JPS61501609A - ヒルジンの発現のためのベクタ−、形質転換細胞及びヒルジンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒルジンの発現のためのベクター、 形質転換細胞及びヒルジンの製造方法 本発明は、ヒルジン及びヒルジン類縁体をコードするＤＮＡ配列のクローニング 及び発現のためのベクター、これらのベクターで形質転換された微生物、並びに 醗酵によりヒルジンを得ることを可能にする方法及び得られたヒルジンに関する 。

医薬的ヒルであるヒルド　メデイシイナリス（Ｈｉｒｕｄ。

ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ　）の唾液腺に存在する抗凝血性の活性は、ヒルジンと して知られる小さいポリペプチドに由来する。

この非常に特異的で非常に効果的なトロンビンインヒビターは、もしかすると非 常に有用な治療薬であると表明されたので、最近広く研究されている。しかしな がら、分離及び精製における極度の困難とコストのため、それがより広く使用さ れること又は臨床レベルで研究されることさえも妨げられていた。この物質のコ ストは、２０００Ｕ当り１３００から１６００７う：／（１９８３年）のオーダ ーである。

本発明は、ヒルジンの生物的特性を有する大量のポリペプチドを得るために、異 種の宿主細胞において組換えＤＮＡ技術により遺伝子をクローニングし、それを 発現させることによりヒルジンを製造する方法にに関する。

ヒルの唾液腺から得られる抗トロンビン活性を持つポリペプチドは、１９５０年 代の中頃に始めて分離された（１．２）。このヒルジンとして知られるタンパク は、ヒルの頭から出発してほぼ６５０倍に精製され１ミリグラム当り８５００ユ ニツトの比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）が得られティる。

このタンパクの分子量は、はぼ１６０００と推定された。このタンパクは熱変性 に対して安定で、等電点は４．８である。紙上での電気泳動において、精製４さ れたプロダクトは単一のバンドの形で移動する。そしてアミノ酸分析は、この物 質が酸性アミノ酸即ちアスパラギン酸及びグルタミン酸に非常に冨むことを示す 。

更なる精製〈３）により、比活性は１０４００Ｕ／ｌＩｌ。

に増加し、Ｎ−末端アミノ酸としてイソロイシンが同定された（３．４）。

ヒルジン活性は、タンパク分解酵素のプラスミン、キモトリプシンＡ及びトリプ シンによる消化に抵抗するが、パパイン、ペプシン及びズブチロペプチダーゼ（ ｓｕｂｔｉｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）　Ａによる消化に対して感受性であること を示すことが可能であった（３）。

推定分子量は、今では、当初の文献におけるものよりもやや小さく、この分子量 は１００００ダルトンのオーダーであると考えられている。そして、１：１のト ロンビン−ヒルジン　コンプレックスの解離定数の最初の推定（０，８Ｘ１０− １０　）は、これらの２つの分子間の極めて強い会合を示している（５）。実際 上の理由から、これら２つの分子間の非共有結合コンプレックスは−（＞４匹１ ！１とみなし得る。

ヒルジンの抗凝血剤としての活性のメカニズムは、理解され始めたばかりである （５）。ヒルジンの結合のための基質はトロンビンであり、トロンビンはタンパ ク分解酵素であり、そのチモーゲン（酸素源）の形であるプロトロンビンからの 活性化（活性化ファクターＸによる）により、循環流中のフィブリノーゲンを開 裂してフィブリンに変換する。フィブリンは、血餅の形成に必要なものである。

ヒルジンは非常に特異的なトロンビンインヒビターであり、フィブリノーゲンに よりも０速にトロンビンと反応する。更に、他の凝固因子や他の血漿成分の存在 は、必要ではない。２つの分子間の相互作用は、トロンビンのフリーのアミノ基 のアセチル化がヒルジンの結合の喪失を生ずることから、少なくとも部分的には イオン相互作用によるものである。更に、ヒルジンはフィブリノペプチドによっ て占められるのと同じ部位で結合する。というのは、アセチル化トロンビンはヒ ルジンにより阻害されないエステラーゼ活性を保持しており、又トロンビン中の セリン活性中心をリン酸化するＤＦＰ　（ジイソプロピルフルオロフォスフェー ト）で処理したトロンビンは、ヒルジンと結合し続けるからである。

ヒルジン研究の次の進展は、ヒルの頭を切取るという不便な方法に代えて、ヒル 全体からヒルジンを抽出する方法が開発されたことである（１６）。この方法に より得られる最終生成物は、頭から得られたヒルジンと類似した生物学的活性を 有しているが、抗トロンビンの比活性は、ミリグラム当り６５００ユニツトであ る。

この化合物の推定のサイズは、平衡沈降（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ　ｓｅｄｉｍ ｅｎｔａｔｉｏｎ　）　Ｉｐ：、より測定シテ１２０００である。しかし、この 方法と先の方法との間の重要な違いは、Ｎ−末端アミノ酸として、以前に見出さ れたイソロイシンに代って、バリンが同定されたことである。この違いの原因は 、Ｎ−末端の二番目の成分がバリンであることが示されたときに明白に説明され た。

ダンシル化ジペプチドのｖａ　Ｉ−ｖａ　Ｉは酸加水分解に抵抗性であるので、 それは第１に、ｖａ　Ｉ　−ｖａ　ｌのジペプチドを有する当初のＮ−末端がイ ソロイシン誘導体と混同されたものと考えられた（７）。というのは、これらの 成分は、使用されたクロマトグラフィーの分離では充分には分離されないからで ある。

動物全体からのヒルジンの調製は、第１因に示されたタンパクのアミノ酸配列の 決定に使用された（８．９）。

ヒルジンに炭水化物は付加していないようであるが、６３の位置のチロシン残基 がＯ−サルフェートエステル基で修飾されている。

この修飾の機能は知られていないが、多くの種類の動物のフィブリノペプチドＢ においても類似の修飾が起っていることは重装である（９）。

最近の研究（１０）によれば、サルフェート　エステルを完全に消失させたとき 、活性は当初のヒルジン活性のわずか５５％に減少することが示されている。

ヒルジンのＮ−末端の性質の問題は、いくつかの研究で再度取り上げられ（１２ ，１３）、ヒルジンには二種の異なった形態があることが示された。一つの形態 は、活性が低く、シュードヒルジンとして知られており、ヒルの体から抽出され ると考えられており、Ｎ−末端がｖａ　Ｉ−ｖａ　ｌ配列である。そして、頭に おいて優勢である形態は、活性が高く且つＮ−末端がイソ口・イシン基（ｒａｄ ｉｃａｌ　）を有していると思われる。

ヒルジンの特異的で非常に本質的な抗トロンビン活性は、直ちに臨床上の用途即 ち抗凝血剤としての用途を示唆する。

ヒルジンは、その抗凝血特性について、動物において非常に広汎に研究されてき た。最も詳細な研究（１４）は、ラットにおける静脈血栓症（ｖｅｎｏｕｓ　ｔ ｈｒｏｍｂｏｓｅｓ　）、血管閉塞症（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｏｃｃｕｌｓｉｏｎ ｓ）及び播種性血管向凝固症（ｄｉｓｓｅＩＩｌｉｎａｔｅｄ　１ｎｔｒａｖａ ｓｃｕｌａｒ　ｃｇａｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（ＤＩＣ）の予防においてのヒルジ ンの活性について記載している。ヒルジンは、高度に精製された形で静脈内に注 射されたとき、ラット、イヌ、ウサギ及びマウスによって良く耐容される。マウ スでのＬＤｓ　ｏは、より大きく、体重１ｋｇ当り５０００００Ｕ　（即ち６０ ｍｇ／ｋｇ）である。他の研究（１５）によれば、マウスは１　ｋＱ当り１９の 投与範囲に耐容で、ウサギは静脈内及び皮下のいずれでも１０ｔｌＱ／ｋＱまで の耐容であることが示されている。マウスにおいて、２週間にわたる繰返し注入 は、感作反応（Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　’）を惹起 しない。

２つの他の独立の研究は、一つは犬を用い（１６）、そして他は（１７）ラット でのＤＩＣの予防におけるヒルジンの活性を示しており、マークワルド（Ｈａｒ ｋ＊ａｒｄｔ　）及びその共同研究者の前窓的な結果と一致する。

ヒルジンは、ブタにおけるＤＩＣにより誘発された内毒素を中和することも示さ れており、それによりブタでの高い死亡率をもたらす内毒素症（ｅｎｃｉｏｔｏ ｘｉｎｅｍｉａｓ）によって起こされる非常に深刻な問題の可能な解決策を構成 する。更に、実験動物中のヒルジンは、尚生物学的に活性な形のままで腎臓から 急速に排出される（半減期は１時間のオーダー）。

この研究は、ヒルジンは抗凝血剤としての有用な臨床薬を構成し得ることを示唆 する。更に血液凝固の前段階（ｐｒｅ−ｐｈａｓｅ　）はヒルジンの作用の高度 な特異性の故に影響されない。抗トロンビン活性は投与量に依存し、ヒルジンの 効果はその急速な腎性の排出故に急速に可逆的である。ＤＩＣがアンチトロンビ ン■（ヘパリンの作用のために必要な補因子）の減少及び非常に効果的な抗ヘパ リン剤である血小板因子１ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｆａｃｔｏｒ）　４の塩析を伴う という事実から予測される様に、ヒルジンはＤＩＣの治療用としてヘパリンより もはるかに優れていることが示されている（１４．１７）。

一つの研究は、得られた結果の解釈が幾分困難なままであるが、ヒトの皮膚によ りヒルジンが吸収され得るという可能性を示している（１９）。

粗ヒル抽出物の市販の製剤が入手可能である〔ヒルフレイム（Ｈｉｒｕｃｒｅｍ ｅ　）　、イクシルドーブルトゲル（Ｅｘｈｉｒｕｄ−Ｂｌｕｔａｅｌ　）　） が、これが有用な投与経路であるか否かを確立するためには高度に精製された大 量の投与量での更なる試験を必要としている。

一般的に好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内及び経皮的な経路である。ヒルジ ンのための他の投与経路、特に経口の経路が報告されている（ＢＳＭ　３７９２ Ｍ）。

他の成分と組合せて、この製品は乾象（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ　）及び他の同じタ イプの皮膚病（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　）の治療に使用する こともできることがＤＯ８２１０１３９３に記載されている。

ヒルジンは、加えて、実験空での臨床試験における抗凝血方法として及び研究道 具として使用できる。この場合、血液の凝固における単一の段階についての高い 特異性が、最も一般的に使用されその作用の特異性が劣る抗凝血剤にまさって本 質的に有利である。

更に、ヒルジンは体外循環及び透析系における抗凝血剤として非常に有用である 。それは、特にこれらの人工の循環システムの表面に活性な形で固定できれば、 他の抗凝血剤にまさって本質的に有利である。

最後に、標識化されたヒルジンの使用は、トロンビン及びプロトロンビンのレベ ルの測定のための簡易な且つ効果的な方法を構成できる。

まとめると、ヒルジンは非常に多くの可能な次の如き用途を有している： １）存在している血栓が拡がるのを予防及び防止するための重大な血栓状態（ｃ ｒｉｔｉｃａｌ　ｔｈｒｏＩＩｌｂｏｔｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　）での抗凝血 剤として：２）実質的に生きたヒルの使用となるので、顕微鏡手術（ｍｉｃｒｏ ｓｕｒｇｅｒｙ）後の血腫及び腫張の減少のための抗凝血剤として； ３）体外循環システムにおける抗凝血剤として及び被覆合成生物学的物質のため の抗凝血剤として；４）試験室での実験における血液試料の臨床試験における抗 凝血剤として； ５）凝固の臨床研究における抗凝血剤として及び実験道具として； ６）痔（ｈｅｍｏｒｒｈｏｉｄｓ　）　、拡張蛇行静脈（ｖａｒｉｃｏｓｅｖｅ ｉｎｓ　）及び浮＠　（ｅｄｅｍａ　）の治療における皮腐への適用のための可 能な局所剤として：並びに７）乾疵及び他の関連した病気の治療における成分と して。

最後に、ヒルジンはトロンビンが干渉を起こす媒体中でトロンビンと結合させる ために使用できる（例えば、アッセイ、実験又は処理血液）。特に、ヒルジンは 体外循環での凝固の制限を可能にする。

標識化されたヒルジンは、加えて、血餅の形成の検出のために使用し得る。実際 上、血餅形成は循環するプロトロンビンのトロンビンへの変換を必要とし、トロ ンビンにはヒルジンが選択的に結合するようになる。患者の体のあるポイントで の標識化されたヒルジンの蓄積の検出は血餅の形成を視覚化し得る。

抗凝血剤としての多くの利点にもかかわらず、ヒルジンは今まで臨床の研究にお いてさえも広くは使用されていない。これは、天然の物質が純粋な形で得るのが 非常に困難であり、就中可能な用途を示すべく臨床的な試みを始めるためにさえ も著るしく高価であるという事実による。非常に純粋な試料を得るための適当な 精製方法はある（２０．２１）が、基礎的物質（ヒル）を充分な澁得ることが困 難であるという大ぎな障害が残されている。

ヒルジンは様々の会社〔シグマ（Ｓｉ（ｌｌａ）、プラントオーガン（Ｐｌａｎ ｔｏｒｇａｎ）　、ベントファーム（Ｐｅｎｔｏｐｈａｒｍ）　）から商業的に 販売されているが、かかる製剤は途方もなく変動する活性を示し、又それらの純 度は大いに変動する。

この理由から、ヒルジンの組換えＤＮＡ工学による生産は、このタイプの生産物 を試験し使用するために、この物質を合理的なコストで大量に得るための特に魅 力的な解決策である。

以下の記載において、「ヒルジン」という用語が最も使用されるであろう。上述 した事項及び本研究から現われる他の因子とに照らし、ヒルジンにはいくつかの 形態があることが明らかであり、従って［一つのヒルジン（ａ　ｈｉｒｕｄｉｎ 　）　Ｊという用語がより正しいであろう。

この理由から、以下の記載において、「ヒルジン」は天然又は合成のヒルジンの 形態のいずれか即ちヒルジンとしてインビボで同じ活性を有する生産物と理解さ れ、又時々は「ヒルジン類縁体」と称する。

更に、細菌から得られた「ヒルジン類縁体」と称される生産物はＯ−サルフェー ト　エステル　ファンクションに欠けているが、その一方で「細菌のヒルジンは 天然のヒルジンには現われないアミノ酸のメチオニンをＮ−末端に含んでいるか も知れないということに注意するのが適当である。しかし、「ヒルジン類縁体」 はそれが生産された後に特に化学反応又は酵素反応により修飾されたところの保 護された生物起源の生産物であるとも理解されることが明らかである。

本発明は、宿主細胞におけるヒルジン又はヒルジン類縁体の発現及びクローニン グのための新規なベクターに関し、これらのベクターはヒルジン又はヒルジン類 縁体をコードする遺伝子及びこの遺伝子を上記宿主細胞中で発現するのに必要な 要素（ｅｌｅｇｌｅｎｔｓ）を含んでいる。

