WO1991004275A1 - Neue proteine geeignet zur bekämpfung von krankheiten sowie zum schutz von weidevieh gegen zecken - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to new proteins and their production.
- Hirudin is a polypeptide with a molecular weight of approximately 106,500.
- the invention relates to a new protein which has a molecular weight of about 15,000 daltons and the amino acid sequence at the amino terminus
- Muteins are to be understood as proteins that arise from the new protein through exchange, deletion and / or addition of amino acids or peptides in the protein chain without the effect of the new protein thereby changing significantly.
- the new protein can be isolated from ticks.
- the ticks are taken up in a buffer at pH 6 to 9, preferably 7.5.
- the insoluble constituents are centrifuged off.
- Inactive protein is precipitated from the solution thus obtained by adding trichloroacetic acid to a final concentration of 2.5% and removed by centrifugation.
- ether-soluble constituents are removed by extraction and the protein is then precipitated with cold acetone.
- the new protein can be isolated from the precipitated product by ion exchange and pH gradient chromatography.
- the protein described here is present in the ticks in a concentration between 1 - 100 ⁇ g / kg.
- the genetic information thus obtained for the protein can then be expressed in various host cells, such as eukaryotic cells, yeasts, Bacillus subtilis or E. coli, using known methods, and the protein can be obtained in this way.
- the protein is produced in glycosylated form in the eukaryotic cells.
- the muteins which are derived from the new proteins by exchange, deletion or addition of amino acids or peptides are preferably prepared by genetic engineering methods.
- the new protein has anticoagulant properties and can be used to prevent and treat vascular diseases such as heart attack, pulmonary embolism, arterial embolism and phlebothrobose. They are also suitable for the preservation of blood.
- vascular diseases such as heart attack, pulmonary embolism, arterial embolism and phlebothrobose. They are also suitable for the preservation of blood.
- One advantage for these uses is the low toxicity of the new protein.
- the new protein is also suitable for the immunization of grazing cattle against tick-specific proteins.
- neutralizing antibodies can disrupt ticks' food intake. This causes the ticks to leave the host and thus die. Examples 1 to 3
- TCA trichloroacetic acid
- This protein mixture (200 mg) was then taken up to a protein concentration of 20 mg / ml in phosphate-buffered saline, pH 5, and applied to a Q-Sepharose® column (Pharmacia Fine Chemicals, fast-f ow).
- the volume of the column was 10 ml.
- the column was equilibrated with the same buffer in which the sample was taken up. After washing the column with three column volumes of squilibration buffer, the column was eluted with a pH gradient.
- 10 column volumes of the wash buffer (pH 5.0) were slowly mixed with 10 column volumes of wash buffer (pH 1 to 3) using a gradient mixer. Under these conditions, the thrombin inhibitor eluted at pH 4.5.
- the protein was thus obtained in a pure and active form. It showed a molecular weight of 15,000 + 1000 in gel electrophoresis.
- the amino-terminal sequence of this protein is: SDYEFPPPKKSRPG. Its isoelectric point is pH 4 to 5.
- the protein which was homogeneous according to molecular weight and obtained according to Example 1 and identified by the thrombin inhibitor effect, was precipitated and dried as described in Example 1 by a 4-fold excess of cold acetone. The residue was then taken up in phosphate-buffered saline, pH 7.5 (protein concentration 20 mg / ml) and placed on a Mono-Q column (column volume 1 ml) equilibrated with the same buffer (approx. 0.1 mg) .
- the column was washed at a flow rate of 0.5 ml / min and then with a gradient of 150 mM NaCl to 350 M NaCl (2.5 ml each) and then of 350 mM NaCl to 450 mM NaCl (2.5 ml each) ), followed by 450 mM NaCl after 550 mM NaCl (10 ml each) and then eluted to 800 mM NaCl.
- the protein appeared between 350 mM NaCl and 550 mM NaCl.
- activity measured as thrombin inhibitor activity
- sequence analysis of all eluted proteins showed that they all have the same amino-terminal sequence and are therefore identical in terms of their primary structure.
