JP2733602B2 - ヒルジンをコードする発現カセット、プラスミド及び形質転換酵母 - Google Patents
ヒルジンをコードする発現カセット、プラスミド及び形質転換酵母Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はフランス特許出願第85/06672号の改良に関す
る。本発明は活性を持つ蛋白、即ちヒルジン（エイチ
メディシナリス（H.medicinalis））の発現ベクターに
関する。 フランス特許出願第85/06672号は、例えばエスセレヴ
ィシアエ（S.cerevisiae）等の酵母にヒルジンを活性形
で培値に分泌させて生産させる方法を記載する。 本発明は、ヒルジンまたはその変異体、特にヒルジン
変異体HV1を改良された条件で生産する新規なベクター
を提供する。 本発明は、酵母からヒルジンまたはその変異体の生産
を可能にする、少くとも下記ａ）、ｂ）及びｃ）を有す
る発現カセットに係るものである。 ａ）ヒルジンもしくはその変異体の前駆体をコードする
第一のDNAフラグメント： ここで、ヒルジンもしくはその変異体の前駆体は、ヒ
ルジン又はその変異体とそのＮ末端にペプチド結合によ
り結合する二以上のアミノ酸からなる付加的領域とから
構成されるものであり、その付加的領域にyscFプロテイ
ナーゼにより認識される単一の切断部位を有し、該切断
部位が付加的領域のＣ末端を構成することを特徴とする
ものである。 ｂ）第一のDNAフラグメントの５′末端に同位相（in ph
ase）で結合してなる、ペプチドリーダー配列をコード
する第二のDNAフラグメント：及び ｃ）第一及び第二のDNAフラグメントを発現するための
適当な制御領域。 この種の発現カセットにより単一の成熟した正しい蛋
白を得ることが可能になる。 事実、フランス特許出願第85/06672号に記載されてい
る構築により、エス セレヴィシアエはyscFプロテイナ
ーゼに対する２つの切断部位を有する前駆体、即ちKEX2
遺伝子の生産物、の形でヒルジンを生産する（Achetett
er,T.et al.,EMBO Journal、４、P173、1985）。yscFの
エンドペプチダーゼ活性は該ヒルジン前駆体の成熟に必
要である。しかし、前駆体のＮ末端からより遠い第２部
位で起こる切断のみが、活性ヒルジンを分泌させる。一
方、切断が第２部位ではなく、第１部位で起こった場
合、Ｎ末端でのアミノ酸残基が伸長された点で、ヒルジ
ンと異なるより長い配列のものが分泌される。後者の分
泌形は好ましいものではなく、精製の種々の段階で成熟
した正しいヒルジンを汚染し、従って精製工程を複雑化
し、純ヒルジンの製造収率を低下させる。 本発明においては、酵母にyscFに対する単一の切断部
分を有するヒルジン前躯体を合成せしめ、該前駆体のヒ
ルジンへの成熟により、所望の形態のみの分泌をもたら
す。 第二のDNAフラグメントでコードされるペプチドリー
ダー配列の内、特に、酵母のα性フェロモンの分泌をも
たらす所謂“プレプロ（prepro）”配列について述べ
る。 分泌系の例として、αフェロモンを選択した。即ち、
前述のフラグメント中、第二のDNAフラグメントは酵母
のα性フェロモンの遺伝子に由来している。しかし、キ
ラー蛋白系等の他の系を利用することもできる（Bussey
H.et al.,Mol.Cell.Biol.,３、PP1362−1370、198
3）。 本発明の発現カセットを運ぶプラスミドの宿主である
酵母は交配型で、淘汰圧を使用せずに培養され得るもの
であることが有利である。 これらの条件下で、形質転換された酵母は工業的レベ
ルでの利用に特に有利である。 この目的のために、本発明はStr配列がMFα１遺伝子
プロモーター以外の酵母遺伝子プロモーター、例えば酵
母のPGK遺伝子プロモーターを有する上記DNA発現カセッ
トを提供するものである。 事実、フランス特許出願第85/06672号によれば、ヒル
ジン前駆体の遺伝子はMFα１遺伝子プロモーターにより
転写される。このプロモーターは交配型Matαの菌株中
で最大力を発揮する。従って、宿主の選択は、この型の
菌株に限定され、交配型のない２倍体又は倍数体細胞株
及び交配型菌株Mataは除かれる。特に産業上利用されて
いる酵母は、２倍体又は倍数体になりやすく除外されて
しまう。プロモーターを変化させることにより、宿主菌
の交配サインと無関係にヒルジンの形質発現が可能とな
る。 一般にこれらDNAブロックはその他に２μプラスミド
の複製の起点等の酵母中の複製の起点を有するプラスミ
ドにより担持される。 ベクターの構築を促進するため、これらのプラスミド
は大腸菌／酵母のシャトルベクターであっても良く、PR
B322の複製起点等の複製起点及びampR等の選択マーカー
など大腸菌中で複製を許容する要素を有していても良
い。又、該プラスミドは酵母に対する選択マーカー、例
えば、ある種の毒性のある化合物に対する耐性をコード
する遺伝子や栄養素要求株に相補性を与えることができ
る遺伝子を有していても良い。とりわけ、URA3遺伝子を
用い得る。 国際公開公報第86/01224号に記されているように、プ
ラスミドによりura＋に形質転換されたura3株において
５−FUに対する耐性を与えるある種の突然変異の誘発
は、これらの形質転換株を培養するための培地の選択を
広げた。特に、工業用複合培地の使用を可能にした。 本発明は、特に変異体HV1の合成及び分泌に関する。 HV1遺伝子は、大腸菌中でそれを発現させるために、
既に化学的に合成されている（フランス特許第84/13250
号）。該特許で用いられた殆んどの合成オリゴヌクレオ
チドは、HV1の前駆体をコードする配列の構築に対して
維持されている。但し、該配列の上流又は下流で融合さ
れる配列と種々の連結を可能にするオリゴヌクレオチド
は維持されていない。 分泌されたヒルジンの生産には、分泌に必要な情報及
び酵母中起こる正常代謝経路によるヒルジンの正しい成
熟に必要な情報を有する前駆体の存在が必要である。フ
ランス特許出願第85/06672号は、α−因子の前駆体のＮ
末端配列がヒルジン変異体HV2の分泌に使用し得たこと
が述べられている。本発明は、このシステムの変異体HV
1の分泌への応用に関する。 本発明は、特にヒルジンを酵母より生産させ得る発現
カセットに関し、該カセットは少くとも ・HV1遺伝子 ・酵母によるHV1遺伝子の転写の為のシグナルをもつDNA
配列（Str） を有する。 この発現カセットは、プラスミド又は、酵母の、好ま
しくはサッカロマイセス層（saccharomyces）の染色体
に組みこまれ、該酵母の形質転換後、活性型或いは活性
化によりヒルジンを再生できる不活性の前駆体の形態で
ヒルジンを発現させ得る。 これらの発現カセット下記ａ）〜ｃ）の構造を有する
ことが望ましい。 ａ）ヒルジンHV1変異体の前駆体をコードする第一のDNA
フラグメント： ここで、HV1変異体の前駆体は、HV1変異体とそのＮ末
端にペプチド結合により結合する二以上のアミノ酸から
なる付加的領域とから構成されるものであり、その付加
的領域にyscFプロテアーゼにより認識される単一の切断
部位としてジペプチドLys−Argを有し、その切断部位が
付加的領域のＣ末端を構成することを特徴とするもので
ある。 ｂ）第一のDNAフラグメントの５′末端に同位相（in ph
ase）で結合してなる、ペプチドリーダー配列をコード
する第二のDNAフラグメント：及び ｃ）第一及び第二のDNAフラグメントを発現するための
適当な制御領域 なお、構成単位である第一のDNAフラグメントは数度
繰り返すことができる。ｂ）の第二のDNAフラグメント
については、酵母のα性フェロモンについて述べ、ｃ）
の制御領域については、MFα１遺伝子プロモーター及び