発現の要素の性質は、宿主細胞の性質に応じて変化させることができる。従って 、細菌細胞では、発現要素は、少なくとも一つの細菌プロモーターとリポソーム 結合部位（該部位は、時々は翻訳開始のためのコーディング領域と称されものを 構成する）を含むであろう。

一般に、本発明によるベクターは、ヒルジンをコードする遺伝子に加えて、次の ものを含むであろうニー細菌プラスミドの複製開始起源（ｏｒｉｇｉｎ　ｏｒｒ ｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　）、 一プロモーター、特にバクテリオファージスプロモーター：Ｐ　、Ｐ　又はＰ′ １の全部又は一部；［Ｒ −翻訳開始をコードする領域、これはヒルジン遺伝子の５′端又は他のタンパク と５′サイドで融合したヒルジン遺伝子の５′端のＡＴＧを含有する：この融合 の理由はＥ、コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１　）中でより小さいものに分解する高分子量 のタンパクを発現させるのを可能にするためである。

プラスミドの複製開始起源が存在することは、相当する細菌細胞中でベクターを 複製させるのに必須である。

そして、特にＥ、コリの場合においては、プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始起 源を好ましく使用できるであろう。プラスミドｐＢＲ３２２は、実際上、高いコ ピー数を与え、そしてそれにより所望のタンパクを生産するプラスミドの量が増 加するという利点を有している。

バクテリオファージスプロモーターの中で、λＰ［と呼ばれる主要な左向きプロ モーターが好ましく使用できるであろう。Ｐ、は、λの初期転写（ｅａｒｌｙｔ ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　）に関与する強力なプロモーターである。

他のバクテリオファージスプロモーター、特に右向きプロモーターＰＲ又は第二 の右向きプロモーターＰ′８を使用することも可能である。

非常に種々の翻訳開始配列の使用が可能であるが、バタテリオファージλタンパ クｃＩＩ　（以下、λＣエエｒｂｓという）のリポソーム結合部位の全部又は一 部を使用するのが好ましい。

以下に示される様に、合成配列特に下記配列の全部又は一部のようなものも使用 できる： 問題のベクターは、加えて、例えばλのＮ遺伝子（λＮという）によりコードさ れた転写の終結阻害機能（ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ ）を含むのが好ましい。

遺伝子Ｎ転写生産物の存在下では、Ｐ、から出発した転写は、大部分の停止シグ ナルを越えて、続いていく。

これにより、クローン化した外来遺伝子が停止シグナルを持つ場合に起り得る早 過ぎる停止（ｐｒｅｍａｔｕｒｅｓｔｏｐｐｉｎｇ）により引き起こされる問題 を回避できる。加＋　＋ えて、Ｐ、から開始した発現はＮ　の状況下（Ｎｅｎｖｉｒｏｎｎ＋ｅｎｔ　） で改善されることが示された。

大量の外来タンパクの継続的な生産を行なう場合の宿主／ベクター系における毒 性と不安定性の問題を避けるためには、誘導発現（１ｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ）系特に温度、誘導系の全部又は一部をプロモーターに結合させ ることによりプロモーターの活性の制御を可能とすることが必要である。

外来タンパク合成の温度による制御は、宿主細菌中にコードされた温度感受性の リプレッサー例えばＣｌ８５７により転写のレベルで好ましく達成される。Ｃｌ ８５７は、２８℃ではＰ、の活性を抑制するが、４２℃では不活性化される。該 リプレッサーは、プロモーターＰ　に隣接したオペレーター〇Ｌに作用する。上 記の場り 合において温度誘導発現系の一部は宿種細菌の絶対必要な（ｉｎｔｅｇｒａｌ） 部分であるが、この系をベクター自体の部分を形成するようにすることが可能で ある。

問題のベクターは、抗生物質抵抗性の遺伝子を含むこともできる。例えば、ｐＢ Ｒ３２２の場合はアンピシリン抵抗性であるが、テトラサイクリン（Ｔｅｔ　） 又はクロラムフェニール（Ｃｍ　）に抵抗性である他の抵抗性遺伝子も使用でき る。

このようなマーカーの導入は、クローニングの実験の問、本発明のプラスミドを 保持する形質転換体を含む細菌の選択のために必要である。

抵抗性遺伝子の導入は、ｆｆ１Ｎの間選択の圧力を負ねきることにより（ｂｙ　 ｉｍｐｏｓｉｎｇ　ａ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）プラスミドの 安定性を増加させることを可能にし、また更に形質転換体の分離を容易にする。

クローニングのためには、外来ＤＮＡのプラスミドへの挿入を検出できる系を使 用するのが有利である。

例えば、Ｅ、コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ’）のＮ−末端フラグメント とλＣＩＩ由来の翻訳開始領域とを融合することによりクローニングゾーンに該 フラグメントを供給することができ、これによりαフラグメントの翻訳をＣ■配 列の制御下に置くことができる。

該αフラグメントは、宿主中にコードされたＣ−末端ωフラグメントの発現によ り補われ（ｃｏｎｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）、これが細胞中でのβ他−ガラクトシダ ーゼ活性を惹起する。このβ−ガラクトシダーゼ活性は、色素産生基質である５ −ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシダーゼの存在下で青色 のコロニーを生ずる。

２８℃では、ＰＬプロモーターは不活性化され、αフラグメントは合成されず、 そしてコロニーは無色のままである。温度を４２℃に上げたとき、ＰＬプロモー ターは活性化され、αフラグメントが合成され、そしてコロニーが青色になる。

この検出系中に位置するクローニングサイトへの外来ＤＮＡの挿入により、β− ガラクトシダーゼの合成が妨げられ、そしてそのため２８℃と４２℃のいずれで も無色のコロニーが生じるようになる。ＩａｃＺ’３Ｒ伝子の検出を達成するの を可能にする他の遺伝子で置換することも可能である。

本発明により調製及び使用できる異なったヒルジンの中で、以下のものを挙げね ばならない：ａ）　ＨＶ２として知られ、バリアント２　（ｖａｒｉａｎｔ　２ 　）に相当するヒルジンであって、その構造は第１図において一８Ｏ３Ｈ基を有 し又は有しないもので示されるものに相当する； ｂ）バリアント２の修飾体に相当するヒルジンで、ｖａｔ−ｖａ＋Ｎ末端配列が １ｌｅ−ｔｈｒで置き換えられたちの； ｃ）　ｆ（Ｖｌとして知られ、バリアント１に相当するヒルジンであって、その 構造は第１８ｂ図に示されるものに相当するもの。

相当する遺伝子の構造は、実施例に示されるように、アミノ酸の構造から演鐸さ れ得る；これらの遺伝子は公知の合成りＮＡ調製法のいずれの方法によっても合 成できる。

Ｎ−末端の構造が１ｌｅ−ｔｈｒに相当するヒルジンが好ましく使用されるだろ う：相当する遺伝子の異なった構造が実施例に示されるであろう。

本発明は、細胞特に細菌殊にＥ、コリの菌株であって、公知の技術を用いて、本 発明のベクターで形質転換されたものに関する。該公知技術のいくつかは実施例 において記載されるであろう。

最後に、本発明は、上記の如く形質転換された細菌を培養培地で培養し、次いで 生成したヒルジン又はその類縁体を回収する、ヒルジン又はその類縁体の製造法 に関する。

使用される培養培地は、当業者にとり公知のものであり、培養される各菌株に適 したものとすべきである。培養は、形質転換された菌株が耐性を示す抗生物質の 存在下で行なうのが好ましい。

ヒルジン又はその類縁体は、Ｉｌｌ酵混合物を酸性ｐＨにて、特に５０〜８０℃ 、ｐＨ１〜３の条件下、殊に７０℃、１）Ｈ２，８の条件下で加熱し、該ヒルジ ンを含有づ゛る上清を回収することにより精製又は予備精製（ｐｒｅ−ｐｕｒｉ ｆｔｅｄ）される。

また、トロンビンが結合された樹脂を用いて、トロンビンに対するヒルジンの親 和性を利用し、ヒルジンを含有する該混合物を上記の如き樹脂上を通過させると 、ヒルジンは結合される。これは、次いで、ヒルジンに対する競合剤を含有する 溶液で溶離される。

本発明は、最後に、本発明の方法を実施することにより得られるヒルジン又はそ の類縁体、即ち、細菌由来のヒルジン又はその類縁体のみならず、細菌による産 物から化学反応又は酵素反応、例えば化学的又は酵素的開裂又は−８Ｏ３Ｈ基を 結合するための化学的又は酸素的反応により得られたヒルジン類又はその類縁体 にも関するものである。

特に、本発明は、次式の全部又は一部を含有するペプチドに関する。

ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＴＡＣＡＣ’ｒ　ＧＡＴ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＴＣＧ　 ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＴＴＧ　ＴＧＣ工１ｍ　Ｔｈｒ　’！’ｙｒ　Ｔｈｒ 　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ 　ＣｙｓＣＴＣＴＧＣＧＡＱ　ＧＧＡ　ＡＧＣＡＡＴ　ＧＴＴ　’Ｉ’ＧＣＧＧ Ｔ　ＡＡＡ　ＧＧＣＡＡＴ　ＡＡＧ　ＴＧＣＬｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　 Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓｉ 　ＣＹ！！ＡＴＡ　Ｔ′ｒＧ　ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＧＧ ＣＡＡＣＣＡＡ　ＴＧＴ　ＧＴＣＡＣ’！’　ＧＧＣＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　 ＣＣＧ　ＡＡＣＣＣＴ　ＧＡＡ　ＡＧＣＣＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＣＧ’ＧＣＧＡＴ 　ＴＴＣＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　 Ｈｌｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＰｈｅＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　Ｃ ＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　Ｃ入ＡＧｌｕ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ上記ペプチドは、対応するコーディ ング配列と共に示されているが、該配列は、ペプチドの一部を構成するものでは ない。

また、本発明は、第１８因に示す如く、ヒルジンＨＶ１及びＨＶ２の変異種にも 関する。

最後に、本発明は、活性成分としてヒルジン又はその類縁体を含有する薬理組成 物に関する。

これら組成物は、腹腔的投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与又 は局所的皮膚投与により適用される。

これら組成物は、この分野で公知の賦形剤、及び必要に応じて他の活性成分を含 有する。

本発明は、当然に、他の側面、特に実施例に記載されるある種のプラスミド及び その変異種及び誘導体をも含有し、また、一般に、上記形質転換された細菌の醗 酵方法及びそれにより得られた産物を包含する。

本発明の他の特徴及び利点は、下記実施例及び添附口面を読むことにより、より 一層充分理解されるであろう。

図面において、 ・第１図は、ヒル全体（ｗｈｏｌｅ　１ｅｅｃｈ　）から抽出されたヒルジンの アミオ酸配列を示す。

・第２図は、スクリーニングのために設計された４８量体オリゴヌクレオチドプ ローブを示す。

・第３図は、クローンｐＴＧ７１７のヒルジン配列を示す。

・第４図は、標識化プローブと各種ｐＴＧ７１７制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ 　）とのハイブリダイゼーション混合物のオートラジオグラフを示す。

・第５図は、ｐＴＧ７１７における挿入物（１ｎｓｅｒｔ）　（７）制限地図を 示す。

・第６図は、ヒルジンの発現のための二つのベクター、即ちｐＴＧ９２７から誘 導されたｐＴＧ７１８及びｐＴＧ９５１から誘導されたｐＴＧ７１９の構造を詳 細に示す。

・第７図は、上記二つのベクターに対するＥ、コリ抽出物中のヒルジン活性の経 時変化をグラフとして示すものである。

・第８図は、ヒルジン活性を含有する標識化Ｅ、コリ抽出物の分析を示す。

・第９図は、第８図と同一の抽出物ではあるが酸性ｐＨにて熱処理後のものの分 析を示す。

各図中に表わされている各種ヌクオレチド配列は、本記載の明白な一部を構成す るものと考えなければならず、該配列が明ｉ書本分中に再現されていないのは、 明細書を不必要に煩雑化させないためであることを説明しておくのが適切である 。

下記実施例で使用されている手法の多くは、当業者に公知のものであり、そのい くつかは添附参考文献中に記載されている。従って、特殊な手法に限り以下の記 載に記載する。使用した菌株の性質は一般的情報により記載本発明で使用される 細菌菌株は次の通りである。

・ＴＧＥ９００、これは次の特徴を有するＥ、コリ株である：ｓｕ　Ｆ　ｈｉｓ 　ｉｌｖ　ｂｉ。

（λｃＩ８５７Δ３ａｍΔＨＩ）。

・Ｎ６４３７、これは次の特徴を有するＥ、コリ株であ＋ る：Ｆ　ｈｉｓ　ｉｌｖ　ｇａｌ　８ｐｒｏＣ＋：ｔｎ１０１ａｃΔｍ１５（λ ｃＩ８５７Δ１３ａｍΔ１」■） ・Ｊｍｌ　０３、これは、次の特徴を有するＥ。コリ株である：Δ（Ｉａｃ−ｐ ｒｏ）ｓｕｐ　ｔｈｉｅｎｄＡ　ｓｂｃ　８１５　５ｔｔＡ　ｒｋ−ｎｋ　／Ｆ ’　ｔｒａＤ３６　ｐｒｏＡＢ＋・　ａ Ｉａｃ＋　ＩａｃＺΔｍ１５゜ 上記株は入手可能であったため使用したが、詳細な説明中に記載される成る必須 の特徴を有する限り他の菌株を使用することも可能である。

下記実施例は、次の段階から本−質的になっている。

１）ｍＲＮＡ分子の製造とＣＤＮＡライブラリーの形成、２）プローブの製造、 ３）このプローブによる上記ライブラリーの選別及びヒルジンをコードする配列 を含有するプラスミドの同定、４）ヒルジンをコードする遺伝子の発現のための ベクターの製造、 ５）得られた結果の検討。

ヒルド・メデイシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ　）種に属す る生存ヒルを、フランス国のボルドー地方（Ｂｏｒｄｅａｕｘ　ｒｅｇｉｏｎ） にて集める。これらは最低４週間絶食させ、次いで祈願し、頭部を直ちに液体窒 素中で凍結させる。液体窒素中で頭部を微細粉末となるまで磨砕することにより 、全頭部ＲＮＡを抽出する。この粉末１Ｑに、ＮＥＴＳ！ｌｉｉ液（１０ｍＭ　 Ｔｒｉｓ　ＨＣＱ。

ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＮａＣＱ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．５％５ＯＳ）５回及び再蒸留したフェノール５＋１１！２を加え、両者を９ ５℃　に予備加熱する。次いで、この溶液を渦巻き撹拌により混合し、３０，０ ００ｇにて遠心分離し、水層をＮ　Ｅ　Ｔ８！衝液１ｍ１２で再抽出し、水層を 合せて新しいフェノール５ＩＩｌｉ２で再抽出する。ＲＮＡは、２容困のエタノ ールを添加することにより沈澱し、混合物を一２０℃にて４時間放置した後、遠 心分離により集められる。暗褐色ペレットを蒸留水２．５ｍ１２に溶解させ、５ Ｍ　ＬｉＣＯ３，５ｍｆ２を添加し、混合後、該溶液を４℃にて一夜放置する。

