒルジン組換体HV1の他の特性 天然のヒルジン及びE.コリから得られた変種HV2の特
性の一つは、極めて低いpH条件下での熱処理に対する抵
抗性である。E.コリから得られた変種HV1についても、
同様の現像が認められる。pTG726により形質転換された
E.コリ細胞の３時間経過後の培地を遠心分離した後、培
地体積の1/5のTGE（トリス HCl 50mM、pH8.0、グルコ
ース50mM、EDTA10mM）に再度懸濁させ、細胞を超音波に
より破壊した。細胞残渣を遠心分離によつて除去し、上
澄の一部を抗トロンビン活性の測定に直接使用した。 上澄の他の部分を希薄HClによりpH2.8に調整し、70℃
で15分間加熱した。希釈液を氷中で30分間冷却し、変性
した不溶性蛋白質を遠心分離により除去した。上澄を希
薄NaOHを加えることにより中和し、次いで抗トロンビン
活性を測定した。酸性化及び中和による量のわずかの変
化を考慮に入れた上で、当初の活性が、この酸／熱処理
によつても、100％そのまま残存していることが計算に
より明らかとなつた。このことから、変種HV1は、天然
のヒルジン及び変種HV2と同一である。 ヒルジンHV2活性は、セフアローズ ビーズ（Sepharo
se beads）に共有結合的に結合されたトロンビンを使用
することにより、微生物抽出物から完全に除くこともで
きる。酸及び熱により処理され、次いで中和されたE.コ
リ/pTG726抽出物（200μｌ中に抗トロンビン活性7.7単
位を含む）を、濃度50％のトロンビン−セフアローズ懸
濁液50μｌ中37℃で15分間培養した。シロンビン−セフ
アローズ ビーズを遠心分離により除去し、上澄の抗ト
ロンビン活性を検査した。当初の抗トロンビン活性の95
％以上が、セフアローズ−トロンビン処理により、除去
された。E.コリ細胞により得られた変種HV1は、従つ
て、セフアローズ ビーズに結合するトロンビンに結合
することができる。 下記の菌株が、1985年３月26日に75724 パリ リユ
・デユ・ドクトウール ルー 28のコレクシオン ナシ
ヨナル ド クルトウル ド ミクロオルガニスム（CN
CM）に寄託された： pTG718により形質転換されたE.コリTGE900 No.I-427 pTG720により形質転換されたE.コリTGE900 No.I-428 pTG726により形質転換されたE.コリTGE900 No.I-429 参考文献 1.エフ．マルクバルト（F.Markwardt）（1955）ナツ−
アヴイツセンシヤフテン（Naturwissenshaften）42,58
7。 2.エフ．マルクバルト（F.Markwardt）（1957）ホツペ
−ザイラーズ ツアイトシユリフト フユア フイジオ
ローギツシユ ヘミー（Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Ch
em.）308,147-156。 3.エフ．マルクバルト（F.Markwardt）及びピー．バル
スマン（P.Walsman）（1967）ホツペ−ザイラーズ ツ
アイトシユリフト フユア フイジオローギツシユ ヘ
ミー（Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.）348,1381-13
86。 4.テルトリン シー．デ ラ ロサ（Tertrin C.de La
Llosa）及びエム．ユテイス（M.Jutisz）（1963）ビユ
ルタン デ ラ ソシエテ デ シミー ビオロジク
（Bull.Soc.Chim.Biol.）45,67-74。 5.エフ．マルクバルト（F.Markwardt）（1970）メソー
ズ イン エンザイモロジー（Methods in Enzymology,
eds.）ジー．イー．パールマン（G.E.Perlman）及びエ
ル．ローランド（L.Lorand）編、アカデミツク プレス
（Academic Press.），第19巻,924-932。 6.デイー．バクデイ（D.Bagdy）、イー．バラバス（E.B
arabas）及びエル．グラフ（L.Graf）（1973）トロンボ
ウシス リサーチ（Thrombosis Research）２,229-23
8。 7.エル．グラフ（L.Graf）、エー．パツチー（A.Path
y）、イー．ビー．バラバス（E.B.Barabas）及びデイ
ー．バグデイ（D.Bagdy）（1973）バイオシミカ エト
バイオフイジカ アクタ（Biochim.Biophys.Acta）31
0,416-417。 8.テイー．イー．ピーターセン（T.E.Petersen）、エツ
チ，アール．ロバーツ（H.R.Roberts）、エル．ソトラ
ツプ−イエンセン（L.Sottrup-Jensen）、エス．マグヌ
ソン（S.Magnusson）及びデイー．バグデイ（D.Bagdy）
（1976）プロタイズ オブ ザ バイオロジカル フル
ーイツズ、ブロシーデイング オブ ザ コロキニウム
（Protides Biol.Fluids,Proc.Colloq.）第23巻 145-1
49。 9.ジエイ．ドツト（J.Dodt）、エツチ．−ピー．ミユラ
ー（H.−P.Muller）、ユー．ジーミユラー（U.Seemulle