PGK遺伝子プロモーターについて述べるが、他の配列も
利用できる。特に、分泌系の例として、αフェロモンの
分泌系を選択した。即ち、上記構造では、第二のDNAフ
ラグメントは酵母のα性フェロモンの遺伝子に由来する
が、キラー蛋白系等の他の系を用いることができる（Bu
ssey H.et al.,Mol.Cell.Biol.,３、PP1362−1370、198
3）。 ヒルジンの発現及び培地内への分泌を行わせるため
に、対応遺伝子が、上記の発現カセット及び複製起点を
少くとも１つ含む酵母を宿主とするベクター又はプラス
ミド中に組み込まれる。プラスミドは下記の要素を有す
るのが好ましい。 ・酵母の２μプラスミドの複製起点 ・ura3遺伝子 ・大腸菌中の複製起点及び抗生物質耐性マーカー ・転写プロモーター、リーダー配列及びα因子の前駆体
のプレプロ配列（この配列はヒルジンHV1をコードする
配列の上流で同位相で融合される）を含むMFα１遺伝子
の５′領域 ・ヒルジン遺伝子の下流に位置する酵母PGK遺伝子の転
写ターミネーター 一般に、本発明の発現カセットは酵母中に、特にサッ
カロマイセス属に組み込まれる。即ち、自律的複製をす
るプラスミド又は酵母の染色体中に組み込まれる。 プラスミドが自律的である場合、その複製のための要
素、即ち、例えば２μプラスミドの複製起点等の複製起
点を有する。更に、該プラスミドはura3−又はLeu2−酵
母と相補的なURA3又はLEU2遺伝子等の選択要素を有する
ことがある。該プラスミドが例えば、PBR322の複製起点
の様な複製起点、Amprの様なマーカー遺伝子、あるいは
従来技術に公知の他の要素等の“シャトル”プラスミド
である場合、該プラスミドはバクテリアにおけるその複
製のための要素をも有することができる。 本発明は、本発明に従い発現カセットにより形質転換
された酵母に関する。該カセットはプラスミドにより担
持されるか或いはその染色体に組み込まれる。酵母は、
特にサッカロマイセス属に属する株、更にエス セレヴ
ィシアエ、更に限定してその交配型株Mata又は交配型を
持たない２倍体もしくは倍数体であり、これらのura−
酵母は、本発明のプラスミドによりura＋酵母に形質転
換される。これら菌株は５−FUに耐性を示し、工業用培
地で培養できる。 プロモーターがαフェロモンに対する遺伝子のプロモ
ーターである場合、酵母は交配型Matαを有するである
ことが望ましい。例えば、遺伝子型細胞株ura3−、Leu2
−等が使用され、適当な淘汰圧による酵母中のプラスミ
ドの維持のためにプラスミドにより相補性を得る。 本発明は、上記の形質転換された酵母を培地上で発酵
させ、成熟体もしくはin vitro又はin vivoで成熟し得
るヒルジン全躯体の形で培地に分泌されたヒルジンの回
収によるヒルジン又はその変異体の製造方法及び該製造
方法で得られたヒルジン並びにその変異体についても記
載する。 この様に、ヒルジンの製造は、上記の形質転換株の適
当な培地での発酵及び細胞内のヒルジンの蓄積により可
能であるが、ヒルジンを成熟体もしくはin vitroで成熟
し得る前駆体の形で培地に分泌させることが好ましい。 この成熟は数段階で実施される。まず、第二のDNAフ
ラグメントの翻訳由来の要素を切断する必要があり、こ
の切断は付加的領域に対応する配列上で行われる。該成
熟ヒルジンは臭化シアンで選択的に切断されるメチオニ
ンの後ろに位置する。この方法は、ヒルジンをコードす
る配列がメチオニンを含んでいないため使用可能であ
る。 又、特定のエンドペプチダーゼによりCOOHに切断され
るジペプチドLys−ArgをＮ末端に配置することが可能で
ある。この酵素は分泌過程で活性であるので、このよう
にして成熟蛋白を培地中に直接得られる。しかし、ある
場合は、特定の酵素を加え、分泌後に酵素切断を行うこ
とが必要である。場合によっては、特に臭化シアン処理
後にＳ−Ｓブリッジを再架橋することにより蛋白を再生
することが必要となる。この目的のため、ペプチドを、
例えば塩酸グアニジンで変性し、その後還元型グルタチ
オンの存在下で再生し、酸化する。 更に、本発明は上記の方法により得られるヒルジンに
ついて記載する。 上記方法により得られたヒルジンは凝血因子抑制の用
途、例えば抗凝血剤、臨床検査時の凝血防止剤、あるい
は標識物を用いて診断薬として、使用できる。 特に、HV1は医薬品製剤に単独で又は他の活性薬物と
併用して用いられ、in vitroあるいはin vivoでの検査
や診断にも使用できる。後者の場合、例えば放射性、螢
光性、酵素性標識物あるいは他の標識物で分子を標識す
ることが有用である。 下記の実施例により、本発明の特性及び長所について
説明する。 フランス特許出願第85/06672号で使用され、記された
プラスミド及び方法についてはここでは援用し繰返さな
い。 実施例１ プラスミドpTG897はyscFプロテイナーゼに対し単一の
切断部位を有するヒルジン前駆体に対する情報を担持す
る。この切断部位での成熟は不活性のヒルジンを分泌す
る。yscFプロテイナーゼによる切断は、Ｎ末端がGLu−A
La−GLu−ALaの４つのアミノ酸残基で伸鎖されたヒルジ
ン分子を放出する。このGLu−ALa−GLu−ALa配列をコー
ドするDNAフラグメントの欠失は正しく処理されたヒル
ジン鎖を遊離させる。この欠失はin vitroでの突然変異
誘発の方法で行われた。 プラスミドpTG897はPst I/Bgl IIの２重消化で切断さ
れた。ヒルジン配列を含むDNAフラグメントは１本鎖フ
ァージM13TG131の複製型にクローン化され、ファージM1
3TG897を得た（第１図）。 オリゴヌクレオチドは下記の配列 ５′−TCTTTGGATAAAAGAATTACGTATACAGAC−３′ を持ち、該ファージM13TG897の染色体DNAとハイブリッ
ド形成した。該オリゴヌクレオチドの最初の半分（15ベ
ースペア）は欠失されるべき配列のすぐ上流の15ベース
ペアの配列とハイブリッド形成し、後の半分はすぐ下流
の15bpの配列とハイブリッド形成する（第２図）。この
オリゴヌクレオチドは、in vitroでファージM13TG897ゲ
ノムの相補的鎖を合成するための鋳型として働いた。T4
DNAリガーゼの作用後、新しく形成され鎖を共有結合的
にシールするようにして、バクテリアレセプター、例え
ばJM103〔（Lac−Pro）SupE Thi End1A sbcB15 strA rk
−mk＋/F′ TraD36 ProAB＋Lac I Q LacZ M15〕が形質
移入され、この形質移入によるファージを、プローブと
して上記のオリゴヌクリオチドを使用したDNA−DNAハイ
ブリッド形成法により分析し、キナーゼ処理により32P
で標識し（Zoller,M.J.et al.,Meths in Enzym.,100、p
469、1983）。正しく変異されたファージDNAは、突然変
異誘発のためのオリゴヌクレオチドにより、非成熟型の
ファージDNA及びオリゴヌクレオチドで形成されたハイ
ブリッド形成複合体は一本鎖のDNAループの存在で不安
定化する一方で、そのより大きな安定性及びストリンジ
ェント状態に対するより大きな耐性によって確認できる
ハイブリッド形成複合体を形成する。 実施例２ 変異されたフラグメントの新規の発現ベクターへの形質
移入 プラスミドpTG883は、PKG遺伝子の転写ターミネータ
ーに近いBgl II部位を欠失させることによってプラスミ
ドPTG876から得られる。 この目的のため、プラスミドpTG876はBgl IIで部分消
化され、大腸菌のDNAポリメラーゼＩのクレノー断片が
４種のヌクレオチドの存在下に反応せしめられ、ファー
ジT4DNAリガーゼの作用によりDNA分子が互いに共有結合
した。プラスミドpTG883は単一のBgl II部位のみ有し、