次いで、該溶液を、３ＭＬｉＣＱ５鵬で濃厚化し、４℃、２０，０００ｇにて１ ０分間遠心分離を行なう。上清を除去し、淡色のＲＮＡベレットを水１戒中に入 れる。これを０．２５ＭＮａＣＱ中に入れ、２容凹のエタノールで該ＲＮＡを沈 澱させる。この最終ＲＮＡペレットを遠心分離により回収し、次いで蒸留水に溶 解させ、−８０℃にて保存する。

該ＲＮＡ１度は、２６０ｎｍにおける吸収により測定される。

ポリアデニル化メツセンジャーＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースを用い、 標準的方法（２２）を用いて製造する。ｍＲＮＡの収率は、出発物質の全ＲＮＡ 量の約２〜５％である。

使用した手法は、ヒト肝＠ｍＲＮＡライブラリーの構築に用いられた、参考文献 ２３に記載の方法と全く同一である。ヒル頭部ｍＲＮＡ分子を、オリゴ（ｄＴ） “プライマー″及び逆転写酵素を用いてＤＮＡの形に複製する。第２のＤＮＡ鎖 はＤＮＡポリメラーゼを用いて合成され、ヘアピンはＳ１ヌクレアーゼを用いて 開かれ、二重鎖ｃＤＮＡはスクロースグレーディエンドによりＩｌｌされる。特 定のサイズのＣＤＮＡ分子を、酵素ターミナルデオキシトランスフェラーゼを用 いて少量のｄＣ延長を伴い、３′末端で停止させ、次いでＰｓｔＩＩにより切断 されポリＧ末端を有するｐＢＲ３２２ベクターに結合される。得られるプラスミ ドは、Ｅ、コリ株（１１０６株）を形質転換するのに用いられ、テトラサイクリ ン耐性形質転換体（二重鎖ＣＤＮＡ１ｎ０当り５００〜１０００の効率で得られ る）は、テトラサイクリン１５μｇ／−を含有するし一寒天プレート上で生育さ れる。

４３、ＯＯ”０個の形質転換体を含むＣＤＮＡクローンのライブラリーが確立さ れ、細胞は、コロニーからかき集めて回収され、テトラサイクリンを含有するし 一ブロス中に再懸濁される。懸濁液は、５０％強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）のグリ セロール中で製造され、−２０℃にて保存される。

ライブラリーのスクリーニングのためのＤＮＡプローブメチオニン又はトリプト ファン、即ち、単一のコドンによりコードされたアミノ酸を有しないことを考慮 すると、その蛋白質配列は、一般にクローン化された配列を同定するのに用いら れる戦略（ｓｔｒａｔｅｇｙ）を構成する特に単鎖のオリゴヌクレオチドプロー ブを製造するのに殊に好ましい領域を有しない（２４）。このため、単一ではあ るが、大きなオリゴヌクレオチドプローブを用いる異なった手法を採用すること が決定され、これにより、特にヒト凝血因子（ｈｕｍａｎ　ｃｌｏｔｔ、ｉｎｇ 　ｆａｃｔｏｒ）　Ｉ　Ｘ　（２３）のためのｃＤＮＡクローンを単離すること が可能となった。この戦略において、アミノ酸配列領域が選択されるが、これに 関しては、コドンの重複性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）は三番目の塩基の選択に限 定され（即ちアルギニン、ロイシン及びセリンは除外される）、該三番目の塩基 が選択される。このコドンの該三番目の塩基を選択するための当該パラメーター は公知であり、これは、Ｇ／Ｔ相互作用（１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　）の可能性 を最大にし、プローブ配列においてヘアピンとパリンドロームを避けること、そ して勿論ヒルに関する公知の遺伝子配列を考慮することにかかつている。

ヒルに関する遺伝子配列は全く公表されていなかったので、進化論的な見地から ヒルに最も近い生体に関する知見を利用することが必要であった。そして、この ためには、多くの公表されたＤＮＡ配列が存在し、即ち、昆虫である。昆虫ＤＮ Ａ分子に対する全てのコーディング配列が分析され、最も頻繁に生じるコドンに 関する表が作製された。他のパラメーターと共に、これが、ヒルジン配列中の３ ４の位置から４９の位置までの１６個のアミノ酸に対応する、４８塩基の長さの オリゴヌクレオチドを設計するのに用いられた、。この配列領域は、各コドンの 第三番目の位置においてのみ重複性を示す。

このオリゴヌクレオチドは、第２図に示されており、参考５２１体（２３）につ いて既に記載された無機固体支持体（２５）上で、フォスフオシエステル法によ り化学合成された。

ヒルの頭部ｍＲＮＡ分子から形成されたＣＤＮＡライブラリーを、テトラサイク リン１５μｇ／ｍｆ２を含有するし一寒天プレート上でに、１３ｃｍプレート当 り約４．０００コロニーのコロニー密度で平板培養し、該コロニーを、３７℃に て直径１〜２ｍｍの大きさとなるまで生育させる。該コロニーを、次いでニトロ セルロースフィルター上に移す。維持されたプレート上・のコロニーは生育され 、該プレートは次いで４℃にて保存される。上記フィルターは、クロラムフェニ コール１７０μｇ／ｍｉ２を含有するし一寒天のプレート上に置かれ、細菌ロロ 二−中のプラスミドを増大させるべく、３７℃で一部インキユベートされる。該 フィルターを次いで標準的な方法で処理し、該細菌コロニーを溶解し、ＤＮＡを ニトロセルロースに結合させる。次いで、該フィルターは完全に洗浄され、１０ ０四の６ｘｓｓｃ　（ｌｘｓｓｃ−０，１５％ＮａＣＱ、０．０１５Ｍクエン酸 三ナトリウム）、５×デンハーツ（Ｏｅｎｈａｒｄｔｓ　）　（１ｘデンハーツ １ｍ−０，０２％フイ：１−）Ｌｔ　（Ｆｉｃｏｌｌ）　、Ｑ、　０２％のポリ ビニルピロリドン、０．０２％の牛血清アルブミン）１００μｇ／戒のイースト 転移ＲＮＡ及び０．０５％のソデイウム・ピロフォスフェートの容量中でブレハ イブリダイズされる。

該４８１体オリゴヌクレオチドのアリコート（３０ｐｍｏ　ｌ　）は、１５ユニ ツトのポリヌクレオチドキナーゼの存在下でγ（３２Ｐ）ＡＴＰと共にインキュ ベートすることにより、その５′末端において（３２Ｐ）で標識される。該標識 化プローブは、遊離のγ（３２Ｐ）ＡＴＰからＤＥＡＥ−セルロース上を通過さ せることにより精製される。

該標識化プローブは、フィルター上で、２０ｍＱの６×ｓｓｃ、１Ｘデンハーツ （１）ｅｎｈａｒｄｔｓ　）　、１００μｑ／−のイーストｔＲＮＡ、０．０５ ％のソデイウム・ビトフオスフエートの看にて、４２℃で１６時間緩かに撹拌し てハイブリダイズされる。

該フィルターは、次いで、６ｘｓｓｃ、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ ＤＳ）中、３７℃、４２℃及び５０℃の温度にて洗浄され、次いで、２ｘｓｓｃ １０．１％ＳＤＳを用いて５０℃で１０分間最終的に洗浄される。該フィルター は、次いで乾燥され、Ｘ線フィルム上に露出される。Ｘ線フィルム上のポジティ ブのスポットとマスタープレートとを比較することにより、標識化プレートから 、ポジティブの結果を与えるコロニーが同定される。これらクローンの二つ（そ のプラスミドを以下ｒｐＴＧ７００Ｊと呼ぶ）は、標識化プローブとの第二回目 のハイブリダイゼーションによりポジティブであることが確認され、多量培養さ れ、プラスミドＤＮＡは標準的な方法で精製される。

ヒルジンをコードする配Ｊを含有するものとのｐＴＧ７００の同定 １）ＴＧ７００のｃＤＮＡ挿入物は、約２３５塩基対をファージｍ１３ｍｐ８中 に転移され、該挿入物のＤＮＡ配列が鎖停止（ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉ ｏｎ　）　（２６）により決定される。この配列の一部が、ヒルジンの蛋白質配 列と非常に類似する蛋白質配列をコードする。該配列のこの領域は、第２図に示 すプローブの領域に対応する。

この第２図において： （ａ）は、参考文献２に示されるｇｌ　ｕ４９からｇｌｙ３４までのヒルジン配 列に対応する。

（ｂ）は、合成され、ハイブリダイゼーションに用いられた４８量体プローブの 配列に対応する。

（Ｃ）は、この領域におけるクローンｐＴＧ７００の配列に対応し、ドツトは相 同関係（ｈｏｍｏｌｏａｙ）を示す。

（ｄ）は、ｐＴＧ７００のこの領域においてコードされるアミノ酸配列に対応す る。

留意すべきは、ｐＴＧ７００のｃＤＮＡ配列は不完全であり、フェーズの合った 停止コドンの後の３′−非翻　”訳配列の１０１塩基に加えて、ヒルジンのＣ− 末端アミノ酸の内の２８個のみをコードするにすぎないことである。ヒルジンに 対する公表された蛋白質配列との相違点の一つが、このクローンにおいて観察さ れる。なぜならば、位＠４９においてグルタミン酸がグルタミンを置換している からである。

より大きなヒルジンｃＤＮＡのクローンの単離ＤＮＡ配列からｐＴＧ７００挿入 物がヒルジンをコードすることが確認されるので、該挿入物は公知の“ニック翻 訳（ｎｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　）”の方法により（３２Ｐ）で放射性 を付与され、ＣＤＮＡライブラリーについての新たな試験に用いられる。数種の 他のポジティブのコロニーが見出され、その一つは、ｐＴＧ７１７と呼ばれるプ ラスミドを含有し、ｐＴＧ７１７は長さ約４５０塩基対の挿入物を含有する。こ の挿入物の制限分析は、中心の領域にＴａｑ　１制限部位が存在することを示す 。

このため、ＭｌフラグメントをＴａｑ　１で消化し、生じる５′及び３′フラグ メントを、ＰＳｔｌ／ＡＣＣＩで開裂された配列ベクターｍ１３中に結合する。

ｍ１３の構造は、いずれも同定可能で配列分析（５ｅｑｕｅｎｔ　ｉａ　１ａｎ ａｌｙｓｉｓ）に供し得るフラグメントを含有する。この分析の結果は、第３図 に示される。ｐＴＧ７１７挿入物のＤＮＡ配列から、操作のクローニングの間に 鎖末端に導入されたポリＧ／Ｃ末端を差引くと、長さ３７９塩基となり、該塩基 の２１６個が、公表されたヒルジンの配列と非常に類似する配列のペプチドをコ ードする。

該配列においては、各種の事項が留意されなければならない。

１）該フラグメントによりコードされたアミノ酸配列は、天然のヒルジンについ て公表された蛋白質配列のそれとは同一ではない。ｐＴＧ７１７から単離された ヒルジン配列と公表されたヒルジン配列との間には、９個のアミノ酸の相違があ る。次の変更が認められる：Ｖａ１１−ｉ　１ｅ：ｖａｔ２−ｔｈｒ：ｏｌｎ２ ４−Ｉｙｓ；ａｓｐ３３−ａｓｎ：ｇｌｕ３５−１ｙｓ：ｌ　ｙｓ３６−Ｑ　ｌ 　ｙ：　Ｉ　ｙ５４７−ａＳｎ　：Ｑ　ｌ　ｎ４９−ｇｌｕ及びａＳｐ５３−ａ ｓｎ、これは、該配列における大きな変更を構成する。なぜなら、これら変更の 内７つがチャージにおける変更を含んであるからである。従って、該クローン化 されたコーディング配列と公表されている蛋白質配列との間の相同性（ｈｏｍｏ ｌｏａＶ）は、４６／６５、即ち、約７０％である。

これら二つのアミノ酸配列間で観察された相違点には、二つの理由が考えられる 。

１−ヒルジン分子の正確な配列間で、種（ｓｐｅｃｉｅｓ　）、亜１　（５Ｕｂ Ｓｌ）ｅｃｉｆ３ｓ）更には個々の動物の変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ　）が認め られる。本研究で用いたヒルが、アミノ酸配列を公表するのに用いられたヒルと 同一の種又は亜種であるか否かを確認することはできない。

しかも、ヒルには、１種のみならず各種の形態のヒルジンがあり、同様な生物学 的活性を有するが基本的なアミノ酸配列において変異を有する可能性もある。こ の意味において、ヒルジンのＮ−末端アミノ酸に関する文献上の結果における相 違点について言及するのが有意義である（当初、ｉｌｅは頭部からの物質中に見 出された。次いで、ｖａｔが動物全体において見出された。その一方で、最近、 ｉｌｅは、頭部由来の物質に対し再び示された。イソロイシンは、ｐＴＧ７１７ 配列において、成熟蛋白Ｎ−ターミナル宋端に対応する位置に存在する。

ヒルジンに異なる形態が存在するという考え方は、ＤＮＡレベルの予備的研究に よっても支持される。ヒルの全ＤＮＡを、標準的な方法で磨砕凍結ヒルから抽出 し、各種制限酵素で消化し、アガロースゲル上で電気泳動処理をし、次いでニト ロセルロースに移し、プローブとしてのｐＴＧ７１７挿入物とハイブリダイズす る場合、ハイブリダイズする多量の７ラグメントが観察される。

即ち、第４図の結果は、次の如くして得られる。

−ヒルの全ＤＮＡの１０μＱを制限酵素で消化し、１％アガロースゲル上で電気 泳動に圧し、ニトロセルロースフィルター上に移し、〔３２Ｐ〕〜標識ｐＴＧ７ １７のＰｓｔＩ挿入物でハイブリダイズする。該フィルターを完全に洗浄しく０ ．１ｘｓｓｃ、Ｑ、１％５Ｏ８１６５℃）、ハイブリダイズしたバンドをオート ラジオグラフィーにて顕現化する。

レーン１　：ＥＣ０ＲＩで消化されたＤＮＡＬ／−ン２　：　Ｈｉ　ｎｄｌ［Ｉ で消化されたＤＮＡレーン３：ＢａｍＨＩで消化されたＤＮＡレーン４：８ｇＩ ＩＩで消化されたＤＮＡＥＣ０ＲＩフラグメントのｋｂによる大きさが右側に示 されている。

ＥＣ０ＲＩ消化フラグメントに関し、計４０ｋｂの６７ラグメントが非常に厳重 な（５ｔｒｉｎｏｅｎｔ　）洗浄条件下で認められる。たとえ、このスキームが 非常に広いモザイク遺伝子を示していることが理論的に可能であるとし列が４０ ｋｂのゲノムに分布しているとは考えにくい。

