DE3445517C2 - Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 angegebene DNA-Sequenz, die für ein Hirudin-ähnliches Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin codiert, nach den Ansprüchen 2 bis 4; rekombinante DNA-Moleküle zur Clonierung, nach den Ansprüchen 5 und 6; transformierte Wirtsorganismen nach den Ansprüchen 7 und 8 ein Hirudin-ähnliches Protein, nach Anspruch 9 ein Verfahren zu seiner Herstellung und nach Anspruch 10 dessen Verwendung.

Das Ansetzen des Blutegels (Hirudo medicinalis) ist eine der ältesten bekannten Therapiearten. Nachweislich sind schon in vorgeschichtlichen Zeiten Blutentziehungen zu Heilzwecken vorgenommen worden.

Die Blutegeltherapie bot eine in ihren Wirkungsmechanismen zwar unbekannte, aber seit Jahrtausenden bekannte Heilmethode an, die mehr erreichte, als nur Blutentnahme. Die erste historisch nachweisbare Blutegeltherapie ist durch den Arzt Nikander von Colophon vor knapp 2200 Jahren angewandt worden; als eigentlicher Begründer gilt jedoch Themison von Laodika, ein Schüler Äskulaps. Im Mittelalter waren die Blutegel Allgemeingut der Medizin, und zwar nicht nur der Bader, der damaligen Heilgehilfen, sondern auch ganz speziell der Ärzte.

Der Blutegel kann sich in wenigen Minuten ca. 15 Kubikzentimeter Blut einverleiben. Er würde an dieser Nahrung ersticken, wenn er sie nicht an der Gerinnung hindern könnte. Bereits in der geschlagenen Wunde vermischt er das Blut mit einem Antikoagulans. Die Sekretion eines Thrombinantagonisten ist für den Egel lebensnotwendig. Er produziert diesen Wirkstoff in seinen Halsdrüsen. Die gerinnungshemmende Eigenschaft hat darüberhinaus eine Verbesserung der Blutfließeigenschaften zur Folge, verstärkt den Lymph- und Blutstrom um ein Mehrfaches und wirkt gefäßkrampflösend. Aber das Sekret kann mehr: Es hat antibiotische Eigenschaften, die nur das Bakterium Pseudomonas überlebt. Dieses Bakterium verdaut das eingelagerte Blut und wandelt es zu Nahrung um. Vernichtet man dieses Bakterium, geht der Egel ein, es ist lebensnotwendig für ihn. Damit wird verständlich, warum der Blutegel über Tausende von Jahren hilfreicher Begleiter der Menschheit war: sein Sekret wirkt antithrombotisch, entzündungshemmend, ödemreduktiv, - darüberhinaus lymph- und blutstrombeschleunigend, gefäßkrampflösend und antibiotisch. Es ist dabei eine äußerst wirksame Substanz. Geringe Mengen in einer durch Blutegel verursachten Bißwunde (sie tut übrigens nicht weh, verursacht lediglich ein kleines Kitzelgefühl) hemmen bis zu 10 Stunden die Gerinnung des Blutes.

Nachdem Asepsis und Antisepsis der Blutegel-Direkttherapie ein Ende bereiteten, suchten Forscher in aller Welt nach einer Möglichkeit, den Wirkstoff zu isolieren, um ihn so der Therapie wieder nutzbar zu machen. 1884 wurde erstmals ein gerinnungshemmender Extrakt von Blutegeln gewonnen. Später wurde der Wirkstoff des Blutegels teilweise vom artfremden Eiweiß befreit und isoliert; er erhielt die Bezeichnung Hirudin.

