JPH02501027A

JPH02501027A - 組換えｄｎａ法により生産されるヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターおよびその生産方法

Info

Publication number: JPH02501027A
Application number: JP62506869A
Authority: JP
Inventors: コウノ　タダヒコ; バンディオパドヒャイ，プラディプ; アイゼンバーグ，ステファン　ピー．; トンプソン，ロバート　シー．
Original assignee: シナージェン　バイオロジカルズ，インコーポレイティド
Priority date: 1986-10-30
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1990-04-12
Also published as: KR880701777A; WO1988003171A1; EP0329693A4; EP0329693A1; AU8172787A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換えＤＮＡ法により生産されるヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターおよびその生産方法１圀１１且本発明は、ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター（ＨＰＳＴＩ）およびその類似体の生産のための組換えＤＮＡ法、並びに微生物の組換え発現系を使った）ＩＰｓＴＩおよびその類似体の生産方法に関する。

膵臓は、デンプン分解性、脂肪分解性およびタンパク質分解性の酵素を含む、様々なタイプの酵素を分泌する器官である。膵臓により分泌されるタンパク質分解酵素は、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼといったエンドペプチダーゼおよび幾つかのエキソペプチダーゼを包含する。これらのタンパク質分解酵素は、ペプチド結合を消化する能力があり、従って膵臓それ自体を消化しかねないが、それらはチモーゲンとして知られる不活性な前駆体として生産される。それらチモーゲンから活性なタンパク質分解酵素への変換は、チモーゲン形態でのタンパク質置酵素の合成により、チモーゲン顆粒におけるそれらのパッケージングにより、およびプロテアーゼインヒビター、特に、少量のトリプシンがチモーゲンを活性化しないようにするトリプシンインヒビターの存在により、阻害される。

膵臓の成る病気の状態では、タンパク質分解酵素のチモーゲン形の活性化を許容し、これが膵臓の自己消化を生み、そして循環系の関連した炎症および損傷を生む。これらの病気状態は、急性もしくは慢性のアルコール乱用、胆管の病気、術後合併症または高脂血症を含む種々の要因により発生し得る。

これらの病気状態により生じる膵臓の自己消化を止めようとして、膵臓のタンパク質分解酵素の非調節的な活性化を停止できるであろう処置の方法が捜しめられてきた。この事について、ウシ膵臓トリプシンインヒビターを静脈内に用いてタンパク質分解酵素の活性化を調節する試みがなされている。しかしながら、この処置ははっきりと効果的でなく、そしてヒトの免疫系が時折このタンパク質を異物として認識することがあり、処置薬として使われているまさにその物質に対する免疫応答が生じる。

外来タンパク質の利用から起こる不利な免疫反応により生ずる問題を解決するために、ヒトのトリプシンインヒビター、特にＨＰＳＴＩ　、を処置薬として研究するということを仮定した。

この事について、）ＩＰＳＴ　Ｉは固定されており、そしてそのアミノ酸配列は、Ｂａｒｔｅｌｔ、　Ｄ、Ｃ，、らにより“ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターの一次構造、”　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

１７９　：　１８９−１９９（１９７７）および白木、Ｔ、らにより“ヒト膵臓分泌インヒビター（ＰＳＴＩ）　ｃＤＮＡの分子クローニングおよびヌクレオチド配列”、Ｂｉｏｃｈｅｇ＋、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１３２　：６０５−６１２　（１９８５）において記載されている。しかしながら、これらのＨＰＳＴＩの記載にもかかわらず、現在までＨＰＳＴＩはヒトの膵液および膵臓組繊からしか単離できなかった。従って、ＨＰＳＴ　Ｉは、処置薬としての効能を決定するためテストする使用目的に十分な量で入手することができなかった。

驚くべきことに、本発明者らは、ＨＰＳＴＩをコードするＤＮＡ配列を発見し、そしてこの配列を使った、微生物発現系中でＨＰＳＴＩを生産するための組換ＤＮＡ法を発見した。このようにして生産されるＨＰＳＴＩは、ヒトの膵液および膵臓組織から単離されるものと生物学的に等価である。さらに、本発明者らは、膵臓の自己消化を処置および予防することにおいて、並びにプロテアーゼによる組織の非調節的破壊に関係することが知られる他の病気の処置に有用であると思われる、ＨＰＳＴＩの類似体を発見した。

本発明のＨＰＳＴＩおよびその類似体は、本明細書中に記載の組換えＤＮＡ法により調製され、これらは膵臓組織の自己消化を生む病気の予防および処置への改良された研究を可能にするだけでな（、ウシ膵臓トリプシンインヒビターを利用する疑わしい効能の現存の処置方法に代わり、効能のある交替物として役立つであろう、従って、膵臓組織の自己消化に関係する病気のためのさらなる処置方法は、膵臓のタンパク質分解チモーゲンのトリプシンで触媒される活性化を阻害するためのＨＰＳＴＩまたはその類似体の利用を含むであろう。

主皿Ω亙立本発明は、ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター（ＨＰＳＴＩ）およびその類似体、それを生産するための組換えＤＮＡ法、並びにＨＰＳＴＩおよびその類似体の微生物的生産を指示することのできるポータプルＤＮＡ配列に関する。本発明はまた、これらのボータプルＤＮＡ配列を含むベクターシリーズにも関する。

本発明の目的は、組換えＤＮＡ法により生産されるヒト膵からの膵臓組織の保護において有用である医薬組成物の製造を可能にするのに十分な量および純度において生産され得る。

本発明のさらなる目的は、ＨＰＳＴＩの生産のための組換えＤＮＡ法を提供することである。この方法により生産される組換えＨＰＳＴＩは、ヒトの膵液および膵臓組織から単離できるＨＰＳＴＩ　と生物学的に等価であることが意図される。

本発明の別の目的は、ＨＰＳＴＩの類似体およびそれら類似体の生産のための組換えＤＮＡ法を提供することである。　ＨＰＳＴＩ類似体のうちの幾つかは、トリプシンを阻害することができ、従って膵臓のタンパク質分解チモーゲンの活性化および結果として生ずる膵臓の自己消化を防ぐことができるものである。

他のものは、他の組織の破壊に関与する種々のタンパク質分解酵素を阻害することができる。

ＨＰＳＴＩおよびその類似体の組換えＤＮＡ合成を容易にするために、これらのタンパク質の合成を指示することのできるポータプルＤＮＡ配列を提供することが本発明の更なる目的である。さらに、これらのボータプルＤＮＡ配列を含むクローニングベクターを提供することも本発明の目的である。これらのクローニングベクターは、医薬上有用な量のＨＰＳＴＩおよびその類似体を生産することができる。

本発明の更なる目的は、少なくとも１つの活性成分として、本発明のＨＰＳＴＩまたはＨＰＳＴＩ　１似体を含む、医薬上有用な調製物を提供することである。

本発明の付加的な目的および利点は、次に続く記載中に部分的に示されるか、または本発明の実施から学ぶかもしれない。目的および利点は、添付された請求の範囲の中に特に指摘された手段および組み合わせにより理解されそして達成され得る。

目的を達成するために、そして本発明の意図に従って、組換えＤＮＡ法により生産されるＨＰＳＴＩが示される。このＨＰＳＴＩは、膵液および膵臓組織から単離できる天然のＨＰＳＴＩ　と非常に類似している。さらにこのＨＰＳＴＩはヒトの膵液および膵臓組織から単離されるものと生物学的に等価である。

）ＩＰｓＴＩの類似体もまた示される。これら類似体の幾つかは、トリプシンを阻害する能力において、ヒトの膵臓組織および膵液から単離できるＨＰＳＴ　Ｉ　と生物学的に等価である。他の類似体は、トリプシン以外のタンパク質分解酵素を阻害し、種々の組織の破壊を防ぐことができるものである。これらの酵素は、例えば、気腫の原因となる役割に関係しているエラスターゼを包含する。これらの）ＩＰＳＴＩ類似体を生産するための組換えＤＮＡ法も記載される。

本発明の目的をさらに達成するために、そして本発明の意図に従って、本明細書中に例示されそして広く記載されるように、）ＩＰｓＴＩおよび開示された類似体をコードしているポータプルＤＮＡ配列が提供される。これらのポータプルＤＮＡ配列は、）ＩＰｓＴＩまたはその類似体のいずれかの生産を指示することのできるヌクレオチド配列を含んで成る。該ポータプルＤＮＡ配列は、合成的に製造された配列でも制限断片（以後“天然の”ＤＮＡ配列と称する）でもよい。合成りＮＡ配列は、連続的ポリヌクレオチド合成および当業者にとって既知の技術により調製され得る。