しかも、部分的な挿入フラグメントを含有するプローブでの゛予備実験は、そう ではないことを示唆している。

また、同一のｃＤＮＡライブラリーから単離されたヒルジンの異なるクローンに おける配列にも相異があることが観察された。例えば、ｐＴＧ７００において、 ｌｙｓは公表されているアミノ酸配列と同様に位置４７に見出される（第２図） がｐＴＧ７１７においてはこの位置にａｓｎが存在する。

上記理由により、これら全てのデーターは、蛋白のレベルで多様な形態を示す異 なる構造のヒルジン遺伝子の概念に一致する。

最後に重要な点は、全ヒルジンｍＲＮＡ配列が、確かに１）ＴＧ７１７には存在 しないことである。事実、オーブンリーディングがクローンの５′末端まで続き 、この領域にはメチオニンは含まれない。ヒルジンは、唾液腺細胞から分泌され る蛋白であるので、そのＮ末端にリーダー（１ｅａｄｅｒ）配列（分泌に必要な ）を有していると考えられ、またプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の存在 が考えられる。次いで、最終的に活性な分子が、多くのチモーゲン及び前駆体に おける場合のように、蛋白分解の開裂段階（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｃｌｅａ ｖａｇｅ　ｓｔａｇｅ　）で生産されるのであろう。

ヒルジンｍＲＮＡの大きざを決定し、クローンｐＴＧ７１７は、その完全なコピ ーではないことを確かめた。

ヒルジンの全頭部ＲＮＡを、ホルムアルデヒド変性アガロースゲル上電気泳動に かけ（２７＞、ニトロセルロースに移し、ｐＴＧ７１７挿入物でハイブリダイズ した。

単一の、６４０塩基対のハイブリッドＲＮＡ種が観察される。ｐＴＧ７１７は全 ３’　ｍＲＮＡ配列（ポリＡ部分が観察される）、及びポリＡから約２０塩基重 複する２つのポリＡ付加サイトを有していると考えられるので、１６０ｂｐの３ ′非−翻訳領域が見られる（第３図）。

このＣＤＮＡクローンは、その５′末端に１６０個の塩基対を欠失している。こ れは目的蛋白のＮ末端の残り、イニシエーターのメチオニン及び該ｍ　ＲＮ　Ａ の５′非−翻訳領域を有する。ヒルジンが他の生物学的に活性なペプチドをコー ドし得る、より大きい前駆体の形態でそのＣ−末端から切断されることは排除で きないが、この仮説の前駆体の最大のサイズは、少なくとも１１０〜１２０のア ミノ酸（即ち成熟ヒルジンのサイズのほぼ２倍）に相当すると考えられる。

ｐＴＧ７１７より良いｃＤＮＡクローンを生成することは可能ではなく、またｍ ＲＮＡの５′末端における二次構造（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ 　）は、この点を越えるｍＲＮＡの逆転写を防止すると考えられる。ヒルジンの ゲノムの配列の分析からこの遺伝子の５′末端のデーターが得られるであろう。

クローンｐＴＧ７１７によりコードされたヒルジンのアミノ酸配列をＥ・コリー （Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞内で発現されるように、以下の手法により適合させた。

ヒルジンのＥ・コリー内での発現 ρＴＧ７１７の制限分析（第５図）から、アミノ酸をコードする配列のすべてが 、２２５ｂｐの）（ｉｎｆニーＡｈａＩ［［フラグメントの形態で存在している ことが明らかである。このフラグメントを、制限で単離し、プラスミド発現ベク ターｐＴＧ９５１及びｐＴＧ９２７に、合成オリゴヌクレオチドアダプター分子 を用いて挿入した。

該アダプターは、ＨｉｎｆＩ制限によりＮ末端から除去された７つのアミノ酸か らなり、また発現ベクターに挿入されることを要求されるイニシエーター　メチ オニンフラグメントと制限酵素エンドヌクレアーゼＮｄｅ及び８９１■のための サイトとが追加されている。

ｍｅｔイニシエーターの後の２つのアミノ酸は置換されている。即ちｐＴＧ７１ ７ｃＤＮＡクローンに見られる１ｌｅ−ｔｈｒフラグメントは、公知のヒルジン 蛋白配列のｖａｔ−ｖａｔにより置換されている。

１）ＴＧ７１７ＣＤＮＡクローンは、ヒルジンにつき公表された配列であるｖａ 　Ｉ−ｖａ　Ｉ配列の代りに１ｌｅ−ｔｈｒ配列を有しているが、Ｎ−末端にｖ ａｌ−ｖａｌ配列を有する分子を発現させることが、最初に決定された。この選 択には下記２つの理由がある。

−ＣＤＮＡクローンは確かに不完全であり、おそらく転写を防止するｍＲＮＡに 二次構造があると考えられる。

これは「人工物」の転写及びクローン化を考慮すれば、該ＣＤＮＡ配列の５′末 端を、不正確にする、−全動物から抽出された活性なヒルジン分子のＮ−末端が ｖａ　ｌ　−ｖａ　Ｉから始まっていることは、一般に認められている（８．１ １）。

発現ベクターｐＴＧ９５１は、γ−インターフェロン遺伝子の発現用にデザイン されたプラスミド発現ベクターである。その合成は本記載の終わりに詳述する。

実際上、それは、要素として、温度感受性宿主０１８５７によってコードされた リプレッサーで制御されるバクテリオファージの左向きプロモーターＰ１、次い でインタクトの又は切断されたλのＮ遺伝子を含有している。次いで合成リポソ ームに結合するサイトが存在し、これは、リボゾームの最適な結合を与えるよう にデザインされている。単一のＢｇＩＩ［制限サイトが、リポソーム結合サイト とγ−インターフェロンをコードする配列のＡＴＧとの間に存在する。このベク ターは、ＢＱＩＩＩサイト及びγ−インターフェロンをコードする配列の下流の 単一のＰｖｕエサイトで消化され、次いでアガロースゲル上電気泳動で回収され る。このベクターフラグメントを、第６図に示すように、アダプター　オリゴヌ クレオチド結合体（ａｓｓｅｍｂｌｙ）及びｌ−１ｉｎｆニーＡｈａｌ［Ｉフラ グメントを含有するヒルジン配列と結合させる。

発現ベクターｐＴＧ９２７は、本記載の終わりに記載する発現ベクター１）ＴＧ ９０８と密接に関連している。

これは単にｐＢＲ３２２のテトラサイクリン遺伝子由来の付加的Ｓａ　Ｉ　Ｉ− ＰｖｕＩ［フラグメントを含む点において異なるのみである。発現ベクターｐＴ Ｇ９２７は、プロモーターＰ４、インタクトのＮＷ伝子及びλＣＩ蛋白のリポソ ーム結合サイト、次いでＡＴＧ及びβ−ガラクトシダーゼのＩａｃＺフラグメン トをコードする配列を含んでいる。ＮｅｄＩサイトは、このコード配列のＡＴＧ 上に認められる。該ベクターはＮｅｄＩ及びｐｖｕ［で消化され、ベクターフラ グメントが精製され、他のオリゴヌクレオチド　アダプターの組合せ及びヒルジ ンのＨｉｎｆＩ−ＡｈａＩ［［フラグメントと共に用いて、第６図に示す第二の ヒルジン発現ベクターを構築する。

これらの２つの発現ベクターは、天然のヒルジン分子（ＡＴＧイニシエーターの 直後のＮ−末端にｖａｌ−ｖａｌ配列を有する）を発現するようにデザインされ ている。

アダプター　オリゴヌクレオチドにおいて、第３番目の塩基のコドンは、翻訳を 高度に促進するように、そしてこの領域のレベルでｍＲＮＡに二次構造が形成さ れることを回避するように選択される。

２つのベクターは以下の手法により組み合される。即ち、オリゴヌクレオチド相 互を、ポリヌクレオチド　キナーゼを用いてその５′末端でリン酸化し、次いで 等モル混合物として処理（６５℃で１０分間加熱後、１５℃で１５時間）する。

ベクター及びヒルジン　フラグメントを、ベクター／ヒルジン　フラグメント／ アダプターフラグメントのモル比が１：２０：５０となる量で添加し、混合物を Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させる。

該リゲーション混合物を用いてＥ・コリー株ＴＧ９００を形質転換させ、プラス ミドを担う形質転換体を、アンピシリン（１０ｏμｏ／ｍＱ）を含む寒天プレー ト上で選別し、ヒルジンをコードする配列を含むものを、プローブとして標識化 したｐＴＧ７１７挿入物を用いてコロニーハイブリダイゼーションにより同定す る。多数のポジティブクローンから各６株と共に１株のネガティブ（親株）を選 別し、６５０　ｎａ＋での光学密度が０．３となるまで３０℃でし一ブロス液体 培地で培養する。Ｐ、プロモーターから始まる発現を、次いで、温度を３７℃に 上昇させて誘発し、インキュベーションを６時間続ける。次いで細胞を遠心分離 により収穫し、ＴＧＥ　（２５ｍＭトリス塩酸、Ｉ）Ｈ８，５０ｍＭグルコース 、１０ｍＭＥＤＴＡ）の１１５容積に懸濁させ、超音波粉砕する。

遠心分離による抽出物の清澄化の後、上清のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ　）を その抗トロンビン活性試験に供する。６つのｐＴＧ　９２７構築物の内５つに、 高レベルの抗トロンビン活性が認められ、また６つのｐＴＧ９５１構築物の内４ つに、弱いものではあったが、活性が認められた。

コントロールには如何なる有意な活性も認められなかつた。プラスミドの直接配 列化（ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によりポジティブの結果を与える クローンのＤＮＡ配列の分析によって、活性を示す全ての構築物に所望の配列が 存在することが明らかとなった。

ポジティブの発現を示す２つのクローン、ｐＴＧ９５１由来のクローンｐＴＧ７ １９及びｐＴＧ９１７由来のクローンｐＴＧ７１８を、誘導の６時間に渡って分 析する。３０℃で光学密度が０．３になるまで培養物を生育させた後、温度を３ ７℃に上昇させて発現を誘発させ、上記で調製した抽出物から６時間に渡って毎 時間アリコートを取り出し、ヒルジン活性を測定する（２９）。

その結果（第７因）から、クローンｐＴＧ７１９は、最初の生育に次いで３〜４ 時間後に活性のプラトー（ｐｌａｔｅａｕ　）を示し、これは６５０での光学密 度で３７０１Ｊ／１２のレベルである。

これに対し、クローンｐ’ＴＧ７１８は、より強い活性を示し、これは上記誘導 期間の全般に渡って上昇を続けた。

６時間後に得られた活性のレベルは、クローン１）ＴＧ７１９のほぼ５倍強いも のであり、培養物当りの全活性は７３００μ／Ｑであった。もし上記ヒルジン組 換体が天然のｖａ　ｌ　−ｖａ　ｌ産物と同様の特異活性を示すなら、最も活性 な抽出物で得られる生成物は、はぼ１８ｇ／　Ｑ培養物に相当するであろう。

生　ヒルジンの性 Ｅ、コリーから得られたヒルジンを特徴付けるために、誘導後の培養物サンプル につき分析を行なった。これは、７０℃で１５分間加熱するか又は塩酸でｐＨを ２．８に下げた後７０℃で加熱して行なった。後者の場合、抽出物のｐＨを、分 析に先だって中性に戻した。上記と同様にして処理した天然のヒルジンは、公表 された該分子の性質（２０）に照らし予想されるように、活性の消失を託めなか った。抽出物の場合、上記処理後活性の消失は見られなかった。実際には、上記 処理後、約２倍の活性増加が認められた。このことはヒルジンの活性を阻害して いた抽出物成分の分解又は不活性化を反映するものと考えられ、また比較的低い ｐＨ及び加熱段階が、ある場合には、ヒルジンが最大の活性を示すのに必要なジ スルフィド結合のより完全な再形成を与えるためとも考えられる。対照の抽出物 は、上記処理の前及び後のいずれも活性を示さない。

細菌抽出物を、セファロース樹脂に結合させたトロンビンを用いてブレインキュ ベートし、ｉ〜ロンビン−セファロースを遠心分離により除去すると、実質的に 全ての最初のヒルジン活性が抽出物から除去される。本発明により得られるヒル ジンは、トロンビン−セファロース樹脂に非常に効果的に結合すると思われ、こ のことから上記細菌性ヒルジンの可能な精製手段が提供され得る。

発現ベクターｐＴＧ７１８を含む細胞の細菌性培養物を、３０℃で光学密度が０ ．３になるまで培養し、次いで３７℃で誘導し、毎時間毎にそのアリコートを回 収し、最小培地上で１００μＣｉ／ｍの［３５Ｓ］メチオニンでラベルする。該 細菌を遠心分離により集め、ラベルされた細菌性蛋白の組合せを５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲル上で電気泳動し、次いでフルオログラフィーで分析する。

ベクター構築物によりかなりの量で誘発された少なくとも２つのポリペプチドが 、約６〜ｓ、ｏｏｏダルトンにて認められる（第８図のレーン５〜１０）。

非誘導１）ＴＧ７１８培養物由来の標識化物質及び諺導後３及び５時間の培養物 由来の標識化物質を、７０℃及びｐＨ２，８で１５分間処理し、遠心分離により 変性蛋白を除去し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析すると、標識化し たＥ、コリー蛋白質の大部分がサンプルから除去されることが明らかである（第 ９図のレーン１及び２）。この方法は、ヒルジン発現ベクター中で誘導される低 分子量の２つのバンドの非常に有効゛な精製法を与える。

全てのヒルジン活性が上清中に認められた。

ベクタープラスミドｐＴＧ９５１及びｐＴＧ９２７の製造 これらのベクタープラスミドは、γ−インターフェロンのクローニングに用いら れたものであるか又は上記の如きベクターの製造に関与するプラスミド由来のも のである。上記合成を添附の各図面に関連して簡単に述べる。

−第１０図はｐＴＧ９０７の製造を示す一第１１図はＭ１３ＴＧ９１０の製造を 示す一第１２図はｐＴＧ９０８の製造を示す−第１３因はｐＴＧ９０９の製造を 示す一第１４図はｐＴＧ９４１の製造を示す一第１５図はｐＴＧ９５１の製造を 示す。

上記各ベクタープラスミドの製造は、基本的には、ａ−Ｐ、、Ｎ及びＣＩＩｒｂ ｓを含むベクターｐＴＧ９０８の製造 す−合成リポソームに対する結合サイトを含むベクターｐＴＧ９５１の製造 を包含している。

ｐＴＧ９０７の製造（第１０図） 使用した親プラスミドは、プラスミドｐＢＲ３２２である。しかしながら、該プ ラスミドｐＢＲ３２２は、ａｍｐ”遺伝子中にＰＳｔ１制限サイトを有する不利 がある。なぜなら、引きつづき同じ性質のサイトを、クローニングゾーンにおい て、単一の制限サイトとして用いるからである。従って、上記ＰｓｔＩ制限サイ トを、プラスミド１）ＢＲ３２２の変異体であるプラスミドｐＵＣ８を用いて消 失させるのが適当である。該ｐＵｃ８においてアンピシリン耐性遺伝子は、ｐｓ ｔ工制限サイトを有していない（このサイトはインビトロでの変異により除去さ れている）。ｐＢＲ３２２は特にベテスダ　リサーチ　ラボラトリーズ（Ｂ　ｅ ｔｈｅｓｄａ　ＲｅｓｅａｒｃｈＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）から市販され ており、ｐＵｃ８は、参考文献３０として示した文献に記載されている。