フェロモン遺伝子のプロモーターの上流に位置する（第
３図）。 プラスミドpTG883（20μｇ）は従来技術にのっとって
Bgl II消化で直線化され、Ba131ヌクレアーゼ（1.4ユニ
ット、10分、ベーリンガー・マンハイム）による制限消
化に供せられた。この様に処理されたDNAを、フェノー
ル、続いてクロロホルム／イソアミルアルコールで連続
抽出して精製し、平滑末端の最大量を得るため、フラク
ション（５μｇ）をクレノーポリメラーゼで処理した。
かくして得られたDNAをファージT4リガーゼの存在下
に、ラセ等の方法（Lathe,R.et al.,DNA、３、P173、19
84）に従って、リン酸化されていないBamH Iリンカー
（５′−CGGGATCCCG）と結合させた。大腸菌1106の形質
変換及びアンピシリン耐性に対する選択の後、MFα１遺
伝子を迂回する５′領域で欠失を受けたプラスミドpTG8
92が単離され（第４図）、BamH Iリンカーは、下式の如
くATGより１塩基上流に位置する。 かくして得られた新しいBamH I−Sal Iフラグメント
はファージM13TG120のBamH I−Sal I間にクローンさ
れ、ファージM13TG889を得た（第４図）。αフェロモン
をコードする全部分を有するBamH I−Bgl IIフラグメン
トはファージM13TG889より単離され、プラスミドpTG848
の大きいBgl IIフラグメントと連結した。連結後得られ
たプラスミドpTG892bは、PGK遺伝子のプロモーターのBg
l II側の後に挿入されるフェロモンをコードする部分に
相当するBamH I−Bgl IIフラグメントを有する。 pTG892bDNAはBal II部位１つとSal I部位１つを持
ち、２つの部位はPst Iを含む短い配列を含有する。Bgl
II及びSal Iによる二重消化、大きいフラグメントの溶
離、及び合成ポリリンカーとの連結により、短い配列が
合成ポリリンカーと置きかわった。このポリリンカーは
下記の配列 を有し、一方の末端はBgl IIによって切り出されたフラ
グメントと結合し、もう一方の末端は、Sal Iによって
切り出されたフラグメント、及び特に酵素Pvu I、Bgl I
I及びSph Iの認識部位と結合する。 得られた新規のベクターをpTG1819と称した。該ベク
ターのDNAは酵素Sph I及びPst Iで消化された。この二
重消化により、３種のフラグメントが得られた。即ち、
6.5kbのPst I−Pst I、1.9kbのPst I−Sph I及び0.5kb
のSph I−Pst Iフラグメントである。 長いほうのフラグメント２種は精製され、変異を受け
たヒルジンに相当し、かつファージM13TG1827由来であ
るSph I−Pst Iフラグメントと混合された。かくして、
新しい発現ベクターpTG1828が得られた（第６図）。 実施例３ ベクターpTG881へのフラグメントの形質移入：新規のプ
ラスミドpTG1833 pTG881DNAはPst Iで部分消化され、6.1kbのフラグメ
ントを得た。このフラグメントは単離され、Bgl IIで完
全消化され、Pst I−Pst I及びPst I−Bgl IIの２つの
フラグメントを得た。これらのフラグメントはpTG1828
由来の0.62kbのPst I−Bgl IIフラグメントで接合され
た。従って新規ベクターpTG1833が再構築された。この
ベクターはGlu Ala Glu Alaをコードする配列の欠失と
いう点でのみプラスミドpTG897と異なる。形成された前
駆体の構造を第７図に示す。プラスミドpTG1833は、大
腸菌の複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、エス セレ
ヴィシアエのLeu2遺伝子、エス セレヴィシアエの複製
を許容する２μプラスミドのフラグメント、プレプロ
（prepro）をコードするMFα１遺伝子のプロモーター及
びヒルジン遺伝子を有する（第６図）。 実施例４ プラスミドpTG1828及びpTG1833による酵母の形質転換 エス セレヴィシアエ菌株TGY1sp4（Matα ura3−25
1−373−328 his3−11−15）はプラスミドPTG1818、pT
G1828及びpTG1833で形質転換された。第１表に示される
結果より、pTG1818及びpTG1833が同程度のヒルジン活性
分泌を起こすことがわかる。反対に、TGY1sp4 pTG1828
のヒルジン活性分泌は他の２つの1/2である。TGY1sp4
pTG881はヒルジンに対する遺伝情報を持たず、対照とし
て含められた。pTG1828又はpTG1833により形質転換され
たエス セルヴィシアエ（Mata）菌株TGY14−１及び同
プラスミドにより形質転換されたTGY14−２について、
比較された（第２表）。更に、TGY14−２の場合（交配
型Matα）、プラスミドpTG1833は、pTG1828よりも大き
なヒルジン分泌を惹き起こす。反対に、TGY14−１の場
合（交配型Mata）、予想された如く、TGY14−２がヒル
ジン産生する一方で、pTG1833による形質転換株はヒル
ジン分泌を起こさない。 実施例５ 表現型プラスミドの欠失を伴わない完全培地で培養可能
な菌株の単離 国際公開公報第86/01224号にある如く、プラスミドに
よりura＋に形質転換されたura3において５−FU耐性を
与えるある種の変異の誘発はこれら形質転換株を培養す
るための培地の選択領域を広げることができた。特に、
工業用複合培地の使用が可能だった。国際公開公報第86
/01224号によると、完全倍地（YPG）上にコロニーを形
成できる自然変異体がTGY1sp4 pTG1833株より単離され
た。上記完全培地には1mg/ml 5−FUを添加した。６つの
突然変異体を完全培地上に培養し、コロニーを産生しな
い、このため非淘汰的条件下での20世代以上の交代後プ
ラスミドの作用がみられない、変異体を１つ選んだ。 この突然変異体をTGY1sp4−３と称し、完全培地での
ヒルジンの生産に用いることが可能である。 実施例６ HV1をコードするDNA配列の合成方法 この配列は、MFα１のプレプロ部分と同位相（in pha
se）でHV1配列の融合を許容する要素及び分泌したヒル
ジンの正しい成熟を許容するシグナルを担持する。特に
結合領域はHV1の最初のＮ末端残基のすぐ上流にLys−Ar
g対を有する。 用いられた方法は、フランス特許出願第84/13250に記
載の方法と同様である。合成は２種の別々のブロックで
実施され、その後、該ブロックはそのBamH I粘着末端に
より組み立てられた。第１ブロックは１〜９までの番号
を付された９種のオリゴヌクレオチドから成り、第２ブ
ロックは10〜19までの番号を付された10種のオリゴヌク
レオチドから成る。オリゴヌクレオチドの配列及び位置
は第８図に示される。 制限地図及びアミノ酸への配列の翻訳が第９図及び第
10図に示される。 実施例７ 合成遺伝子の構築 第１合成ブロック ２〜８のオリゴヌクレオチド（第８図）は、ダイマー
又はポリマーの形成を防ぐために５′末端でリン酸化さ
れた。各オリゴヌクレオチドの500ピコモルを、60mMト
リス−塩酸、pH7.5、10mM MgCl2及び8mMジチオスレイ
トールの25μｌ混液中でポリヌクレオチド キナーゼ
（２単位）で処理した。該オリゴヌクレオチドは3.3ピ
コモルの〔32P〕−γ−ATP（5000Ci/nM）を含有した。3
7℃で15分間培養後、5nMの標識されていないATPが添加
された。 37℃で30分間培養後、相補得フラグメントが２つずつ
ハイブリッド形成された。但し、フラグメント１、２及
び３は１−２−３の混合ハイブリッドであった。各オリ
ゴヌクレオチド300ピコモルが、66mMトリス塩酸、pH7.