好ましい態様においては、）ＩＰｓＴＩをコードしているポータプルＤＮＡ配列は、ヒトの膵臓のｃＤＮＡライブラリーから単離され、そしてヒトの膵液および膵臓組織から単離できるものと生物学的に等価である）ＩＰｓＴＩの生産を指示することができる。総合的態様においては、発見された第一の好ましいＤＮＡ配列のコード鎖は次のヌクレオチド配列を有する：ＧＡＣＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＴＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＡＣＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧ　ＧＴＡ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＡＣＣＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＧＡＡ　ＴＧＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＡＣＣＧＴ　ＡＡＡ　ＣＧＴ　ＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＴＣＣ次のヌクレオチド配列を有する第二の好ましいＤＮＡ配列もまた発見さた：ＧＡＣＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＴＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＡＣＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＣＧ　ＧＴＣＴＧＣＧＧＴ　ＡＣＣＧＡＴ　ＧＧＴ　ＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＧＡＡ　ＴＧＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＡＣＣＧＴ　ＡＡＡ　ＣＧＴ　ＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＴＣＣ加えて、ＨＰＳＴＩ類似体を作製する本発明の方法において有用なポータプルＤＮＡ配列が記載される。本発明のこの態様の好ましいボークプルＤＮＡ配列は、上に示された配列の部位特異的突然変異誘発により作製され、そして１８番目の位置のリジンがアルギニン、メチオニン、バリン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンのいずれかに変えられている。

さらに、目的を達成するためにそして本発明の意図に従って、微生物細胞から、上記に言及したポータプルＤＮＡ配列を使って完全なＨＰＳＴＩまたはＩＩＰｓＴＩ類似体を生産する、組換えＤＮＡ法が開示される。−態様においては、この組換えＤＮＡ法は、（ａ）宿主微生物を、ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターまたはその類似体を生産するように指示することのできるポータプルＤＮＡ配列を調製し；（ｂ）宿主微生物中に移入できそして複製することのできるベクター中に前記ポータプルＤＮＡをクローニングし、ここでそのようなベクターは該ポータプルＤＮＡ配列のための作用要素を含んでおり；（Ｃ）前記ポータプルＤＮＡ配列および作用要素を含む前記ベクターを、ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター遺伝子を発現することのできる宿主微生物中に移入せしめ；（ｄ）前記バク。ターの増幅および前記インヒビターの発現に通する条件下で前記宿主微生物を培養し；そして（ｅ）活性形において前記インヒビターを収得する；ことを含んで成る。

また、本発明は、この組換えＤＮＡ法を使い、そしてさらに生じたインヒビターを１つまたは複数の医薬上許容される担体と組み合わせた、医薬上許容される組成物を製造するための方法を提供する。

目的をさらに達成するため、そして本発明の意図にさらに従って、上述のポータプルＤＮＡ配列の少なくとも１つを含んで成る発現ベクターのシリーズが提供される。特に、ベクターｐＳＧＥ　１およびｐＳＧＦ、　９が開示される。

上記の一般的説明と下記の詳細な説明は共に模範的および説明的なものに過ぎず、そして本発明の限定でないことは理解される。本明細書の中に組み込まれそして一部分を構成する添付図面は、本発明の２つの態様を図解しており、そして説明と共に、本発明の原理を解釈するのに役立つ。

皿皿五皿里星脱皿第１図は、プラスミドｐＳＧＥ　１の制限地図である。

第２図は、プラスミドｐｓＧＥ　９の制限地図である。

ましい能、のｉ　な舌゛■ 本発明の現在の好ましい態様に対する言及は、詳細にはなされないだろうが、これは、図面および下記の例と一緒に、本発明の原理を解釈するのに役立つであろう。

前述したように、本発明は、様々な微生物系中でヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター（ＨＰＳＴＩ）およびその類似体の微生物的生産を指示することのできる、ポータプルＤＮＡ配列に部分的に関連する。この文脈中の“ポータプルＤＮＡ配列”は、合成的に製造されたヌクレオチド配列か、または天然に存在するＤＮＡ配列の適当に改変された制限断片のいずれかについて言及するつもりである。

本明細書のための、“ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター”またはＨＰＳＴ　Ｉ″という用語は、Ｂａｒｔｅｌｔら、前掲により、および白木ら、前掲により、−次構造が確立されたタンパク質、または前に挙げた配列を含むデオキシリボ核酸中に存在するコドンにより定義されるタンパク質（これらタンパク質は、天然のＨＰＳＴＩと生物学的に等価であるように機能し、そして翻訳後修飾を含んでいても含まなくてもよい）、およびヒトの膵臓中に発見され得る同じ機能を有する他のいかなる類似のタンパク質を意味するつもりである。“ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター”または”ＨＰＳＴＩ”という用語は、さらに、微生物から排泄されるであろうタンパク質の形態または、それが排泄されなかった微生物中に存在するかもしれないメチオニル−インヒビターの形態のいずれかについて言及するつもりである。

さらに、本発明は、少な（とも１つの活性成分として、本発明のＨＰＳＴＩまたはＨＰＳＴＩ類似体を含む、医薬上許容される組成物を包含することを心に留めておかねばならない。この態様において、該組成物は、生理的食塩水、デンプンのような充填剤または結合剤、分解剤および香味剤から成る群から選択された１つまたは複数の化合物もまた含むことができる。

これらの医薬上許容される組成物は、錠剤、カプセル、シロップ、または筋肉内、腹腔内もしくは静脈内注射に適する溶液の形態であることができることが考えられる。

本発明の実施において、タンパク質配列中の幾つかのアミノ酸の変更が、クレームされるタンパク質の基本的性質に影響しない限りにおいて起こり得る。従って、全く同じアミノ酸配列の生産を指示することのできるもの及び所望の活性を有する類似のアミノ酸配列の生産を指示することのできるものの両方の別のポータプルＤＮＡ配列が、本発明の範囲内に含まれることもまた期待される。

これらの類似のアミノ酸配列のうちの幾つかは、実質的に天然のＨＰＳＴＩと相同であり、一方トリプシンインヒビターとして働くことができる他のアミノ酸配列は、天然のＨＰＳＴＩ　と実質的に相同性を示さないであろうことが考えられる。“実質的に相同”とは、本明細書で使用する場合、７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の天然のＨＰＳＴＩとの相同性の程度を意味する。本明組番中論じられる相同性の比率は、引例として本明細書中に特別に組み込まれる、Ｄａｙｈｏｆｆ、　Ｍ、０．によりＡｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅ　ｕｅｎｃｅ　１ｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５巻、第１２４頁（１９７２）中に示されたような整列を助けるために５０個のアミノ酸の長さ中に２つの空隙を導入され得る時、配列中同じアミノ酸残基を比較しながら整列した２つの配列のうちの小さい方の中に見つかるアミノ酸残基の比率として計算される。

■、ポー　プルＤＮＡ配置好ましい態様において、ポータプルＤＮＡ配列はＨＰＳＴＩの微生物的生産を指示することのできるものである。それらのＨＰＳＴＩは、ヒト膵液および膵臓組織から以前に単離されたものと生物学的に等価である。“生物学的に等価”とは、この用語が本明細書および請求の範囲において使われる時、本発明のポータプルＤＮＡ配列を使って生産されるインヒビターが、同じタイプのタンパク質分解酵素のチモーゲン前駆体のトリプシン活性化を阻害することができるが、天然のヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター、特にヒトの膵液および膵臓組織から単離できる）ＩＰｓＴＩ　と必ずしも同じ程度である必要はないことを意味する。

）ＩＰｓＴＩの生産を指示することのできる本発明の第一のポータプルＤＮＡ配列は、次のヌクレオチド配列を有する：ＧＡＣＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＴＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＡＣＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧ　ＧＴＡ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＡＣＣＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＧＡＡ　ＴＧＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＡＣＣＧＴ　ＡＡＡ　ＣＧＴ　ＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＴＧにこで、ヌクレオチドは下記に示される略語により表わされる。

デオキシアデニル酸　Ａデオキシグアニジル酸　Ｇデオキシシチジル酸　Ｃデオキシチミジル酸４ＴＨＰＳＴＩの生産を指示することのできる本発明の第二のポータプルＤＮＡは、次の配列を有する：ＧＡＣＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＴＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＡＣＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＣＧ　ＧＴＣＴＧＣＧＧＴ　ＡＣＣＧＡＴ　ＧＧＴ　ＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＧＡＡ　ＴＧＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＡＣＣＧＴ　ＡＡＡ　ＣＧＴ　ＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＴＣＣ上に示したように、本発明のポータプルＤＮＡ配列は、天然に存在するＤＮＡ源から単離されてもよく、または合成的に作製されてもよい。これらのポリヌクレオチド配列の合成的作製のための手段は、特に本明細書に含まれる教示を考慮すれば、−ＩＣ的に当業者に周知であると思われる。ポリヌクレオチド合成に関連する技術の現状の例は、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ＋　Ｍ、Ｄ。

およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｌ）１．、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１０３　：　３１８５（１９８１）並びにＢｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、Ｌ、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ＋　Ｍ、Ｈ，＋　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、競：　１８５９（１９８１）、特に引例として本明細書に組み込まれるものに向けられる。

本発明はまた、本明細書に開示されるＨＰＳＴＩ　“類似体”の微生物的生産を指示することのできるポータプルＤＮＡ配列にも関する。上に示したように、これらの類似体の幾つかは、１８番目の位置のリジンがアルギニン、メチオニン、バリン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンと置き換わっているアミノ酸配列を含む。これらの置換は、好ましくは、上記の好ましい配列中の５２位〜５４位のりジンコドンの代わりに、アルギニン、メチオニン、バリン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンのいずれかをコードするヌクレオチドの置換により達せられる。これらの置換に適当なヌクレオチドは、当業者において既知であり、特にＧｒａｎｔｈａｍ、　Ｒ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｉ：　ｒ４３（１９８１）のような文献を参照のこと。