Hirudin ist ein hochmolekulares Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 7000 und mit entzündungshemmenden und ödemreduktiven Eigenschaften. Das Studium der Hemmstoffwirkung auf die einzelnen Phasen des Gerinnungssystems zeigte, daß es sich um einen spezifischen Hemmstoff des Enzyms Thrombin handelt, der mit keinem anderen Gerinnungsfaktor reagiert und seine Wirkung ohne die Mitwirkung anderer im Blut vorhandener Komponenten entfaltet. Hirudin verhindert demnach die Gerinnung des Blutes, indem es das Reaktionsprodukt der ersten Gerinnungsphase, das Thrombin, abfängt und dadurch die Auslösung der zweiten Gerinnungsphase, die Fibrinbildung, verhindert. Hirudin ist also ein spezifischer Thrombin-Antagonist (Jui-Yoa Chang, FEBS Bd. 164, S. 307 [1983]). Bislang wurde Hirudin aus Blutegeln isoliert. Dabei konnte nur etwa 1 mg Hirudin aus 70 Blutegeln gewonnen werden. Das so gewonnene Hirudin wurde hauptsächlich zu Salben verarbeitet, die zur antithrombotischen und antiphlogistischen Venentherapie eingesetzt wurden. (P. Walsmann, F. Markwardt, Die Pharmazie, Bd. 36, S. 653 [1981]). Neuerdings soll Hirudin auch zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen oder zur Verhinderung der Blutgerinnung, z. B. während der Hämodialyse, verwendet werden. Wegen der begrenzten Verfügbarkeit und der noch unzulänglichen Reinheit von Hirudin konnte jedoch noch keine ausreichende klinische Erprobung vorgenommen werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Hirudin-ähnliches Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin bereitzustellen und ein gentechnologisches Verfahren zu schaffen, das die technische Herstellung dieses Proteins in größeren Mengen ermöglicht. Eine weitere Aufgabe ist es, Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, die dieses Hirudin- ähnliche Protein enthalten. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Der Ausdruck "Hirudin-ähnliches Protein" bezeichnet ein Protein, dessen Aminosäuresequenz ähnlich der Aminosäuresequenz des nativen Hirudins ist oder nur einen Teil davon umfaßt und/oder das nicht wie das native Hirudin am Tyrosinrest 63 sulfatisiert ist. Erfindungsgemäß werden auch entsprechende Fusionsproteine als Hirudin-ähnliche Proteine bezeichnet. Die Bezeichnung "Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin" bezieht sich auf ein Protein, das nicht identisch mit dem nativen Hirudin ist, das aber dennoch die biologische Aktivität des nativen Hirudins hat, d. h. es verhält sich gegenüber Proteinen, wie Thrombin, wie das native Hirudin und/oder es hat immunologische Eigenschaften des nativen Hirudins.

Es ist bekannt, daß die Desulfatisierung des Hirudins nur einen geringen Verlust der biologischen Aktivität des Hirudins zur Folge hat (Jui-Yoa Chang, FEBS Bd. 164, S. 307 [1983]).

Zur Bereitstellung eines gentechnologischen Verfahrens zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins mit der biologischen Aktivität von Hirudin werden erfindungsgemäß folgende Schritte ausgeführt:
Zunächst werden die in Tabelle I aufgeführten Oligodesoxyribonukleotide mit Hilfe eines DNA-Synthesegerätes aufgebaut. Dabei wird gemäß der von J. Dodt, H.P. Müller, U. Seemüller und Jui-Yoa Chang in FEBS Bd. 165, S. 180 (1984) beschriebenen Aminosäuresequenz gearbeitet. Es werden vornehmlich die von E. coli am häufigsten benutzten Codons verwendet. Es wird darauf geachtet, daß am 5′-Ende des synthetischen Gens ein ATG-Codon liegt, weil dann gegebenenfalls das entsprechende Protein durch eine CNBr-Spaltung aus einem Fusionsprotein abgespalten werden kann. Die so erhaltenen Oligodesoxyribonukleotide werden gereinigt und wegen der später durchzuführenden Ligierung mit Polynucleotidkinase und γ-³²P-rATP phosphoryliert. Die Produkte dieser Reaktion werden über eine präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Anschließend werden die zueinandergehörenden + und --Stränge (die komplementären Stränge) aneinandergefügt, durch eine präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und zum vollständigen synthetischen Gen zusammengefügt (Fig. 1). Das so hergestellte Gen kann zur Isolierung des nativen Gens aus genomischen Genbanken oder aus cDNA-Banken verwendet werden. Dieses synthetische Gen wird in den Vektor pEMBL 8+ (hinterlegt bei DSM, Göttingen, BRD [Hinterlegungsbezeichnung DSM 3139]) der den β-Galactosidase- Promoter enthält, eingebaut. Selbstverständlich können auch andere Expressionskontrollsequenzen verwendet werden, beispielsweise das E.coli lac-System, das E.coli trp-System, der E.coli Lipoprotein-Promoter, Hefe-Expressionskontrollsequenzen oder andere eukaryontische Expressionskontrollsequenzen. Wichtig ist dabei nur die funktionelle Verknüpfung des Gens mit der Expressionskontrollsequenz sowie die Auswahl einer geeigneten Expressionskontrollsequenz für einen bestimmten Wirtsorganismus.

