DE3907492A1

DE3907492A1 - Verfahren zur isolierung und reinigung von hpsti und hpsti-varianten

Info

Publication number: DE3907492A1
Application number: DE19893907492
Authority: DE
Inventors: Helmut Dr Hustedt; Karl Heinz Kroner; Jens Dr Paulsen; Horst Schuette
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Current assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Priority date: 1989-03-08
Filing date: 1989-03-08
Publication date: 1990-09-13
Also published as: EP0414874A1; WO1990010642A1

Description

h-PSTi ist ein Inhibitor der Protease Trypsin und wird im Pancreas des Menschen produziert. Durch Klonierung des h-PSTi-Gens in E. coli und Anfügung einer leader Sequenz konnten Collins und Mitarbeiter zeigen, daß das h-PSTi-Gen in E. coli exprimiert und das Genprodukt ins Medium sekretiert wird (1, 2).

Durch Substitution einiger der 56 Aminosäuren gelang es Collins et al. (1, 2), h- PSTi Varianten zu präparieren, die als potente und spezifische Elastase-Inhibitoren wirken. Elastase ist mitverantwortlich für akute und chronische Entzündungsprozesse, insbesondere dem septischen "Schock"-Syndrom (3).

Bei dem bisherigen Verfahren zur Aufreinigung PSTi aus dem Kulturüberstand eines rekombinanten Escherichia coli (1,4) wird zunächst eine Zentrifugation zur Biomasseabtrennung durchgeführt und anschließend eine Perchlorsäurefällung mit erneuter Zentrifugation. Die chromatographische Feinreinigung erfolgt über Affinitätschromatographie an Matrix-gebundenem Trypsin/Chymotrypsin.

Die Nachteile des obigen Verfahrens sind:

- Die Biomasseabtrennung und die Vorreinigung sind aufwendig.
- Die Perchlorsäurefällung ist ökologisch unverträglich und wenig Scale-up-geeignet.
- Bei der Affinitätschromatographie entstehen ungewünschte Spaltprodukte.
- Es können nur PSTi-Varianten gereinigt werden, die an Trypsin oder Chymotrypsin binden. Interessant sind jedoch Elastase-hemmende Varianten.

Die Vorteile des hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen vor allem in der effizienten Biomasseabtrennung und Vorreinigung durch Membranverfahren und der Möglichkeit, auch Elastase-hemmende PSTi-Varianten zu reinigen. In Abb. 1 ist ein Schema der erfindungsgemäßen Aufarbeitung von h-PSTi gezeigt. Der entscheidende Schritt ist hierbei die Ultrafiltration vorzugsweise mit einem cut off von 10 000. Der Hauptteil der Fremdproteine einschließlich des von E. coli produzierten endogenen Trypsininhibitors (MW=30 kDa) wird zurückgehalten, während hPSTi mit einem Molekulargewicht von 6 200 das Filter passiert. Die Abtrennung der Zellen und die Vorreinigung können in einem Schritt mittels Ultrafiltration (z. B. cut off 10 000) durchgeführt werden, wobei ein rotierendes Scherfilter (Biodruckfilter) sehr gute Leistungen ergibt. Führt man die Ultrafiltration in Tangentialfluß-Betrieb durch, empfiehlt sich eine vorherige Biomasseabtrennung durch Crossflow-Mikrofiltration (Porengröße bevorzugt 0,2- 0,45 µm) (beide Filtrationen können gleichzeitig durchgeführt werden) oder Flockulation. Insgesamt erfolgt durch das erfindungsgemäße Verfahren eine erhebliche Vorreinigung.

Vom Ultrafiltrat ausgehend erfolgt die Feinreinigung auf beiden Wegen jeweils über drei Chromatographie-Schritte (Kationenaustausch-, Reversed-Phase- und Kationenaustausch-Chromatographie oder Anionenaustausch-, Kationenaustausch und Reversed-Phase-Chromatographie).