コドン縮重のために、同じアミノ酸をコードする他のコドンを置換して同じ類似体を得ることができることにも注目すべきである。そのようなコドン置換は当業者の人々には容易に知られる。

る。ポータプルＤＮＡ配列の付加的コピーを単一ベクター中に含め、所望のＨＰＳＴＩまたはそれの類似体を大量に生産する宿主微生物の能力を増大させることができることが期待される。

該ポータプルＤＮＡ配列に加えて、本発明の範囲内のクローニングベクターは、該ポータプルＤＮＡ配列の上流または下流に追加のヌクレオチド配列を含むことができる。これらの追加のヌクレオチド配列は、ポータプルＤＮＡ配列の転写を妨害せず、そして下記に詳細に示すような幾つかの場合には、転写、翻訳、分泌を増強するか、または生じるインヒビターのポリペプチド鎖が活性な三次構造をとる能力を増強するものである。

Ａ、ベク　−ＳＧＥ　１好ましい本発明のベクターは、第１図に示されるものである。このベクターｐｓＧＥ　１は、ＨＰＳＴＩをコードするものとして上記に示された好ましいポータプルＤＮＡ配列を含有する。

プラスミドｐｓＧＥ　１は、ポリリンカー中のＥｃｏＲ１部位と５ａ４２１部位との間のＤＮＡが、ｂｌａ−ＨＰＳＴＩの遺伝子を含むシ遼Ｒ１−錘工Ｉ断片で置換されている、ｐＵＣ８の誘導体である。第１図中に示されるＡｍｐ’は、β −ラクタマーゼ遺伝子であり；　Ｐ　ＬＡｃは、　ｌａｃプロモーター、　ｌａｃオペレーターおよびβガラクトシダーゼの最初の６個のアミノ酸のためのコード配列を含むＤＮＡセグメントを示し；　ｂｌａ−）ＩＰｓＴＩは、βラクタマーゼリポソーム結合部位およびβラクタマーゼリーダーペプチド／ＨＰＳＴＩ融合タンパク質のためのコード配列を含むＤＮＡセグメントを示し；Ｒ１および５ａｉｌは、制限酵素ＥｃｏＲＩおよび５ａＬｌの認識部位を示し、ＯＲＩはＣｏ１ｔ　Ｅｌ複製開始点を示し；そして矢印は転写の方向を示す。

Ｂ、ベクターＳＧＥ　９第二の好ましいベクターｐｓＧＥ　９が第２図に示される。これは、ＥｃｏＲＩ部位とＰｓｌＩ部位との間のｐＫＫ２２３−３のポリリンカー中のＤＮＡを、ＯｍｐＡ　ＨＰＳＴＩ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ　Ｐｓｔ　Ｉ断片で置き換えることにより作製された。第２図において、Ａｍｐ’はβラクタマーゼ遺伝子を表わし；Ｐｔｍｃはｔａｃプロモーター、１ａｃオペレーターおよびβ−ガラクトシダーゼのシャイン／ダルガルノ配列のためのＤＮＡを含み；抛ｐＡ−ＨＰＳＴＩは、該遺伝子の上流の翻訳開始コドンに隣接する５２塩基対のＤ　Ｎ　Ａ　（ＯｍｐＡのシャイン／ダルガルノ配列を含む）およびＯｍｐＡリーダーペプチド／）ＩＰＳＴＩ融合タンパク質のコード配列を含むＤＮＡセグメントを示す。ＲＩ　、　ＰｓｔおよびＢａｍは、ＥｃｏＲＩ　、　Ｐｓｔ　ＩおよびＢａｍＨＩのための認識部位である。

Ｔｅｔ’は、テトラサイクリン耐性を付与するｐＢＲ３２２由来の遺伝子の一部分であり（従って、このベクターはテトラサイクリンに対する耐性を付与しない）；ｒｒｎＢは、転写ターミネータ−を含む６４１６位〜６８４０位の上−ｑ　ｒｒｎＢオペロンからのＤＮＡである。ＯｒｉはＣｏ１ＥＴ複製開始点を示す。

矢印は転写の方向を示す。

Ｃ０ましいベクターの、′ 本発明の成る態様は、本明細書中に記載のポータプルＤＮＡ配列の１つまたは複数を含むであろう既知のまたは現在未開発のベクターを使用することが予想される。特に、これらのベクターが次の特徴のうちの幾つかまたは全部を有することが好ましい：　（１）最少数の宿主−生物体配列を有する：（２）所望の宿主中で安定して維持されそして増殖される；（３）所望の宿主中で高いコピー数で存在することができる；（４）着目の遺伝子の転写を促進するように配置された制御可能なプロモーターを有する；　（５）ポータプルＤＮＡ配列が挿入されるであろう位置から離れた該プラスミドの位置に存在する、選択可能な特性をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を有する；および（６）転写を停止させることのできるＤＮＡ配列を有する。

様々な好ましい態様において、本発明のポータプルＤＮＡを含みそして発現することのできるそれらのクローニングベクターは、様々な作用要素を含む。本明細書中で論じる時、これらの“作用要素”は、少なくとも１つのオペレーター、少なくとも１つのシャイン−ダルカッ配列および開始コドン、並びに少なくとも１つの終止コドンを含む。好ましくは、これらの“作用要素”は、少なくとも１つのオペレーター、細胞内間隙から輸送されるべきタンパク質のための少な（とも１つのリーダー配列、少なくとも１つの調節タンパク質の遺伝子、並びにベクターＤＮＡの適当な転写および次なる翻訳にとって必要なまたは好ましい他のいかなるＤＮＡ配列をも含む。

これらの作用要素の幾つかは、本発明の好ましいベクターの各々に存在するかもしれない。所望するどんな付加的作用要素でも、当業者に既知の方法を使って、特に本明細書中の教示を考慮して、それらのベクターに加えることができる。

実際、該ベクターが容易に単離され、組み立てられ、そして置き換えられるような方法で各々の該ベクターを作製することが可能である。これは、該要素と）ＩＰｓＴＩまたはＨＰＳＴＩ類似体のコード領域との組合せから多数の機能的な遺伝子の組み立てを容易にする。さらに、多数の該要素が、１つより多い宿主中に適用できるであろう。ある好ましい態様においては、該ベクターは、レギュレーター（“オペレーター″）として機能することができるＤＮＡ配列、および調節タンパク質をコードすることのできる他のＤＮＡ配列を含むであろう。

１、　レギュレー　− これらのレギュレーターは、−態様において、成る周囲条件の存在下ではポータプルＤＮＡ配列の発現を妨げるように働（であろうし、他の周囲条件の存在下では、ポークブルＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の転写および次なる発現を許容するであろう、特に、該ポータプルＤＮＡ配列の発現が起こらないか、または非常に減少された程度で例えば、イソプロピル千オーＤ−ガラクトシドの非存在下で起こるように調節セグメントが該ベクター中に挿入されるのが好ましい、この状況においては、該ポータプルＤＮＡを含む形質転換された微生物が、ＨＰＳＴＩまたはＨＰＳＴＩ類似体の発現の開始前に所望の密度まで増殖される。この態様においては、所望のトリプシンインヒビターの発現は、所望の密度が達成された後に微生物環境への該ＤＮＡ配列の発現を引き起こすことのできる物質の添加により誘導される。

λ　プロモー　− 発現ベクターは、宿主生物体によりそれ自身のタンパク質の発現のために利用され得るプロモーターを含まなければならない。ラクトースプロモーター系が一般に利用される一方、他の微生物性プロモーターが単離されそして特徴づけられており、当業者が）ＩＰｓＴＩ遺伝子の発現に利用することができ°る。

３、−　−ミネー　− ここで期待されるターミネータ−は、ベクターを安定化させるために役立つものである。特に、引例として本明細書に特別に組み込まれる、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、およびＣｏｕｒｔ、　Ｄ、＋Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１３：　３１９−３５３（１９７９）により記載されたような配列は、本発明における利用が期待される。

土−匪皿駅望刀好ましい態様においては、コード配列の３′または５′端を再構成して遺伝子転写物への３′または５′非翻訳配列の組込みを可能にするのが望ましいことに注目する。これらの３′または５′非翻訳配列の中に包含されるのは、引例として本明細書中に特別に組み込まれるＳｃｈｍｅｉｓｓｎｅｒ＋　ｕ、ｌ　ＭｃＸｅｎｎｙ。

Ｋ、、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、およびＣｏｕｒｔ、　Ｄ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１７６　：３９−５３　（１９８４）により同定されたような、ｍＲＮＡを安定化する〔またはその翻訳を増強する〕ものである。

５．１ボソーム　人　亡外来タンパク質の微生物的発現は、リポソーム結合部位を含むがそれに限定されない幾つかの作用要素を特徴とする特定のそのような要素は、Ｇｏｌｄ＋　ｔｔ、Ｉ　ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ６Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

３５　：　５５７　５８０（１９８３）　；　Ｍａｒｑｕｉｓ、　Ｄ、Ｍ、、ら、　Ｇｅｎｅ　４２　：　１７５−１８３　（１９８６）　（引例として本明細書中に特別に組み込まれる）中に示されるような、タンパク質合成の開始においてリポソームが認識しそして結合する配列である。