Nach der Konstruktion des rekombinanten Expressionsvektors wird dieser in einen transformierbaren Wirtsorganismus, z. B. ein Coli-Bakterium, wie E. coli OM 214 (Stammsammlung Prof. G. Schütz, Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg; DMS Göttingen [Hinterlegungsbezeichnung DSM 3138]) eingebracht. Je nach Auswahl der Expressionskontrollsequenz können als Wirtsorganismen auch andere Bakterien, Hefen und tierische oder menschliche Zellen verwendet werden. Transformanten, die ein Hirudin-ähnliches Protein synthetisieren, werden durch ihre Ampicillin-Resistenz und durch Reaktion mit anti-Hirudin-IgG-Antikörpern identifiziert.

Schließlich wird das erfindungsgemäß hergestellte Hirudin- ähnliche Protein auf seine biologische Aktivität gegenüber dem Enzym Thrombin, das bei der Blutgerinnung eine Schlüsselrolle spielt, getestet. Dabei wird einerseits ermittelt, daß das von Bakterien hergestellte Hirudin-ähnliche Protein die Umsetzung von Fibrinogen zu Fibrin durch Thrombin inhibiert und zum anderen wird festgestellt, daß mit diesem Protein auch die Umsetzung eines chromogenen Substrates durch Thrombin inhibiert werden kann. Daraus folgt also, daß das erfindungsgemäß hergestellte Protein über die biologische Aktivität von Hirudin verfügt. Mit dem erfindungsgemäßen Protein bzw. seinem Bromcyan-Spaltprodukt und pharmazeutisch verträglichen Zusätzen und Verdünnungsmitteln können also Arzneimittel zur Behandlung von Gerinnungsstörungen des Blutes oder zur Verhinderung der Blutgerinnung hergestellt werden.

Fig. 1: Dargestellt ist die vollständige DNA-Sequenz des synthetisierten Gens. Die schwarzen Pfeile kennzeichnen die Grenzen der synthetisierten einzelsträngigen Oligodesoxynukleotide, die Balken geben die Grenzen der Fragmente I, II und III sowie des Adapters an. Außerdem ist die entsprechende Aminosäuresequenz über der DNA-Sequenz abgebildet.

Fig. 2: Dargestellt ist das rekombinante Plasmid pRudi 1 mit insertiertem synthetischen Eco RI-Bam HI- Fragment.

Das synthetische Fragment wurde in die Polylinkerstelle des α-Fragments des β-Galactosidasegens des Plasmids pEMBL 8+ inseriert. Die ersten Aminosäuren des alpha-Fragments bilden mit den Aminosäuren des Hirudins das beschriebene Fusionsprotein.

Fig. 3: Dargestellt ist die vollständige Aminosäuresequenz des ausgehend vom Klon pRudi 1 gebildeten Fusionsproteins. Dabei sind die Aminosäurepositionen der dem nativen Hirudin entsprechenden Aminosäuren beginnend mit Großbuchstaben angegeben.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Synthese einer DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin codiert

Die in Tabelle 1 aufgeführten Oligodesoxyribonukleotide werden mit Hilfe eines DNA-Synthesegerätes aufgebaut.

Tabelle 1

Synthetisierte Oligonukleotide

Das Syntheseprogramm ist ABI 003 5/17/84. Die verwendeten Chemikalien stammen ebenfalls von Applied Biosystems wie auch das LCAA/CPG (long chain alkylamine controlled pore glass), das mit Nukleosid - 3-0-succinat (ca. 30 µmol/g) funktionalisiert ist. Ausgegangen wird bei jeder Synthese von 1 µmol Nucleosid. Beendet wird die Synthese in allen Fällen mit dem "trityl off, auto" Abspaltungsmodus, bei dem die säurelabile 5′-0-(4,4′-Dimethoxytrityl)gruppe vor Thiophenol- und Ammoniakbehandlung entfernt wird. Die ammoniakalischen Lösungen der Produkte des Synthesegerätes werden in Spitzkolben überführt und die ursprünglichen Glasbehälter mit je ca. 10 ml 25% Ammoniak nachgespült.

Nach sorgfältigem Versiegeln werden die Kolben 14 h auf 50°C erwärmt. Anschließend wird im Ölpumpenvakuum zur Trockene eingeengt und jedes Produkt in 500 µl 20 mM Triäthylammoniumbicarbonat-Puffer (TEAB), pH 7,4 aufgenommen.

Der zehnte Teil jedes Roh-Oligomers wird danach mittels Ionenaustausch-HPLC (High performance liquid chromatography) gereinigt.