In beiden Fällen gelangt man zu einem homogenen Produkt. Drei Chromatographie- Schritte sind notwendig, um alle Mediumbestandteile abzutrennen, die teilweise gleiche Bindungseigenschaften zeigen wie das PSTi.

Die sich entsprechend der vorliegenden Erfindung anschließende Feinreinigung vermeidet das Problem der teilweisen Produktspaltung, wie es bei der Verwendung von Matrix-gebundenem Trypsin/Chymotrypsin besteht. Alternativ könnte man letzteren Schritt jedoch auch nach der hier erfindungsgemäß beschriebenen Vorreinigung durchführen.

I. AUSFÜHRUNGSBEISPIEL Stamm: E. coli JM 103, der das h-PSTi-Gen auf dem p MAMPF-Plasmid (5) trägt 1. ZELLABTRENNUNG UND VORREINIGUNG

Die Zellabtrennung und Vorreinigung des h-PSTi aus einem 70-l-Fermenter erfolgt alternativ über drei Wege:

1.1 Ultrafiltration 1.1.1 Tangentialfluß-Ultrafiltration

Die Abtrennung des h-PSTi von den Zellen und größeren Proteinen erfolgte direkt durch einen Ultrafiltrationsschritt. Im 70-l-Maßstab wurde das Pellicon-System von Millipore mit 8×0,46 m² PTGC-Kassetten mit einer Ausschlußgrenze von 10 000 verwendet. Eingangsdruck: 3 bar, Ausgangsdruck: 2 bar, Retentatfluß: 100 l/hm². Der Filtratfluß lag bei 2-3 l/hm² bei einer optischen Dichte der Ausgangskultur von E₅₇₈=30. Die 70 l wurden zunächst auf 10 l konzentriert und dann mit 10 l 10-mM-K-Phosphatpuffer pH 6,8 versetzt und wieder auf 10 l konzentriert. Dieser Vorgang wurde 4× wiederholt, um das PSTi zu über 90% auf die Filtratseite zu überführen. Über 95% des Proteins (gemessen nach Bradfort (6)) wurden zurückgehalten, was einer 20fachen Anreicherung entsprach.

1.1.2 Scherfiltration/Biodruckfilter

Im 5-l-Maßstab wurde die Ultrafiltration mit dem Biodruckfilter BDF 01 (Sulzer) mit dem Filter WG 10 K (Polysulfon) durchgeführt, das ebenfalls eine Ausschlußgrenze von 10 000 besitzt. Transmembraner Druck: 0,7 bar. Feedfluß: ∼10 l/h · Rotordrehzahl: 3000 rpm. Der Filtratfluß lag bei 45 l/hm² bei einer optischen Dichte der Ausgangskultur von E₅₇₈=7. Die 5 l wurden zunächst auf 1 l konzentriert und wie oben mit 2×1 l 10-mM- K-Phosphatpuffer pH 6,8 nachgewaschen. 90% des PSTi wurden auf die Filtratseite überführt, über 90% des Proteins wurden vom Filter zurückgehalten.

1.2 Mikrofiltration und Ultrafiltration

Die Abtrennung der Zellen (E₅₇₈=15) erfolgte durch Crossflow-Mikro- Filtration mit dem Sartocon-II-System von Sartorius (2×0,2 µm PP Weitspalt- Kassetten mit je 0,6 m²): Eingangsdruck: 1,6 bar, Ausgangsdruck: 1,2 bar, Retentatfluß: 650 l/hm², Filtratfluß: ∼25 l/hm². Im Anschluß an die Crossflow-Mikro-Filtration wurde die unter 1.1 beschriebene Ultrafiltration durchgeführt, die Filtratleistung lag hier bei ∼30 l/hm² (Ausbeute und Anreicherung s. Tab. 1 und 2).