上記目的のため、ｐＢＲ３２２の１，６６９ｂｐのｐｖｕ　Ｉ−Ｐｖｕ　Ｉ［フ ラグメントを、プラスミドｐＵＣ８の同様のＰＶｕＩ−ＰｖｕＵフラグメントと 交換する。

この交換を実施するために・、プラスミドｐ８Ｒ３２２及びｐＵｃ８をＰＶｕＩ 及びＰＶｕ［で順次処理し、次いでリガーゼの作用により環化させる。

もはやＰｓｔＩ制限サイトを有さず、またｐＢＲ３２２に始めに存在していたＮ ｄｅＩ制限サイト（図示せず）をもまた欠失しているプラスミド１）ＴＧ９０２ を、かくして得る。更に、プラスミドｐＴＧ９０２は、ｐｖｕｌ［サイトが存在 するｌ　ａｃ　ｉ’配列に相当する５０ｋｂのフラグメントを保有している。

ＰＬプロモーター及びλＮ遺伝子（ファージλ由来、λＮ遺伝子は転写の終結阻 害機能をコードする）を、プラスミドｐＫＣ３０から単離し、ｐＴＧ９０２に挿 入する。これは爾１０図に示すように、ｐＴＧ９０２をＥｃｏＲ工、Ｓｌ、Ｂａ ｍＨＩで処理し、ｐＫｃ３０をＰｖｕ　Ｉ、８１、ＢａｍＨＩｒ処理シ、連結さ セルコトにより行なわれる。

ＴＧＥ９００株の形質転換後に得られたプラスミドの内のひとつｐＴＧ９０６を 、処理してＰｖｕｌＩ−８ａ　Ｉエセグメントを除去する。この目的のために、 ｐＴＧ９０６をＳａ　ｌ　Ｌ　８１ヌクレアーゼ、ｐｖｕ■及ヒＩＪガーゼを用 いて順次処理する。ｐＴＧ９０７をかくして収得する。

Ｍ１３ＴＧ９１０の　造（１１図） λｃＩＩｒｂｓリポソーム結合領域、（ｒｉｂｏｓｏｍｅｂｉｎｄｉｎｇ　ｒｅ ｇｉｏｎ、これもファージλ由来である）を、次いでＡｖａＩ−ＴａｑＩフラグ メントの形態で１−ａｃｚ’遺伝子（β−ガラクトシダーゼのαフラグメント） の始めに挿入する。該遺伝子はＭ１３ｔｇ１１０として知られるファージＭ１３ 内でクローン化されている。上記戦略（５ｔｒａｔｅｏｙ）はｒｂｓのための簡 単な機能的試験、即ち１ａｃＺ’蛋白の生成試験を行なうことを可能とし、その 結果Ｉ　ＰＴＧ及びＸｇａ　ｌの存在下でブループラークを得ることを可能とす る。また所謂ジデオキシ法を利用する構築物の急速な配列化を可能とする。

コンピテント細菌内での選別の後、クローンＭ１３ｔｇ９１０を得る。その全構 造は図面の下に示した。

ｐＴＧ９０８の製造（第１２図） ファージ〜１１３ｔＱ９１０のｃ　Ｉ［ｒｂｓ−ｌ　ａｃＺ’フラグメントを、 先に製造したベクタープラスミドｐＴＧ９０７に転移させる。

この目的のために、ｃＩＩｒｂｓから上流のＥＣ０ＲＩ。

３ａｍＨＩ及びΔｖａＩサイトを除去し、次いでＢｑｌ■サイトを挿入する。

上記条件下、ｃｌ［ｒｂｓはＢＱ　Ｉ　Ｉ−ＢＧ　Ｉ　Ｉ［フラグメントの形態 で取り出され、Ｐ、プロモーター及び１）ＴＧ９０７のλＮ遺伝子から下流のＢ ａｍＨＩサイトに置かれる。

ファージＭ１３ｔｏ９１０をＥＣ０ＲＩで消化させ、次いでＢａ１３１で処理し 、クレノーポリメラーゼ（にｌｅｎｏｗ　ｐｏｌｙａ＋ｅｒａｓｅ）で処理する 。得られたフラグメントに、次いで非−ホスホリル化ＢＱ　Ｉ　Ｉ［アダプター の存在下にリガーゼを作用させる。得られたリグ−ジョン混合物をコンピテント ＪＭ１０３ｉ１Ｂ胞の形質転換に用いる。

次いで、ブルー領域を選別する。これらのクローンを次いでこれらがＢにＩＩＩ Ｉサイトを含み、且つ上流にＥＣ０ＲＩ又はＢａｍＨＩサイトを含まないことを 確かめるために分析する。その構造を示したＭ１３ｔｇ９１２のようなりローン を、かくして収得する。

Ｂａ１３１を用いた処理により、ＥＣ０ＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＡｖａＩサイトの 除去と同時にｌ　ａｃＡＴＧ及びＩａｃシャイン／ダルガルノ配列の除去を伴う １０１ｂｐの削除が行なわれた。挿入された８ｇ１１［サイトは、ｃＩ［ＡＴＧ の約１００ｂｐ上流及びＰＩａｃの１０ｂｐ下流に位置している。

ｐＴＧ９０７のＢａｍＨＩ−３ｐｈＩフラグメント、Ｃ［ｒｂＳ及びＩａｃＺ’ を保有するＥ３Ｑ　Ｉ　ＩＩ／Ｈｐａエフラグメント及びホスホリル化アダプタ ーをモル比１：２：１でプレハイブリダイズし、次いでＴ４リガーゼで処理した 。アリコートを、６１５０°株コンピテント細胞の３℃での形質転換に用いる。

形質転換株を３２ｐでラベルしたｃｌ［ｒｂｓ／１ａｃｚ’　フラグメントを用 いて選別することにより興味のある細胞を同定し、得られた構築物を制限酵素研 究により確かめる。

発現系の異なるエレメントが所望の行動をとるという当初の指示を得るために、 得られたプラスミドｐＴＧ９０８をＮ６４３７宿主株に転移させる。該宿主はｃ １８５７及びβ−ガラクトシダーゼのωフラグメント讐有しており、該フラグメ ントはプラスミドによってコードされるαフラグメントと相補的なものである。

ＩＰＴＧ＋）ｌａｌを含むディツシュに置かれた上記で得た形質転換体は２８℃ で無色であり、次いで４２℃に移すと、約３０分後に青色に変わる。

ヒルジンのクローニングに用いる前に、このベクターをヒトγ−インターフェロ ン、即ちγ−ＩＮＦのり〇−ン化に適合させた。実際上、ヒルジンのクローン化 のために、りａ−ン化された中間体蛋白の性質は重要ではないが、上記ベクター を下記スキームに従い製造した。

制限サイトについてのγ−ＩＦＮヌクレオチド配列の分析から、成熟蛋白の開始 点の８ｂｐ下流にＥＣ０ＲＩ［サイトが、また停止コドンの２８５ｂｐ下流に５ ａｕ３Ａサイトがあることが判り、結果的に、ＥＣ０ＲＩＩ−８ａｕ３Ａフラグ メント上に成熟蛋白をコードする全配列が単離される。ライブラリーから得られ たγ−ＩＦＮクローンを１）ＴＧｌｌとする。

ｐＴＧ９０９の構築（第１３図） 合成アダプター分子が最初に用いられ、これにより次の事が可能となる。

ｂ）成熟γ−ＩＦＮをコードする配列に関し、欠損している８ｂｐが導入される こと、及び ｃ）　ｃ［ｒｂｓＡＴＧ開始コドンが、再構成されるため、成熟γ−ＩＦＮ蛋白 質をコードする配列が、「−ｍａｒィニシエターを除き、融合アミノ酸を伴うこ となく翻訳されること。

このアダプターは、化学的に合成され、その構成は図に示されている。

ｐＴＧｌｌはＥＣ０ＲＩ及び５ａｕ３Ａで消化され、ｐＴＧ９０８はＮｄｅＩ及 びＢａｍＨＩで消化される。

適当なフラグメントはゲル上でＮ製され、等モル量のアダプターと混合され、予 備ハイブリダイズされ、連結される。該混合物は、受容能力のある（　ｃｏｍｐ ｅｔｅｎｔ　）ＴＧＥ９００細胞を形質転換するのに使用し、形質転換体は、ニ ック−翻訳された、３２ｐ−標識化ｐＴＧＩＩのＰｓｔＩ挿入物を該形質転換体 とハイブリダイズヶることにより選択される。

１３のクローンが選択され、マツピング（ｍａｐｐｉｎａ　）によりモニターさ れ、これらの−っであるｐＴＧ９０９が配列化（５ｅｑｕｅｎｃ　＋　ｎｇ　） により確認される。

ベクターｐＴＧ９４１の構築（第１４図）ｐＴＧ９０９は、二つのＮｄｅＩサイ トを含有し、その一方はγ−ＩＦＮの開始コドンに、他方はγ−ＩＦＮ配列から ２２ｂｐ下流に存在する。

これらサイト間の領域は、γ−ＩＦＮの最初の７つのアミノ酸をコードする領域 であるが、ＮｄｅＩで処理して除去され、図示する合成オリゴヌクレオチドで置 換さエサイトを上流に再構成する一方で、特異なり　ａ　ｍ　Ｈエサイトを導入 する。ベクターｐＴＧ９４１は、こうして得られる。

ｐＴＧ９５１の構築（第１５図） 第１５因は、ｐＴＧ９４１から誘導されるｐＴＧ９５１の構築を図式的に示すも のである。ｐＴＧ９４１においては、Ｃ［ｒｂＳを含有するフラグメントが、Ｅ 、コリＩａｃオペロンｒｂｓと呼ばれるＥ、コリＩａｃオペロンの翻訳開始領域 の配列に基づく合成配列で置換されている。この合成オリゴヌクレオチドは、γ −ＩＦＮをエサイトにおいて挿入された。

る（ｉｎ　ｐｈａｓｅ　）停止コドンは、新たにｒｂｓサイトの以Ｆの実施例は 、そのＮ−末端で修飾された変異体ＨＶ２の製造を示すものである。

添附図面において： ・第１６図は、ｐＴＧ７２’ｏを含有するＥ、コリＴＧ９００＠養物において誘 発されたヒルジン活性の曲線を示す。

・第１７図は、ｐＴＧ７２０を含有するＥ、コリＴＧ９００の抽出物からの３５ ３−標識化蛋白質の分析のフベクトルを示す。

修飾ＨＶ２の製造 本発明のヒルジンを発現するプラスミドｐＴＧ７２０の構築は、ｐＴＧ７１７及 びｐＴＧ９２７を出発物質として、上記したプラスミドｐＴＧ７１８の場合と同 じ方法に従い行なわれる。

ｐＴＧ９２７のＮｄｅＩ−ＰｖｕＩ［７ラグメントは、ヒルジンのＮ−末端にお ける１ｌｅ−ｔｈｒ配列を再構成するために、下記のアダプターオリゴヌクレオ チドによりｐＴＧ７１７のＨｉ　ｎｆＩ−ＡｈａｌＩ［フラグメントに合体され る。

リグ−ジョン混合物は、Ｅ、コリＴＧ９００を形質転換するのに用いられ、プラ スミドを含有する形質転換体は、アンピシリン１００μｇ／ＩＩＩＱを含有する 寒天−Ｌプレート上で選択される。ヒルジン配列を含有する構築物は、プローブ として標識化ｐＴＧ７１７挿入物を用いて該コロニーをハイブリブイズすること により同定される。

最終プラスミドのＤＮＡ配列は、発現プラスミドにおけるＤＮＡの直接配列（ｄ ｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）　ニよりモニターされた。

ｐＴＧ７２０によるヒルジン活性の発現プラスミドｐＴＧ７２０を含有するＥ、 コリＴＧ９００を、ＬＢ培地及ヒ５０μｇ／ｌｌ１１２ノアンヒシリン中で３０ ℃にて、６００における光学密度が０．３となるまで増殖させる。

該細胞培養物は、次いで、３７℃にて、ＰＬプロモーターからの転写を誘発すべ く転移される。

１−のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ　）を１時間毎に取出し、６００　ｎｍにお ける密度を測定し、細胞を遠心分離により集める。

遠心分離ベレットは、２００ｔｌＱのＴＧＥ　（２５ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣＱ、ｐ Ｈ８，０，５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ　ＥＤＡ）中に再懸濁さＵ、該細胞は 音波処理により溶解される。

清澄化後、上清を集め、その抗トロンビン活性を、凝集試験（ＣＯａｑｕｌａｔ ｉＯｎ　ｔｅｓｔ）により又はトロンビンの標準溶液による、基質、トシルグリ シルプロリルアルギニン　４−ニトロアニリド　アセテート（Ｃｈｒｏｍｏｚｎ ＋ＴＨ１ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミツト・ベシュレンクタ ー・ハフラング、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＨａｎｎｈｅｉｍ　Ｇ　ｍ　ｂ　Ｈ）の 開裂阻害についての比色定量試験により測定する。

該反応は、１−の反応容量において、１００ｍＭＴｒｉｓ　ＨＣＱ１ｐＨ８，０ ，０，１５Ｍ　ＫＣＱ及び０．１％のポリエチレングリコール６０００からなる 緩衝液に溶解させた１３μＭの基質を用いて行なう。

０．２５Ｕのトロンビンとの反応を、４０５ｎｍにて分光光度計を用いて２分間 追跡し、反応速度を光学密度の上昇スロープから測定する。

標準ヒルジン又は未知の抽出物をこのトロンビン反応混合物に添加し、阻害の程 度乃至は抗トロンビン活性を測定する。

添附の第１６図は、ｐＴＧ７２０を含有する細胞の培養物中の抗トロンビン活性 の誘導（１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　）効果を、培養物１Ｑ当りの６００の光学密度に 対する抗トロンビン単位として示す。該誘導は６時間にわたるものである。

破線は、同一時間に６００の光学密度で測定されたＥ。

コリ細胞の増殖曲線を示す。

誘導の結果、有意なレベルを示すヒルジン型の活性が観察される。

ヒルジン配列を有しないプラスミドを含有する培養物の対照溶菌産物は、活性を 示さない。

これら細菌溶菌産物を、ＨＣＱでｐＨ２，８に酸性化した後１５分間７０℃に加 熱すると、かなりの量の蛋白質が変性され、沈澱する。後者を冷却抽出物から遠 心分離により除去し、上清を丁ｒｉｓ　ＨＣＱ緩衝液（最終濃度１００ｍＭ、　 ｐＨ８，０）を添加することにより中和すると、当初の活性の少なくとも１００ ％の活性、しばしばそれ以上の活性が上清中に再び現れる。