Die Latek HPLC-Anlage besteht aus zwei P 400 Lösemittelpumpen, einer automatischen Gradientensteuerung einem Rheodyne 7125 Injektionsteil mit 100 µl Probenaufgabeschleife, einem Milton Roy model 1204 A UV-Detektor (Detektionswellenlänge 280 nm, Empfindlichkeit 1.0) und einem Shimadzu C-R3A-Schreiber. Die Latek Partisil 10 SAX HPLC-Säule (4 mm i.D.) befindet sich in einem Wasserbad der Temperatur 50°C, und die Durchflußrate beträgt 2 ml/min. Zur Abtrennung der Verunreinigungen wird ein linearer Gradient der Lösungsmittel A und B von 20- 60% B während 45 min angewendet (Lösungsmittel A = 40%(v/v) 1 mM Triäthylammoniumphosphat, pH 6,3, 60% (v/v) Formamid; Lösungsmittel B = 40% (v/v) 500 mM Triäthylammoniumphosphat, pH 6,3 60% (v/v) Formamid). Zum Ansetzen dieser Lösungen wird Formamid p.A. eingesetzt, welches 5h lang mit 40 g/l Bio Rad AG 501-X8 Ionenaustauscher (analytical grade mixed bed resin) gerührt worden ist.

Die Elution wird sorgfältig überwacht und die Fraktion mit der zuletzt eluierten UV-aktiven Substanz (gewöhnlich die Hauptabsorption) manuell aufgefangen. Zur Entsalzung wird diese Fraktion im Verhältnis 1 : 1 mit entionisiertem Wasser versetzt und auf eine 3 ml Oktadecyl (C₁₈) Wegwerf-Säule (J.T. Baker 7020-3) aufgetragen, die mit je 3 ml Methanol, 200 mM TEAB, pH 7,4/30% Acetonitril und 200 mM TEAB, pH 7,4 vorgewaschen ist. Nachher wird die Säule zweimal mit je 3 ml desselben Puffers gewaschen Das Produkt wird anschließend mit 2 × 3 ml 200 mM TEAB, pH 7,4/80% Methanol eluiert (H. Blöcker, R. Frank u. Mitarb., EMBO Kurs Braunschweig, September 1984, Manual). Nach Einengen zur Trockene im Ölpumpenvakuum wird das saubere Oligodesoxyribonukleotid in 1 ml 20 mM TEAB, pH 7,4, aufgenommen und die Absorption bei 260 nm bestimmt. 500 pmol jedes der Oligomeren werden für die quantitative Phosphorylierung eingesetzt (die molaren Extinktionskoeffizienten werden durch Summation der individuellen Extinktionskoeffizienten der Nukleotide ohne Berücksichtigung des hypochromatischen Effekts berechnet). Sie werden in 15 µl destilliertes Wasser und 2 µl 10 × PNK-Puffer (500 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 10 mM Spermidin) suspendiert und dann 10 min bei 70°C gehalten. Das Gemisch wird anschließend abgeschreckt und auf eine rATP- Konzentration von 1 µM gebracht. Danach wird das Gemisch mit 1 µCi Adenosin -5′-(-³²p) Triphosphat-triäthyl- ammoniumsalz (6000 Ci/mMol und 1 µl Polynukleotidkinase (4,5 U versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 37°C inkubiert. Nach 15 min wird 1 µl 10 mM rATP zugesetzt und die Umsetzung wird weitere 15 min fortgeführt und dann durch Zugabe von 10 µl Urea-Mix abgebrochen (10 M Harnstoff, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylencyanolblau). Vor dem Aufbringen auf das Gel wird das Gemisch 1 min. bei 95°C gehalten.

Ein denaturierendes Polyacrylamidgel (60 cm lang, 0,1 cm dick, 8% Acrylamid, 8,5 M Harnstoff, 1 × TBE (89 mM Trisbase, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA)) wird 2 h bei 30 Watt für den Lauf vorbereitet. Dann wird es mit dem denaturierten Phosphorylierungsreaktionsprodukt beladen. Die Elektrophorese wird bei 30 Watt durchgeführt, bis das Bromphenolblau 45 cm gewandert ist. Sodann wird eine der Glasplatten abgenommen, das Gel mit Haushaltsfolie bedeckt und 1 h mit einem Röntgenfilm belichtet.

Die den Oligonukleotiden der gesamten Länge entsprechenden Banden werden einschließlich der Gelmatrix ausgeschnitten. Die Matrix wird zerstoßen und in 300 µl TE- Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) suspendiert.

Die Oligonukleotide werden 3 h bei 65°C eluiert. Die Gelmatrix wird von dem Gesamtgemisch durch silikonisierte Glaswolle abzentrifugiert. Die verbleibende Gelmatrix wird dann bei 1200 U.p.M. 10 min. abzentrifugiert und der Überstand in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat, pH 10, und Glykogen als Träger mit Äthanol ausgefällt. Der Niederschlag wird zweimal mit 80% Äthanol gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und dann in TE-Puffer zur Endkonzentration von 2 pMol Oligonukleotid/µl aufgenommen.