r）ジエイ．−ワイ．チヤン（J.−Y.Chang）（1984）フ
エブス レターズ（Febs Lett.）165,180-183。 10.テイー．クラジエスキー（T.Krajewski）及びビー．
ブロンベツク（1968）アクタ ケミカ スカンジナビカ
（Acta.Chem.Scand.）22,1339-1346。 11.ジエイ．−ワイ．チヤン（J.−Y.Chang）（1983）フ
エブス レターズ（Febs Lett.）164,307-313。 12.アイ．ピー．バスコワ（I.P.Baskova）、デイー．ユ
ー．チエルケソワ（D.U.Cherkesova）、ブイ．ブイ．モ
ゾロフ（V.V.Mosolov）、イー．エル．マウロワ（E.L.M
avlova）及びエル．エー．ベリヤノワ（L.A.Belyanov
a）（1980）ビオキミヤ（Biokhimiya）45,463-467。 13.アイ．ピー．バスコワ（I.P.Baskova）、デイー．ユ
ー．チエルケソワ（D.U.Cherkesova）及びブイ．ブイ．
モゾロフ（V.V.Mosolov）（1983）トロンボウシス リ
サーチ（Thrombosis Research）30,459-467。 14.エフ．マルクバルト（F.Markwardt）、ジエイ．ハウ
プトマン（J.Hauptman）、ジー．ノバツク（G.Nowa
k）、シーエツチ．クレツセン（Ch.Klessen）及びピ
ー．バルスマン（P.Walsmann）（1982）トロンボウシス
アンド ヘモスタシス，シユトツトガルト（Thrombos
is and Hemostasis,Stuttgart）47,226-229。 15.ピー．バルスマン（P.Walsmann）及びエフ．マルク
バルト（1981）デイー フアルマツイー（Die Pharmazi
e）10,653-660。 16.テイーエツチ．クロス（Th.Kloss）及びユー．ミツ
トマン（U.Mittmann）（1982）Longenbecks Arch.Chiru
rg.358,548。 17.エー．イシカワ（A.Ishikawa）、アール．ハフター
（R.Hafter）、ユー．ジーミユラー（U.Seemuller）、
ジエイ．エム，ゴケル（J.M.Gokel）及びエム．グラエ
フ（M.Graeff）（1980）トロンボウシス リサーチ（Th
rombosis Research）19,351-358。 18.ジー．ノバツク（G.Nowak）及びエフ．マルクバルト
（F.Markwardt）（1980）Expt.Path.18,438-443。 19.エー．エツチ．ストール（A.H.Sutor）、エス．クノ
ツブ（S.Knop）及びデイー．アドラー（D.Adler）（198
1）コントローレ アンチトロンボンチカ、第23回シン
ポジウム ブルートゲリング、ハンブルグ（Kontrolle
Antithrombotica,23rd Symp.Blutgerinnung,Hamburg）1
17-123。 20.デイー．バグデイ（D.Bagdy）、イー．バラバス（E.
Barabas）、エル．グラフ（L.Graf）、テイー．イー．
ピーターセン（T.E.Petersen）及びエス．マグヌソン
（S.Magnusson）（1976）メソーズ インエンザイモロ
ジー パート ビー（Methods in Enzymology part
B）、第45巻、669-678。 21.ピー．バルスマン（P.Walsman）（1981）フアマツイ
ー（Pharmazie）36,860-861。 22.エツチ．アビブ（H.Aviv）及びピー．レダー（P.Led
er）（1972）プロシーデイングズ オブ ザ ナシヨナ
ル アカデミー オブ サイエンス オブ ユー．エ
ス．エー．（Proc.Matl.Acad.Sci.USA）69,1408-1412。 23.エム．ジヤイエ（M.Jaye）、エツチ．デ ラ サー
レ（H.De La Salle）、エフ．シヤンバー（F.Schambe
r）、エー．バランド（A.Balland）、ブイ．コウリ（V.
Kohli）、エー．フインデリ（A.Findeli）、ピー．トル
ストシエフ（P.Tolstoshev）及びジエイ．ピー．ルコツ
ク（J.P.Lecocq）（1983）ヌクレイツク アシツズ リ
サーチ（Nucleic Acids Res.）11,2325-2335。 24.ジエイ．ダブリユ．ゾスタツク（J.W.Szostak），エ
イ．アイ．スタイルズ（J.I.Stiles），ビー．−ケー．
タイ（B.−K.Tye），ピー．チユウ（P.Chiu），エフ．
シヤーマン（F.Sherman）及びアール．ウー（R.Wu）（1
979）メソーズ イン エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）、第68巻、419-428。 25.ブイ．コウリ（V.Kohli）、エー．バランド（A.Ball
and），エム．ウインゼリス（M.Wintzerith），アー
ル．サウエルバルト（R.Sauerwald），エー．スタウブ
（A.Ataub）及びジエイ．ピー．ルコツク（J.P.Lecoc
q）（1982）ヌクレイツク アシツズ リサーチ（Nucl.