本明細書中で論じられる作用要素は、本明細書中に含まれる先行文献および教示を考慮して、当業者の人々により慣例的に選択され得る。これらの作用要素の一般例は、Ｂ　、　Ｌｅｗ　ｉ　ｎ　＋Ｇｅｎｅｓ、　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）中に記載されており、これは引例として本明細書中に特別に組み込まれる。適当な作用要素の種々の例は、上記したベクター上に発見することができ、そして前記のベクターの基本的特徴を論じている刊行物のレビューを通して明らかにされるであろう。

６、　リー゛−配Ｉおよび云　力・・ブー−加えて、適当な分泌リーダー（シグナル）配列をコードするＤＮＡがポータプルＤＮＡ配列の５′端に存在するのが好ましい。リーダー配列のためのＤＮＡは、該リーダー配列がすぐ隣りにありそして該インヒビターと共有結合的に連結されている融合タンパク質の生産を可能にする位置に存在しなければならず、即ち、２つのＤＮＡコード配列の間に転写または翻訳終止シグナルが全（あってはならない。該リーダー配列の存在は、次の理由の１つまたは複数のために一部分で所望される。第一に、リーダー配列の存在は、成熟ＨＰＳＴＩまたはＨＰＳＴＩ　ｌ似体への最初の生成物の宿主プロセシングを促進することができる。特に、該リーダー配列は、該リーダー配列を除去するためのリーダーペプチダーゼによる最初の翻訳生成物の開裂を指示し、そしてＨＰＳＴＩ活性の可能性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを残すことができる。

第二に、該リーダー配列の存在は、細胞形質の外にＨＰＳＴＩまたは）ＩＰＳＴＩ類似体を指し向けることにより、ＨＰＳＴＩまたはＨＰＳＴＩ類似体の精製を容易にする。ある種の宿主微生物においては、あるＥ、コリの場合のように、細胞周辺腔への完全なタンパク質の輸送を可能にするであろう。あるＥ、コリ、サツカロミセス、バシラスおよびシュードモナス菌株の場合には、適当なリーダー配列が、細胞膜を通りそして細胞外の媒質中へのタンパク質の輸送を可能にするであろう。この状況においては、該、タンパク質は細胞外タンパク質から精製できる。第三に、本発明により調製されるＨＰＳＴＩまたはＨＰＳＴＩ類似体の幾つかの場合には、完全なタンパク質を活性な構造をとるように折りたたむことのできる環境に置くためにリーダー配列が必要であるかもしれない、この構造は適当な阻害活性を有する。

７．８　−ミネー　− ここで期待される翻訳ターミネータ−は、ｍＲＮＡの翻訳を停止させるために働く。それらは天然の、Ｋｏｈｌｉ＋　Ｊ、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、１８２　：　４３０−４３９（１９８１）に記載のものか、または合成された、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｆ、、Ｇｅｎｅ　２４　：　１５− ２’？（１９８３）に記載のもののどちらでもよい。この２つの文献はともに引例として本明細書中に組み込まれる。

８、゛　口　なマーカーさらに、クローニングベクターは選択可能なマーカー、例えば薬剤耐性マーカーまたは、宿主微生物により選択可能な特性の発現を引き起こす他のマーカーを含むのが好ましい。

本発明の特に好ましい態様においては、アンピシリン耐性遺伝子がベクターｐＳＧＥ　１およびｐＳＧＥ　９中に含まれる。他のプラスミド中には、テトラサイタリン耐性遺伝子またはクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれる。

そのような薬剤耐性または他の選択可能なマーカーは、形質転換体の選択を容易にするためのものである。加えて、クローニングベクター上の選択可能なマーカーの存在は、培地中での増幅で微生物を汚染しないように使用され得る。この態様においては、生き残りのために誘導された表現型を要求する条件下で微生物を培養することにより、形質転換された宿主微生物の純粋な培養物が得られるであろう。

Ｄ　ベタ　−の　）で上述したクローニングベクターの全ての必要な且つ所望の成分の部分の合成および／または単離の際に、当業者に一般的に知られた方法により、ベクターが組み立てられる。そのようなベクターの組み立ては、当業者により行われる職務および仕事の範囲内であると思われ、そしてそれなりに、過度な経験なしで実施できる。例えば、同様なりＮＡ配列が、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｎｕａｌ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ、Ｙ、（１９８２）（これは引例として本明細書中に特別に組み込まれる）に示されたようにして、適当なベクター中に連結されている。

呈−盲目生立体本明細書中に開示されるベクターおよび方法は、原核および真核生物の広範囲にわたる宿主細胞における利用に適する。

該Ｄ　Ｎ　Ａ配列のクローニングおよび該遺伝子の発現には原核生物が好ましい。Ｅ、コリ株ＪＭ　１０５　、　ＪＭ　１０７およびＪＭ　１０９（ファルマシアから入手可能）、並びにバシラス菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、シュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびクロストリジウム菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種を、該遺伝子の発現に使用することができる。原核生物に加えて、真核性微生物、例えばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａ匹田敬ｙ亜皿社■憇）ヲ該遺伝子の発現に使用することもできる。

一般に、宿主細胞に適合する種から由来する作用要素を含むプラスミドベクターが使用される。例えば、Ｅ、コリは、典型的にはＥ、コリ由来のプラスミドｐＢＲ３２２を使って形質転換される。下の第１表は、宿主生物体および適合性ベクターの一覧表を示す。

次の、非包括的な、Ｅ、コリおよび他の生物体のためのクローニングベクターおよび作用要素のリストは、上記の基準に合うように容易に変更でき従って本発明における利用に好ましい、ベクターを示すと思われる。そのような変更は、利用可能な文献および本明細書中の教えを考慮すれば、当業者により容易に行われ得る。

１、Ｂａｃｋｍａｎ、　Ｋ、、　Ｐｔａｓｈｎｅ、　Ｍ、およびＧ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７３　、４１７４−４１７８（１９７６）。

２、ｄｅ　Ｂｏｅｒ、　）１．Ａ、、　Ｃｏｍ５ｔｏｃｋ、　Ｌ、Ｊ、、およびＶａｓｓｅｒ、　Ｍ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０　、２ｌ−２５（１９８３）。

３、Ｓｈｉｍａｔａｋｅ、　Ｈ，およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、　Ｎａｔｕｒｅ　２９２＋　１２８−１３２（１９８１）。

４、Ｄｅｒｏｍ、　Ｃ，、Ｇｈｅｙｓｅｎ、　Ｄ、およびＦｉｅｒｓ、　Ｗ、　Ｇｅｎｅ　１７　＋　４５−５４　（１９８２）　。

５、Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ、　Ｒ，Ａ、およびＥｍｔａｇｅ、　Ｓ、　Ｇｅｎｅ　９　、２７−４７（１９８０）。

６、Ｂｒｏｓｉｕｓ、　Ｊ、、　Ｄｕｌｌ、　Ｔ、Ｊ、、　５１ｅｅｔｅｒ＋　Ｄ、Ｄ、およびＮｏｌ　ｌｅｒ。

）１．Ｆ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１４８．　１０７　１２７（１９８１）。

７、Ｎｏｒｍａｎｌｙ、　Ｊ、＋　Ｏｇｄｅｎ、　Ｒ，ｃ、ｌ　Ｈｏｒｖａｔｈ＋　Ｓ、Ｊ、およびＡｂｅｌｓｏｎ、　Ｊ、　Ｎａｔｕｒｅ　３２１　、　２１３−２１９（１９８６）。

８、Ｂｅ１ａｓｃｏ、　Ｊ、Ｇ、、　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、　Ｇ、、　Ｖｏｎ　Ｇａｂａｉｎ、　Ａ、およびＣｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、　Ｃｅｌ　４６．　２４５−２５Ｈ１９８６）。

９＋５ｃｈｎ＋ｅｉｓｓｎｅｒ、　ｕ、ｌ　ＭｃＫｅｎｎｅｙ、　Ｋ、、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｍ、およびＣｏｕｒｔ、　Ｄ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１７６　、３９−５３（１９８４）。

１０、　Ｍｏｔｔ、　Ｊ、Ｅ、、Ｇａｌｌｏｗａｙ、　Ｊ、Ｌ、およびＰｌａｔｔ、　Ｔ、　ＥＭＢＯＪ。

土、　１８８７−１８９１　（１９８５）　。

１１、　Ｋｏｓｈｌａｎｄ、　Ｄ、およびＢｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、　Ｃｅ１１２０．　７４９　７６０（１９８０）　。

１２、　Ｍｏｖｖａ、　Ｎ、Ｒ，＋　Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｋ、およびＩｎｏｕｙｅ、　Ｍ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、１４３．　３１７−３２８（１９８０）。

１３、５ｕｒｉｎ、　Ｂ、Ｐ、、　Ｊａｎｓ、　Ｄ、Ａ、Ｆｉｍｍｅｌ、　Ａ、Ｌ、、　Ｓｈａｗ、　ｏ、ｃ、１Ｃｏｘ、　Ｇ、Ｂ、およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｈ，Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５７　。

７７２−７７８　（１９８４）。

１４、５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　Ｊ、Ｇ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ７５゜３７３７−３７４１（１９７８）。