50 pMol eines einzelsträngigen Oligonukleotids werden mit seinem entsprechenden Gegenstrang in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 100 µl (50 mM NaCl, 1 × TE, pH 8) verbunden. Die Gemische werden auf 90°C erhitzt, 2 min. auf dieser Temperatur in einem Wasserbad gehalten und dann über Nacht auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Unterfragmente werden unter Verwendung von jeweils 20 µl Ligierungsgemisch ligiert (Unterfragment I: R1 + R2 plus R3 + R4, Unterfragment II: R5 + R6 plus R7 + R8, Unterfragment III: R9 + R10 plus R11 + R12, Unterfragment IV: R13 + R14 werden zu einem Dimeren ligiert; vgl. Fig. 1). Die Ligierung erfolgt in einem Gesamtvolumen von 100 µl (50 mM Base, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 µg BSA, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP, 10 U T4-DNA-Ligase. Die Inkubation wird 4 h bei 17°C durchgeführt und durch 10 min Erhitzen auf 70°C abgebrochen. Das Gemisch wird dann mit Äthanol in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat, pH 10, und Glykogen als Träger gefällt, zweimal mit 80% Äthanol gewaschen, getrocknet und in 30 µl TE-Puffer, pH 8 aufgenommen. Jeweils 20 µl von den Ligierungsgemischen werden mit 5,5 µl Beladungspuffer (20% Ficoll 400, 2% SDS, 0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylencyanolblau) vermischt und 5 min auf 70°C erhitzt.

Die Ligierungsproben werden sodann auf ein nicht denaturierendes Polyacrylamidgel (40 cm lang, 0,01 cm dick, 10% Acrylamid, 1 × TBE) aufgebracht, das 2 h bei 200 Volt für den Lauf vorbereitet wurde. Die Elektrophorese wird bei 300 Volt 7 h in 1/2 × TBE durchgeführt, bis das Bromphenolblau 25 cm gewandert ist. Dann wird das Gel 12 h autoradiographiert. Die der erwarteten Länge entsprechenden Fragmente werden ausgeschnitten und, wie für das erste Gel beschrieben, eluiert. Das getrocknete DNA-Pellet wird in 20 µl TE-Puffer aufgenommen.

Zur Herstellung des vollständigen Gels werden etwa 1 pM (10 µl der Unterfragment-Zubereitung) eines jeden Unterfragments in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 50 µl unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen ligiert. Die Inaktivierung des Enzyms und die Konzentrierung der DNA werden wie beschrieben durchgeführt. Das DNA-Pellet wird in 8 µl TE aufgenommen. Die Gesamtsequenz des synthetischen Gens ist ebenfalls in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 2 Konstruktion eines Vektors für Clonierung und Expression der synthetischen DNA-Sequenz und Transformation von E. coli OM214

Da das synthetisierte Gen Multimere über seine Eco RI und Bam HI-Schnittstellen bilden kann, wird die Zubereitung mit Eco RI und Bam HI vor der Ligierung mit einem Vektor verdaut. 5 µl des Ligierungs-Reaktionsproduktes werden mit 40 Einheiten Eco RI und 30 Einheiten BAM HI in einem Gesamtvolumen von 40 µl (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT) 1 h bei 37°C verdaut. Danach wird die DNA mit Äthanol in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat, pH 10, gefällt, ferner mit 80% Äthanol gewaschen, getrocknet und in 24 µl TE aufgenommen.

10 µg Plasmid-DNA von pEMBL8+ (U. Rüther, Molec. gen. Genet., Bd. 178 [1980], S. 475) werden mit 40 Einheiten Eco RI und 30 Einheiten Bam HI verdaut und mit 2,5 Einheiten sogenannte intestinale Phosphatase in einem gesamten Reaktionsvolumen von 100 µl 1 h bei 37°C entphosphoryliert. Als Reaktionspuffer wird 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 1 mM DTT verwendet. Die Umsetzung wird durch Zugabe von EGTA auf eine Endkonzentration von 25 mM und 10 min. Erhitzen auf 70°C abgebrochen. Das Gemisch wird dann mit 150 µl 80% gepuffertes Phenol, pH 7,5, extrahiert. Die obere Phase wird auf eine Gelfiltrationssäule aufgebracht, die mit Sephadex G 100 gesamtes Bettvolumen: 2 ml) gefüllt und mit 10 mM Ammoniumbicarbonat equilibriert ist. Jede Fraktion des Eluats enthält etwa 100 µl. Anteile dieser Fraktionen werden auf Ethidiumbromid enthaltende Agaroseplatten getüpfelt. Die DNA wird durch UV-Bestrahlung sichtbar gemacht. Die ersten Fraktionen, die etwa 75% der gesamten DNA enthalten, werden vereinigt und unter Vakuum getrocknet. Die DNA wird sodann auf eine Endkonzentration von 0,1 µg DNA/µl TE-Puffer resuspendiert.