Acids Res.）10,7439-7448。 26.エフ．サンガー（F.Sanger），エス．ニツクレン
（S.Nicklen）及びエー．アール，コールソン（A.R.Cou
lson）（1977）プロシーデイングス オブ ザ ナシヨ
ナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユ
ー．エス．エー．（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）74,5463-
5467。 27.ピー．トマス（P.Thomas）（1980）プロシーデング
ス オブ ザ ナシヨナル アカデミー オブ サイエ
ンス オブ ザ ユー．エス．エー（Proc.Natl.Acad.S
ci.USA）77,5201-5205。 28.エツチ．カールカー（H.Kalckar）（1947）ジヤーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Che
m.）167,461。 29.ジエイ．ケイン（J.Caen）、エム．ジエイ，ラリー
エ（M.J.Larrieu）及びエム．サママ（M.Samama）（197
5）レエモスターズ メトド デクスプロラシオン エ
デイアグノステイク プラテイク（Ｌ′ Hemostase,M
ethode,d′ exploration et diagnostic Pratique）第
２版，出版レクスパシオン シアンテイフイーク，パリ
（Ｌ′ Expansion Scientifique,Paris） 30.ジエイ．ビエイラ（J.Vieira）及びジエイ．メツシ
ング（J.Messing）ジーン（Gene）19,259-268。 31.ブイ．コウリ（V.Kohli），エー．バランド（A.Ball
and），エム．ウインゼリス（M.Wintzerith），アー
ル．サウエルバルド（R.Sauerwald），エー．スタウブ
（A.Staub）及びジエイ．ピー．ルコツク（J.P.Lecoc
q）（1982）ヌクレイツク アシツズ リサーチ（Nucl.
Acid.Res.）10,7439-7448。 32.アール．グランサン（R.Grantham），シー．ゴーチ
エ（C.Gauthier），エム．ゴウイ（M.Gouy），イー．エ
ム．ジヤコブソン（E.M.Jacobzon）及びアール．マーシ
ア（R.Mercier）（1981）ヌクレイツク アシツズ リ
サーチ（Nucl.Acids Res.）９,143-174。 33.テイー．イケムラ（T.Ikemura）（1981）ジヤーナル
オブ モレキユラー バイオロジー（J.Molec.Bio
l.）151.389-409。 34.エフ．サンガー（F.Sanger）．エー．アール．コー
ルソン（A.R.Coulson），ビー．ジー．バレル（B.G.Bar
rel），エー．ジエイ．エツチ．スミス（A.J.H.Smith）
及びビー．エー．ロエ（B.A.Roe）ジヤーナル オブ
モレキヤラー バイオロジー（J.Mol.Biol.）（1980）1
61-178。 35.エツチ．シー．ビーンボイム（H.C.Birnboim）及び
エス．ドリー（S.Doly）（1979）ヌクレイツク アシツ
ズ リサーチ（Nucl.Acids Res.）７,1513。 36.ユー．ラエムリ（U.Laemli）ネイチヤー（Nature）
（1970）227,680-685。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 コートニー マイケル
フランス国 67100 ストラスブール
リユ デユ バロン 18
(72)発明者 ルコツク ジヤン‐ピエール
フランス国 67116 ライヒステート
リユ デユ シヤン・デユ・フオ ６
(56)参考文献 特開 昭60−136597（ＪＰ，Ａ)
ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ 165
（1984）Ｐ．180−183
Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ，45（1980)
Ｐ．463−467
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ 30（1983）Ｐ．459−467
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．以下の配列を含むヒルジン： Ile−Thr−Tyr−Thr−Asp−Cys−Thr−Glu−Ser−Gly− Gln−Asn−Leu−Cys−Leu−Cys−Glu−Gly−Ser−Asn− Val−Cys−Gly−Lys−Gly−Asn−Lys−Cys−Ile−Leu− Gly−Ser−Asn−Gly−Lys−Gly−Asn−Gln−Cys−Val− Thr−Gly−Glu−Gly−Thr−Pro−Asn−Pro−Glu−Ser− His−Asn−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro− Glu−Glu−Tyr−Leu−Gln 及びアミノ酸の一部を下記の通り変えたヒルジン変種： 1 Ile→Val 2 Thr→Val。 ２．グリコシル化または硫酸化されていないことを特徴
とする請求の範囲第１項記載のヒルジン。 ３．ヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子を
含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびThr
をコードする配列から始まることを特徴とするヒルジン
またはヒルジン変種をクローニングおよび発現させるベ
クターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成した
ヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴とす
るヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得られ
た請求の範囲第１項に記載のヒルジンまたはヒルジン変
種。 ４．ヒルジン遺伝子の最初において、以下の配列： ATG ATT ACG TAC TAA TGC を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成し
たヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得ら
れた請求の範囲第３項記載のヒルジンまたはヒルジン変
種。 ５．ヒルジン遺伝子のはじめに下記の配列： ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成し
たヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得ら
れた請求の範囲第４項記載のヒルジンまたはヒルジン変
種。 ６．コレクシオン ナシヨナル ド クルトウル ド
ミクロオルガニスム（CNCM）にNo.I-428の下で寄託され
たE.coli株TGE900中に含まれる、ベクターpTG720で形質
転換されたバクテリアを培養し、生成したヒルジンまた
はヒルジン変種を回収することを特徴とするヒルジンま
たはヒルジン変種の製造方法により得られた請求の範囲