１５、　Ｐｅｄｅｎ、　Ｋ、Ｗ、Ｃ，Ｇｅｎｅ　２２．　２７７　２８０（１９８３）。

１６、　Ａｌｔｏｎ、　Ｎ、に、およびＶａｐｎｅｋ、　Ｄ、　Ｎａｔｕｒｅ　２８２　、　８６４−８６９（１９７９）　。

１７、　Ｙａｎｇ＋　Ｍ、＊　Ｇａ１ｉｚｚｉ、　Ａ、、およびＨｅｎｎｅｒ、　Ｄ、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、月ｆｉ、２３７−２４８（１９８３）。

１Ｂ、　Ｗｏｎｇ、　Ｓ、−Ｌ、＋　Ｐｒ１ｃｅ、　Ｃ，Ｗ、、　Ｇｏｌｄｆａｒｂ、　Ｄ、Ｓ、、およびＤｏｉ、　Ｒ，Ｈ，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８１　、１１８４−１１８８（１９８４）。

１９、　Ｗａｎｇ、　Ｐ、−Ｚ、＋　およびＤｏｉ、　Ｒ，Ｈ，Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５９゜８６１９−８６２５　、　（１９８４）。

２（Ｌ　Ｌｉｎ、　Ｃ，Ｋ、、　Ｑｕｉｎｎ、　Ｌ、Ａ、　Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ、　Ｒ，Ｌ、　Ｊ、　ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ、　５ｕｐｐ１．　（９Ｂ）　、　ｐ、１９８（１９８５）。

２１、　Ｖａｓａｎｔｈａ、　Ｎ−、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｌ、Ｄ、、　Ｒｈｏｄｅｓ、　Ｃ，、Ｂａｎｎｅｒ。

Ｃ，、Ｎａｇｌｅ、　Ｊ、＋およびＦｉｌｐｕｌａ、　Ｄ、Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１５９（３）　。

８１１−８１９（１９８４）。

２２、　Ｐａ１ｖａ、　ｔ、Ｉ　５ａｒｖａｓ、　Ｍ、、　Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ、　Ｐ、、　５ｉｂａｚｋｏｖ。

ＭｌおよびＫａａｒｉａｉｎｅｎ、　Ｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ困、　５５８２−５５８６　（１９８２）。

２３、　Ｗｏｎｇ、　Ｓ、−Ｌ、、　Ｐｒ１ｃｅｅ＋　Ｃ，Ｗ、、　Ｇｏｌｄｆａｒｂ、　Ｄ、Ｓ、、およびＤｏｉ、　Ｒ，Ｈ−Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　＋　１１８４−１１８８（１９８４）。

２４．５ｕ１１ｉｖａｎ、　Ｍ、Ａ、ｌ　Ｙａｓｂｉｎ＋　Ｒ，Ｅ−１およびＹｏｕｎｇ、　Ｆ、Ｅ。

Ｇｅｎｅ　２９　、２１　４６（１９８４）。

２５、　Ｖａｓａｎｔｈａ、Ｎ、、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｌ、Ｄ、、Ｒｈｏｄｅｓ、　Ｃ，、Ｂａｎｎｅｒ。

ｃ、、　Ｎａｇｌｅ、　Ｊ、＋およびＦｉｌｐｕｌａ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１５９（３）　。

８１１−８１９（１９８４）。

２６、　Ｙａｎｓｕｒａ、　Ｄ、Ｇ、およびＨｅｎｎｅｒ、　Ｄ、Ｊ、　ＰＮＡＳ　８１　、　４３９−４４３（１９８４）。

２７、Ｇｒａｙ、Ｇ、Ｌ、、ＭｃＫｅｏｗｎ＋　Ｋ、Ａ、、Ｊｏｎｅｓ、Ａ、Ｊ、Ｓ、＋　Ｓｅｅｂｕｒｇ。

Ｐ、Ｈ，およびＨｅｙｎｅｋｅｒ、　Ｈ，Ｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋　１６１−１６５（１９８４）。

２８、　Ｌｏｒｙ、　Ｓ、、およびＴａｉ、　Ｐ、Ｃ，Ｇｅｎｅ　２２　、９５　１０１（１９８３）。

２９、　Ｌｉｕ、　Ｐ、Ｖ、　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１３０（ｓｕｐｐｌ）、　５９４−５９９（１９７４）。

３０、　Ｗｏｏｄ、　Ｄ、Ｇ、、　Ｈｏｌｌｆｎｇｅｒ、　Ｍ、Ｆ、、およびＴｉｎｄｏｌ、　Ｍ、Ｂ、　Ｊ。

Ｂａｃｔ、１４５．１４４８　１４５Ｈ１９８１）。

３１、　Ｓｔ、　Ｊｏｈｎ、　Ｔ、Ｐ、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５ム２８５−３１５　（１９８１）　、。

３２、　Ｈｏｐｐｅｒ、　Ｊ、Ｅ、およびＲｏｗｅ、　Ｌ、Ｂ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋、　２５３＋７５６６−７５６９（１９７８）。

３３、　Ｄｅｎｉｓ＋　Ｃ，Ｌ、、　Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、　Ｊ、およびＹｏｕｎｇ＋　Ｅ、Ｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２５８　、１１６５　１１７Ｈ１９８３）。

３４、　ＬｕｔｓｄｏｒＬ　Ｌ−およびＭｅｇｎｅｔ、　Ｒ，Ａｒｃｈｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｌ慣、９９３−９４４（１９６８）。

３５、　Ｍｅｙｈａｃｋ、　Ｂ、＊　Ｂａｊｔｎａ＋　Ｎ、ｌ　Ｒｕｄｏｌｐｈ、　Ｈ，および旧りｎｅｎ＋へ、　ＥＭＢＯ，Ｊ、６　、　６７５−６８０（１９８２）。

３６、　Ｗａｔｓｏｎ、Ｍ、Ｅ、Ｅ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１２Ｌ＋　５１３５−５１６４（１９８４）。

３７、　Ｇｅｒｂａｎｄ、　ｃ、およびＧｕｅｒｉｎｅａｕ、　Ｍ＋Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、上。

２１９−２２８　（１９８０）。

３Ｂ、　Ｈｔｎｎｅｎ＋　Ａ、、　Ｈｉｃｋｓ、　Ｊ、Ｂ、およびＦｉｎｋ、　Ｇ、Ｒ，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５　、１９２９　１９３３（１９７８）。

３９、　Ｊａｂｂａｒ、　Ｍ、Ａ、＊　Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、　Ｎ、およびＮａｙａｋ、　Ｄ、Ｐ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２　、２０１９　２０２３（１９８５）。

下記の実施例では、ラクトースプロモーター系またはｔａｃプロモーター系、およびβ−ラクタマーゼまたはｏｍｐＡシグナル配列を使うＥ、コリを使用する。

しかしながら、類似の技術により、他の原核性または真核性宿主微生物からＨＰＳＴＩを発現しそして分泌する発現ベクターを作製することは、当業者の能力の十分範囲内であろう。

上記に同定された特性を有し、従って本発明における利用に適する付加的なベクターが現存するかもしれないしまたは開発されるだろうことを理解すべきである。これらのベクターもまた、開示されるクローニングベクターのシリーズの範囲内であるものとして期待され、そのベクター中に必要な作用要素と共にポータプルＤＮＡ配列を導入でき、改変されたベクターは本発明の範囲内に含まれ、そして下記により詳細に示される組換え、ＤＮＡ法において使用され得るだろう。

本発明は、ＨＰＳＴＩおよびＨＰＳＴＩ類似体の生産のための組換えＤＮＡ法にも関する。一般的に、この方法は次の工程を含む：（ａ）トリプシン阻害活性を有するタンパク質を生産するように宿主微生物を指示することのできるポータプルＤＮＡ配列を調製し；（ｂ）該ポータプルＤＮＡ配列を、宿主微生物を形質転換できそしてその中で複製できるベクター中にクローニングし、ここでそのようなベクターは該ポータプルＤＮＡ配列のための作用要素を含んでおり；（Ｃ）　８ｇポータプルＤＮＡおよび作用要素を含むベクターを、ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターまたはその類似体を発現し得る宿主微生物中に導入し；（ｄ）該ベクターの増幅および該ベクターの発現に適する条件下で該宿主微生物を培養し；そして（ｅ）活性形において該インヒビターを収得する。

この方法において、ポータプルＤＮＡ配列は、セクションＩにおいて記載した合成のまたは天然に存在するポリヌクレオチドである。本発明の好ましい態様においては、セクションＩに特定的に示された２つのポータプルＤＮＡ配列を使用する。

末法において有用であるとして期待されるベクターは、セクション■において上述したものである。好ましい態様においては、Ｅ、コリ発現ベクターｐＳＧＥ　１およびｐＳＧＥ　９を、開示された方法に使用する。

このようにして得られたベクターは、適当な宿主微生物中に導入される。外来ＤＮＡを取り込みそしてそれら遺伝子および付随の作用要素を発現する能力を有するいずれの微生物でも選択できると思わ、。る、宿主微生物が嫌気性菌、通性嫌気性菌または好気性菌であるのが好ましい。この方法における利用に好ましいであろう特定の宿主は、酵母およびバクテリアを包含する。特定の酵母としては、サツカロミセス属、特にサツカロミセス・セレビシェ−（り且■ｇμ狙ｃｅｒｅｖ　ｉ　−紅憇）を含み、一方特定のバクテリアは、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属を含む。種々の他の好ましい宿主およびベクターは前掲の第１表に示されている。