0,05 pM der gespaltenen synthetischen DNA werden mit 0,1 pM der vorbereiteten Vektor-DNA in einem Gesamtvolumen von 20 µl (50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 µg BSA, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP, 5 Einheiten T4-DNA-Ligase vermischt. Die Inkubation wird 3 h bei 14°C durchgeführt. Nach Zugabe von 2 µg t-RNA aus Kalbsthymus und 80 µl TE-Puffer wird das Gemisch mit 100 µl 80% Phenol, pH 7,5 - Chloroform - Isoamylalkohol (24+24+1 Volumina) extrahiert.

Der Extrakt wird dann mit 10 µl 3 M Natriumacetat, pH 10, und 1 µl Glycogen versetzt und die Lösung mit Äthanol gefällt, zweimal mit 80% Äthanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 10 µl TE-Puffer wieder aufgelöst. Die Struktur des dabei entstehenden Plasmids pRudi 1 ist in Fig. 2 dargestellt. Die Aminosäuresequenz des Expressionsproduktes wird in Fig. 3 gezeigt. Beim Expressionsprodukt handelt es sich um ein Fusionsprotein mit Aminosäuren des α-Peptids der β-Galaktosidase (Position -8) und mit dem nativen Hirudin entsprechenden Aminosäuren (9-Ende).

Die Herstellung von kompetenten E. coli OM 214-Zellen erfolgt in üblicher Weise.

40 ml Nährmedium (Serva, Katalognr. 48498) werden mit einer einzelnen Kolonie des Stammes E. coli OM 214 beimpft. Die Kultur wird etwa 15 h bei 37°C und 200 U.p.M. geschüttelt. 4 ml dieser Kultur werden dann in 200 ml frisches Nährmedium verdünnt. Die Inkubation erfolgt wie vorstehend, bis die Zellen eine Dichte von 2 × 10⁸ Zellen pro ml erreicht haben. Dann wird die Kultur rasch abgeschreckt und 5 min. bei 8000 U.p.M. zentrifugiert. Das Zellsediment wird in 100 ml 30 mM Calciumchloridlösung resuspendiert, 20 min. bei 0°C gehalten, erneut zentrifugiert und in 10 ml Calciumchloridlösung resuspendiert. Dann werden die Zellen 24 h bei 0°C gehalten, hierauf mit 1 ml keimfreies Glycerin versetzt und dann rasch in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -70°C gelagert.

Die auf diese Weise hergestellten, gefrorenen, kompetenten E. coli-Zellen werden auf Eis aufgetaut und pro 100 µl Zellen werden 5 µl der vorstehend genannten gereinigten ligierten DNA zugesetzt. Das Gemisch wird 20 min bei 0°C gehalten. Dann werden die Zellen genau 4 min einem Hitzeschock bei 37°C unterworfen, um die Aufnahme der Plasmid-DNA durch sie zu ermöglichen. Die Zellsuspension wird dann auf Eis abgeschreckt, mit der zehnfachen Menge Nährmedium verdünnt und 40 min bei 37°C inkubiert. Mengen von 1, 10 und 90% der Suspension werden auf Agarplatten, die 1.5% Agar, Nährmedium und 100 µg Ampicillin pro ml enthalten, welches wegen deren Resistenz gegen dieses Antibioticum als Selektionsmarker für transformierte Zellen benutzt wird, ausgestrichen. Die Agarplatten werden 14 h bei 37°C inkubiert. Die wachsenden Kolonien werden aufgenommen und mit dem ELISA-Test (enzymetlinked immunosorbent assay) auf die Expression eines Fusionsproteins geprüft.

Beispiel 3 Expression der synthetischen DNA-Sequenz und Nachweis der Expressionsprodukte

Mit E. coli-Einzelkolonien werden 2.5 ml 2 × YT-Medium mit 60 µg/ml Ampicillin angeimpft, und die Kulturen werden 6 h bei 37°C geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, in 1 ml 10 mM NaCl gewaschen und in 250 µl Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH8, 30 mM NaCl, 1 mg/ml Lysozym) suspendiert. Nach 30 min bei 0°C werden die Zellen dreimal bei -70°C gefroren und bei 37°C wieder aufgetaut. Die erkalteten Lysate werden 20 min bei 15 000 Upm zentrifugiert, und die Überstände werden für den Nachweis vom Hirudin-ähnlichen Proteinen aufgehoben.