第３項記載のヒルジンまたはヒルジン変種。 ７．バクテリアがE.coli株である請求の範囲第３〜６項
のいずれかに記載のヒルジンまたはヒルジン変種。 ８．ヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子を
含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびThr
をコードする配列から始まることを特徴とするヒルジン
またはヒルジン変種をクローニングおよび発現させるベ
クターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生成
物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行っ
て上澄中にヒルジン又はその変種を回収することを特徴
とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得
られた請求の範囲第３項記載のヒルジンまたはヒルジン
変種。 ９．ヒルジン遺伝子の最初において、以下の配列： ATG ATT ACG TAC TAA TGC を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
って上澄中にヒルジン又はその変種を回収することを特
徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により
得られた請求の範囲第８項記載のヒルジンまたはヒルジ
ン変種。 １０．ヒルジン遺伝子のはじめに下記の配列： ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
って上澄中にヒルジン又はその変種を回収することを特
徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により
得られた請求の範囲第９項記載のヒルジンまたはヒルジ
ン変種。 １１．コレクシオン ナシヨナル ド クルトウル ド
ミクロオルガニスム（CNCM）にNo.I-428の下で寄託さ
れたE.coli株TGE900中に含まれるベクターpTG720で形質
転換されたバクテリアを培養し、培養生成物を酸性pH域
で加熱し、次いでデカンテーションを行って上澄中にヒ
ルジン又はその変種を回収することを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種の製造方法により得られた請求の
範囲第８項記載のヒルジンまたはヒルジン変種。 １２．バクテリアがE.coli株である請求の範囲第８〜11
項に記載のヒルジンまたはヒルジン変種。 １３．ヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
い、トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結合させ、
次いでヒルジン拮抗体（hirudin competitor）の結合後
に樹脂を溶出処理してヒルジン又はその変種を回収する
ことを特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方
法により得られた請求の範囲第８項記載のヒルジンまた
はヒルジン変種。 １４．ヒルジン遺伝子の最初において、以下の配列： ATG ATT ACG TAC TAA TGC を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
い、トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結合させ、
次いでヒルジン拮抗体（hirudin competitor）の結合後
に樹脂を溶出処理してヒルジン又はその変種を回収する
ことを特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方
法により得られた請求の範囲第13項記載のヒルジンまた
はヒルジン変種。 １５．ヒルジン遺伝子のはじめに下記の配列： ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
い、トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結合させ、
次いでヒルジン拮抗体（hirudin competitor）の結合後
に樹脂を溶出処理してヒルジン又はその変種を回収する
ことを特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方
法により得られた請求の範囲第14項記載のヒルジンまた
はヒルジン変種。 １６．コレクシオン ナシヨナル ド クルトウル ド
ミクロオルガニスム（CNCM）にNo.I-428の下で寄託さ
れたE.coli株TGE900中に含まれるベクターpTG720で形質
転換されたバクテリアを培養し、培養生成物を酸性pH域
で加熱し、次いでデカンテーションを行い、トロンビン
を担持する樹脂にヒルジンを結合させ、次いでヒルジン
拮抗体（hirudin competitor）の結合後に樹脂を溶出処
理してヒルジン又はその変種を回収することを特徴とす
るヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得られ
た請求の範囲第13項記載のヒルジンまたはヒルジン変
種。 １７．バクテリアがE.coli株である請求の範囲第13〜16
項のいずれかに記載のヒルジンまたはヒルジン変種。 １８．ヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成し
たヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴と
する以下の配列を含むヒルジン： Ile−Thr−Tyr−Thr−Asp−Cys−Thr−Glu−Ser−Gly− Gln−Asn−Leu−Cys−Leu−Cys−Glu−Gly−Ser−Asn− Val−Cys−Gly−Lys−Gly−Asn−Lys−Cys−Ile−Leu− Gly−Ser−Asn−Gly−Lys−Gly−Asn−Gln−Cys−Val− Thr−Gly−Glu−Gly−Thr−Pro−Asn−Pro−Glu−Ser− His−Asn−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro− Glu−Glu−Tyr−Leu−Gln 及びアミノ酸の一部を下記の通り変えたヒルジン変種： 1 Ile→Val 2 Thr→Val。 の製造方法。 １９．ヒルジン遺伝子の最初において、以下の配列： ATG ATT ACG TAC TAA TGC を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびThr
をコードする配列から始まることを特徴とするヒルジン
またはヒルジン変種をクローニングおよび発現させるベ
クターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成した
ヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴とす
る請求の範囲第18項記載のヒルジンまたはヒルジン変種
の製造方法。 ２０．ヒルジン遺伝子のはじめに下記の配列： ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成し
たヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴と
する請求の範囲第19項記載のヒルジンまたはヒルジン変
種の製造方法。 ２１．コレクシオン ナシヨナル ド クルトウル ド
ミクロオルガニスム（CNCM）にNo.I-428の下で寄託さ
れたE.coli株TGE900中に含まれるベクターpTG720で形質
転換されたバクテリアを培養し、生成したヒルジンまた
はヒルジン変種を回収することを特徴とする請求の範囲
第18項記載のヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法。 ２２．バクテリアがE.coli株である請求の範囲第18〜21
項のいずれかに記載の製造方法。 ２３．培養生成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテ
ーションを行ってヒルジンを回収し、ヒルジン又はその
変種はデカンテーションにより回収され、ヒルジン又は
その変種は上澄中に回収されることを特徴とする請求の
範囲第18〜22項のいずれかに記載の製造方法。 ２４．さらにトロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結
合させ、次いでヒルジン拮抗体（hirudin competitor）
の結合後に樹脂を溶出処理してヒルジンを回収する請求
の範囲第18〜23項のいずれかに記載の製造方法。 ２５．標識された以下の配列を含むヒルジン： Ile−Thr−Tyr−Thr−Asp−Cys−Thr−Glu−Ser−Gly− Gln−Asn−Leu−Cys−Leu−Cys−Glu−Gly−Ser−Asn− Val−Cys−Gly−Lys−Gly−Asn−Lys−Cys−Ile−Leu− Gly−Ser−Asn−Gly−Lys−Gly−Asn−Gln−Cys−Val− Thr−Gly−Glu−Gly−Thr−Pro−Asn−Pro−Glu−Ser− His−Asn−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro− Glu−Glu−Tyr−Leu−Gln 及びアミノ酸の一部を下記の通り変えたヒルジン変種： 1 Ile→Val 2 Thr→Val。 を必須成分とするヒト又は動物の凝血塊形成診断薬。 ２６．ヒルジンがグリコシル化または硫酸化されていな
い請求の範囲第25項記載の凝血塊形成診断薬。 ２７．ヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成し
たヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得ら
れた、標識されたヒルジンまたはヒルジン変種を必須成
分とする請求の範囲第25項又は第26項記載のヒト又は動
物の凝血塊形成診断薬。 ２８．ヒルジン遺伝子の最初において、以下の配列： ATG ATT ACG TAC TAA TGC を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成し
たヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得ら
れた、標識されたヒルジンまたはヒルジン変種を必須成
分とする請求の範囲第27項記載のヒト又は動物の凝血塊
形成診断薬。 ２９．ヒルジン遺伝子のはじめに下記の配列： ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成し
たヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得ら
れた、標識されたヒルジンまたはヒルジン変種を必須成
分とする請求の範囲第28項記載のヒト又は動物の凝血塊
形成診断薬。 ３０．コレクシオン ナシヨナル ド クルトウル ド
ミクロオルガニスム（CNCM）にNo.I-428の下で寄託さ
れたE.coli株TGE900中に含まれる、ベクターpTG720で形
質転換されたバクテリアを培養し、生成したヒルジンま
たはヒルジン変種を回収することを特徴とするヒルジン
またはヒルジン変種の製造方法により得られた、標識さ
れたヒルジンまたはヒルジン変種を必須成分とする請求
の範囲第27項記載のヒト又は動物の凝血塊形成診断薬。 ３１．バクテリアがE.coli株である請求の範囲第27〜30
項のいずれかに記載のヒト又は動物の凝血形成診断薬。 ３２．ヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
って上澄中にヒルジン又はその変種を回収することを特
徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により
得られた、標識されたヒルジンまたはヒルジン変種を必
須成分とする請求の範囲第27項記載のヒト又は動物の凝
血塊形成診断薬。 ３３．ヒルジン遺伝子の最初において、以下の配列： ATG ATT ACG TAC TAA TGC を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
って上澄中にヒルジン又はその変種を回収することを特
徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により
得られた、標識されたヒルジンまたはヒルジン変種を必
須成分とする請求の範囲第32項記載のヒト又は動物の凝
血塊形成診断薬。 ３４．ヒルジン遺伝子のはじめに下記の配列： ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
って上澄中にヒルジン又はその変種を回収することを特
徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により
得られた、標識されたヒルジンまたはヒルジン変種を必
須成分とする請求の範囲第33項記載のヒト又は動物の凝
血塊形成診断薬。 ３５．コレクシオン ナシヨナル ド クルトウル ド
ミクロオルガニスム（CNCM）にNo.I-428の下で寄託さ
れたE.coli株TGE900中に含まれるベクターpTG720で形質
転換されたバクテリアを培養し、培養生成物を酸性pH域
で加熱し、次いでデカンテーションを行って上澄中にヒ
ルジン又はその変種を回収することを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種の製造方法により得られた、標識
されたヒルジンまたはヒルジン変種を必須成分とする請
求の範囲第32項記載のヒト又は動物の凝血塊形成診断
薬。 ３６．バクテリアがE.coli株である請求の範囲第32〜35
項のいずれかに記載のヒト又は動物の凝血塊形成診断
薬。 ３７．ヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
い、トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結合させ、
次いでヒルジン拮抗体（hirudin competitor）の結合後
に樹脂を溶出処理してヒルジン又はその変種を回収する
ことを特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方
法により得られた、標識されたヒルジンまたはヒルジン