もし、組換えＨＰＳＴＩまたはＨＰＳＴＩ類似体が最終的にＥ、コリ以外の生物体中で発現されることを期待するならば、クローニングベクターをまずエシェリキア・コリ中に導入し、そこで該ベクターの複製を可能にし、そしてそこから該ベクターを増幅後に得そして精製する。次いで該ベクターを、該インヒビターの最終的発現のために酵母または他の生物体に導入する。

宿主微生物を選択した後、当業者に一般的に知られた方法を使って宿主微生物中にベクターが導入される。そのような方法の例は、Ｒ，Ｗ、ＤａｖｉｓらによるＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅ−ｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）中に見つけることができ、これは引例として本明細書中に特別に組み込まれる。

該ＤＮＡの発現の制御のために必要などんな条件でも、該ベクター中に挿入されるかまたは存在するいずれかの作用要素に依存して、形質転換および培養の段階で発効されるだろう。−態様においては、該Ｄ　ＴｈＴ　Ａ配列の発現を抑制する適当な調節条件の存在下において細胞を高密度まで増殖させる。

最適な細胞密度に近づいた時、周囲条件をポータプルＤＮＡ配列の発現に適するものに変更する。かくして、ＨＰＳＴＩまたはＨＰＳＴＩ類似体の生産が最適密度近くへの宿主細胞の増殖に続く時間中に起こるだろうこと、および発現に必要な調節条件が誘導された後の成る時点で生じたインヒビターが収得されるだろうことが期待される。

宿主微生物は、ＨＰＳＴＩおよびＨＰＳＴＩ類似体の発現に適する条件下で培養される。それらの条件は、一般に宿主生物体に特異的であり、そしてそのような生物体のための増殖条件に関する公表された文献、例えばＢｅｒ　ｅ　’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒ−＋ｅｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ１ｏ■ 、第８版、Ｗｉｌｌｉａａｍｓ　＆　ＷｉｌｋｉｎｓＣｏ＋ｅｐａｎｙ、　Ｂａ１ｔｉ＋ａｏｒｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　（これは引例として特別に本明細書中に組みこまれる）を考慮すれば、当業者により容易に決定される。

成る状況下では、ＨＰＳＴＩおよびＨＰＳＴＩ類似体は、宿主微生物中での発現および細胞壁もしくは細胞膜を通るかまたは細胞周辺腔中へのタンパク質の輸送の際に、正しい活性な構造をとるであろう０組換えタンパク質をコードするＤＮＡに適当なリーダー配列が連結されているならば、これが一般的に起こるであろう０本発明の好ましい肝ＳＴＩおよびＨＰＳＴＩ類似体は、例１に示されるようなシグナルペプチドがクローニングベクター中に組み込まれる場合、内側の細胞膜から外への移動の際に成熟した活性な形態をとるであろう。さらに、多数の他のシグナルペプチドの構造が発表されており、例えばＭａｒｉｏｎ　Ｅ、ＥＪａｔｓｏｎによりＮｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２　：　５１４５−５１６４（１９８４）中に発表されており、これは引例として本明細書中に特別に組み込まれる。これらのリーダー配列は、ボータプルＤＮＡと共に、細胞膜を通って輸送されそして細胞からの放出時に該リーダー配列部分が開裂されるであろう融合タンパク質の細胞内生産を指示するためのものである。

好ましい態様においては、β−ラクタマーゼタンパク質のシグナルペプチドがリーダー配列として使用され、そしてインヒビター構造をコードするポータプルＤＮＡ配列と隣接する位置に置かれる。加えて好ましいリーダー配列は、Ｅ、コリＯｍｐＡタンパク質のものおよびカルボキシペプチターゼＧ２のものを包含する。これらおよび他のリーダー配列は上記に記載されている。

特別の問題または状況への本発明の教示の適用は、本明細書に含まれる教示を考慮すれば、当業者の能力の範囲内であろうことを理解すべきである。本発明の生成物の例並びに代表するそれらの単離および生産方法は、次の実施例中に示さヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター（以後“ＨＰＳＴＩ”と称する）のアミノ酸配列は、Ｂａｒｔｅｌｔ、　Ｄ、Ｃ０ら、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、１７９　：　１８９　１９９（１９７７）およびＹａｍａｍｏｔｏ、　Ｔ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ５．１３１　：　６０５−６１２（１９８５）　により発表されており、この両方とも引例として本明細書中に組み込まれる。本発明者らは、Ｂａｒｔｅｌｔらの、この細菌により利用される標準的遺伝子コード並びに適当な発現および制御要素の配列を部分的に使って、Ｅ、コリにこのタンパク質を生産するように指示する遺伝子を発見した。実際には、Ｅ。

コリ中で高度に発現されるタンパク質において使われているものに相当しそして遺伝子の作製のために便利な制限部位を提供する、限定されたコドンのサブセットを使った。

成熟ＨＰＳＴＩをコードする選択されたＤＮＡ配列の上流の列は次のものである。

ＧＡＣＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＴＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＡＣＧＧＴＴＧＣＡＣＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧ　ＧＴＡ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＡＣＣＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＣＧ　ＡＡＣＧＡＡ　ＴＧＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＡＣＣＧＴ　ＡＡＡ　ＣＧＴ　ＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＴＧＣ翻訳を終結させるために、該ＤＮＡの終わりにＴＡＡコドンを加えた。該ＤＮＡのクローニングを容易にするために、ＴＡＡＯ後に５ａｌ１１部位を付加した。

翻訳を開始させるために、そして該タンパク質をＥ、コリの細胞周辺腔へ輸送することのできるアミノ酸配列を提供するために、次のＤＮＡ配列を付加した。

翻訳の開始ＡＡＴＴＣＡＧＡＴ　ＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡ　ＧＴＡＴＧＡＧＴＡＴ　ＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣ構造が上記のものであるＤＮＡは、製造業者の推薦に従ってＡＢＩ　３８０Ａ　ＤＮＡ合成機において調製された次のオリゴヌクレオチドから合成された。

１、ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴ２、ＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴ３、ＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＴ４、　ＣＴＧＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＧＴＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡ５、　ＣＴＧＡＡＣＧＧＴＴＧＣＡＣＴＡＡＡＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧ６、　ＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧ７、　ＣＧＣＡＡ八八ＡＡへへＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴ８、ＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣ９、ＧＴＡＧＣＡＣＴＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＧＴＣｌｏ、　ＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴｌｌ、ＧＡＴＣＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＧＴＧＡＣ１２、ＡＣＣＴＡＣＣＣＧＡＡＣＧＡＡＴＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＧＡＡ１３、　八ＡＣＣＧＴＡＡＡＣＧＴＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴ１４、ＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＡＣＣＧＧ１５、　ＡＣＧＧＴＴＴＴＣＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣＧＣＡＴＴＣＧＴＴＣＧＧ１６、　ＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＡＣＧＴＴＴ１７、ＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧＣＴＡＡＧ１８、ＴＣＧＡＣＴＴＡＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧオリゴヌクレオチドは、ゲル電気泳動により精製され、そして使用前に５′−リン酸化された。

次のオリゴヌクレオチドをベアで組み合わせ、湯浴中９０°Ｃに加熱し、そしてゆっくり冷却させた：１と６；２と７；３と８：４と９；５と１０゜これらのベアを一緒にした後、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断されたＭ１３　ｍｐ１８またはｍｐ１９を添加し、そしてこれらの物質をＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　−Ａ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）（これは引例として本明細書に特別に組み込まれる）に従って連結せしめた。生じた混合物を用いてＥ、コリＪＭ　１０５を形質転換し、そして着目のＤＮＡを含むプラークを、構成において使ったラベル化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする能力により選択した。

ａ遼Ｒ１部位と４狸ＩＩ部位との間のＤＮＡの配列を、Ｓａｎｇｅｒ＋ＦらによりＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉｅｎｃｅ　７４　：　５４６３−６７（１９７７）（これは引例として本明細書中に特別に組み込まれる）中に記載されたような“ジデオキシ”配列決定プロトコールにより決定した。ＤＮＡを標準手順に従って細胞から調製し、そしてＥｃｏＲＩおよび町狙ＩＩ制限エンドヌクレアーゼで切断した。

１５２塩基対のＤＮＡ断片を電気泳動により消化物から精製した。この配列を“ フラグメント１″と称する。

次のオリゴヌクレオチドをペアで組み合わせ、湯浴中で９０″Ｃに加熱し、そしてゆっくりと冷却させた＝１１と１４　；　１２と１５　；　１３と１６　；　１７と１８゜これらのペアを一緒にした後、ＢａｍＨＩおよび５ａｉＩで切断されたＭ１３　ｍｐ１８またはＭ１３　ｍｐ１９を添加し、そしてこれらの材料を、前述したように、Ｍａｎｉａ−ｔｉｓにより報告された標準法に従って連結した。生じた混合物を用いてＥ、コリＪＭ　１０５を形質転換せしめ、そして着目のＤＮＡを含むプラークを、前述の“ジデオキシ”配列決定プロトコールにより決定した。標準手順に従って該ＤＮＡを細胞から調製し、そして５ａｉＩおよび膓胆■制限エンドヌクレアーゼで切断した。１０９塩基対のＤＮＡ断片をゲル電気泳動により消化物から精製した。以後°“フラグメント２″と称するこの断片は、町＋ａｌｌおよびＳａｉ■粘着末端により結合される。