- the inactive thrombin inhibitor fraction obtained in 2 was precipitated as described in Example 1 and taken up in a renaturation buffer which contained 8 M urea and 200 mM dithiothreitol (DTT). After 1 h at 37 ° C., the protein was dialyzed against 100 times the volume of phosphate-buffered saline (cut-off volume of the dialysis tube 10 kDa). After 2 h dialysis at 4 ° C., the protein was active and showed the same behavior on the Mono-Q column after elution through a salt gradient as the active fraction in Example 2.
- DTT dithiothreitol
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Abstract
Es wird ein neues Protein mit dem Molekulargewicht von etwa 15.000 Dalton und den N-Terminus SDYEFPPPKKXRPG beschrieben. Das Protein eignet sich zur Bekämpfung von Krankheiten sowie zum Schutz von Weidevieh gegen Zecken.
Description
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NEUE PROTEINE GEEIGNET ZUR BEKÄMPFUNG VON KRANKHEITEN SOWIE ZUM SCHUTZ VON WEIDEVIEH GEGEN ZECKEN
Beschreibung
5 Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine und deren Herstellung.
Es ist bereits bekannt, daß Blutegel einen die Blutgerinnung hemmende Substanz, das Hirudin, produzieren (vgl. The Merck Index, 10. Auflage, Nr. 4613). Hirudin ist ein Polypeptid mit dem Molekulargewicht von etwa 106.500.
Substanzen, die die Blutgerinnung hemmen, werden auch von anderen blut¬ saugenden Parasiten, z.B. den Zecken, produziert. Diese Substanzen sind aber bislang weder in reiner Form erhalten noch synthetisch hergestellt 5 worden (Naturwissenschaften 11, 30 (1961).
Es wurde nun ein neues Protein aus Zecken isoliert.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Protein welches ein Molekular- 0 gewicht von etwa 15.000 Dalton besitzt und am Aminoterminus die Amino¬ säuresequenz
SDYEFPPPKKXRPG
5 aufweist, worin X S oder N ist, sowie dessen Muteine.
Als Muteine sind Proteine zu verstehen, die sich von dem neuen Protein durch Austausch, Deletion und/oder Addition von Aminosäuren oder Peptiden in der Proteinkette entstehen, ohne daß sich dadurch die Wirkung des neuen 0 Proteins wesentlich verändert.
Das neue Protein läßt sich aus Zecken isolieren. Hierzu werden die Zecken in einem Puffer bei pH 6 bis 9, vorzugsweise 7,5, aufgenommen. Nach dem Homogenisieren der Mischung mit einem Homogenisator werden die unlöslichen 5 Bestandteile abzentrifugiert. Aus der so erhaltenen Lösung wird durch Zu¬ gabe von Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 2,5 % un¬ wirksames Protein ausgefällt und durch Zentrifugieren entfernt. Aus der so erhaltenen Lösung werden etherlösliche Bestandteile durch Extraktion ent¬ fernt und anschließend das Protein mit kaltem Aceton ausgefällt. Das neue Protein läßt sich durch Ionenaustausch- und pH-Gradientenchromatographie aus dem ausgefälllten Produkt isolieren.
Das hier beschriebene Protein liegt in den Zecken in Konzentration zwischen 1 - 100 μg/kg vor. Um das Protein für pharmazeutische Zwecke in größeren Mengen verfügbar zu machen, kann man bekannte gentechnische Methoden (vgl. Maniatis, T. et al: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1982) heranziehen. Für diesen Zweck muß zunächst die genetische Information für das neue Protein identifiziert und die entsprechende Nukleinsäure isoliert werden. Dazu wird das reine Protein mit Dithiothreitol reduziert, dann wird lodacetamid zur Derivati- sierung der freien SH-Gruppen zugesetzt und anschließend wird das so be- handelte Protein mit Bromcyan und Trypsin in kleine Peptide gespalten. Die Auftreπnung der Peptide erfolgt über reversed phase-Chromatographie. Die N-terminale Sequenzierung eines dieser gereinigten Peptide ergab die Sequenz SDYEFPPPKKSRPG.
Die vorhandenen Peptidsequenzen erlauben nun durch die Synthese entspre¬ chende Oligonukleotide eine eindeutige Identifizierung des Gens aus dem Genom oder aus entsprechenden c-DNA-Bänken durch sequenzspezifische Filterhybridisierung.
Die so erhaltene genetische Information für das Protein kann dann in verschiedene Wirtszellen, wie eukaryontische Zellen, Hefen, Bacillus subtilis oder E. coli nach bekannten Methoden zur Expression gebracht und das Protein so erhalten werden. In den eukaryotischen Zellen entsteht dabei das Protein in glykosylierter Form.
Die Muteine, die sich durch Austausch, Deletion oder Addition von Amino¬ säuren oder Peptiden von den neuen Proteinen ableiten, werden vorzugsweise nach gentechnischen Methoden dargestellt.
Das neue Protein besitzt blutgerinnungshemmende Eigenschaften und kann zur Prävention und Behandlung von Gefäßerkrankungen wie Herzinfarkt, Lungen- embolie, arterielle Embolie und Phlebothro bose eingesetzt werden. Weiter eignen sich zur Konservierung von Blut, on Vorteil für diese Verwendungen ist die niedrige Toxizität des neuen Proteins.
Weiter eignet sich das neue Protein zur Immunisierung von Weidevieh gegen zeckenspezifische Proteine. So kann durch neutralisierende Antikörper die Nahrungsaufnahme der Zecken gestört werden. Dadurch werden die Zecken zum Verlassen des Wirtes und damit zum Absterben gebracht.
Beispiel 1 bis 3
Beispiel 1
Reinigung des Thrombininhibitors
Eine im Labor bei 28°C und 80 % relativer Luftfeuchte gehaltene Kultur Lederzecken (Ornithodorus oubata) wurde in 14-tägigen Abständen dadurch gefüttert, daß sie an Kaninchen saugen konnten. Zecken aller Entwicklungs- Stadien vor oder nach der Fütterung wurden bei -20°C eingefroren und bei der anschließenden Aufarbeitung eingesetzt. 10 g Zecken wurden hierzu in 20 ml Phosphat-gepufferter Saline aufgenommen (20 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 1 M EDTA, pH 7,5 und bei 20°C homogenisiert. Die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt.
Der klare, rote überstand wurde mit Trichloressigsäure (TCA) bis zu einer Endkonzentration von 2, 5 % TCA versetzt. Es bildete sich ein massiger, roter Niederschlag der durch Zentrifugation abgetrennt wurde. Danach wurde die Lösung mit 1/10 ihres Volumens an Ether 3mal ausgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wurde mit NaOH neutralisiert.
Dazu wurde das 4fache Volumen an kaltem (-78°C) Aceton gegeben. Die Lösung stand dabei in der Kälte auf Trockeneis. Es bildete sich im Verlauf von bis zu 24 h ein flockiges, weißes Präzipitat. Dieses wurde abzentrifugiert und im Exsikkator getrocknet. Die Ausbeute lag bei 1 % des Gewichts der eingesetzten Zecken. In der SDS-Gelelektrophorese zeigte dieses Produkt noch 10 bis 20 Proteinbanden im niedermolekularen Bereich bis 40 kDa nach Färbung mit Coomassie Brilliantblau. Der isoelektrische Punkt dieser Proteine lag zwischen pH 4 und pH 7.
Dieses Proteingemisch (200 mg) wurde nun zu einer Proteinkonzentration von 20 mg/ml in Phosphat-gepufferter Saline, pH 5, aufgenommen und auf eine Q-Sepharose® Säule (Pharmacia Fine Chemicals, fast-f ow) aufgetragen. Das Volumen der Säule betrug 10 ml. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer äquilibriert, in dem auch die Probe aufgenommen wurde. Nach Waschen der Säule mit drei Säulenvolumina Squilibrierungspuffer wurde die Säule mit einem pH-Gradienten eluiert. Dazu wurden 10 Säulenvolumina des Wasch¬ puffers (pH 5,0) über einen Gradientenmischer langsam mit 10 Säulen¬ volumina Waschpuffer (pH 1 bis 3) gemischt. Unter diesen Bedingungen elu- ierte der Thrombininhibitor bei pH 4,5. Das Protein wurde so in reiner und aktiver Form erhalten. In der Gelelektrophorese zeigte es ein Molekular¬ gewicht von 15.000 +_ 1000. Die aminoterminale Sequenz dieses Proteins lautet: SDYEFPPPKKSRPG. Sein isoelektrischer Punkt liegt bei pH 4 bis 5.
Beispiel 2
Trennung aktiver von inaktiven Thrombininhibitor-Molekülen.
Das nach Molekulargewicht homogene, nach Beispiel 1 erhaltene und durch Thrombininhibitor-Wirkung identifizierte Protein wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durch den 4fachen Überschuß kalten Acetons gefällt und ge¬ trocknet. Danach wurde der Rückstand in Phosphat-gepufferter Saline, pH 7,5, aufgenommen (Proteinkonzentration 20 mg/ml) und auf eine mit dem gleichen Puffer äüquilibrierte Mono-Q-Säule (Säulenvolumen 1 ml) gegeben (ca. 0,1 mg). Die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min gewaschen und dann mit einem Gradienten von 150 mM NaCl nach 350 M NaCl (je 2,5 ml) und dann von 350 mM NaCl nach 450 mM NaCl (je 2,5 ml), gefolgt von 450 mM NaCl nach 550 mM NaCl (je 10 ml) und schließ- lieh auf 800 mM NaCl eluiert. Das Protein erschien zwischen 350 mM NaCl und 550 mM NaCl. Jedoch war Aktivität (gemessen als Thrombininhibitor- wirkung) nur mit einem Absorptionsmaximum bei 450 mM NaCl verbunden. In der Sequenzanalyse aller eluierten Proteine zeigte sich jedoch, daß alle die gleiche aminoterminale Sequenz haben, somit hinsichtlich ihrer Primärstruktur identisch sind.
Beispiel 3
Renaturierung der inaktiven Thrombininhibitormoleküle
Die in 2 erhaltene, inaktive Thrombininibitorfraktion wurde wie in Bei¬ spiel 1 beschrieben gefällt und in einem Renaturierungspuffer aufgenommen, der 8 M Harnstoff und 200 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt. Nach 1 h bei 37°C wurde das Protein gegen das lOOfache Volumen Phosphat-gepufferte Saline dialysiert (Ausschlußvolumen des Dialyseschlauchs 10 kDa). Nach 2 h Dialyse bei 4°C war das Protein aktiv und zeigte auf der Mono-Q-Säule nach Elution durch einen Salzgradienten das gleiche Verhalten wie die aktive Fraktion in Beispiel 2.
Claims
1. Protein, gekennzeichnet durch die N-terminale Aminosäuresequenz SDYEFPPPKKXRPG, worin X S oder N ist, und das Molekulargewicht von
5 etwa 15.000 Dalton, sowie dessen Muteine.
2. Protein gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
103. Verwendung des Proteins gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von
Antikörpern gegen Zeckenbefall bzw. zur Immunisierung von Weidevieh gegen Zeckenbefall.
4. Verfahren zur Herstellung des Proteins gemäß Anspruch 1, dadurch 15 gekennzeichnet, daß man
a) Zecken homogenisiert, aus dem Homogenisat die unlöslichen Be¬ standteile entfernt, aus dem überstand durch Fällung mit Tri- chloressigsäure unwirksame Proteine ausfällt und das in Lösung 0 gebliebene Protein nach Ausfällung mit Aceton einer Chromato¬ graphie unterwirft oder
b) das Protein nach bekannten gentechnischen Methoden herstellt.
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