変種を必須成分とする請求の範囲第32項記載のヒト又は
動物の凝血塊形成診断薬。 ３８．ヒルジン遺伝子の最初において、以下の配列： ATG ATT ACG TAC TAA TGC を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
い、トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結合させ、
次いでヒルジン拮抗体（hirudin competitor）の結合後
に樹脂を溶出処理してヒルジン又はその変種を回収する
ことを特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方
法により得られた、標識されたヒルジンまたはヒルジン
変種を必須成分とする請求の範囲第37項記載のヒト又は
動物の凝血塊形成診断薬。 ３９．ヒルジン遺伝子のはじめに下記の配列： ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
い、トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結合させ、
次いでヒルジン拮抗体（hirudin competitor）の結合後
に樹脂を溶出処理してヒルジン又はその変種を回収する
ことを特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方
法により得られた、標識されたヒルジンまたはヒルジン
変種を必須成分とする請求の範囲第38項記載のヒト又は
動物の凝血塊形成診断薬。 ４０．コレクシオン ナシヨナル ド クルトウル ド
ミクロオルガニスム（CNCM）にNo.I-428の下で寄託さ
れでE.coli株TGE900中に含まれるベクターpTG720で形質
転換されたバクテリアを培養し、培養生成物を酸性pH域
で加熱し、次いでデカンテーションを行い、トロンビン
を担持する樹脂にヒルジンを結合させ、次いでヒルジン
拮抗体（hirudin competitor）の結合後に樹脂を溶出処
理してヒルジン又はその変種を回収することを特徴とす
るヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得られ
た、標識されたヒルジンまたはヒルジン変種を必須成分
とする請求の範囲第37項記載のヒト又は動物の凝血塊形
成診断薬。 ４１．バクテリアがE.coli株である請求の範囲第37〜40
項に記載のヒト又は動物の凝血塊形成診断薬。 ４２．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が以下の配列を含むヒルジン： Ile−Thr−Tyr−Thr−Asp−Cys−Thr−Glu−Ser−Gly− Gln−Asn−Leu−Cys−Leu−Cys−Glu−Gly−Ser−Asn− Val−Cys−Gly−Lys−Gly−Asn−Lys−Cys−Ile−Leu− Gly−Ser−Asn−Gly−Lys−Gly−Asn−Gln−Cys−Val− Thr−Gly−Glu−Gly−Thr−Pro−Asn−Pro−Glu−Ser− His−Asn−Asn−Gly−Asp−Phe−Glu−Glu−Ile−Pro− Glu−Glu−Tyr−Leu−Gln 及びアミノ酸の一部を下記の通り変えたヒルジン変種： 1 Ile→Val 2 Thr→Val。 により被覆されている体外血液回路。 ４３．ヒルジンがグリコシル化または硫酸化されていな
い請求の範囲第42項記載の体外血液回路。 ４４．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、ヒルジンまたはヒルジン変種をコード
する遺伝子を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後に
IleおよびThrをコードする配列から始まることを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種をクローニングおよび
発現させるベクターで形質転換されたバクテリアを培養
し、生成したヒルジンまたはヒルジン変種を回収するこ
とを特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法
により得られたヒルジンまたはヒルジン変種により被覆
されている請求の範囲第42項又は第43項記載の体外血液
回路。 ４５．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、ヒルジン遺伝子の最初において、以下
の配列： ATG ATT ACG TAC TAA TGC を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成し
たヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得ら
れたヒルジンまたはヒルジン変種により被覆されている
請求の範囲第44項記載の体外血液回路。 ４６．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、ヒルジン遺伝子のはじめに下記の配
列： ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、生成し
たヒルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種を製造方法により得ら
れたヒルジンまたはヒルジン変種により被覆されている
請求の範囲第45項記載の体外血液回路。 ４７．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、コレクシオン ナシヨナル ド クル
トウル ド ミクロオルガニスム（CNCM）にNo.I-428の
下で寄託されたE.coli株TGE900中に含まれるベクターpT
G720で形質転換されたバクテリアを培養し、生成したヒ
ルジンまたはヒルジン変種を回収することを特徴とする
ヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得られた
ヒルジンまたはヒルジン変種により被覆されている請求
の範囲第44項記載の体外血液回路。 ４８．バクテリアがE.coli株である請求の範囲第44〜47
項のいずれかに記載の体外血液回路。 ４９．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、ヒルジンまたはヒルジン変種をコード
する遺伝子を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後に
IleおよびThrをコードする配列から始まることを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種をクローニングおよび
発現させるベクターで形質転換されたバクテリアを培養
し、培養生成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテー
ションを行って上澄中にヒルジン又はその変種を回収す
ることを特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造
方法により得られたヒルジンまたはヒルジン変種により