1.3 Flockulation und Ultrafiltration

Die Abtrennung der Zellen erfolgte durch Zugabe von 5 l einer 0,1%igen Lösung des Flockungsmittels Sedipur (stark kationisches Polyacrylamid). Nachdem für 10 s mit einer Geschwindigkeit von 1000 rpm gerührt wurde, wurde der Ansatz für 20 min stehengelassen. Alternativ wurde für 10 min bei 8000×g zentrifugiert. Der Überstand wurde der unter 1.1 beschriebenen Ultrafiltration unterzogen. Die Filtratleistung lag ebenfalls bei ∼30 l/hm². Bei der Flockulation wurde kein Produkt durch Präzipitation verloren. Die Anreicherung und Produktausbeute war wie bei 1.1.1 (unter Vernachlässigung der Verluste im Sediment, die durch Waschen vermieden werden könnten).

2. IONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAMME ÜBER S-SEPHAROSE-FAST-FLOW

Der pH-Wert des Ultrafiltrates wurde mit 10 M HCl auf 2,7 gestellt und die Lösung mit einem Fluß von 25 l/h auf eine S-Sepharose Fast-Flow-Säule (11,8×9,2 cm) aufgetragen, die zuvor mit 10 mM Citronensäure pH 2,7 äquilibriert wurde. Waschen und Elution erfolgte mit einer Flußrate von 6 l/h. Gewaschen wurde mit 5 l des Äquilibrierpuffers, der 0,2 M NaCl enthielt. Die Elution des PSTi erfolgte durch einen NaCl-Gradienten von 0,2 -0,8 M, jeweils in 10 mM Citronen-Säure pH 2,7. Das Gradientenvolumen betrug 6 l, PSTi eluierte bei ∼0,5 M NaCl in einem Volumen von 1 l.

3. REVERSED-PHASE CHROMATOGRAPHIE

Das aktive Eluat der S-Sepharose-Säule, dessen pH mit NaOH auf 5,5 gestellt wurde, wurde mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/min auf eine 250 ml Sperisorb C6 (5 µm) (Phase Separation) aufgetragen, die zuvor mit 10 mM Citrat pH 5,5 äquilibriert wurde. Nach dem Waschen mit 300 ml des Äquilibrierpuffers wurde das PSTi durch einen Isopropanol-Gradienten von 0-30% Isopropanol (jeweils im Äquilibrierpuffer) eluiert. Das Gradientenvolumen betrug 2,5 l, die Flußgeschwindigkeit 20 ml/min. Das h-PSTi eluierte bei 20% Isopropanol in einem Volumen von 100 ml.

4. IONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE ÜBER S-SEPHAROSE-FAST-FLOW

Nachdem das Isopropanol durch Evaporation entfernt und der pH-Wert mit 2,5 M HCl auf 2,7 gestellt wurde, wurde das aktive Eluat der Reversed- Phase-Säule auf eine 20-ml-S-Sepharose-Fast-Flow-Säule aufgetragen, die zuvor mit 10 mM Citronensäure pH 2,7 äquilibriert worden war. Gewaschen wurde mit 60 ml Äquilibrierpuffer, der 0,2 M NaCl enthielt. Das PSTi wird wiederum mit einem NaCl-Gradienten von 0,2-0,8 M NaCl in Äquilibrierpuffer eluiert. Die Flußrate betrug 100 ml/h, das Gradientenvolumen 120 ml, h-PSTi eluierte bei ∼0,5 M NaCl in einem Gesamtvolumen von 20 ml. Die PSTi-haltigen Fraktionen wurden bei -20°C gelagert. Nach diesem Schritt war das h-PSTi nach der SDS-PAGE (Silberfärbung) homogen.

In Tabelle 1 ist die gesamte Reinigung zusammengefaßt.

II. AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 1. Stamm, Zellabtrennung und Vorreinigung entsprechend Beispiel I 2. DEAE-FILTRATION

Der pH des Ultrafiltrates wurde mit 10 M NaOH auf 8,5 gestellt und das Volumen mit H₂O auf 140 l aufgefüllt. Das so verdünnte Filtrat wurde mit einem Fluß von 60 l/h auf eine 6-l-DEAE-Sepharose-Fast-Flow-Säule aufgetragen, die zuvor mit 10 mM Tris-HCl pH 8,5 äquilibriert worden war.

Das h-PSTi adsorbierte nicht an das Säulenmaterial, ein Großteil der Mediumbestandteile wurde dagegen an den Anionaustauscher adsorbiert.

3. IONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE ÜBER S-SEPHAROSE-FAST-FLOW

Der pH-Wert des DEAE-Durchlaufs wurde mit 10 M NaOH auf 2,7 gestellt. Das weitere Vorgehen ist mit 2. im I. Ausführungsbeispiel identisch.

4. REVERSED PHASE CHROMATOGRAPHIE

Identisch wie 3. im I. Ausführungsbeispiel, nur daß eine 80-ml-Sperisorb C6 (5 µm) verwendet wurde und die Flußgeschwindigkeit und Volumina entsprechend reduziert wurden. Das h-PSTi eluierte in einem Gesamtvolumen von 35 ml. Nach diesem Schritt war das h-PSTi nach der SDS-PAGE (Silberfärbung) homogen. Die Reinigung ist in Tabelle 2 zusammengefaßt.

LITERATUR

(1) Maywald et al. (1988): Human pancreatic trypsin inhibitor (PSTi) produced in active form and secreted from Escherichia coli, Gene, 68, 357-369.
(2) Collins et al.: Manuskript in Vorbereitung.
(3) Jochum et al. (1981), Eur. surg. Res., 13, 152-168.
(4) Marks et al. (1986): Production of native, correctly folded bovine pancreatic trypsin inhibitor by Escherichia coli. J. Biol. Chem., 16, 7115-7118.
(5) Szardenings: Unveröffentlichte Ergebnisse.
(6) Bradford (1976): A Rapid and Sensitive Methode for the Quantitation of Microgram Quantities of Proteins Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem., 72, 248-254.

Tabelle 1

Reinigung von h-PSTi IV nach dem Filtratsverfahren Weg I

Tabelle 2

Reinigung von h-PSTi Ogawa nach dem Filtratsverfahren Weg II

Claims

1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von hPSTI und hPSTI- Varianten aus Fermentationsbrühen, in die hPSTI oder hPSTI- Varianten durch einen Mikroorganismus sekretiert worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentationsbrühe

(a) einer Ultrafiltration oder
(b) einer Kombination von Mikrofiltration und Ultrafiltration oder
(c) einer Kombination von Flockulation und Ultrafiltration unterwirft und
ggf. eine weitere Reinigung folgen läßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei den Maßnahmen gemäß (a), (b) oder (c) bei der Ultrafiltration mit einer Trenngrenze von etwa 10 000 arbeitet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Mikrofiltration und/oder Ultrafiltration Tangentialfluß- System und/oder Scherfilter verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Ultrafiltration Scherfilter, beispielsweise rotierende Scherfilter verwendet.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Maßnahme gemäß Anspruch 1 (b) eine Cross-Flow-Mikrofiltration vorzugsweise mit einem Porengrößenbereich von 0,2 bis 0,45 µm durchführt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Maßnahme gemäß Anspruch 1 (c) eine Polyelektrolyt-Flockulation durchführt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die Maßnahmen gemäß Anspruch 1 (a), (b) oder (c)
(d) eine Kationenaustausch-, Umkehrphasen- und Kationenaustausch- Chromatographie oder
(e) eine Filtration über Anionenaustauscher (negative Adsorption) und danach eine Kationenaustausch- und eine Umkehrphasen-Chromatographie folgen läßt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine E.-coli-Fermentationsbrühe einsetzt.