5、6mM MgCl2、100mM NaCl、0.5mMスペルミジン及び8
mMDTTの最終容量10μｌの混液中に使用された。 該混合物を３分間100℃に加熱し、２時間かけて37℃
にゆっくり冷却した。ハイブリッド形成されたオリゴヌ
クレオチド１−２−３はオリゴヌクレオチド４−５と混
合され、37℃で２時間培養された。同様にして、オリゴ
ヌクレオチド対６−７とオリゴヌクレオチド対８−９と
のハイブリッド形成が遂行された。最終段階で、上記の
様に前処理された９つのオリゴヌクレオチドを一緒に最
終容量を100μｌ中で37℃で２時間培養した。 これらハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチド14
ピコモルをT4リガーゼを用いて、15時間、15℃で処理し
た。その後、M13TG131の大きいフラグメントHind III−
BamH I 50ng（あらかじめゲルで精製）を反応混合物に
添加した。この連結混合物は、コンピテント菌の大腸菌
JM103を形質転換するのに用いられた。かくして得られ
た12のファージ クローン中、所望の配列（M13TG188
8）を有するのは１つのみだった。 第２合成ブロック 第２ブロック（第８図）の合成に同じ方法が用いられ
た。該ブロックはファージM13TG131のBamH I部位とSal
I部位の間でクローンされた。供試クローン12の内２つ
は所望の配列に相当する挿入配列を有していた。これら
クローンの内１つをM13TG1889とした。 合成遺伝子の構築 M13TG1888及びM13TG1889の２種の２本鎖DNAはHind II
I及びBamH I並びにBamH I及びSal Iで各々消化され、ゲ
ルで精製されたpBR322の大きいフラグメントHind III−
Sal Iと混合された。連結後、混合物は大腸菌1106を形
質転換するために用いられた。アンピシリン耐性の選択
により、プラスミドpTG1890が与えられ、該プラスミド
は正しく再構築された合成配列を有する。 実施例８ 合成ヒルジンを分泌し得るベクターPTG1891の構築 HV1をコードする配列を担持するpTG1890のDNAフラグ
メントがHind III−Bgl IIフラグメントの形で得られ
（Bgl II部位は、上記クローニングで用いられたSal I
のすぐ上流に位置する）、フランス特許出願第85/06672
号に記載されたプラスミドpTG881のHind III及びBgl II
の間に挿入される。得られたプラスミドpTG1891中で、H
V1遺伝子がMFαのプレプロ配列と転写ターミネーターと
の間に挿入されている。従って、この構築は、HV1をコ
ードする配列と置換されるHV2をコードする配列を除
き、pTG1818（フランス特許出願第85/0672と同一である
ため、ヒルジンHV1の成熟及び分泌をもたらす。 実施例９ プラスミドpTG1819 DNAを用いた細胞株TGY1sp4の形質
転換 細胞株TGY1sp4（α−１ ura−３−251−373−328、H
is3−11−18）はプラスミドpTG1891で形質転換された。
ura＋特性に対する選択により得られた２つのクローン
は培養された。培地に分泌されたヒルジン生産を測定し
た。対照として、TGY1sp4 pTG1818により分泌されたヒ
ルジンの量を同条件下で測定した。 TGY1sp4 pTG1891の培養上澄液中の抗トロンビン活性
は、TGY1sp4 pTG1833の２倍であった（0.9mg/培養液1m
l）。本発明の菌株の寄託 下記の菌がパスツール研究所のナショナル コレクシ
ョン オブ マイクロオーガニズム カルチャーズ（Na
tional Collection of Microorganism Cultures）（28
リュ デュ ドクトォール ルウ、75724 パリ セ
デックス 15）に寄託された。 1986年６月６日寄託 サッカロマイセス セレヴィシアエ TGY1sp4 pTG1828（No.I−569） サッカロマイセス セレヴィシアエ TGY1sp4 3pTG1833（No.I−570） 1986年11月６日寄託 サッカロマイセス セレヴィシアエ TGY1sp4 pTG1891（No.I−623）
る。本発明は活性を持つ蛋白、即ちヒルジン（エイチ
メディシナリス（H.medicinalis））の発現ベクターに
関する。 フランス特許出願第85/06672号は、例えばエスセレヴ
ィシアエ（S.cerevisiae）等の酵母にヒルジンを活性形
で培値に分泌させて生産させる方法を記載する。 本発明は、ヒルジンまたはその変異体、特にヒルジン
変異体HV1を改良された条件で生産する新規なベクター
を提供する。 本発明は、酵母からヒルジンまたはその変異体の生産
を可能にする、少くとも下記ａ）、ｂ）及びｃ）を有す
る発現カセットに係るものである。 ａ）ヒルジンもしくはその変異体の前駆体をコードする
第一のDNAフラグメント： ここで、ヒルジンもしくはその変異体の前駆体は、ヒ
ルジン又はその変異体とそのＮ末端にペプチド結合によ
り結合する二以上のアミノ酸からなる付加的領域とから
構成されるものであり、その付加的領域にyscFプロテイ
ナーゼにより認識される単一の切断部位を有し、該切断
部位が付加的領域のＣ末端を構成することを特徴とする
ものである。 ｂ）第一のDNAフラグメントの５′末端に同位相（in ph
ase）で結合してなる、ペプチドリーダー配列をコード
する第二のDNAフラグメント：及び ｃ）第一及び第二のDNAフラグメントを発現するための
適当な制御領域。 この種の発現カセットにより単一の成熟した正しい蛋
白を得ることが可能になる。 事実、フランス特許出願第85/06672号に記載されてい
る構築により、エス セレヴィシアエはyscFプロテイナ
ーゼに対する２つの切断部位を有する前駆体、即ちKEX2
遺伝子の生産物、の形でヒルジンを生産する（Achetett
er,T.et al.,EMBO Journal、４、P173、1985）。yscFの
エンドペプチダーゼ活性は該ヒルジン前駆体の成熟に必
要である。しかし、前駆体のＮ末端からより遠い第２部
位で起こる切断のみが、活性ヒルジンを分泌させる。一
方、切断が第２部位ではなく、第１部位で起こった場
合、Ｎ末端でのアミノ酸残基が伸長された点で、ヒルジ
ンと異なるより長い配列のものが分泌される。後者の分
泌形は好ましいものではなく、精製の種々の段階で成熟
した正しいヒルジンを汚染し、従って精製工程を複雑化
し、純ヒルジンの製造収率を低下させる。 本発明においては、酵母にyscFに対する単一の切断部
分を有するヒルジン前躯体を合成せしめ、該前駆体のヒ
ルジンへの成熟により、所望の形態のみの分泌をもたら
す。 第二のDNAフラグメントでコードされるペプチドリー
ダー配列の内、特に、酵母のα性フェロモンの分泌をも
たらす所謂“プレプロ（prepro）”配列について述べ
る。 分泌系の例として、αフェロモンを選択した。即ち、
前述のフラグメント中、第二のDNAフラグメントは酵母
のα性フェロモンの遺伝子に由来している。しかし、キ
ラー蛋白系等の他の系を利用することもできる（Bussey
H.et al.,Mol.Cell.Biol.,３、PP1362−1370、198
3）。 本発明の発現カセットを運ぶプラスミドの宿主である
酵母は交配型で、淘汰圧を使用せずに培養され得るもの
であることが有利である。 これらの条件下で、形質転換された酵母は工業的レベ
ルでの利用に特に有利である。 この目的のために、本発明はStr配列がMFα１遺伝子
プロモーター以外の酵母遺伝子プロモーター、例えば酵
母のPGK遺伝子プロモーターを有する上記DNA発現カセッ
トを提供するものである。 事実、フランス特許出願第85/06672号によれば、ヒル
ジン前駆体の遺伝子はMFα１遺伝子プロモーターにより
転写される。このプロモーターは交配型Matαの菌株中
で最大力を発揮する。従って、宿主の選択は、この型の
菌株に限定され、交配型のない２倍体又は倍数体細胞株
及び交配型菌株Mataは除かれる。特に産業上利用されて
いる酵母は、２倍体又は倍数体になりやすく除外されて
しまう。プロモーターを変化させることにより、宿主菌
の交配サインと無関係にヒルジンの形質発現が可能とな
る。 一般にこれらDNAブロックはその他に２μプラスミド
の複製の起点等の酵母中の複製の起点を有するプラスミ
ドにより担持される。 ベクターの構築を促進するため、これらのプラスミド
は大腸菌／酵母のシャトルベクターであっても良く、PR
B322の複製起点等の複製起点及びampR等の選択マーカー
など大腸菌中で複製を許容する要素を有していても良
い。又、該プラスミドは酵母に対する選択マーカー、例
えば、ある種の毒性のある化合物に対する耐性をコード
する遺伝子や栄養素要求株に相補性を与えることができ
