DE2210262A1

DE2210262A1 - Polyvalente proteaseninhibitorpraeparate aus helix pomatia

Info

Publication number: DE2210262A1
Application number: DE2210262A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Fritz; Rudolf Christoph Prof Dr Marx; Harald Dr Tschesche
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-03
Filing date: 1972-03-03
Publication date: 1973-09-06
Also published as: CH590063A5; JPS4899384A; FR2174925B1; GB1378277A; FR2174925A1; US3885012A

Description

TRDErDRIKE BAYER AG LEVERKUSEN-Bayerwerk f „ , Zentralbereich Patente, Marken und Lizenzen

Si/MH Polyvalente Proteaseninhibitorpräparate aus Helix pomatia

Es ist bekannt, daß das Blutserum der Weinbergschnecke (Helix pomatia) einen Hemmkörper für !Trypsin und Kallikrein enthält /&. Werle, W. Appel, E. Happ, Arch. exp. Path. u. Pharmak., 234 (1958), 364 - 3727. Man kennt ferner bereits Hinweise auf vier polyvalente, allerdings kaum näher charakterisierte Proteaseninhibitoren in der Eiweißdrüse der Weinbergschnecke /ß. Uhlenbruck, I. Sprenger, I. Ishiyama, Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. j£ (1971), 361 - 362; G. Uhlenbruck, ö. Sprenger, G. Hermann, Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. 2. (1971), 494 - 49£7.

Gegenstand der Erfindung sind neue, polyvalente Proteaseninhibitorpräparate aus Helix pomatia. Die in diesen erfindungsgemäßen Präparaten enthaltenen Inhibitoren besitzen eine Hemmwirkung gegenüber Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kininogenasen, haben ein Mol-Gewicht von etwa 6500, einen Gehalt von 55 - 70 Aminosäureresten pro Molekül Inhibitor, einen isoelektrischen Punkt niedriger als 10,5 und sind mit Ammonsulfat bis zu 63 "p der Sättigungskonsentration vollständig fällbar. Die erfindungsgemäßen Präparate enthalten außerdem Isoinhibitoren.

Besonders enthalten die erfindungsgemäßen Präparate solche Inhibitoren, die 58 Aminosäurereste pro Molekül enthalten, unter denen Histidin und Tryptophan fehlen, und die einen Argininrest im reaktiven Zentrum enthalten, der für die Hemmwirkung essentiell ist.

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Die Unterschiede zwischen den oben genannten Inhibitoren aus dem Blutserum von Helix pomatia und den erfindungagemäßen, im folgenden Helicin genannten Präparaten gehen aus der folgenden Gegenüberstellung hervor:

Inhibitor aus Blutserum

Helicin

1. Hemmung a) progressiv, abhängig von

Vorinkubationszeit

b) progressiv, abhängig von Inkubationstemperatur maximal bei 45 C

c) von Salzkonzentration abhängig, wird gehemmt von

5 χ 10"²M (NHJ₂SO₄

2. Temperatureffekte a) siehe oben

b) thermolabil

3. Molekulargewicht hochmolekular,

dissoziierend

4. Chymotrypsinhemmung keine

sofort (1 Min.)

bei 25⁰C sofort maximal

unabhängig

hitzebeständig

niedermolekular

hemmt Chymotrypsin

Die Unterschiede zwischen den oben genannten vier polyvalen- ten Inhibitoren aus den Eiweißdrüsen von Helix pomatia und Helicin gehen aus der folgenden Gegenüberstellung hervor:

Inhibitor aus Eiweißdrüse Helicin

1. Organvorkommen Eiweißdrüse nicht in Eiweißdrüee (sondern in Schleim, Fuß u. Mantel)

2. Hemmung

erstaunlich breites Spektrum, Bromelain, Picin und Papain werden gehemmt, ferner Pronase und Thermolysin.

3. Immunelektrophorese positiv im Uhlenbruck-Test

begrenzt und definiert; keine Hemmung von Bromelain, Picin u. Papain bzw. Pronase oder Thermolysin.

negativ

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Inhibitor aus Eiweißdrüse Helicin

4. Molekulargewicht nicht direkt bestimmt, 6.500

hochmolekular nach Daten der Immunelektrophorese bzw. nach Eiution an Se_r phadex G-200 vor Anti-A-Agglutinin!

Helicin ist auch eindeutig von dem bekannten Kallikrein-Trypsin-Inhibitor (KTI) unterschieden, wie aus folgendem klar hervorgeht:

Helicin zeigt gleiches Hemmspektrum wie KTI, wenn auch die gereinigten Isoinhibitoren I.B, I.E und I.G- unterschiedliche Aktivität (geringer als die Ausgangsmischung) gegenüber Kininogenasen aufweisen. Aber alle vier Enzyme Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kininogenasen werden eindeutig gehemmt.

Die Hemmung tritt sofort ein, in weniger als einer Minute ist der Endwert der Hemmung erreicht. Dies dauert bei KTI bis 20 Minuten.

Die drei Isoinhibitoren weisen gleiche Anzahl von Aminosäuren pro Molekül auf wie KTI (58 Reste), ferner eine auffallend ähnliche Aminosäurezusammensetzung. Insbesondere die für die Tertiärstruktur wichtigen hydrophoben Aminosäuren sind in gleicher Anzahl vertreten: 4 Tyr, 4 Phe, 2 He, 6 Cys und 6 (7) GIy.

Alle drei Isoinhibitoren besitzen Arginin im aktiven Zentrum und sind damit ohne Inaktivierung chemisch modifizierbar, z. B. acylierbar. KTI besitzt Lysin im aktiven Zentrum.

Die isoelektrischen Punkte der Isoinhibitoren liegen alle tiefer als die von KTI, zum Teil erheblich niedriger im Bereich von 6 - 9,5, was physiologisch bedeutungsvoll ist.

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Es war überraschend, in Weichtieren niedermolekulare Inhibitoren mit analogen Hemmspektren wie aus Säugetieren isolierter polyvalenter KTI vorzufinden und daraus zu isolieren. Alle anderen aus Schnecken isolierten Inhibitoren sind nämlich hochmolekular, und KTI kommt nicht bei allen Säugetieren bzw. Wiederkäuern vor, vielmehr bildet das Rind die Ausnahme.

Gegenüber den bekannten Inhibitoren, einschließlich KTI, besitzt das erfindungsgemäße Helicin eine Reihe von Vorteilen, die wie folgt zusammengefaßt werden können:

1. Wegen isoelektrischer Punkte zwischen 6-10 besteht eine höhere Nierengängigkeit.

2. Die raschere Ausbildung des Hemmgleichgewichtes ist physiologisch und therapeutisch bedeutungsvoll.

3. Der Argininrest im reaktiven Zentrum ermöglicht eine leichte chemische Modifizierung ohne Inaktivierung der Helicin-Inhibitoren. z. B. eine Acylierung wie bei der Herstellung von Tetramaleoyl-KTI.

4. Die Helicin-Inhibitoren sind native Inhibitoren, die sich verhalten wie. Tetramaleoyl-KTI.

5. Durch Acylierung von Helicin-Inhibitoren mit Dicarbonsäuren anhydriden wie Maleinsäure- oder Bernsteinsäure-anhydrid lassen sich besonders saure Inhibitoren mit sehr niedrigen isoelektrischen Punkten herstellen, die von KTI nicht zu gewinnen sind.

Das erfindungsgemäße Helicin stellt kein homogenes Inhibitormaterial dar, wenn auch die Gelfiltration auf ein etwa

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einheitlich gleiches Molekulargewicht von ca. 6.500 für diese Fraktion hindeutet. Durch Ionenaustausehchromatographie an SE-Sephadex C-25 ließ sich mittels pH-Gradientenelution das gewonnene Präparat in wenigstens sechzehn aktive Komponenten zerlegen.

So zeigt Pig. 1 die ionenaustauschchromatographische Auftrennung der Fraktion I (70 mg) in die Subfraktionen I.1-1.10 mit SE-Sephadex C-25 (Säule: 1,5 x HO cm; Eluant: 0,05 m NH₄Ac, Vorlage 100 ml pH 4,9» Durchfluß: 14 ml/Std) : Extinktion bei 280 nm; ..o.. : Trypsinhemmaktivität in mIU/ml; —^A— : pH-Kurve

Drei der aktivsten Hauptfraktionen konnten rein dargestellt und als IsoinhiMtoren I.B, I.E und I.G, jeweils "bestehend aus 58 Aminosäuren, mit Mol-Gewichten von 6.500 näher charakterisiert werden. In Fig. 1 sind sie "bei 2__t _5_ und 7. sichtbar, ihre Aminosäureanalysen sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt:

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T a b e lie

Inhibitoren	• 16	I.	B	48⁺>	7	I	16	.E	48	AS/to	I.	16	6
iydrol (Std)	6,99	„♦>	6,37	2	5,91	5,90	6	7,01	AS/to
Asp	1,79	6,20	1,50	5	2,12	1,99	2	1,94	7
Thr	5,00	1,76	4,53	6	5,22	4,58	5	3,24	2
Ser	6,20	5,27	6,10	5	7,22	6,60	7	8,32	3
&lu	5,00	6,17	4,82	6	4,96	4,92	5	2,64	8
Pro	5,90	4,90	6,04	3	7,02	6,99	7	6,03	3
GIy	2,98	6,04	3,12	0	2,63	2,94	3	1,93	6
kla	—	3,22	-	6	0,25	0,26	0	2,79	2
VaI	5,97	-	3,60	1	5,75	5,04	6	5,84	3
Cys	0,87	3,58	0,75	2	0,85	0,74	1	-	6
«et	1,76	0,75	2,00	2	1,94	1,94	2	1,87	0
lie	1,40	1,75	1,84	4	0,90	0,96	1	1 ,18	2
Leu	3,86	1,65	3,14	4	3,78	3,38	4	3,73	2
Ty r	3,78	3,44	3,64	1	3,88	3,52	4	3,39	4
Phe	1,02	3,56	1,01	4	0,98	0,96	1	2,01	4
Ly s	4,00	1,01	4,00	58	4,00	4,00	4	4,00	2
Arg		4,00				58		4
Summe				58

Tabelle

Aminosäureanalysenwerte der aus Weinbergschnecken isolierten Inhibitoren I.B , A.E und I.G (entsprechen den gereinigten Fraktionen 1.2, 1.5 und 1.7)

AS/ϊΊ = Aminosäuren pro Molekül

⁺ ' Analysenwerte aus der Fraktion 1.2.1 nach dreifacher Rechromatographie

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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Präparate, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Helix pomatia homogenisiert, das Homogenat zentrifugiert, den Überstand mit Ammonsulfat bis zu 63 i> der Sättigungskonzentration versetzt und die dabei entstandene Fällung abtrennt und an sich bekannten weiteren Reinigungsmaßnahmen unterwirft.

Gegenstand der Erfindung sind vor allem auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Präparate in Arzneimitteln, ferner die Arzneimittel selbst, die die erfindungsgemäßen Präparate enthalten.

Hierbei kommen folgende Indikationen in Präge:

I) Direkte, lokale, hämostyptische Wirkung zusammen mit Thrombin (allenfalls mit Tamponmaterial), allenfalls auch ohne Thrombin und bzw. oder andere Koagulantien.

II) Indirekte, lokal hämostyptische Wirkung prophylaktisch und therapeutisch.

III) Hemmung primärer Hyperfibrinolysezustände.

IV) Hemmung überstarker sekundärer Hyperfibrinolysezustände zur Ermöglichung einer Substitution (Pibrinogen) vor der Heparintherapie.

V) Gefäßabdichtung während der Heparintherapie bzw. der Therapie mit anderen Antikoagulantien bei Schockzuständen.

VI) Pankreatitis akuta.

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ad I) Zur Erzielung eines gehärteten, länger als ohne eine solche Härtung ausdauernden Verschlußthrombus bei Blutungszuständen, z. B. zur Nasentamponade (bei der 3etufigen Tamponade), zur Blutstillung im operierten Sinus maxillaris, zur Verstärkung der lokal blutstillenden Wirkung der Sengstaken-Blakemore-Sonde bei Oesophagusvarizenblutungen, bei Leberzirrhose usw., aufgeträufelt auf das Tamponadematerial (Oxycellulose, Fibrinschaum, Kollagenschaum usw.) 1000 E auf die Oberfläche des Tamponmaterials (Kontaktflächenbenetzung). Pur die Tamponade blutender Uteruskarzinon* kava - 10000 E zur Durchtränkung des Tampons.

ad II) Prophylaktisch:

1) Zur intra- und postoperativen Anwendung zur Verminderung postoperativer Blutungen und Embolien (etwa 2 Mill. E in 3 Tagen).

2) Zur Vermeidung von postoperativen Blutungen bei überdehntem Uterus und nach Myomektomie in der Gynäkologie (etwa 300 000 E per infusionem).

3) Zur Verminderung von Strahlenschäden bei Malignombestrahlungen (100 000 bis 200 000 E ante radiationem).

ad III) Zur Blockierung der durch Urokinase- und Streptokinase induzierten primären Hyperfibrinolyse 100 000 E per infusionem bei Blutungszwischenfällen mit Fibrinogen.

ad IV) Bei post partum MASSIVBLUTUNGEN mit unmittelbarer Verblutungsgefahr zusammen mit 3 - 6 g Fibrinogen, 100 000 E i. v.

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ad V) 1) Bei operierten intrazerebralen Blutungen - 100 000 E per infusionem.

2) Bei Rhexisblutungen zur Verminderung des Hirn-Endstrombahn-Oedems - 100 000 E 2 - 4mal tgl.

3) Zur Abdichtung der hyperpermeablen Kapillarstrombahn bei posthämorrhagischem und septischem Schock zusammen mit einem Antikoagulans..

Geeignete Zubereitungsformen für alle genannten Indikationen sind Ampullen, die den Wirkstoff in steriler, isotonischen Lösung enthalten.

Beispiel: (siehe auch das beigefügte Trennschema) Herstellung des Homogenate3

Es wurden 2 kg Weinbergschnecken (P. JV Jungwirth G.d.b.R., Hausen i. K.) in halbgefrorenem Zustand von ihren Gehäusen getrennt und mit 4 Liter Wasser bei 0 - 1O⁰C in 10 Minuten homogenisiert. Aus dem Homogenat erhielt man 4,1 Liter klaren Überstand, indem man 60 Minuten bei 12 000 U/min (Ultrazentrifuge Sorvall RC 2-B, 24 000 χ g) zentrifugierte.

Die folgenden Arbeiten wurden bis zur Neutralisierung des Trypsinharz-Eluats bei 0 - 4°C, sodann bei Raumtemperatur durchgeführt.

Fällung mit Ammoniumsulfat

In dem Überstand wurden unter ständigem Rühren 1839 g festes (NH^)₂SO₄ gelöst (447 g/Liter; 63 # gesättigt bei 3⁰C). Um den Niederschlag zu gewinnen, wurde 30 Minuten bei 12 000 U/min zentrifugiert. Der Niederschlag wurde sofort wieder ad 1,9 Liter Wasser suspendiert und weitgehend gelöst. Ein unlöslicher Rest wurde durch 30 Minuten Zentrifugation bei 12 000 U/min abgetrennt.

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Isolierung der Inhibitoren mit Trypsinharz

Die Isolierung der Inhibitoren mit Hilfe von aktivem, wasserunlöslichem Trypsinharz (Rindertrypsin polymer gebunden an CM-Cellulose, 7-10 U(BAEE)/mg; Merck AG, Darmstadt) (10, 11, 13) erfolgte im batch-Verfahren.

Dazu wurden 5 g Trypsinharz, das über Nacht in einem 0,1 m TRA-Puffer (0,4 m NaCl; pH 7,8) gequollen war, mit jeweils der halben Inhibitorlösung 60 Minuten bei pH 7 gerührt.
Nach dieser Zeit war in der Lösung keine merkliche Hemmaktivität gegenüber Trypsin mehr nachweisbar.

Das nach 20 Minuten bei 4000 U/min abzentrifugierte Harz
wurde durch wiederholtes Suspendieren mit 0,1 m TRA-Puffer (0,4 m NaCl; pH 7,8) und Zentrifugieren von nicht gebundenen Fremdsubstanzen gereinigt. Die 6. und letzte Waschlösung mit 0,01 m TRA-Puffer (0,04 m NaCl; pH 7,8) zeigte dann keine Färbung mehr. Eine Hemmaktivität war im Waschwasser nicht
nachzuweisen.

Der Inhibitor wurde dann durch mehrmaliges 10-minütiges
Rühren mit einer 0,4 m KCl/HCl-Lösung (pH 1,7) und Zentrifugieren wieder vom Harz eluiert. Die Elutionsvolumina
wurden sofort neutralisiert und ergaben insgesamt ein Volumen von 1 Liter.

Gelfiltration mit Sephadex G 50

Das Trypsinharz-Eluat wurde am Rotationsverdampfer bei 35 C und 12 Torr konzentriert, vom Salzniederschlag getrennt und auf einer Sephadex G 50 fine (Pa. Pharmacia, Frankfurt/faain; Korngröße 20 - 80 ax) Säule (6 χ 740 cm), äquilibriert mit 0,1 m Essigsäure, in 20-ml-Fraktionen aufgetrennt.

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Der Durchfluß betrug 100 ml/Stunde. Die von hochmolekularen Stoffen und Salzen freien Inhibitorfraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert.

Die Ausbeute an fast weißer Inhibitorsubstanz (Fraktion I) betrug 140 mg.

Auftrennung der Inhibitoren mit Sephadex C 25 durch pH-Gradient en-Elut ion

Die Elution von Sulfoäthyl-(SE)-Sephadex C 25 erfolgte stets mit 0,05 m NH.Ac-Puffer unter jeweils angegebenen pH-Bedingungen.

Auf eine Säule (1,5 x 140 cm) mit SE-Sephadex C 25 (Pharma= cia, Frankfurt/Main; Korngröße 40-120 /a), äquilibriert mit NH.Ac-Puffer pH 4,9» wurden 70 mg der Inhibitorsubstanz (Fraktion I), gelöst in 2 ml 0,05 m NH.Ac-Puffer pH 4,5, aufgegeben.

Um eine annähernd lineare pH-Gradienten-Elution zu erreichen, wurden 100 ml HH.Ac-Puffer pH 4,9 in einem engen Zylindergefäß vorgelegt und in einem weiten zylindrischen Becher NH.Ac-Puffer pH 8,0 angeschlossen. Der Durchfluß betrug 14 ml/Stunde.

Die gemessenen Aktivitäten der einzelnen Fraktionen zeigten fast durchweg Höchstwerte dort, wo auch die "Uvicord"-kur- e Maxima aufweist.

ReChromatographie mit Sephadex C 25

Die jeweils über Bio-Gel P2 (Fa. Bio-Rad Laboratories, Richmond CaI., USA; 100 - 200 mesh; Säulen: 0,8 χ 30 cm

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bzw. 0,8 χ 60 cm) entsalzten Fraktionen wurden an Säulen (0,8 χ 60 cm) aus SE-Sephadex C 25, äquilibriert mit 0,05 m NH.Ac, gereinigt.

Die Fraktionen 1.2 und 1.5 wurden bei pH 4,7 und die Fraktion 1.7 bei pH 5,7 rechromatogrfcphiert.

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1S

Trennschema

4

I

1.1

+ Sephadex

1.4

E

pH 1

,7

1

4,9 -

I
Rückstand

8,0

1.7.

1

•

1.2 1.3

+ Sephadex

I

1.7

1.8 1.9 1.10

I.G

1.2.1

G 50

I
Lösung

2

+ Trypsinharz

0 25

; pH

13

!
Rückstand

1.5

1.6

Schnecken

+ Sephadex

0*25

I
Überstand

1.2.2

1.5.

I.
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CJ25

I
Trypsinharz

1.5.

I.E

+ H₂O

Homogenisat

Rohextrakt

Trypsin-Inhibitor-Komplex

+ (NH₄)₂SO

+ KCl/HCl;

Niederschlag

Eluat

+ H₂O

Lösung

+ Sephadex

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Claims

Patentansprüche;

1) Polyvalente Proteaseninhibitorpräparate aus Helix pomatia, gekennzeichnet durch ihre Hemmwirkung gegenüber Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kininogenasen, durch einen Gehalt an Isoinhibitoren, durch ein Mol-Gev/icht von etwa 6500, durch einen Gehalt von 55 - 70 Aminosäureresten pro Molekül, durch vollständige Fällbarkeit mittels Ammoniumsulfat bis zu 63 i° der Sättigungskonzentration und durch einen isoelektrischen Punkt niedriger als 10,5.

2) Präparate nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt von 58 Aminosäureresten pro Molekül, durch Abwesenheit von Histidin und Tryptophan bei diesen Aminosäureresten und einen Argininrest im reaktiven Zentrum, der für die Hemmwirkung essentiell ist.

3) Verfahren zur Herstellung von Präparaten nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß,man Helix pomatia homogenisiert, das Homogenat zentrifugiert, den Überstand mit Ammonsulfat bis zu 63 i° der Sättigungskonzentration versetzt und die dabei entstandene Fällung abtrennt und an sich bekannten weiteren Reinigungsmaßnahmen unterwirft.

4) Verwendung der Präparate nach Anspruch 1 und 2 in Arzneimitteln.

5) Verwendung nach Anspruch 4 in Arzneimitteln, die die Fibrinolyse hemmen.

6) Verwendung nach Anspruch 4 in Arzneimitteln gegen Pankreatitis.

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7) Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Präparaten nach Anspruch 1.

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