フラグメント１およびフラグメント２を、ＥｃｏＲＩおよび５ａｆｌで切断されたＭ１３　ｍｐ１８またはＭ１３　ｍｐ１９のＤＮＡと混合し、そして標準プロトコールに従って連結せしめた。該ＤＮＡを用いてＥ、コリＪＭ　１０５を形質転換せしめ、構成において使われた選択されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプラークからＤＮＡを単離した。このＤＮＡをＥｃｏＲＩおよび力匹■ で切断し、そしてＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで切断されたｐｔｌｃ８と連結せしめた。生じたＤＮＡを用いてＥ、コリＪＭ１０５を形質転換せしめた。

アンピシリン耐性コロニーを、イソプロピルチオガラクトシドの存在下で増殖させた時にＨＰＳＴＩに対するウサギ抗体と交差反応する物質の生産について調べた。幾つかのそのようなコロニーを拡大せしめ、そして制限部位分析によりプラスミド構造を確かめた。１つのプラスミド構造を制限部位分析により確かめた。

正しい構造を有するプラスミドをｐＳＧＥ　１と命名し、そしてＥｌ、コリ株ＪＭ　１０５／ｐｓＧＥ１　（後に５ＧＥ３と称される）をさらなる試験のために選択した。

選択されたクローンを、ｄ当り５０鱈のアンピシリンを含むＬＢ培地中で増殖し；　０．２　Ａ６００／滅の時に０．２ｍＨのＩＰＴＧを添加し、そして０．７　Ａ６００／ｄまで増殖を続行した。５０ｍ１！の培養ブロスを遠心し、そして細胞ペレットを、２０％ショ糖を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ　、　ｐＨ７，５中で洗浄した。洗浄した細胞を同溶液中・に再懸濁し、そして２０ｍＭ　ＥＤＴＡ中０．５ｍｇ／ｄのリゾチームでＯ″Ｃにて５分間処理した。該溶液を再び１０、０００　ｇで５分間遠心し、そして細胞の周縁成分を含む上清をクロマトグラフィーにより分析した。

最初の体積のｌ／１０の１％トリクロロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を添加し、そして５０ｊ１１の上清を５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　ＲＰ８逆相高圧液体クロマトグラフィー（ｈｐｆｆｉｃ）カラムにかけた。該カラムを、１分間当り１％で増加する０〜５０％のアセトニトリル中０．１％ＴＦＡの直線勾配でｌｉｅ／ｍｉｎの流速で溶離さ七た。

２１５および２８０ｎｍの光を吸収する物質のピークが、２４％アセトニトリルの所で検出された。この物質は、トリプシンで触媒されるカルボベンゾキシアルギニンｐ−ニトロアニリドの加水分解を阻害した。該ピークからの物質をＡＢＩタンパク質シークエンサーで分析すると、次の配列を有していた：Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｘ　Ｔｙｒ　ＡｓｎＧｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｚ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ上式中、同定された残基は、単離されるＨＰＳＴＩの最初の２０個のアミノ酸のものと一致しており、そして未知の残基ＸおよびＹの存在は、Ｓ−３結合中の存在のためである。記述した結果は、遺伝子が、Ｅ、コリ中で発現される時、（ａ）天然のＨＰＳＴＩ　と同時にクロマトグラフィーで分離し、（ｂ）ＨＰＳＴＩに対する抗体と反応し、（ｃ　）　ＨＰＳＴＩの最初の２０個のアミノ酸の特徴を有し、そして（ｄ）抗−トリプシン活性を有する、タンパク質の出現を細胞周辺腔中に導くように構成されていることを示１．従って、これらの方法は、ヒトのタンパク質と全く同じ活性タンパク質を生産するのに十分適Ｂａｒｔｅｌｅｔらのアミノ酸配列および白木らのｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列、エシェリキア・コリ（ｔｉｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ匹旦）の高度に発現される遺伝子におけるコドンの用い方、並びに便利な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の用意に基づいて、ＨＰＳＴＩのための次のＤＮＡ配列が提案された：ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧ　ＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴＡＡＧＴＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡ　ＡＣｆｌｔＧＴＴＧＣＡＣＴＡＡＡＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＣＧＧＴＣＴ　ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡ　ＴＧＧＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＣＧＡＡＣＧＡＡＴＧＣＧＴＧＣＴ　ＧＴＧＣＴＴＣＧＡＡ　ＡＡＣＣＧＴＡＡＡＣＧＴＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧ　ＧＴＣＣＧＴＧＣＴＡ　ＡＥ、コリの周縁質への輸送に適する形態での該タンパク質の発現を調節するために、次の調節要素が提案される：高レベルでの転写の開始のためのプラスミドｐＫＫ２２３−３上の里プロモーター；Ｅ、コリ株Ｊ、Ｍ　１０９の染色体上にコードされるべき里リプレッサー（１ａｃＩり　；高レベルで翻訳を開始するためのＯｍｐＡシャインーダルガルノ配列；生成物の周縁質輸送を促進するためのＯｍｐＡリーダー；成熟ＨＰＳＴＩを生じるように最初の生成物の開裂を指示するための、これらのオペレーター要素によりコードされるタンパク質配列と前記の構造遺伝子によりコードされるものとの間のＡｌａ−Ａｓｐ結合のＡｌａ。

前記ＯｍｐＡ要素は、次のＤＮＡ配列中に組み込まれている：ＧＡＡＴＴ　ＣＧＡＴＡ　ＴＣＴＣＧ　ＴＴＧＧＡ　ＧＡＴＡＴ　ＴＣＡＴＧ　ＡＣＧＴＡ　ＴＴＴ丁Ｇ　ＧＡＴＧＡＴＡＡＣＧ　ＡＧＧＣＧ　ＣＡＡＡＡ　ＡＡＴＧＡ　ＡＡＡＡ’　ＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧ　ＣＧＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴ　ＧＧＴＴＴ　ＣＧＣＴＡ　ＣＣＧＴＡ　ＧＣＧＣＡ　ＧＧＣＴＡ、止倣王所片皇作製上記のＯ＋ｎｐＡ配列を作製するために、ＡＢＩ　ＤＮＡ合成機（Ｆｏｓ　ｔｅｒＣｉｔｙ＋　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を使って下記のデオキシリボヌクレオチドを合成する。この生成物を、ＡＢＩ計器マニュアルに記載のようにしてゲル電気泳動により精製する。標準的手段を用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを使ってそれらを５′−リン酸化する。

次のオリゴヌクレオチド配列のグループを、断片Ａａを作製するために使用する。

オリゴヌクレオチド八ａｌ：ＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＴＣＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＴＴＴＧＧＡＴＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡ。

オリゴヌクレオチドＡａ２：ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＣＧ。

オリゴヌクレオチドＡａ３：ＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣ。

オリゴヌクレオチドＡａ４：　啼ＧＣＣＴＣＧＴＴＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴＣＡＴＧＡＡＴＡＴＣＴＣＣＡＡＣＧＡＧＡＴＡＴＣＧ。

オリゴヌクレオチドＡａ５：ＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＴＡＡＡ。

オリゴヌクレオチドＡａ６：ＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＣＴＡＣＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧＣＧＡＴＣＧ。

下記のオリゴヌクレオチドのグループを混合し、標準条件下でアニーリングし、そして標準条件下でＴ４　ＤＮＡリガーゼを使って、適当な制限エンドヌクレアーゼで切断されたクローニングおよびシーフェンシングベクターＭ１３…ｐｌＢおよびＭ１３　ｍｐ１９と並びに互いと連結せしめる。その生成物を使ってヱよ、ｌ：ｌ　＋７　ＪＭ　１０９を形質転換し、そして着目のＤＮＡを含むクローンを、アニーリング段階において使用するグループから選択された３２ｐラベル化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより選択する。挿入部の構造を、万能プライマーを使ったクローン化ＤＮＡのジデオキシシーフェンシングにより確認する。

オリゴヌクレオチドＡａｌ−Ａａ４は、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断されたＭ１３　ｍｐ１８およびＭ１３　＋ａｐ１９に連結される。所望の挿入ＤＮＡを有するＭ１３複製型ＤＮＡを標準的手法により回収する。Ｍ１３　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびハラ■で切断することによりＭ１３　ＯＮＡから挿入ＤＮＡを切り出し、そしてポリアクリルアミドゲル電気法により精製する。その構造は次のものである：ＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＴＣＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＴＴＴＧＧＡＴＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＣＧＧＣＴＡＴＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＴＡＴＡＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＡＡＡＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＡへへへへＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＴＧＴＣＧＡＴＡＧＣＧＣオリゴヌクレオチドＡａ５およびＡａ６は、ＢａｍＨＩおよび＋（ｉｎｄＩ［［で切断されたＭ１３　ｍｐ１８およびＭ１３　ｍｐ１９と連結される。