典型的実験において、当初の活性の１３０％の活性が上清に再び現れる。

ベレットとして沈澱した物質には、残留活性は認められない。

冷却、遠心分離及び中和後、加熱され酸性化された細菌抽出物（ヒルジン５ＡＴ Ｕを含有する２００μＱ）を、３７℃にて１５分間、（標準的方法で調製した） セファロース樹脂に共有結合的に結合されたトロンビンの５０％強度スラリー１ ００μＱと共にインキュベートし、且つ該セファロース・トロンビンを遠心分離 により除去する場合には、上清中にヒルジン型の活性は認められない。

従って、ｐＴＧ７２０により産生されるヒルジンは、天然の分子と同一の一般的 性質を有し、またｐＴＧ７１７及びｐＴＧ７１８により得られる物と同一の一般 的性質を有する。

ｐＴＧ７２０培養物中に特異的に誘導され、（３５８）電気泳動による分離及び 蛍光間接撮影法（ｆｌｕｏｒｏａｒａｐｈｙ）による顕現化を行なった後のポリ ペプチドは第２図に示されている。一連の低分子量（５〜１０．０００ダルトン ）のポリペプチドが、特に誘導される。

第１７図において、 ・レーン１は、非誘導細胞を示し、 ・レーン２は、０時間での誘導を示し、・レーン３は、１時間の誘導を示し、 ・レーン４は、２時間の誘導を示し、 ・レーン５は、分子量マーカーを示し、・レーン６は、３時間の誘導を示し、 ・レーン７は、４時間の誘導を示し、 ・レーン８は、５時間の誘導を示し、 ・レーン９は、６時間の誘導を示し、 ・レーン１ｏは、７時間の誘導を示す。

以下に示す実施例は、ヒルジンＨｖ１の製造を示すものである。

ＨＶＩ遺伝子の研究　び合成の戦略 ヒルジンＨＶ１のための遺伝子を製造するための合成の作戦は、各種の段階を包 含する。

まず、第１８図に示されるように、アミノ酸５３の後は）（Ｖｌと）（Ｖ２とで アミノ酸の相違はなく、また、アミノ酸５６に中心を有する、ｐＴＧ７１７中で クローン化されたＨＶ２のＣＤＮＡ中のＴａｑエサイトは一つであるため（第１ ９図）、アミノ酸５６の後の変異体ＨＶ１のＤＮＡ配列はｐＴＧ７１７のＴａＱ 　Ｉ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ７ラグメントにより供給され得る。

この理由から、ＨＶＩの最初の５６個のアミノ酸をコードするＤＮＡのみを、化 学的に合成しなければならない。

このＤＮＡは、２つの別個のブロックとして合成された。第２０図に示す第一の ブロックは、まず、主としてクローニングを目的とする［：ｃｏＲＩ粘着末端が ら始まり、次いで直ちに、ＨＶＩをコードする配列の前のＡＴＧ開始コドンを含 有するＮｄｅＩサイトが続く。完全な遺伝子は、５′末端におけるＮｄｅＩサイ トを用い、Ｅ。

コリ中での発現ベクター中への挿入のために回収（ｗｉｔｈｄｒａｗ）すること ができる。この部分に続いて、ＨＶｌの１〜３２のアミノ酸をコードするＤＮＡ が延長しており、３ａｍＨＩ粘着末端で終了することができる。

なぜなら、アミノ酸３１及び３２はｌｙ及びｓｅｒであり、下記に示す如く、Ｂ ａｍＨＩサイトによりコードされるからである。

ａｍＨＩ ↓ ＧＡＴＣＣ ｇＮ／　Ｓｅｒ この１０９ｂｐを有する合成りＮＡ部分は、その開成オリゴヌクレオチドを縮合 することにより組立てられ、次いでリゲーションにより、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ Ｉｒ切断されたファージＭ１３ｒｒＮ）８中に置かれ、斯くしてＭ１３ＴＧ７２ ４が構築される。談合成りＮＡは、ファージＭ１３のポリリンカー領域に存在す るので、この第１の合成ブロックが正しく組立てられていることを確認するべく 、即座に配列化（５ｅｑｕｅｎｃｅｄ　）することができる。

第２の合成ブロックは、アミノ酸３３〜５６に対応するものであり、その一端に はＢａｍＨＩ粘着サイトがあり、他端にはＴａｑＩサイトがある（第２１図）。

この６９ｂｌ）の合成ブロックは、やはり、その構成オリゴヌクレオチドから組 立てられ、次いで第２１図に示すように、ｐＴＧ７１７由来のＴａＱＩ−Ｐｓｔ Ｉフラグメントと共に、３ｐｍＨＩ／ＰｓｔＩで切断された〜１１３ＴＧ７２４ 中に挿入される。これにより、完全なＨＶｌをコードする配列を含有するファー ジＭ１３ＴＧ７２５が得られる。上記の如く、この構築が正確に組立てられてい るか否かは、配列化（５ｅｑｕｅｎｃ　ｉ　ｎｏ　）により即座に確認できる。

次の段階は、ヒルジン配列のＡＴＧから始まり、３′末端の非翻訳領域で終了す るＮｄｅＩ−Ａｈａｌｌｌフラグメントを、ＮｄｅＩ／ＰｖｕＩ［で切断された プラスミドｐＴＧ９２７へ転移させることからなる。この発現ベクターはヒルジ ンＨＶ２発現ベクターｐＴＧ７２０の構築に使用されたものと同一であり、その 構造及び構築法は既述の通りである。変異体ＨＶＩをコードする最終発現ベクタ ーは、ｐＴＧ’７２６として知られ、第２２図に示されている。

これら２つのブロックを構築するのに用いられたオリゴヌクレオチドの正確な配 列は、第２３図に示されている。ブロック１は、ＥＣ０ＲＩサイトからＢａｍＨ Ｉサイトへと延び、２２〜３２塩基の大きさを有する８個のオリゴヌクレオチド から成る。ブロック２は、ＢａｍＨエサイトからＴａｑＩサイトへと延び、１９ 〜３０塩基の大きさを有する６個のオリゴヌクレオチドから成る。

該ヌクレオチドは、シリカ支持体上でマニュアル・フォスフオトリエステル法（ 参考文献３１）により合成され、ＨＰＬＣ法又はポリアクリルアミドゲルからの 溶離を用いて精製された。

該遺伝子の合成部分に用いられたオリゴヌクレオチドの正確な配列は、次のパラ メーターを考慮して選択された。

ａ）コドンの選択は、可能な場合、Ｅ、コリにおいて非常に高いレベルで発現さ れる遺伝子のそれによる。この選択は、発表されているデータ（参考文献３２． ３３）を用いてなされる。

ｂ）各オリゴヌクレオチドを個々に、次いで完全な配列においてコンピューター 分析し、こうして゛ヘアピン”を形成し得る構造を除去する。

Ｃ）　ヒルジン分子のＮ−末端の選択はこの領域における成る位置において該塩 基が得られるようにすべく成るコドンを優先的に使用することに対応する。該ｇ Ａ域においては、２等塩基がＥ、コリにおいて外部蛋白質を高いレベルで発現す るのに重要であることが示されてこのブロックを形成するオリゴヌクレオチド１ 〜８（第２３図）は、２つの端部オリゴヌクレオチド１および及び８を除いて、 標準的条件下に、ポリヌクレオチドキナーゼで５′末端においてリン酸化される 。これは、引続くリゲーションの段階において合成ブロックの三量化又は重合体 の生成を避けることを企画するものである。

５００ピコモルの各オリゴヌクレオチドに対し、最終２５ｔｌＱ容量の６０ｍＭ 　Ｔｒ　ｉ　ｓ　ＨＣＱ、ｐｌ−１７，５，１０ｍＭ　ＭＱＣＱ２．８ｍＭジチ オスレイトールテアッテ、且つ３．３ｐｍｏｆの’　２Ｐ　７−ＡＴＰ（その特 異的活性は５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌである）を含有するものの中で、２ユニツト のポリヌクレオチドキナーゼを用いて、キナーゼを作用させる。次いで、３７℃ にて１５分間インキュベート後、冷Ａ　Ｔ　Ｐ　５　ｍｍｏｌを添加することに より、該オリゴヌクレオチドは完全にリン酸化される。　更に３７℃で１５分間 インキュベー１・後、該ヌクレオチドは、変性条件（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｃ ｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）で行なわれる２０％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳 動によりＭ製される。標識化オリゴヌクレオブトは、オートラジオグラフィーに より検出され、該ゲルの】当な領域が切り取られ、該オリゴヌクレオチドは、３ ７℃にて一部インキユベートしつつ水でＲｆｌｉされる。

次いで、該オリゴヌクレオチドは、ＤＥＡＥ−セルロースのカラム上で、１Ｍト リエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液、ｐＨ８を用いて溶離し、凍結乾燥される 。

キナーゼの作用を受けず、また標識化されなかったオリゴヌクレオチド１及び８ については、ゲル精製を上記の如く行なうが、該オリゴヌクレオチドはＵＶ吸収 により検出される。

該相補性のあるフラグメント（１＋５．２＋６等）は、最終５０μＱ容量の６６ ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＱ、ＤＨ７，５，６ｍＭ　ＭＧＣＱ２．１００ｍＭ　Ｎａ ＣＱ。

０．５ｍＭスペルミジン（５ｐｅｒＩＩｌｉｄｉｎｅ）及び８ｍＭジチオスレイ トール中、等モル量、即ち各オリゴヌクレオチドの１００ピコモルを用いて、混 合される。これら混合物は、１００℃まで加熱し、２時間で３７℃まで徐冷する 。これら溶液を混合して、１００μＱ中４種のオリゴヌクレオチドのハイブリッ ドを得る。これら混合物は最終的に合され、該８種のオリゴヌクレオチドは、ペ アを形成すべく、最終容量２００μＱ中、３７℃にて終夜放置３れる。ベアを形 成したオリゴヌクレオチドの０．００５ピコモルを、６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ ７，５，６，６ｍＭ　ＭＱＣＱ２．１０ｍＭジチオスレイトール及び０．５ｍＭ 　ＡＴＰを含有する、最終２０μＱ容量のリゲーション混合物中において、Ｂａ ｍＨＩ／ＥＣ０ＲＩで消化され、ゲル上でＭ’ＳされたＭ１３ｍｏ９の２５０ｇ と連結させる。

該リゲーションを、１５℃にて２４時間続け、再び４℃にて２４時間行なう。リ ゲーション混合物を、次いで、Ｅ、コリ・ＪＭ１０３を形質転換するのに用いる 。形質転換により得られた多くの無色プラークから、８つの候補を選択し、該フ ァージから一重鎖ＤＮＡを調製し、これをジデオキシ・チェイン・ターミネーシ ョン法（参考文献３４）により直接ＤＮＡ配列化（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）　ニ かける。これら候補から、２つが、第２３図のブロック１に対応するオリゴヌク レオチドが正確に組立てられたものを含有することが見出され、その１つはＭ１ ３ＴＧ７２４と命名され、次の段階で使用される。

第２の合成ブロック及び 全遺伝子のアセンブリー 第２の合成ブロックをアセンブルするために、上記の方法と基本的に同様の手順 を採用した。但し、オリゴヌクレオチド成分は、ベアリング段階前には精製せず 、キナーゼに接触させ（但し第２３図における末端オリゴヌクレオチド９及び１ ４は除り）、次いで直接ベアリングさせた。ベアリング条件は、上記と同様であ り、最終体積１５０μＱ中に各オリゴヌクレオチドが１００ピコモルとなる様に した。

ベアリング段階後、混合物は、２％アガロースゲル（低融点アガロース）上に注 入さ゛れ、電気泳動に供された。オリゴヌクレオチドは、エチジウム　ブロマイ ドによる染色により検出され、アセンブルされたブロック（６９ｂｐ）に対応す るバンドがゲルから切り出され、常法により溶離された。

第２の合成ブロック（２ｎｏ）が次いでファージＭ１３ＴＧ　７２４　（５０ｎ ｇ）と混合され、Ｐｓ　ｔ　Ｉ／Ｂａｍ１−１工により切断され、ゲル上で精製 され、ｐＴＧ７１７のＴａＱ　Ｉ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ７５グメント（２ｎｇ）　が’ ｊＪＩｖ上でｍ製された。これ等エレメントの組合せが、６６ｍＭトリスＨＣＱ 、　ｐＨ７，５及び６．６ｍＭ　ＶＣＪＣＱ２を含む液２０μＱ中でアセンブル され、６５℃で５分間加熱され、更にＤＴＴＩ　ＯｍＭ、ＡＴＰ０．５ｍＭ及び Ｔ４リガーゼ５単位を加えた。リゲーションを１５℃で１６時間Ｍ続し、リゲー ション混合物をＥ、コリ　Ｊ〜１１０３の形質転換に使用した。

被形質転移体中の無色のプラーク群から、単一鎖ファージを直接連鎖（ｓｅｑｕ ｅｎｉｎｇ　）させるために１２のプラークを選んだ。更に、二本鎖型のファー ジをも作り（参考文献３５）、正しくアセンブルされた組換体（ｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｔｅｓ）中に存在する筈の単一［３ａｍＨＩサイトの存在を調べた。これ等 クローンの大多数は、ＢａｍＨＩサイト、及びＨＶｌをコードする全遺伝子の正 確なアセンブリーに対応するＤＮＡ配列を含んでいた。これ等の１つでＭ１３Ｔ Ｇ７２５と名付けられたものが、選択されたゆ ３現ベクターへのＨＶＩ遺伝子の転移 ＨＶ１の蛋白質を発現することができるベクタープラスミドを作り出す為のＲ終 段階は、Ｍ１３ＴＧ７２５の２４８ｂｐ　ＮｄｅＩ−Ａｈａ！［［セグメントを 、ＮｄｅＩ／Ｐｖｕ　■により切断されたｐＴＧ９２７（第２２図）に転移させ ることである。しかしながら、この種の消化によるファージの再現型は、第２の Ｍ１３フラグメントとなり、これは、所望の７ラグメントと実質上同一のサイズ を有するが発現ベクター中でより効率良くクローンを形成するので、まずヒルジ ンＨＶ１配列全体を含むＡｖａｌＩ−Ｂａａ　ＩＩフラグメント（１，７１Ｋｂ ）を作り、次いでこれをＮｄｅＩ／ＡｈａＩｒで消化する必要があった。この消 化生成物は、それ以上のＮ製を行なうことなく、ＮｄｅＩ／ＰｖｕＩｒで切断さ れた後の発現ベクター１）ＴＧ９２７内にリゲートされた。Ｅ、コリＴＧＥ９０ ０の形質変換体中で、正しい構造のｐＴＧ７２６は、ＨＶＩ遺伝子の配列から得 られる単−ＢａｍＨＩサイトの存在により、次いでＤＮＡ配列の直接分析により 確認された。

ｐＴＧ７２６によるヒルジンＨＶ１の生物学的活性の発現 発現ベクターｐＴＧ７２６は、温度誘導性のプロモーター、ＰＬプロモーター、 即ちバタテリオファージλの主左方プロモーター（ｍａｊｏｒ　Ｉｅｆｔｗａｒ ｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を有している。このプロモーターは、ホストによりエン コードされた温度に敏感なリプレッサーによりブロックされているので、ヒルジ ンＨＶＩ遺伝子は、３０℃での成長期間中には転写されない。しかしながら、温 度が３７℃を超えると、この遺伝子の転写が誘発される。