被覆されている請求の範囲第44項記載の体外血液回路。 ５０．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、ヒルジン遺伝子の最初において、以下
の配列： ATG ATT ACG TAC TAA TGC を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
って上澄中にヒルジン又はその変種を回収することを特
徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により
得られたヒルジンまたはヒルジン変種により被覆されて
いる請求の範囲第49項記載の体外血液回路。 ５１．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、ヒルジン遺伝子のはじめに下記の配
列： ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
って上澄中にヒルジン又はその変種を回収することを特
徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により
得られたヒルジンまたはヒルジン変種により被覆されて
いる請求の範囲第50項記載の体外血液回路。 ５２．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、コレクシオン ナシヨナル ド クル
トウル ド ミクロオルガニスム（CNCM）にNo.I-428の
下で寄託されたE.coli株TGE900中に含まれるベクターpT
G720で形質転換されたバクテリアを培養し、培養生成物
を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行って
上澄中にヒルジン又はその変種を回収することを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法により得ら
れたヒルジンまたはヒルジン変種により被覆されている
請求の範囲第49項記載の体外血液回路。 ５３．バクテリアがE.coli株である請求の範囲第49〜52
項のいずれかに記載の体外血液回路。 ５４．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、ヒルジンまたはヒルジン変種をコード
する遺伝子を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後に
IleおよびThrをコードする配列から始まることを特徴と
するヒルジンまたはヒルジン変種をクローニングおよび
発現させるベクターで形質転換されたバクテリアを培養
し、培養生成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテー
ションを行い、トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを
結合させ、次いでヒルジン拮抗体（hirudin competito
r）の結合後に樹脂を溶出処理してヒルジン又はその変
種を回収することを特徴とするヒルジンまたはヒルジン
変種の製造方法により得られたヒルジンまたはヒルジン
変種により被覆されている請求の範囲第49項記載の体外
血液回路。 ５５．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、ヒルジン遺伝子の最初において以下の
配列： ATG ATT ACG TAC TAA TGC を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
い、トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結合させ、
次いでヒルジン拮抗体（hirudin competitor）の結合後
に樹脂を溶出処理してヒルジン又はその変種を回収する
ことを特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方
法により得られたヒルジンまたはヒルジン変種により被
覆されている請求の範囲第54項記載の体外血液回路。 ５６．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、ヒルジン遺伝子のはじめに下記の配
列： ATG ATT ACG TAT ACA GAC TGC ACA TAC TAA TGC ATA TGT CTG ACG TGT を含むヒルジンまたはヒルジン変種をコードする遺伝子
を含み、該コード化遺伝子が開始配列の後にIleおよびT
hrをコードする配列から始まることを特徴とするヒルジ
ンまたはヒルジン変種をクローニングおよび発現させる
ベクターで形質転換されたバクテリアを培養し、培養生
成物を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行
い、トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結合させ、
次いでヒルジン拮抗体（hirudin competitor）の結合後
に樹脂を溶出処理してヒルジン又はその変種を回収する
ことを特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方
法により得られたヒルジンまたはヒルジン変種により被
覆されている請求の範囲第55項記載の体外血液回路。 ５７．体外血液回路であって、血液と接触する回路の少
なくとも一部が、コレクシオン ナシヨナル ド クル
トウル ド ミクロオルガニスム（CNCM）にNo.I-428の
下で寄託されたE.coli株TGE900中に含まれるベクターpT
G720で形質転換されたバクテリアを培養し、培養生成物
を酸性pH域で加熱し、次いでデカンテーションを行い、
トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結合させ、次い
でヒルジン拮抗体（hirudin competitor）の結合後に樹
脂を溶出処理してヒルジン又はその変種を回収すること
を特徴とするヒルジンまたはヒルジン変種の製造方法に
より得られたヒルジンまたはヒルジン変種により被覆さ
れている請求の範囲第54項記載の体外血液回路。 ５８．バクテリアがE.coli株である請求の範囲第54〜57
項に記載の体外血液回路。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8404755A FR2562088B1 (fr) | 1984-03-27 | 1984-03-27 | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| FR84/13250 | 1984-08-27 | ||
| FR84/04755 | 1984-08-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61501609A JPS61501609A (ja) | 1986-08-07 |
| JP2696316B2 true JP2696316B2 (ja) | 1998-01-14 |
Family