る遺伝子を有していても良い。とりわけ、URA3遺伝子を
用い得る。 国際公開公報第86/01224号に記されているように、プ
ラスミドによりura＋に形質転換されたura3株において
５−FUに対する耐性を与えるある種の突然変異の誘発
は、これらの形質転換株を培養するための培地の選択を
広げた。特に、工業用複合培地の使用を可能にした。 本発明は、特に変異体HV1の合成及び分泌に関する。 HV1遺伝子は、大腸菌中でそれを発現させるために、
既に化学的に合成されている（フランス特許第84/13250
号）。該特許で用いられた殆んどの合成オリゴヌクレオ
チドは、HV1の前駆体をコードする配列の構築に対して
維持されている。但し、該配列の上流又は下流で融合さ
れる配列と種々の連結を可能にするオリゴヌクレオチド
は維持されていない。 分泌されたヒルジンの生産には、分泌に必要な情報及
び酵母中起こる正常代謝経路によるヒルジンの正しい成
熟に必要な情報を有する前駆体の存在が必要である。フ
ランス特許出願第85/06672号は、α−因子の前駆体のＮ
末端配列がヒルジン変異体HV2の分泌に使用し得たこと
が述べられている。本発明は、このシステムの変異体HV
1の分泌への応用に関する。 本発明は、特にヒルジンを酵母より生産させ得る発現
カセットに関し、該カセットは少くとも ・HV1遺伝子 ・酵母によるHV1遺伝子の転写の為のシグナルをもつDNA
配列（Str） を有する。 この発現カセットは、プラスミド又は、酵母の、好ま
しくはサッカロマイセス層（saccharomyces）の染色体
に組みこまれ、該酵母の形質転換後、活性型或いは活性
化によりヒルジンを再生できる不活性の前駆体の形態で
ヒルジンを発現させ得る。 これらの発現カセット下記ａ）〜ｃ）の構造を有する
ことが望ましい。 ａ）ヒルジンHV1変異体の前駆体をコードする第一のDNA
フラグメント： ここで、HV1変異体の前駆体は、HV1変異体とそのＮ末
端にペプチド結合により結合する二以上のアミノ酸から
なる付加的領域とから構成されるものであり、その付加
的領域にyscFプロテアーゼにより認識される単一の切断
部位としてジペプチドLys−Argを有し、その切断部位が
付加的領域のＣ末端を構成することを特徴とするもので
ある。 ｂ）第一のDNAフラグメントの５′末端に同位相（in ph
ase）で結合してなる、ペプチドリーダー配列をコード
する第二のDNAフラグメント：及び ｃ）第一及び第二のDNAフラグメントを発現するための
適当な制御領域 なお、構成単位である第一のDNAフラグメントは数度
繰り返すことができる。ｂ）の第二のDNAフラグメント
については、酵母のα性フェロモンについて述べ、ｃ）
の制御領域については、MFα１遺伝子プロモーター及び
PGK遺伝子プロモーターについて述べるが、他の配列も
利用できる。特に、分泌系の例として、αフェロモンの
分泌系を選択した。即ち、上記構造では、第二のDNAフ
ラグメントは酵母のα性フェロモンの遺伝子に由来する
が、キラー蛋白系等の他の系を用いることができる（Bu
ssey H.et al.,Mol.Cell.Biol.,３、PP1362−1370、198
3）。 ヒルジンの発現及び培地内への分泌を行わせるため
に、対応遺伝子が、上記の発現カセット及び複製起点を
少くとも１つ含む酵母を宿主とするベクター又はプラス
ミド中に組み込まれる。プラスミドは下記の要素を有す
るのが好ましい。 ・酵母の２μプラスミドの複製起点 ・ura3遺伝子 ・大腸菌中の複製起点及び抗生物質耐性マーカー ・転写プロモーター、リーダー配列及びα因子の前駆体
のプレプロ配列（この配列はヒルジンHV1をコードする
配列の上流で同位相で融合される）を含むMFα１遺伝子
の５′領域 ・ヒルジン遺伝子の下流に位置する酵母PGK遺伝子の転
写ターミネーター 一般に、本発明の発現カセットは酵母中に、特にサッ
カロマイセス属に組み込まれる。即ち、自律的複製をす
るプラスミド又は酵母の染色体中に組み込まれる。 プラスミドが自律的である場合、その複製のための要
素、即ち、例えば２μプラスミドの複製起点等の複製起
点を有する。更に、該プラスミドはura3−又はLeu2−酵
母と相補的なURA3又はLEU2遺伝子等の選択要素を有する
ことがある。該プラスミドが例えば、PBR322の複製起点
の様な複製起点、Amprの様なマーカー遺伝子、あるいは
従来技術に公知の他の要素等の“シャトル”プラスミド
である場合、該プラスミドはバクテリアにおけるその複
製のための要素をも有することができる。 本発明は、本発明に従い発現カセットにより形質転換
された酵母に関する。該カセットはプラスミドにより担
持されるか或いはその染色体に組み込まれる。酵母は、
特にサッカロマイセス属に属する株、更にエス セレヴ
ィシアエ、更に限定してその交配型株Mata又は交配型を
持たない２倍体もしくは倍数体であり、これらのura−
酵母は、本発明のプラスミドによりura＋酵母に形質転
換される。これら菌株は５−FUに耐性を示し、工業用培
地で培養できる。 プロモーターがαフェロモンに対する遺伝子のプロモ
ーターである場合、酵母は交配型Matαを有するである
ことが望ましい。例えば、遺伝子型細胞株ura3−、Leu2
−等が使用され、適当な淘汰圧による酵母中のプラスミ
ドの維持のためにプラスミドにより相補性を得る。 本発明は、上記の形質転換された酵母を培地上で発酵
させ、成熟体もしくはin vitro又はin vivoで成熟し得
るヒルジン全躯体の形で培地に分泌されたヒルジンの回
収によるヒルジン又はその変異体の製造方法及び該製造
方法で得られたヒルジン並びにその変異体についても記
載する。 この様に、ヒルジンの製造は、上記の形質転換株の適
当な培地での発酵及び細胞内のヒルジンの蓄積により可
能であるが、ヒルジンを成熟体もしくはin vitroで成熟
し得る前駆体の形で培地に分泌させることが好ましい。 この成熟は数段階で実施される。まず、第二のDNAフ
ラグメントの翻訳由来の要素を切断する必要があり、こ
の切断は付加的領域に対応する配列上で行われる。該成
熟ヒルジンは臭化シアンで選択的に切断されるメチオニ
ンの後ろに位置する。この方法は、ヒルジンをコードす
る配列がメチオニンを含んでいないため使用可能であ
る。 又、特定のエンドペプチダーゼによりCOOHに切断され
るジペプチドLys−ArgをＮ末端に配置することが可能で
ある。この酵素は分泌過程で活性であるので、このよう
にして成熟蛋白を培地中に直接得られる。しかし、ある
場合は、特定の酵素を加え、分泌後に酵素切断を行うこ
とが必要である。場合によっては、特に臭化シアン処理
後にＳ−Ｓブリッジを再架橋することにより蛋白を再生
することが必要となる。この目的のため、ペプチドを、
例えば塩酸グアニジンで変性し、その後還元型グルタチ
オンの存在下で再生し、酸化する。 更に、本発明は上記の方法により得られるヒルジンに
ついて記載する。 上記方法により得られたヒルジンは凝血因子抑制の用
途、例えば抗凝血剤、臨床検査時の凝血防止剤、あるい
は標識物を用いて診断薬として、使用できる。 特に、HV1は医薬品製剤に単独で又は他の活性薬物と
併用して用いられ、in vitroあるいはin vivoでの検査
や診断にも使用できる。後者の場合、例えば放射性、螢
光性、酵素性標識物あるいは他の標識物で分子を標識す
ることが有用である。 下記の実施例により、本発明の特性及び長所について
説明する。 フランス特許出願第85/06672号で使用され、記された
プラスミド及び方法についてはここでは援用し繰返さな
い。 実施例１ プラスミドpTG897はyscFプロテイナーゼに対し単一の
切断部位を有するヒルジン前駆体に対する情報を担持す
る。この切断部位での成熟は不活性のヒルジンを分泌す
る。yscFプロテイナーゼによる切断は、Ｎ末端がGLu−A
La−GLu−ALaの４つのアミノ酸残基で伸鎖されたヒルジ
ン分子を放出する。このGLu−ALa−GLu−ALa配列をコー
ドするDNAフラグメントの欠失は正しく処理されたヒル
ジン鎖を遊離させる。この欠失はin vitroでの突然変異
誘発の方法で行われた。 プラスミドpTG897はPst I/Bgl IIの２重消化で切断さ
れた。ヒルジン配列を含むDNAフラグメントは１本鎖フ
ァージM13TG131の複製型にクローン化され、ファージM1
3TG897を得た（第１図）。 オリゴヌクレオチドは下記の配列 ５′−TCTTTGGATAAAAGAATTACGTATACAGAC−３′ を持ち、該ファージM13TG897の染色体DNAとハイブリッ
ド形成した。該オリゴヌクレオチドの最初の半分（15ベ
ースペア）は欠失されるべき配列のすぐ上流の15ベース
ペアの配列とハイブリッド形成し、後の半分はすぐ下流
の15bpの配列とハイブリッド形成する（第２図）。この