第２４図は、３０℃で且つ６００　ｎ１ｌｌでの光学密度０゜３で成育され、次 いで３７℃で誘発されたＥ、コリｐＴＧ７２６培地における成長曲線及び抗トロ ンビン活性の誘発曲線を示す。

ヒルジン活性は、バクテリア細胞の超音波抽出物（ＳＯｎｉｃａｔｅｄ　ｅｘｊ ｒａｃｔｓ）が、色素基体（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃＳｕｂＳｔｒａｔｅＳ　） を開裂（ｃｌｓａｖｅ）させる能力に関して、ウシのトロンビン活性を抑制する 能力により測定した。

相当な同のヒルジンがｐＴＧ７２６培地中で生成していることが明らかである。

約３〜４０００抗１−ロンビン単位１０Ｄ／Ｑ培地が認められるが、この活性は 、時間の経過とともに急速に低下する。この効果は、容易に再現可能であり、誘 発後３時間で活性がピークとなり、次いで活性低下段階に入る。

この誘発曲線の特性は、極めて特徴的で且つ再現性が高く、発現ベクターｐＴＧ ７２０により従来観察されている特性とは、著るしく異なる。即ち、ｐＴＧ７２ ０の場合には、誘発によりヒルジンの変種ＨＶ２を発現する。

この変種は、約２時間の潜時（ＩａｔｅｎＣＶ　ｐｅｒｉＯｄ）を伴ってよりゆ っくりと誘発され（第２５Ａ図）、次いでその活性は、ｐＴＧ７２６の活性（第 ２５８因）とほぼ同等のレベルに達した後、低下することなく一定値にとどまる 。同一のＥ、コリＴＧＥ９００ホスト細胞中で全く同一の発現ベクターを使用し つつも、２つのヒルジン変種が得られたのだから、この誘発と安定化におけるこ の差異は、ＨＶＩとＨＶ２との間の一次構造の相違に関連するに違いない。更に 、このことは、２つの変種間の蛋白質消化に対する抵抗の相違を反映するものか も知れないし、また、２種の変種の異なる生物学的活性又は異なる生物学的役割 の表われかも知れない。安定性及び他の生物学的特性における相違は、これ等ヒ ルジンの使用に際して、恐らく考慮されることになろう。

Ｅ、コリにおけるＨＶｌ及びＨＶ２の発現の相違は、２種の異なる発現ベクター により形質転換されたＥ、コリＴＧＥ９００細胞のパルス−ラベリング分析（ｐ ｕｌｓｅ−Ｉａｂｅｌｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ）によっても、観察される。、 ２種のヒルジン変種は、システィンに極めて冨むので（分子の約１０％）、又こ のアミノ酸は、Ｅ、コリ蛋白質中ではむしろ一般的ではないので、（３５Ｓ）シ スディンが、ヒルジンの発現に関する放射性マーカーとして極めて有用である。

ｐＴＧ７２６により形質転換されたＥ、コリ細胞が、ＬＢ＋アンピシリン（１０ ０μ＋、１／纜）中で測定される光学密度が０．３となるまで３０℃で培養され 、次いで３７℃まで温度を上昇させることにより変種ＨＶ１を発現させるように した。

定期的に１時間毎に、培地から２００μＱのアリクウオットを取出し、（”５Ｓ ）システィン（比重ｉ　ｏｏ。

Ｃｉ／ｍｍｏｌ）７０μＣｉを加え、２分間にわたりラベリングを行なった。大 過剰（約２−）のリン酸塩を含む冷！！！衝食塩水を更に加え、遠心分離により 細胞を集め、ＳＤＳゲル用の負荷バッファー（５０ｍＭトリスＨＣ（！　。

ｐＨ６，８，５ＤＳ１．３％、グリセロール５％、β−メルカプトエタノール２ ．５％、ブロモフェノールブルー０．００４％）４０μＱ及び１５％５ＤＳ−ポ リアクリルアミドゲル５μＱ中で５分間ベレットを沸農させることにより、全細 胞中の標識された蛋白質を分析した（ラエムリによる手順：参考文献３６）。電 気泳動俊、ゲルを蛍光間接撮影及びオートラジオグラフィーに供した。

得られた結果は、ヒルジンに対応する６０００〜１２０００ダルトンの領域にお ける一連のバンド群の生成を示している。Ｅ、コリｐＴＧ７２６からの抽出物（ 変種ＨＶＩ）については、これ等のバンドは極く弱く標識されているに過ぎない のに対し、Ｅ、コリｐＴＧ７２０抽出物については、これ等のバンドは極めて強 く標識されている。

標識パターンにおけるこの著るしく明確な差異は、２種の培養物がほぼ同様の抗 トロンビン活性を示すという事実にもかかわらず、示されたものである。

ヒルジン組換体ＨＶ１の他の特性 天然のヒルジン及びＥ、コリから得られた変種トＩＶ２の特性の一つは、極めて 低いｐＨ条件下での熱処理に対する抵抗性である。Ｅ、コリから得られた変種Ｈ Ｖ１についても、同様の現象が認められる。ｐＴＧ７２６により形質変換された Ｅ、コリ細胞の３時間経過後の培地を遠心分離した後、培地体積の１７５のＴＧ Ｅ　（ｔ−リス）−ＩＣ（２５０ｍＭ、ｐ）（８，０、グルコース５０ｍＭ。

ＥＤＴＡｌｏｍＭ）に再度懸濁させ、細胞を超音波により破壊した。細胞残渣を 遠心分離によって除去し、上澄の一部を抗トロンビン活性の測定に直接使用した 。

上澄の他の部分を希ＦｆｉＨＣＱによりｐＨ２，８に調整し、７０℃で１５分間 加熱した。希釈液を水中で３０分、間冷部し、変性した不溶性蛋白質を遠心分離 により除去した。上澄を希薄ＮａＯＨを加えることにより中和し、次いで抗トロ ンビン活性を測定した。酸性化及び中和による量のわずかの変化を考慮に入れた 上で、当初の活性が、この酸／熱処理によっても、１００％そのまま残存してい ることが計算により明らかとなった。このことから、変種ＨＶＩは、天然のヒル ジン及び変種ＨＶ２と同一である。

ヒルジンＨＶ２活性は、セファローズ　ビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｂｅａｄ ｓ　）に共有結合的に結合されたトロンビンを使用することにより、微生物抽出 物から完全に除くこともできる。酸及び熱により処理され、次いで中和されたＥ 、コリ／ｐＴＧ７２６抽出物（２００μＱ中に抗トロンビン活性７．７単位を含 む）を、濃度５０％のトロンビン−セファローズ懸濁液５０μＱ中３７℃で１５ 分間培養した。シロンビン−セファローズ　ビーズを遠心分離により除去し、上 澄の抗トロンビン活性を検査した。当初の抗トロンビン活性の９５％以上が、セ ファローズ−トロンビン処理により、除去された。Ｅ、コリ細胞により得られた 変種ＨＶＩは、従って、セファローズ　ビーズに結合するトロンビンに結合する ことができる。

下記の菌株が、１９８５年３月２６日に７５７２４バリ　リス・デュ・ドクトウ ール　ルー　２８のコレクシオン　ナショナル　ド　クルトウル　ド　ミクロオ ルガニスム（ＣＮＣＭ）に寄託された： ＯｐＴＧ７１８により形質転換されたＥ、コリＴＧＥ０Ｏ Ｎｏ、ｌ−４２７ ０１）ＴＧ７２０により形質転換されたＥ、コリＴＧＥ０Ｏ Ｎｏ、ｌ−４２８ ＯｐＴＧ７２６により形質転換されたＥ、コリＴＧＥ０Ｏ Ｎｏ、ｌ−４２９ 参考文献 １、エフ、？ルクバルト（Ｆ、　Ｈａｒｋｗａｒｄｔ）　＜　１９５５　）ナツ ーアヴイツセンシャフテン（Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｈａｆｔｅｎ）４２．５ ８７゜ ２、　エフ、？ルクバルト（Ｆ、　Ｈａｒｋｗａｒｄｔ）　（１９５７）ホツベ ーザイラーズ　ツアイトシュリフト　フユアフイジオローギツシュヘミー（Ｈｏ ｐｐｅ−８ａｙｌｅｒ’　ｓＺ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ＋、　＞　３０ ８．１４７−１５６゜３、　エフ、？ルクバルト（Ｆ、　Ｈａｒｋｗａｒｄｔ） 及びビー。

ハルスマン（Ｐ、　Ｗａｌｓｎ＋ａｎ）　（１９６７）ホツペーザイラーズ　ツ アイトシュリフト　フユア　フイジオローギツシュ　ヘミ−（）ｌｏｐｐｅ−３ ｅｙｌｅｒ’　ｓ　２’、　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　）　３４８　、１３８１−１３８６゜４、テルトリン　シー、デ　 ラ　ロ勺（丁ｅｒｔｒｉｎＣ，ｄｅ　Ｌａ　Ｌｌｏｓａ　）及びエム、　ユテイ ス（Ｈ，ＪｕｔｉｓＺ　）（１９６３）ごュルタン　デ　ラ　ソシエテ　デ　シ ミー　ビオロジク（Ｂｕｌｌ、　Ｓｏｃ、　Ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｌ、）±１゜６ ７−７４゜ ５、エフ、？ルクバルト（Ｆ、　Ｈａｒｋｗａｒｄｔ）　（１９７０）メリーズ 　イン　エンザイモロジ−（ＨｅｔｈＯｄＳ　１ｎＥｎｚｙ＋ｇｏｌｏｇｙ、ｅ ｄｓ、）ジー、　イー、　バールマン（Ｇ、　Ｅ、　Ｐｅｒｌｒａａｎ　）及び エル、　ローランド（Ｌ。

Ｌｏｒａｎｄ　）編、アカデミツク　プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、） 　、第旦巻、９２４−９３２゜６、　ディー、バグディ（Ｄ、Ｂａａｄｙ　）　 、イー、バラバス（Ｅ、　Ｂａｒａｂａｓ）及びエル、グラフ（Ｌ、　Ｇｒａｆ 　）（１９７３）　トロンポウシス　リサーチ（ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅ ａｒｃｈ）　２．２２９−２３８６７、　エル、グラフ（Ｌ、　Ｇｒａｆ　）　 、ニー、バッチ−（Ａ。

Ｐａｔｈｙ）　、イ＋、　ヒ＋、バラバス（Ｅ、８．８ａｒａｂａｓ）及びディ ー、バグディ（Ｄ、Ｂａ１ｌｌｄＶ　）　（１９７３）バイオシミ力　エト　バ イオロジカル ８ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　３１０．４１６−４１７゜８、　ティー、　イー 、ピータ−セン（Ｔ、　Ｅ、　Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）、エッチ、　アール、　Ｏパ ーツ（Ｈ，Ｒ，Ｒｏｂｅｒｔｓ　）、エル、　ソトラップーイエンセン（Ｌ、５ ｏｔｔｒｕｐ−ＪｅｎＳｅｎ）　、ニス、　マグヌソン（Ｓ、Ｍａｇｎｕｓｓｏ ｎ　）及びディー、バグディ（Ｄ、　Ｂａｃ＋ｄｙ）　（１９７６）ブ０タイズ 　オブ　ザ　バイオロジカル　フル−イッズ、ブロシーデイング　オブ　ザ　コ ロキニウム（Ｐｒ０ｔｉｄｅＳ９．　ジエイ、ドツト（Ｊ、’　Ｄｏｄｔ）　、 エッチ、−ビー。

ミュラー（Ｈ，−Ｐ、　Ｍｕｌｔｅｒ）　、１−、ジ−ミュラー（Ｕ。

Ｓｅｅｍｕｌｌｅｒ　）ジエイ、−ワイ、チャン（Ｊ、−Ｙ、　Ｃｈａｎｇ　） （１９８４）フエブス　レターズ（Ｆｅｂｓ　Ｌｅｔｔ、）１６５．１８０−１ ８３゜ １０、　ティー、タラジエスキー（Ｔ、Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ　）及びビー、ブロ ンベック（１９６８）アクタ　ケミ力スカンジナピ力（Ａｃｔａ、Ｃｈｅｗ、５ ｃａｎｄ、　）λユ。

１３３９−１３４６゜ １１、　ジエイ、−ワイ、チャン（Ｊ、−Ｙ、Ｃｈａｎｇ　）（１９８３）フエ ブス　レターズ（Ｆｅｂｓ　Ｌｅｔｒ、　）１６４．３０７−３１３゜ １２、　アイ、ビー、バスコラ（１，Ｐ、　Ｂａ５ｋｏｖａ　）　、ディー、ニ ー、チェルケソワ（Ｄ、　Ｕ、　Ｃｈｅｒｋｅｓｏｖａ）、アイ、　アイ、　モ ソ０７　（ｖ、ｖ、Ｈｏ５ｏｌｏｖ　）　、−ｉ’−。

エル、マウロワ（Ｅ、Ｌ、Ｈａｖｌｏｖａ　）及びエル、ニー、ベリャノワ（Ｌ 、Ａ、Ｂｅ１ｙａｎｏｖａ　）　（１９８０）ビオキミャ１３、　アイ、ビー、 バスコラ（１，Ｐ、Ｂａ５ｋｏｖａ　）　、７’−１’−，１＋、チェルケ’） ’）　（Ｄ、　Ｕ、Ｃｈｅｒｋｅｓｏｖａ）及びブイ、ブイ、モゾロフ（ｖ、Ｖ 、１４ｏｓｏｌｏｖ　）（１９８３）　トロンポウシス　リサーチ（Ｔｈｒｏｍ ｂｏｓ　ｉ　５Ｒｅｓｅａｒｃｈ）　３０．４５９−４６７゜１４、　エフ、マ ルクバルト（Ｆ、　１４ａｒｋｗａｒｄｔ）　、ジエイ。

ハウブトマン（Ｊ、Ｈａｕｐｔｍａｎ）　、ジー、ツバツク（Ｇ。

Ｎｏｗａｋ　）　、シーエッチ、フレラセン（Ｃｈ、ＫｌｅＳＳｅｎ　）及びビ ー、パルスマン（Ｐ、Ｗａｌｓｍａｎｎ）　（１９８２）トロンポウシス　アン ド　へモスタシス、シュトットガルト（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍ ｏｓｔａｓｉｓ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　＞生７，２２６−２２９゜ １５、　ビー、パルスマン（Ｐ、Ｗａｌｓｍａｎｎ）及びエフ、マルクバルト（ １９８１）ディー　ファルマツイ−（Ｄｉｅ　Ｐｈａｒｍａｚｉｅ　）　１０． ６５３−６６０゜１６、　ティーエッチ、クロス（Ｔｈ、　Ｋｌｏｓｓ）及びニ ー。