標準的手法により、所望の挿入ＤＮＡを有するＭ１３複製型ＤＮＡを回収する。

該ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ　ＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで切断することによりＭ１３　ＤＮＡから挿入ＤＮＡを切り出し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。その構造は、次のようである：ＣＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＴＡＡＡＴＡＧＣＧＴＣＡＣＣＧＴＡＣＣＧＡＣＣＡＡＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＧＣＧＴＣＣＧＧＡＧＡＣＣＡＴＴＴＴＣＧＡこのＰｖｕ　１−Ｈｉｎｄｌｌ［断片を、オリゴヌクレオチドＡａｌ　−Ａａ４から調製したは遼ＲＩ−ハッＩ断片と組み合わせ、そしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ１１テ切断されたＭ１３　ｎ＋ｐｌＢまたはＭ１３　ｍｐ１９と連結させる。標準的な手段により、所望の挿入ＤＮＡを有するＭ１３複製型ＤＮＡを回収する。Ｍ１３　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで切断することにより、ＤＮＡ断片がＡａである挿入ＤＮＡをＭ１３　ＤＮＡから切り出す、その構造は、次のようである：ＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＴＣＧＴＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＴＴＴＧＧＡＴＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧ` ＧＣＴＡＴＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＴＡＴＡＡＧＴＡＣＴＧＣＡＴＡＡＡＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＧＴＴＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＣＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴfＧＴＡＴＴＴＴＣＴＧＴＣＧＡＴＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＡＡＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＧＣＧＴＣＣＧＧＡＧＡＣbＡＴＭ１３ベクターＤＮＡを破壊するために、該ＤＮＡをさらにり１１およびＰｖｕ　Ｉ［で消化した。その反応液をフェノール抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱せしめた。ベレット化後、該ＤＮＡを溶解し、ＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉ　ｎｄ　ｎＩ切断ｐυＣ８と混合し、そして連結させた。

このＤＮＡを用いてＥ、コリＪｍ　１０９を形質転換し、そしてラベル化されたオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによりアンピシリン耐性コロニーをスクリーニングし、そして制限部位マツピングによりプラスミド構造を確かめた。

正しい構造を有する１つのコロニーｐＯｍｐｓ、ｓ、１１　Ｃを次のようにして改変し、）ＩＰＳＴＩ　とＯｍｐＡシグナル配列の融合を可能にした。ｐｏｍｐｓ、　Ｓ、　１１−　Ｃを抛Ｉおよび垣ｎｄＩ［で切断し、そして次の配列を有するリン酸化されたオリゴヌクレオチドアダプター二ｐ　−ＣＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＣＴＧＡＧＡＣＣＡＴＴＴＴＣＧＡ　−ｐをＳｔｕ　Ｉ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ切断プラスミドと連結し、これを使ってＪＭ　１０９を形質転換せしめた。

ラベル化オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより形質転換体をスクリーニングし、そして制限部位分析によりプラスミド構造を確かめた。該プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｆ　Ｉで切断し、そして１２３ｂｐの断片を単離した。これを前の例に記載のプラスミドｐＳＧＥ　１からのＨｉｎｆ　Ｉ　／鼠Ｉ断片と混合し、そしてこの２つの断片を、ＥｃｏＲＩおよび形ｎｆ　Ｉで切断されたＭ１３　ｍｐ１８と連結した。ハイブリダイゼーションにより形質転換体をスクリーニングし、そして幾つかのコロニーについて、フランキングＨｉｎｆ　１部位を含むＤＮＡ配列を決定し、それらの構造を確かめた。１つのクローンＯｎ＋ｐＡ−肝ＳＴＩ　：　ｍｐ１８を更なる研究のために選んだ。

ＯｍｐＡ　−ＨＰＳＴＩ　：　ｍｐ１８の突然変異誘発は、引例として本明細書に特別に組み込まれる、Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｆｌ、ｌ　Ｊｒ、＋およびＳｍ１ｔｈ。

Ｈｏ、伽刊崩り山」Ｉ旺竺肢■、１００巻、第４６８頁（１９８３）　；Ｘｕｎｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８２　：　４８８（１９８５）中に記載されているような標準的なオリゴヌクレオチド指示部位特異的突然変異誘発を使って行われた。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの配列は次のものである：ＧＧＴＧＴＴＡＣＣＡＴＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＡＣＣＧＧＧＴＣＧＴＡＧＡＴハイブリダイゼーション・スクリーニング（プローブとして前記突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使って）およびＤＮＡシークエンシングにより、クローンＯｍｐＡ　−ＨＰＳＴＩ　−ｍ　：ｍｐ１８を選択した。このクローンから誘導されたＲＦ　ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで切断し；　２９５ｂｐの断片を精製し、そしてＥｃｏＲＩ　／　Ｐｓｔ　Ｉ −切断ｐＫＫ２２３−３と連結せしめた。生じたＤＮＡを用いてＪＭ　１０９を形質転換せしめた。

アンピシリン耐性コロニーを、イソプロピルチオガラクトシドの存在下で増殖させた時にＨＰＳＴＩに対するウサギの抗体と交差反応する物質の生産について調べた。幾つかのコロニーを増大させ、そして制限部位分析によりプラスミド構造を確かめた。正しい構造を有する１つのコロニーをｐＳＧＥ　９と命名し、ｐＳＧＥ　９を含有するＥ、コリＪＭ　１０９株をＳＧＥ　４５と命名した。

選択されたＳＧＥ　４５株を、成当り５０鱈でアンピシリンを含むＬＢ培培地中子７°Ｃて増殖させた。０．１５　Ａｂｂ。／ｄの細胞密度の時点で、ＩＰＴＧを０．５ｍＭ濃度に添加し、そして細胞を３０　Ａ＆、。／ｄまで増殖させた。

約１−の培養プロスをインキュベーション後の様々な時間に遠心し、そしてＨＰＳＴＩ活性を分析するために培地をとっておいた。第３図は、ＳＧＥ　４５の増殖および培地中に認められる）ＩＰＳＴＩ活性の曲線である。

ＡＩ、６゜／ｄが３０の時、５１の培養プロスを８０００　ｇで２０分間遠心して細胞を取り除き、そして培地中のＨＰＳＴＩを、１ｇのＡｆｆｉｇｅｌ−１０に結合した２０■のウシトリプシンのカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。

このアフィニティー樹脂２００ｄが約１ｇのＨＰＳＴＩを吸着した。

結合したＨＰＳＴＴを５０ｍＭ　Ｈｃｌで溶出させた。上記のアフィニティー精製された）ＩＰＳＴＩ調製物中の少量の汚染タンパク質を、５Ｐ−Ｃ２５イオン交換クロマトグラフイー（２５Ｘ２５ｃｍ）上でのＮａＣｌの直線勾配（０−０，１Ｍ）により除去した。さらに、これら２つのカラムは逆の順序で流すこともできる。５１．の培地から０．７ｇのＨＰＳＴＩが精製された。この物質約２　ｎｎ＋ｏｌを、還元−カルボキシメチル化なしでＡＢＩタンパク質シークエンサーで分析すると、配列：　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　ＡｌａＬｙｓ　Ｘ　Ｔｙｒ　Ａｓｎを有し、ここで未知の残基ＸはＣｙｓであると思われる。この配列は、Ｂａｒｔｅｌｔ　、前掲、および白木ら、前掲により発表された天然配列と等しい。

本発明の方法および生成物において種々の改良および変更を行い得ることば当業者にとって明らかであろう。従って、本発明は、添付された請求の範囲内およびそれらの同等物となる提供される本発明の改良および変更を包含するつもりである。

ＦＩＧ、３（時間）国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．プロテアーゼを阻害する能力を有する少なくとも１つの活性部位を有するタンパク質を含んで成る、ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターであって、ヒトの膵臓組織から単離できるものと実質的に相同であり、そして組換えＤＮＡ法を使って生産される、前記インヒビター。
２．前記インヒビターが、次のＤＮＡ配列：【配列があります】によりコードされる、請求項１に記載のヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター。
３．前記インヒビターが、次のＤＮＡ配列：【配列があります】によりコードされる、請求項１に記載のヒト膵臓分泌トリプシンインヒビター。
４．ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターを生産するための方法であって、（ａ）宿主微生物を、ヒト膵臓組織から単離できるヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターと実質的に相同であるインヒビタータンパク質を生産するように指示することのできるポータブルＤＮＡ配列を調製し；（ｂ）宿主微生物中に移入できそして複製することのできるベクター中に前記ポータブルＤＮＡをクローニングし、ここでそのようなベクターは該ポータブルＤＮＡ配列のための作用要素を含んでおり；（ｃ）前記ポータブルＤＮＡ配列および作用要素を含む前記ベクターを、前記インヒビタータンパク質を発現することのできる宿主微生物中に移入せしめ；（ｄ）前記ベクターの増幅および前記インヒビタータンパク質の発現に適する条件下で前記宿主微生物を培養し；そして（ｅ）活性形において前記インヒビタータンパク質を収得する；ことを含んで成る方法。
５．前記インヒビタータンパク質が、ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターである、請求項４に記載の方法。
６．前記インヒビタータンパク質が、ヒト膵臓分泌トリプシンインヒビターの類似体である、請求項４に記載の方法。