オリゴヌクレオチドは、in vitroでファージM13TG897ゲ
ノムの相補的鎖を合成するための鋳型として働いた。T4
DNAリガーゼの作用後、新しく形成され鎖を共有結合的
にシールするようにして、バクテリアレセプター、例え
ばJM103〔（Lac−Pro）SupE Thi End1A sbcB15 strA rk
−mk＋/F′ TraD36 ProAB＋Lac I Q LacZ M15〕が形質
移入され、この形質移入によるファージを、プローブと
して上記のオリゴヌクリオチドを使用したDNA−DNAハイ
ブリッド形成法により分析し、キナーゼ処理により32P
で標識し（Zoller,M.J.et al.,Meths in Enzym.,100、p
469、1983）。正しく変異されたファージDNAは、突然変
異誘発のためのオリゴヌクレオチドにより、非成熟型の
ファージDNA及びオリゴヌクレオチドで形成されたハイ
ブリッド形成複合体は一本鎖のDNAループの存在で不安
定化する一方で、そのより大きな安定性及びストリンジ
ェント状態に対するより大きな耐性によって確認できる
ハイブリッド形成複合体を形成する。 実施例２ 変異されたフラグメントの新規の発現ベクターへの形質
移入 プラスミドpTG883は、PKG遺伝子の転写ターミネータ
ーに近いBgl II部位を欠失させることによってプラスミ
ドPTG876から得られる。 この目的のため、プラスミドpTG876はBgl IIで部分消
化され、大腸菌のDNAポリメラーゼＩのクレノー断片が
４種のヌクレオチドの存在下に反応せしめられ、ファー
ジT4DNAリガーゼの作用によりDNA分子が互いに共有結合
した。プラスミドpTG883は単一のBgl II部位のみ有し、
フェロモン遺伝子のプロモーターの上流に位置する（第
３図）。 プラスミドpTG883（20μｇ）は従来技術にのっとって
Bgl II消化で直線化され、Ba131ヌクレアーゼ（1.4ユニ
ット、10分、ベーリンガー・マンハイム）による制限消
化に供せられた。この様に処理されたDNAを、フェノー
ル、続いてクロロホルム／イソアミルアルコールで連続
抽出して精製し、平滑末端の最大量を得るため、フラク
ション（５μｇ）をクレノーポリメラーゼで処理した。
かくして得られたDNAをファージT4リガーゼの存在下
に、ラセ等の方法（Lathe,R.et al.,DNA、３、P173、19
84）に従って、リン酸化されていないBamH Iリンカー
（５′−CGGGATCCCG）と結合させた。大腸菌1106の形質
変換及びアンピシリン耐性に対する選択の後、MFα１遺
伝子を迂回する５′領域で欠失を受けたプラスミドpTG8
92が単離され（第４図）、BamH Iリンカーは、下式の如
くATGより１塩基上流に位置する。 かくして得られた新しいBamH I−Sal Iフラグメント
はファージM13TG120のBamH I−Sal I間にクローンさ
れ、ファージM13TG889を得た（第４図）。αフェロモン
をコードする全部分を有するBamH I−Bgl IIフラグメン
トはファージM13TG889より単離され、プラスミドpTG848
の大きいBgl IIフラグメントと連結した。連結後得られ
たプラスミドpTG892bは、PGK遺伝子のプロモーターのBg
l II側の後に挿入されるフェロモンをコードする部分に
相当するBamH I−Bgl IIフラグメントを有する。 pTG892bDNAはBal II部位１つとSal I部位１つを持
ち、２つの部位はPst Iを含む短い配列を含有する。Bgl
II及びSal Iによる二重消化、大きいフラグメントの溶
離、及び合成ポリリンカーとの連結により、短い配列が
合成ポリリンカーと置きかわった。このポリリンカーは
下記の配列 を有し、一方の末端はBgl IIによって切り出されたフラ
グメントと結合し、もう一方の末端は、Sal Iによって
切り出されたフラグメント、及び特に酵素Pvu I、Bgl I
I及びSph Iの認識部位と結合する。 得られた新規のベクターをpTG1819と称した。該ベク
ターのDNAは酵素Sph I及びPst Iで消化された。この二
重消化により、３種のフラグメントが得られた。即ち、
6.5kbのPst I−Pst I、1.9kbのPst I−Sph I及び0.5kb
のSph I−Pst Iフラグメントである。 長いほうのフラグメント２種は精製され、変異を受け
たヒルジンに相当し、かつファージM13TG1827由来であ
るSph I−Pst Iフラグメントと混合された。かくして、
新しい発現ベクターpTG1828が得られた（第６図）。 実施例３ ベクターpTG881へのフラグメントの形質移入：新規のプ
ラスミドpTG1833 pTG881DNAはPst Iで部分消化され、6.1kbのフラグメ
ントを得た。このフラグメントは単離され、Bgl IIで完
全消化され、Pst I−Pst I及びPst I−Bgl IIの２つの
フラグメントを得た。これらのフラグメントはpTG1828
由来の0.62kbのPst I−Bgl IIフラグメントで接合され
た。従って新規ベクターpTG1833が再構築された。この
ベクターはGlu Ala Glu Alaをコードする配列の欠失と
いう点でのみプラスミドpTG897と異なる。形成された前
駆体の構造を第７図に示す。プラスミドpTG1833は、大
腸菌の複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、エス セレ
ヴィシアエのLeu2遺伝子、エス セレヴィシアエの複製
を許容する２μプラスミドのフラグメント、プレプロ
（prepro）をコードするMFα１遺伝子のプロモーター及
びヒルジン遺伝子を有する（第６図）。 実施例４ プラスミドpTG1828及びpTG1833による酵母の形質転換 エス セレヴィシアエ菌株TGY1sp4（Matα ura3−25
1−373−328 his3−11−15）はプラスミドPTG1818、pT
G1828及びpTG1833で形質転換された。第１表に示される
結果より、pTG1818及びpTG1833が同程度のヒルジン活性
分泌を起こすことがわかる。反対に、TGY1sp4 pTG1828
のヒルジン活性分泌は他の２つの1/2である。TGY1sp4
pTG881はヒルジンに対する遺伝情報を持たず、対照とし
て含められた。pTG1828又はpTG1833により形質転換され
たエス セルヴィシアエ（Mata）菌株TGY14−１及び同
プラスミドにより形質転換されたTGY14−２について、
比較された（第２表）。更に、TGY14−２の場合（交配
型Matα）、プラスミドpTG1833は、pTG1828よりも大き
なヒルジン分泌を惹き起こす。反対に、TGY14−１の場
合（交配型Mata）、予想された如く、TGY14−２がヒル
ジン産生する一方で、pTG1833による形質転換株はヒル
ジン分泌を起こさない。 実施例５ 表現型プラスミドの欠失を伴わない完全培地で培養可能
な菌株の単離 国際公開公報第86/01224号にある如く、プラスミドに
よりura＋に形質転換されたura3において５−FU耐性を
与えるある種の変異の誘発はこれら形質転換株を培養す
るための培地の選択領域を広げることができた。特に、
工業用複合培地の使用が可能だった。国際公開公報第86
/01224号によると、完全倍地（YPG）上にコロニーを形
成できる自然変異体がTGY1sp4 pTG1833株より単離され
た。上記完全培地には1mg/ml 5−FUを添加した。６つの
突然変異体を完全培地上に培養し、コロニーを産生しな
い、このため非淘汰的条件下での20世代以上の交代後プ
ラスミドの作用がみられない、変異体を１つ選んだ。 この突然変異体をTGY1sp4−３と称し、完全培地での
ヒルジンの生産に用いることが可能である。 実施例６ HV1をコードするDNA配列の合成方法 この配列は、MFα１のプレプロ部分と同位相（in pha
se）でHV1配列の融合を許容する要素及び分泌したヒル
ジンの正しい成熟を許容するシグナルを担持する。特に
結合領域はHV1の最初のＮ末端残基のすぐ上流にLys−Ar
g対を有する。 用いられた方法は、フランス特許出願第84/13250に記
載の方法と同様である。合成は２種の別々のブロックで
実施され、その後、該ブロックはそのBamH I粘着末端に
より組み立てられた。第１ブロックは１〜９までの番号
を付された９種のオリゴヌクレオチドから成り、第２ブ
ロックは10〜19までの番号を付された10種のオリゴヌク
レオチドから成る。オリゴヌクレオチドの配列及び位置
は第８図に示される。 制限地図及びアミノ酸への配列の翻訳が第９図及び第
10図に示される。 実施例７ 合成遺伝子の構築 第１合成ブロック ２〜８のオリゴヌクレオチド（第８図）は、ダイマー
又はポリマーの形成を防ぐために５′末端でリン酸化さ
れた。各オリゴヌクレオチドの500ピコモルを、60mMト
リス−塩酸、pH7.5、10mM MgCl2及び8mMジチオスレイ
トールの25μｌ混液中でポリヌクレオチド キナーゼ
（２単位）で処理した。該オリゴヌクレオチドは3.3ピ
コモルの〔32P〕−γ−ATP（5000Ci/nM）を含有した。3
7℃で15分間培養後、5nMの標識されていないATPが添加
された。 37℃で30分間培養後、相補得フラグメントが２つずつ
ハイブリッド形成された。但し、フラグメント１、２及
び３は１−２−３の混合ハイブリッドであった。各オリ
ゴヌクレオチド300ピコモルが、66mMトリス塩酸、pH7.
5、6mM MgCl2、100mM NaCl、0.5mMスペルミジン及び8
mMDTTの最終容量10μｌの混液中に使用された。 該混合物を３分間100℃に加熱し、２時間かけて37℃
にゆっくり冷却した。ハイブリッド形成されたオリゴヌ
クレオチド１−２−３はオリゴヌクレオチド４−５と混
合され、37℃で２時間培養された。同様にして、オリゴ
ヌクレオチド対６−７とオリゴヌクレオチド対８−９と
のハイブリッド形成が遂行された。最終段階で、上記の
様に前処理された９つのオリゴヌクレオチドを一緒に最
終容量を100μｌ中で37℃で２時間培養した。 これらハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチド14
ピコモルをT4リガーゼを用いて、15時間、15℃で処理し
た。その後、M13TG131の大きいフラグメントHind III−
BamH I 50ng（あらかじめゲルで精製）を反応混合物に
添加した。この連結混合物は、コンピテント菌の大腸菌
JM103を形質転換するのに用いられた。かくして得られ
た12のファージ クローン中、所望の配列（M13TG188
8）を有するのは１つのみだった。 第２合成ブロック 第２ブロック（第８図）の合成に同じ方法が用いられ
た。該ブロックはファージM13TG131のBamH I部位とSal
I部位の間でクローンされた。供試クローン12の内２つ
は所望の配列に相当する挿入配列を有していた。これら
クローンの内１つをM13TG1889とした。 合成遺伝子の構築 M13TG1888及びM13TG1889の２種の２本鎖DNAはHind II
I及びBamH I並びにBamH I及びSal Iで各々消化され、ゲ
ルで精製されたpBR322の大きいフラグメントHind III−
Sal Iと混合された。連結後、混合物は大腸菌1106を形
質転換するために用いられた。アンピシリン耐性の選択
により、プラスミドpTG1890が与えられ、該プラスミド
は正しく再構築された合成配列を有する。 実施例８ 合成ヒルジンを分泌し得るベクターPTG1891の構築 HV1をコードする配列を担持するpTG1890のDNAフラグ
メントがHind III−Bgl IIフラグメントの形で得られ
（Bgl II部位は、上記クローニングで用いられたSal I
のすぐ上流に位置する）、フランス特許出願第85/06672
号に記載されたプラスミドpTG881のHind III及びBgl II
の間に挿入される。得られたプラスミドpTG1891中で、H
V1遺伝子がMFαのプレプロ配列と転写ターミネーターと
の間に挿入されている。従って、この構築は、HV1をコ
ードする配列と置換されるHV2をコードする配列を除
き、pTG1818（フランス特許出願第85/0672と同一である
ため、ヒルジンHV1の成熟及び分泌をもたらす。 実施例９ プラスミドpTG1819 DNAを用いた細胞株TGY1sp4の形質
転換 細胞株TGY1sp4（α−１ ura−３−251−373−328、H
is3−11−18）はプラスミドpTG1891で形質転換された。
ura＋特性に対する選択により得られた２つのクローン
は培養された。培地に分泌されたヒルジン生産を測定し
た。対照として、TGY1sp4 pTG1818により分泌されたヒ
ルジンの量を同条件下で測定した。 TGY1sp4 pTG1891の培養上澄液中の抗トロンビン活性
は、TGY1sp4 pTG1833の２倍であった（0.9mg/培養液1m
l）。本発明の菌株の寄託 下記の菌がパスツール研究所のナショナル コレクシ
ョン オブ マイクロオーガニズム カルチャーズ（Na
tional Collection of Microorganism Cultures）（28
リュ デュ ドクトォール ルウ、75724 パリ セ
デックス 15）に寄託された。 1986年６月６日寄託 サッカロマイセス セレヴィシアエ TGY1sp4 pTG1828（No.I−569） サッカロマイセス セレヴィシアエ TGY1sp4 3pTG1833（No.I−570） 1986年11月６日寄託 サッカロマイセス セレヴィシアエ TGY1sp4 pTG1891（No.I−623）
【図面の簡単な説明】
第１図はM13TG897の構築及び構造を示す。
第２図はM13TG897のファージDNAのM13TG1827へのin vit
roにおける変異を示す。図中、ａ）は突然変異誘発のオ
リゴヌクレオチド配列、ｂ）はオリゴヌクレオチドとハ
イブリッド形成するM13TG897DNAの部分配列、及び
（ｃ）は突然変異配列を示す。 第３図はpTG883の構築を示す。 第４図はpTG902の構築を示す。 第５図はM13TG889の構築を示す。 第６図はpTG1828及びpTG1833の構造を示す。 第７図は、異なったプラスミドにより担持される配列に
相当するヒルジン前駆体の構造を示す。即ち、ａ）前駆
体のＮ末端に一番近い切断部位（Lys Arg）とｂ）ヒル
ジンHV2の成熟配列（NH2−Ile−Thr etc.）との連結が
示される。 第８図はHV1をコードするDNA配列の合成に用いられたオ
リゴヌクレオチドの配列及び位置を示す。 第９、10図は、HV1をコードするDNA配列の合成に関する
制限地図及びアミノ酸への配列の翻訳を示す。
roにおける変異を示す。図中、ａ）は突然変異誘発のオ
リゴヌクレオチド配列、ｂ）はオリゴヌクレオチドとハ
イブリッド形成するM13TG897DNAの部分配列、及び
（ｃ）は突然変異配列を示す。 第３図はpTG883の構築を示す。 第４図はpTG902の構築を示す。 第５図はM13TG889の構築を示す。 第６図はpTG1828及びpTG1833の構造を示す。 第７図は、異なったプラスミドにより担持される配列に
相当するヒルジン前駆体の構造を示す。即ち、ａ）前駆
体のＮ末端に一番近い切断部位（Lys Arg）とｂ）ヒル
ジンHV2の成熟配列（NH2−Ile−Thr etc.）との連結が
示される。 第８図はHV1をコードするDNA配列の合成に用いられたオ
リゴヌクレオチドの配列及び位置を示す。 第９、10図は、HV1をコードするDNA配列の合成に関する
制限地図及びアミノ酸への配列の翻訳を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(72)発明者 アレン バラン
フランス国 67310 トリステルシャイ
ム リュ デ フェザン 12
(56)参考文献 特開 昭60−41487（ＪＰ，Ａ)
ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．Ｖｏｌ．165,
Ｎｏ．２，Ｐ．180−184 （1984)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ａ） ヒルジンもしくはその変異体の前駆体をコー
ドする第一のDNAフラグメント： ここで、ヒルジンもしくはその変異体の前駆体は、ヒル
ジン又はその変異体とそのＮ末端にペプチド結合により
結合する二以上のアミノ酸からなる付加的領域とから構
成されるものであり、その付加的領域にyscFプロテイナ
ーゼにより認識される単一の切断部位を有し、該切断部
位が付加的領域のＣ末端を構成することを特徴とするも
のである。 ｂ） 第一のDNAフラグメントの５′末端に同位相（in
phase）で結合してなる、ペプチドリーダー配列をコー
ドする第二のDNAフラグメント：及び ｃ） 第一及び第二のDNAフラグメントを発現するため
の適当な制御領域： を有する、酵母からヒルジン又はその変異体を製造する
ための発現カセット。 ２．第一のDNAフラグメントが、ヒルジンもしくはその
変異体の前駆体をコードするものであって、該前駆体は
ヒルジン又はその変異体とそのＮ末端にペプチド結合に
より結合する付加的領域を有し、かつ該付加的領域に単
一の切断部位としてジペプチドLys−Argを有することを
特徴とする、請求項１記載の発現カセット。 ３．第一のDNAフラグメントが、ヒルジン変異体HV1もし
くはHV2の前駆体をコードするものである、請求項１又
は２記載の発現カセット。 ４．第二のDNAフラグメントが、ペプチドリーダー配列
としてα因子のプレプロ前駆体のプレプロ配列をコード
するものである、請求項１乃至３のいずれかに記載の発
現カセット。 ５．ａ） ヒルジンもしくはその変異体の前駆体をコー
ドする第一のDNAフラグメント： ここで、ヒルジンもしくはその変異体の前駆体は、ヒル
ジン又はその変異体とそのＮ末端にペプチド結合により
結合する二以上のアミノ酸からなる付加的領域とから構
成されるものであり、その付加的領域にyscFプロテイナ
ーゼにより認識される単一の切断部位を有し、該切断部
位が付加的領域のＣ末端を構成することを特徴とするも
のである。 ｂ） 第一のDNAフラグメントの５′末端に同位相（in
phase）で結合してなる、ペプチドリーダー配列をコー
ドする第二のDNAフラグメント：及び ｃ） 第一及び第二のDNAフラグメントを発現するため
の適当な制御領域： を有するヒルジン又はその変異体を製造するための発現
カセットによって、形質転換された酵母細胞。 ６．前記の第一のDNAフラグメントが、ヒルジンもしく
はその変異体の前駆体をコードするものであって、該前
駆体はヒルジン又はその変異体とそのＮ末端にペプチド
結合により結合する付加的領域を有し、かつ該付加的領
域に単一の切断部位としてジペプチドLys−Argを有する
ことを特徴とするものである、請求項５記載の酵母細
胞。 ７．ヒルジン変異体がヒルジン変異体HV1またはHV2であ
る。請求項５又は６記載の酵母細胞。 ８．第二のDNAフラグメントが、ペプチドリーダー配列
としてα因子のプレプロ前駆体のプレプロ配列をコード
するものである、請求項５乃至７のいずれかに記載の酵
母細胞。 ９．発現カセットが、酵母中で機能する複製起点を有す
るプラスミドに導入されていることを特徴とする請求項
５乃至８のいずれかに記載の酵母細胞。 １０．ａ） ヒルジンもしくはその変異体の前駆体をコ
ードする第一のDNAフラグメント： ここで、ヒルジンもしくはその変異体の前駆体は、ヒル
ジン又はその変異体とそのＮ末端にペプチド結合により
結合する二以上のアミノ酸からなる付加的領域とから構
成されるものであり、その付加的領域にyscFプロテイナ
ーゼにより認識される単一の切断部位を有し、該切断部
位が付加的領域のＣ末端を構成することを特徴とするも
のある。 ｂ） 第一のDNAフラグメントの５′末端に同位相（in
phase）で結合してなる、ペプチドリーダー配列をコー
ドする第二のDNAフラグメント：及び ｃ） 第一及び第二のDNAフラグメントを発現するため
の適当な制御領域： を有する酵母からヒルジン又はその変異体を製造するた
めの発現カセット、及び酵母中で機能する複製起点を有
するプラスミド。 １１．前記の第一のDNAフラグメントが、ヒルジンもし
くはその変異体の前駆体をコードするものであって、該
前駆体はヒルジン又はその変異体とそのＮ末端にペプチ
ド結合により結合する付加的領域を有し、かつ該付加的
領域に単一の切断部位としてジペプチドLys−Argを有す
ることを特徴とするものである、請求項10記載のプラス
ミド。 １２．ヒルジン変異体がヒルジン変異体HV1またはHV2で
ある、請求項10又は11記載のプラスミド。 １３．第二のDNAフラグメントが、ペプチドリーダー配
列としてα因子のプレプロ前駆体のプレプロ配列をコー
ドするものである、請求項10乃至12のいずれかに記載の
プラスミド。
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| FR8610090 | 1986-07-10 | ||
| FR868616722A FR2607516B2 (fr) | 1986-12-01 | 1986-12-01 | Vecteurs perfectionnes d'expression d'un variant de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu |
| FR8616722 | 1986-12-01 |
Publications (2)
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|---|---|
| JPS6485082A JPS6485082A (en) | 1989-03-30 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
| GB8809860D0 (en) * | 1988-04-26 | 1988-06-02 | Ciba Geigy Ag | Process for production of polypeptides |
| US5112615A (en) * | 1988-08-03 | 1992-05-12 | New England Deaconess Hospital Corporation | Soluble hirudin conjugates |
| US5167960A (en) * | 1988-08-03 | 1992-12-01 | New England Deaconess Hospital Corporation | Hirudin-coated biocompatible substance |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
| US5879926A (en) * | 1989-03-31 | 1999-03-09 | Transgene S.A. | Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin |
| FR2645175B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-02-18 | Transgene Sa | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| FR2645174B1 (fr) * | 1989-03-31 | 1994-01-07 | Transgene Sa | Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant |
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| GB9015825D0 (en) * | 1990-07-18 | 1990-09-05 | Ciba Geigy Ag | In vitro processing of fusion proteins |
| US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
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| US5712114A (en) * | 1995-06-06 | 1998-01-27 | Basf Aktiengesellschaft | Compositions for expression of proteins in host cells using a preprocollagen signal sequence |
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| US7795205B2 (en) | 2004-04-12 | 2010-09-14 | Canyon Pharmaceuticals, Inc. | Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor |
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-
1987
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1995
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1996
- 1996-09-05 US US08/708,543 patent/US5902735A/en not_active Expired - Fee Related
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1997
- 1997-08-06 GR GR970402015T patent/GR3024368T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．Ｖｏｌ．１６５，Ｎｏ．２，Ｐ．１８０−１８４ （１９８４） |
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