ミツトマン（Ｕ、旧ｔｔｍａｎｎ）　（１９８２）　ＬｏｎｇｅｎｂｅｃｋｓＡ ｒｃｈ、　Ｃｈｉｒｕｒｇ、　３５８　、５４８　ａ１７、ニー、インカワ（Ａ 、Ｉｓｈｉｋａｗａ）　、アール、ハフター（Ｒ，Ｈａｆｔｅｒ）　、ニー、ジ −ミュラー（Ｕ、Ｓｅｅｍｕｌｌｅｒ　）　、ジエイ、エム、ゴケル（Ｊ、Ｈ。

Ｇｏｋｅｌ　）及びエム、グラエフ（Ｈ，Ｇｒａｅｆｆ）　（１９８０）トロン ポウシス　リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）■、３５１− ３５８゜ １８、ジー、ツバツク（Ｇ、Ｎｏｗａｋ　）及びエフ、マルクバルト（Ｆ、　Ｈ ａｒｋｗａｒｄｔ＞　（１９８０）　Ｅｘｐｔ、　Ｐａｔｈ、１旦。

４３８−４４３゜ １つ、　ニー、エッチ、ストール（Ａ、Ｈ，５ｕｔｏｒ　）　、ニス。

クツツブ（Ｓ、にｎｏｐ　）及びディー、アドラー（Ｄ、Ａｄｌｅｒ　）（１９ ８１）コントローレ　アンチトロンポンチ力、第２３回シンポジウム　ブルート ゲリング、ハンブルク（にｏｎｔｒｏｌｌｅ　Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃａ 　、　２３ｒｄ　Ｓｙｍｐ。

Ｂｌｕｔｇｅｒｉｎｎｕｎｇ　、　Ｈａｍｂｕｒｇ　）　１１７−１２３゜２０ 、ディー、バグディ（Ｄ、Ｂａｇｄｙ　）　、、イー、バラバス（Ｅ、Ｂａｒａ ｂａｓ　）　、エル、グラフ（Ｌ、Ｇｒａｆ）　、ティー。

イー、ビータ−、セン（Ｔ、　Ｅ、　Ｐｅｔｅｒｓｅｎ　）及びニス、マグヌソ ン（Ｓ、Ｈａａｎｕｓｓｏｎ　）　（１９７６）メリーズ　インエンブイモロジ ー　パート　ビー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ　ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｐａｒｔ　 ３　）　、第４５巻、６６９−６７８゜２１、　ビー、パルスマン（Ｐ、Ｗａｌ ｓｍａｎ　）　（１９８１）ファマツイ−（Ｐｈａｒｍａｚｉｅ　）　３６．８ ６０−８６１゜２２、　エッチ、アビブ（Ｈ，ＡＶｉＶ）及びビー、レダー（Ｐ 、Ｌｅｄｅｒ　）　（１９７２）プロシーデイングズ　オブザ　ナショナル　ア カデミ−オブ　サイエンスオブ　ニー、ニス、ニー、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　＞６９．１４０８−１４１２゜２３、　エム、ジャイエ（Ｈ，Ｊａｙｅ ）　、エッチ、デ　ラサーレ（１１，Ｄｅ　Ｌａ　５ａｌｌｅ　）　、エフ、ジ ャンパー（Ｆ。

Ｓｃｈａｍｂｅｒ）　、　ｘ　＋、バランド（Ａ、Ｂａ１ｌａｎｄ　）　、ブイ 。

コウリ（ｖ、にｏｈｌｉ）、ニー、フィンプリ（Ａ、Ｆｉｎｄｅｌｉ）、ビー、 トルストシェフ　（Ｐ、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ）及びジエイ。

１：’−、／Ｌｌ：Ｉ’／り（Ｊ、Ｐ、Ｌｅｃｏｃａ）　（１９８３）ヌクレイ ツク　アシツズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１１．２ ３２５−２３３５゜ ２４、　ジエイ、ダブリュ、シスタック（Ｊ、　Ｗ、　５ｚｏｓｔａｋ）、　エ イ、　７−１’、　スター１’　ＪＬ／ズ（Ｊ、　Ｔ、Ｓｔ、ｉ　Ｉｅｓ）　、 ビー、−グー。タイ（ａ、−に、　Ｔｙｅ　）　、ビー、チュウ（Ｐ、Ｃｈｉｕ ）　。

エフ、シｔ−？ン（Ｆ、　Ｓｈｅｒｍａｎ　）及びアール、ター（Ｒ，Ｗｕ）（ １９７９）メリーズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ）　、第６！３Ｌ巻、４１９−４２８゜ ２５、　ブー１’、コラＩＪ　（Ｖ、Ｋｏｈｌｉ　）　、ニー、　ハ５ンｔ’（ ＾、Ｂａ１ｌａｎｄ）、　エム、ウインゼリス（Ｈ，Ｗｉｎｔｚｅｒｉｔｈ）　 。

アール、サウエルバルト（Ｒ，Ｓａｕｅｒｗａｌｄ）、　ニー、　スタウブ（Ａ 、Ａｔａｕｂ　）及びジエイ、ビー、ルコツク（Ｊ、　Ｐ。

Ｌｅｃｏｃｑ）　（１９８２）ヌクレイツク　アシツズ　リサーチ（Ｎｕｃｌ、 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）且、７４３９−７４４８゜２６、　エフ、サンガー（ Ｆ、Ｓａｒ＋ｇｅｒ＞　、　ニス。ニツクレン（Ｓ、Ｎ１Ｃｋｌ［＋　）及びニ ー、アール、コールソン（Ａ。

Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ　）　（１９７７）プロシーディンゲス　オブザ　ナショナ ル　アカデミ−オブ　サイエンスオブ　ザ　ニー、ニス、　ニー、（Ｐｒｏｃ、 　Ｈａｔｌ、　ＡＣａｄ。

Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　）７４．５４６３−５４６７゜２７、　ビー、トマス（Ｐ、 Ｔｈｏｍａｓ）　（１９８０）ブｏ−７−デングズ　オブ　ザ　ナショｊｌし　 アカデミ−オブ　サイエンス　オブ　ザ　ニー、ニス、　ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａ口、　ＡＣａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　）　７７．５２０１−５２０５゜ ２８、　エッチ、カールカー（Ｈｌにａｌｃｋａｒ　）　（１９４７）ジャーナ ル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、Ｂ１０１．ＣＭｌ、　）　１６ ７　、４６１゜２９、　ジエイ、ケイン（Ｊ、Ｃａｅｎ）　、エム、ジエイ、ラ リーエ（１４，Ｊ、Ｌａｒｒｉｅｕ　）及びエム。サママ（Ｈ，Ｓａａ＋ａｍａ 　）（１９７５）レエモスターズ　メトド　デクスブロラシオン　エ　ディアグ ノステイク　ブラデイク（１，′Ｈｅ１ｏｓｔａｓｅ　、Ｈｅｔｈｏｄｅ　、ｄ 　’　ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ　ｅｔｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｐｒａｔｒｑｕｅ ）第２版、出版レクスバシオンシアンテイフイーク、パリ（ｔ　′Ｅｘｐａｎｓ ｉｏｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ、　Ｐａｒｉｓ　）３０、ジエイ、ビエイラ（ Ｊ、Ｖｉｅｉｒａ）及びジエイ、メツシン’ｊ　（Ｊ、Ｈｅ５ｓｉｎ＋；＋　） ジーン（Ｇｅｎｅ）１９，２５９−２６８゜ ３１゜　７−１’、　：ｌつ１，１　（Ｖ、Ｋｏｈｌｉ　）　、　ニー、ハラン ド（Ａ、Ｂａ１ｌａｎｄ）、エム、ウインゼリス（Ｈ，Ｗｉｎｔｚｅｒｉｔｈ） 　。

アール、サウエルバルド（Ｒ，Ｓａｕｅｒｗａｌｄ　）　、　ｘ　＋、スタウブ （Ａ、５ｔａｕｂ　）及びジエイ、ビー、ルコツク（Ｊ、Ｐ、ＬｅｃｏｃＱ）　 （１９８２）ヌクレイツク　アシツズ　リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒ ｅｓ、）工０，７４３９−７４４８゜ ３２、　７−ル、グランサン（Ｒ，Ｇｒａｎｔｈａｍ）　、シー、ゴーチェ（Ｃ ，Ｇａｕｔｈｉｅｒ）　、　エム、ゴウイ（＋、Ｇｏｕｙ）　、　イー。エム、 ジャコブソン（Ｅ、　Ｈ，Ｊａｃｏｂｚｏｎ　）及びアール。

マージ７　（Ｒ，Ｍｅｒｃｉｅｒ　）　（１９８１）ヌクレイツクアシツズ　リ サーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｉ？ｅｓ、）　９　、１４３−１７４゜ ３３、ｊ−＋’−，イケムラ（Ｔ、Ｉｋｅｍｕｒａ　）　（１９８１）ジャーナ ル　オブ　モレキュラー　バイオロジー（Ｊ。

Ｈｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、　）　１５１．３８９−４０９゜３４、　エフ、サンガ ー（Ｆ、５ａｎｏｅｒ）　、　ニー、　７−／Ｌ／。

コールソン（Ａ、Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ　）　、ビー、ジー、バレル（Ｂ、　Ｇ、 　Ｂａｒｒｅｌ　）　、ニー、ジエイ、エッチ、スミス（Ａ。

Ｊ、Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ　）及びビー、ニー、ロエ（Ｂ、Ａ、Ｒｏｅ　）ジャーナル 　オブ　モレキャラ−バイオロジー（Ｊ、Ｈｏｌ、Ｂｉｏｌ、　）　（１９８０ ）　１６１−１７８゜３５、　エッチ、シー、ビーンボイム（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎ ｂｏｉｍ）及びニス、ドリー（Ｓ、Ｄｏｌｙ）　（１９７９）ヌクレイツ３６、 　ニー、ラエムリ（Ｉｌ、　Ｌａｅｍ！　ｉ　）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ １９７０）２２７，６８０−６８５゜＋、Ｕζ　← ８石　２５５ Ｃ０Ｎ５ＴＲυＣＴｌ０Ｎ　ρ丁Ｇ９０９’６−　ＩＦＮ　ｌａｃ　Ｚ’ ３１圓５１億−− ＮｏεＩ ＦＮ ＰＴＧ９５１の１羨 ５ｔｌ ｂ）　ＡＩａ　Ｌｌｅ　ＣＹＩＩＶａｌ　Ｓ「Ｇｌｎ　Ａｌｓｓｔ　Ｉ ロ ”嘴。

Ｎｄｅ　ｌ　ＢａｍＨＩ ＥｃｏＲｌ　１０９　ｂｐ ＰＴＧ　７１７の ＢａｍＨｌ／Ｐｓｔ　ｌ １ｖＨ３ＴＧ７２４ ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ　Ｔａｑ　ｌ　Ａｈａ　Ｉｌｌ　Ｐｓｔ　Ｉ↑ Ｎｄｅ　Ｉ　Ｍ１３ＴＧ７２５ 圀４ 、）０　川 ・＋１＋ 国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮτＥＲＮＡＴＸＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰ ＯＲＴ　ＯＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）宿主細胞中にヒルジン又はヒルジン類縁体をクローニングさせ発現させる ためのベクターであつて、ヒルジン又はヒルジン類縁体をコードする遺伝子及び 該遺伝子を宿主細胞中に発現させるためのエレメントを含むことを特徴とするベ クター。 （２）コード化遺伝子がバクテリアのプロモーターによりプロモートされ且つ翻 訳開始をコードする領域が該バクテリアのプロモーターの上流側に位置している 請求の範囲第１項のベクター。 （３）Ｏバクテリアのプラスミドの複製開始領域、○バクテリオフアージλのプ ロモーターＰＬ、ＰＲ又はＰ′Ｒの全部分又は１部分からなるプロモーター及び ○ヒルジン遺伝子の５′末端の又は５′側において他の蛋白質と融合したヒルジ ン遺伝子の５′末端のＡＴＧを組込んだ翻訳開始のためのコード領域を含む請求 の範囲第２項のベクター。 （４）複製開始領域が、ｐＢＲ３２２の複製開始領域である請求の範囲第２項の ベクター。 （５）翻訳開始領域が、バクテリオフアージλ蛋白質ｃＩＩ（ＣＩＩｒｂｓとい う）の翻訳開始シーケンスの全て又は１部を含む請求の範囲第３項及び第４項の いずれかのべクター。 （６）翻訳開始領域が、下記シーケンスの全て又は１部を含む請求の範囲第２項 及び第４項のいずれかのべクタ（７）バクテリオフアージλのＮ遺伝子の全て又 は１部を更に含む請求の範囲第３項乃至第６項のいずれかのベクター。 （８）開始シーケンスに引続いて、ヒルジンをコードする遺伝子が、ｉｌｅコド ン及びｔｈｒコドンではじまる請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかのベクタ ー。 （９）ヒルジンをコードする遺伝子が下記のシーケンスではじまる請求の範囲第 ８項のベクター。 【配列があります】 【配列があります】 （１０）ヒルジン遺伝子のはじめに下記のシーケンスを含む請求の範囲第８項の ベクター。 【配列があります】 （１１）ヒルジン遺伝子のはじめに下記のシーケンスを含む請求の範囲第１０項 のベクター。 【配列があります】 （１２）べクターＰＴＧ７２０。 （１３）抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を更に含む請求の範囲第１項乃 至第１２項のいずれかのべクター（１４）ＡｍｐＲを含む請求の範囲第１３項の ベクター。 （１５）プラスミドｐＴＧ７１８又はＰＴＧ７１９である請求の範囲第１４項の ベクター。 （１６）ＡＴＧ開始コドンとルジン又はヒルジン類縁体をコードする第１のコド ンとの間に、他の蛋白質をコードするシーケンスが存在している請求の範囲第１ 項乃至第１５項のいずれかのベクター。 （１７）請求の範囲第１項乃至第１６項のいずれかのベクターにより形質転換さ れた細胞。 （１８）細胞が、バクテリアである請求の範囲第１８項の細胞。 （１３）細胞が、Ｅ．コリ菌株である請求の範囲第１８項の細胞。 （２０）請求の範囲第１７項乃至第１９項のいずれかに記載の形質変換された細 胞を培養し、生成されたヒルジン又はヒルジン類縁体を回収することを特徴とす るヒルジン又はヒルジン類縁体の製造方法。 （２１）培養生成物を酸性ｐＨ域で加熱し、次いでデカンテーションを行なって 上澄中のヒルジン又ばその類縁体を回収する請求の範囲第２０項の方法。 （２２）トロンビンを担持する樹脂にヒルジンを結合させ、次いでヒルジン拮抗 体（ｈｉｒｕｄｉｎ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）の結合後に樹脂を溶出処理する請 求の範囲第２０項及び第２１項のいずれかの方法。 （２３）請求の範囲第２０項乃至第２２項のいずれかの方法により得られたヒル ジン又はヒルジン類縁体。 （２４）化学的又は酵素的反応により修正されたヒルジン又はヒルジン類縁体。 （２５）下記のぺプチドのすべて又は一部を含むヒルジン：