Der Nachweis von Hirudin in E. coli Lysaten wird mit einem ELISA-Test (enzyme linked immunosorbent assay) durchgeführt. In die Bohrungen einer Mikrotiter- Platte werden 50 µl einer anti-Hirudin-IgG-Lösung mit 10 µg/ml IgG in Bindungs-Puffer (1,59 g Na₂CO₃, 2,93 g NaHCO₃, 0,2 g, NaN₃ ad 1 l H₂O) gefüllt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Bohrungen werden dreimal mit PBS-Puffer (8,0 NaCl, 0,2 g KH₂PO₄, 2,9 gNa₂PO₄ · 12 H₂O, 0,2 g KCl, 0,5 ml Tween 20, 0,2 g NaN₃ ad 1 l H₂O) ausgewaschen. Dieser Puffer wird für alle Waschvorgänge verwendet. Von den zu testenden Lysaten werden 50 µl eingesetzt. Nach 2 h bei Raumtemperatur werden die Bohrungen der Platte wieder dreimal gewaschen und 50 µl Anti-Hirudin, IgG, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert war, werden zugegeben. Die Herstellung des Konjugates wird nach der Vorschrift im Katalog "Biochemical and Organic Compounds for Research", Sigma Chemie GmbH, S. 713, mit alkalischer Phosphatase Typ VII T durchgeführt.

Nach 2 h Inkubation bei Raumtemperatur werden die Bohrungen wieder dreimal gewaschen, dann werden 50 µl des Substrats für alkalische Phosphatase p-Nitro-Phenylphosphat, 1 mg/ml in 10% Diäthanolamin, 0.1 mg/ml MgCl₂ 6H₂O; pH 9,8) zugegeben. Die Enzymreaktion wird visuell bestimmt. Ein positives Ergebnis, d. h. Anwesenheit von Hirudin-ähnlichem Protein zeigt sich durch die Gelbfärbung der Lösung aufgrund der Aktivität der an das anti-Hirudin-IgG gebundenen alkalischen Phosphatase. Eine quantitative Abschätzung des Hirudin-ähnlichen Proteins in E.coli Extrakten wird durch den Vergleich mit einer Verdünnungsreihe einer Hirudinstandardlösung bekannter Konzentration, die parallel mit den Testproben eingesetzt wird, getroffen.

Insgesamt werden fünfunddreißig E.coli Klone untersucht, von denen vier ein positives Ergebnis zeigen (Nr. 9, 13, 18, 35). Der Vergleich der Farbreaktion mit der der Hirudinstandard Lösungen ergibt, daß die Klone zwischen 10-20 µg/l Hirudin-ähnliches Protein produzieren.

Beispiel 4 Nachweis der biologischen Aktivität des Hirudin-ähnlichen Proteins

Ein Liter 2× YT-Medium mit 60 µg/ml Ampicillin wird mit 10 ml einer Übernachtkultur des E.coli Klons No.9 angeimpft und bei 37°C geschüttelt. Nach 1 h werden 5 ml 100 mM IPTG (Isopropyl-β-d-thiogalacto-pyranosid zugegeben, um die Expression des synthetischen Gens zu induzieren. Nach weiteren 5 h werden die Zellen geerntet, in 100 ml Lyse-Puffer aufgenommen und wie beschrieben lysiert. Das Lysat wird mit 1M MgCl₂ auf eine Endkonzentration von 10 mM gebracht und 10 mg DNase I wurden zugegeben. Nach 15 min bei 37°C wird das Lysat 15 min bei 70°C inkubiert. Ausgefallenes Protein wird abzentrifugiert, der Überstand wird mit 6% Trichloressigsäure auf pH 4,5 titriert und mit kaltem Aceton auf 50% Endkonzentration versetzt. Nach 2 h bei 0°C wird das Präzipitat abzentrifugiert, der Überstand wird mit kaltem Aceton auf eine Endkonzentration von 80% gebracht und 2 h bei 0°C gehalten. Der Niederschlag wird erneut abzentrifugiert, das Aceton wird bei 37°C verdampft und der Niederschlag in 2 ml 50 mM Tris-HCl, pH7, gelöst.

Anschließend wird mit dem E.coli Extrakt ein Gerinnungs-Test (Clotting- Test) durchgeführt. Der Clotting-Test beruht auf der spezifischen Hemmung von Thrombin durch Hirudin bzw. durch ein Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin. Eine Fibrinogen-Lösung bekannter Konzentration wird mit einer bestimmten Thrombinmenge versetzt, wodurch die Umwandlung in Fibrin katalysiert und innerhalb einer bestimmten Zeit registriert wird. Wird zu der Fibrinogenlösung Hirudin oder ein Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin in steigenden Mengen zugegeben, so wird die Gerinnung so lange gehemmt, wie kein Thrombin im Überschuß vorliegt. Der Umkehrpunkt ist an der Gerinnung der Probe erkennbar.

Der Test wird folgendermaßen durchgeführt: zu 100 µl 50 mM Tris-HCl,pH7, werden 100 µl einer Fibrinogenlösung (60 mg/ml in 0,85% NaCl) und 100 µl der zu testenden Probe in 50 mM Tris-HCl, pH7, (Puffer bzw. Hirudin Standard-Lösung bzw. E.coli Extrakte) gegeben. Dann werden 5 µl Thrombin (30 IU/ml in 0.85% NaCl; zugegeben und vorsichtig gemischt. Nach 1 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Teströhrchen um 180° gedreht. Ein positives Ergebnis, d. h. Hemmung des Thrombins, zeigt sich durch das Herausfließen der Lösung aus dem Röhrchen, während bei einem negativen Ergebnis die Gerinnung nicht gehemmt wird und das Fibrin-Gel an dem Boden des Röhrchens hängen bleibt. Angereicherter Extrakt aus dem E.coli Klon Nr. 9 hemmt die Umsetzung von Fibrinogen zu Fibrin, während gleich behandelter E.coli Extrakt, der das Hirudin-Gen nicht enthält, keine Hemmung zeigte. Der Vergleich mit Hirudin Standard Lösungen ergibt, daß die biologische Aktivität des Hirudin- ähnlichen Proteins aus E.coli einer Hirudin-Konzentration von 120 ng/ml entspricht.

Die Hirudinaktivität der E.coli-Extrakte wird außerdem durch ihre Fähigkeit, die Thrombinaktivität gegenüber einem chromogenen Substrat zu inhibieren, gemessen. Dabei spaltet Thrombin die gelbfarbene Verbindung p-Nitroanilin vom chromogenen Substrat Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (Chromozym) ab. Im Test werden 20 µl einer Thrombinlösung (5 IU/ml in 0,25 M Phosphat-Puffer pH6,7) mit 890 µl Diäthanolaminpuffer (150 µl/l pH 8,4) gemischt, mit 50 µl einer hirudinhaltigen Lösung (x ng Hirudin in Diäthanolaminpuffer für Eichung oder E.coli-Extrakt) versetzt und 5 min. bei 25°C inkubiert.

Anschließend werden 125 µl einer Chromozymlösung (1,5 mM in Diäthanolaminpuffer) zugegeben und die Extinktion des Gemisches bei 405 nm im Photometer während einer Zeitperiode von 6 min im 60-Sekunden-Rhythmus gemessen. Dabei ist die Zunahme der Extinktion ein Maß für die Thrombinaktivität und verhält sich umgekehrt zur Hirudinaktivität.

Claims (10)

1. Die DNA-Sequenz die für ein Hirudin-ähnliches Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin codiert.

2. Rekombinantes DNA-Molekül zur Clonierung, welches eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 enthält.

3. Rekombinantes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 enthält, die funktionell mit einer Expressions-Kontroll- Sequenz verbunden ist.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressions-Kontroll-Sequenz ein E.Coli Promoter-System, das E.coli lac-System, das E.coli β-Lactamasesystem, das E.coli trp-System, der E.coli Lipoprotein-Promoter, eine Hefe Expressions- Kontroll-Sequenz oder eine andere eukaryontische Expressionskontrollsequenz ist.

5. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mit mindestens einem der rekombinanten DNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 2-4 transformiert ist.

6. Wirtsorganismus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er E.coli, ein anderes Bakterium, Hefe, ein anderer Pilz, eine tierische oder eine menschliche Zelle ist.

7. Hirudin-ähnliches Protein mit der Aminosäuresequenz

8. Hirudin-ähnliches Protein mit der biologischen Aktivität von Hirudin, dadurch gekennzeichnet, daß es von einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 codiert wird.

9. Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins mit der biologischen Aktivität von Hirudin gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wirtsorganismus mit einem rekombinanten DNA-Molekül gemäß Anspruch 3 oder 4 transformiert und das durch Expression erzeugte Hirudin-ähnliche Protein gewinnt.

10. Verwendung des Hirudin-ähnlichen Proteins gemäß Anspruch 7 oder 8 als Thrombin-Antagonist zur Hemmung der Blutgerinnung, zur Behandlung entzündlicher Zustände und/oder Ödembehandlung.