ID=9302516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60501396A Expired - Lifetime JP2696316B2 (ja) | 1984-03-27 | 1985-03-27 | ヒルジンの発現のためのベクター、形質転換細胞及びヒルジンの製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2696316B2 (ja) |
| FR (1) | FR2562088B1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE64956T1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
| CA2255396A1 (en) * | 1990-11-08 | 1992-05-09 | Nippon Mining Company Limited | Hirudin analog, method of manufacturing thereof and anti-coagulant composition, and secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacturing method ofproducts which is produced from said microorganism |
| JP2573114B2 (ja) * | 1991-09-09 | 1997-01-22 | 株式会社ジャパンエナジー | ヒルジン類分泌生産培養液の処理法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3342139A1 (de) * | 1983-11-22 | 1985-05-30 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
-
1984
- 1984-03-27 FR FR8404755A patent/FR2562088B1/fr not_active Expired
-
1985
- 1985-03-27 JP JP60501396A patent/JP2696316B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ，４５（１９８０）Ｐ．４６３−４６７ |
| ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ １６５（１９８４）Ｐ．１８０−１８３ |
| Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（１９８３）Ｐ．４５９−４６７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2562088A1 (fr) | 1985-10-04 |
| FR2562088B1 (fr) | 1987-11-13 |
| JPS61501609A (ja) | 1986-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5824505A (en) | Vectors, transformed cells and process for the preparation of hirudin | |
| AU600667B2 (en) | Vectors for the expression and secretion of hirudin by transformed yeasts | |
| JPH11504938A (ja) | クニッツ型プロテアーゼ阻害因子 | |
| US5516656A (en) | Production of a new hirudin analog and anticoagulant pharmaceutical composition containing the same | |
| US5239058A (en) | Proteins having anticoagulant properties | |
| EP0419099B1 (en) | Proteins having anticoagulant properties | |
| US4845076A (en) | DNA sequences coding for proteins having the biological activity of HUSI-type I inhibitors, biotechnological methods for the preparation of said proteins and pharmaceutical compositions containing said proteins | |
| CA2002924C (en) | Anti-thrombins | |
| JPH0866194A (ja) | ヒト腫瘍壊死因子ミューテインをコードする遺伝子 | |
| US5863534A (en) | Polypeptide having factor Xa inhibitory method of reducing blood coagulation with a novel polypeptide having factor Xa inhibitory activity | |
| US5705355A (en) | Hirudin, pharmaceutical compositions comprising it and their use | |
| JP2696316B2 (ja) | ヒルジンの発現のためのベクター、形質転換細胞及びヒルジンの製造方法 | |
| US5081019A (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lipocortin-like polypeptides | |
| US5340726A (en) | Protein for inhibiting collagen-stimulated platelet aggregation | |
| EP0696198B1 (en) | Novel polypeptide having factor xa inhibitory activity | |
| US5328997A (en) | Processes for making proteins having anticoagulant properties | |
| EP0480651A1 (en) | Protein for inhibiting collagenstimulated platelet aggregation | |
| US5821079A (en) | Vectors for the expression and secretion of hirudin by transformed yeasts | |
| JP3488459B2 (ja) | 単球又はマクロファージ遊走因子 | |
| WO1994012204A1 (en) | Anticoagulant proteins | |
| JPH08291193A (ja) | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進する作用を有するペプチドを含有する医薬組成物 | |
| JPH08289796A (ja) | トロンビンによるプロテインｃの活性化を促進するペプチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |