DE2063070A1

DE2063070A1 - Verfahren zur Isolierung eines fibrinstabilisierenden Faktors

Info

Publication number: DE2063070A1
Application number: DE19702063070
Authority: DE
Inventors: Oswald Dr. 3550 Marbach; Biel Hans 3550 Marburg. A61k 17-00 Zwisler
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1970-12-22
Filing date: 1970-12-22
Publication date: 1972-06-29
Also published as: BR7108490D0; DE2063070C3; AT310941B; CA957943A; NL7117363A; SE371930B; AU432182B2; CH575235A5; AU3708871A; IL38403A0; GB1380056A; DE2063070B2; BE777136A; NL159582B; FR2119009B1; ES398016A1; IL38403A; JPS5421402B1; FR2119009A1; DK127227B

Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg / Lahn

Aktenzeichen: P 20 63 O7O.O Hoe 70/B 010 β Ha 129 b

Datum: 21. Dezember 1970 Dr. Tg/br

Verfahren zur Isolierung eines fibrinstabilisierenden Faktors

Die Anmeldung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung eines fibrinstabilisierenden Faktors aus menschlichen Plazenten.

Der fibrinstabilisierende Faktor - auch Faktor XIII genannt spielt bei der Blutgerinnung eine wichtige Rolle. Fehlt er im Blut, so treten bei Verletzungen starke Nachblutungen auf, und die Wundheilung verzögert sich. Der Faktor XIII-Mangel kann erblich bedingt sein oder als Folge von Krankheiten auftreten, so bei Lebercirrhoe, Karzinom, Leukämie und Verbrauchskoagulopathie. Diese Zustände können lebensbedrohliche Formen annehmen, besonders bei Neugeborenen sowie bei Schwangeren, bei denen der Faktor XIII-Mangel zu Fehlgeburten führt.

Durch Substitution können diese Mangelzustände behoben werden. Dabei hat man sich bisher damit geholfen, daß man Blut, Plasma oder Fibrinogen-Präparate verwendete. Hiervon muß jedoch jeweils ein größeres Volumen infundiert werden, was in vielen Fällen unerwünscht, zudem lästig und zeitraubend ist. Außerdem werden dem Patienten dabei zwangsläufig Begleitproteine und Blutgruppensubstanzen verabreicht, die zu Unverträglichkeiten führen können. Es ist daher ein Präparat erwünscht, das eine hohe fibrinstabilisierende Aktivität besitzt, weitgehend

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frei von Begleitproteinen ist und auch keine Bltitgruppensubstanzen enthält.

Es ist zwar bereits bekannt, daß der Faktor XIII im Blutplasma und in Thrombozyten enthalten ist und aus ihm gewonnen werden kann. Seine Darstellung erfolgte durch Fällung mittels Ammonsulfat, Erhitzen und DEAE-Cellulose-Chromatographie. Die Konzentration des fibrinstabilisierenden Faktors in Plasma ist jedoch.niedrig und die Ausbeute des angegebenen Verfahrens daher gering. Die Erhitzung bei der der Faktor XIII vom Fibrinogen getrennt wird, ist nur mit kleineren Ansätzen durchführbar. Das Verfahren hat daher in die Technik keinen Eingang gefunden und keinerlei Bedeutung erlangt.

Auch ist Plasma als Ausgangsmaterial für die gewerbliche Gewinming des Faktors XIII zu teuer. Aus dem gleichen Grunde sind die Thrombozyten keine Quelle für die industrielle Herstellung des Faktors XIII.

Es wurde nun gefunden, daß man den fibrinstabilisierenden Faktor XIII in guten Ausbeuten aus menschlichen Plazenten isolieren kann. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung des Faktors XIII, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) einen mittels NaCl-Lösung aus menschlichen Plazenten hergestellten, von festen Verunreinigungen befreiten Extrakt bei pH 5fO " 7i5i vorzugsweise 6,0, mit einer ca. 3 $ igen Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat (Rivanol® ) versetzt,

b) den ausgefallenen Niederschlag in neutralem wäßrigen Medium mit 1,5 - 3 $i vorzugsweise 2 $, Alkalichlorid, vorzugsweise NaCl zerlegt, 12-20 Volumprozente eines niederen Alkohols, vorzugsweise Äthanol, zugibt und den Niederschlag abtrennt, .

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c) den Überstand klärt, die Alkalichlorid-Konzentration durch Zugabe von Wasser auf ü~ 2 $, vorzugsweise ca» 1 $, erniedrigt, die Lösung bei -5 bis +5 C, vorzugsweise O C, und pH 5,5 - 6,5, vorzugsweise 5,8, mit 12 - 20 $ eines niederen Alkohols, vorzugsweise Äthanol, versetzt,

d) den Rückstand in neutralem EDTA-Alkalihydroxidpuffer, der außerdem geringe Mengen NaCl, NaN_ und Glucose enthalten kann, bei ca. O C löst, einen eventuell hinterbleibenden unlöslichen Rückstand entfernt und die Lösung mittels Gelfiltration fraktioniert,

Ionenaustauscher auf -basis

e) die aktiven Fraktionen air Cellulose^ chromatographiert,

mit verdünnter, eine geringe Menge 6-Aminocapronsäure enthaltender neutraler NaCl-Lösung eluiert und das Eluat gegen neutralen 0,01 - 0,02, vorzugsweise 0,015 $ igen Na-Phosphatpuffer, der eine geringe Menge Glucose enthält, dialysiert,

f) die dialysierte Lösung gegebenenfalls mit einem Stabilisator versetzt, sterilfiltriert, standardisiert und lyophil trocknet.

Geeignete Stabilisatoren (vgl. (i)) sind z. B. Humanalbumin oder hydrolytisch abgebaute, mittels Isocyanat quervernetzte Gelatine, wie sie unter dem Namen Haetnaccel* im Handel erhältlich ist.

Der erfindungsgemäß isolierte fibrinstabilisierende Faktor aus menschlichen Plazenten unterscheidet sich nicht charakteristisch vom Thrombozyten-Faktor XIII, wohl aber vom Plasma-Faktor XIII. Die chemischen und physikalisch-chemischen Daten sind in folgender Tabelle zusammengestellt:

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Fakt or XIII aus

■	Plasma	Thrombozyten	Plazenta
Sedimentat. Koeffizient	8,4 S '	7,^ S	7,2 s
Molekulargewicht	300.000	150.000-200.000	165.OOO
Kohlenhydratgehalt in ^	h,9	1,5	1,^7
Hexosen	1,9	1,2	0,98
Fukose	0,2	0,0	0,0
Hexosamin (N-Acetyl-)	1.6	0,16	0,28
Neuramins äure (N-Acetyl-)	1,2	0,15	0,21 '
Aminosäurereste pro 100 Aminosäuren
Lysin	6,3	5,7	5,1
Histidin	2,5	2,0	1,9
Arginin	5,5	6,2	6,2
Asparaginsäure	10,4	12,2	12,2
Thre onin	7,2	5,9	6,2
Serin	7,2	5,8	6,1
Glutaminsäure	12,7	10,8	11,0
Prolin	5,7	4,6	h,9
Glycin	7,9	7,1 . ·	7,0
Alanin	*»,1	5,3	5,3
Valin	7,5	9,9	9,7
Methionin	2,0	2,6	2,6
Isoleucin	4,8	5,2	5,0
Leucin	7,3	6,8	6,7
Tyrosin	5,0	^.2	4,4
Phenylalanin	3,9	**,5	4,6
1/2 Cystein	?	1,2	1,1

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Die Aktivität des fibrinstabilisierenden Faktors wird durch einen Verdünnungstest (vgl. Thromb. diathes. haemorrh. 2Ί, ^55 (1970)) bestimmt. Man macht sich dabei die unterschiedliche Löslichkeit des vernetzten und (mangels fibrinstabilisierenden Faktors) nicht vernetzten Fibrins in 1 $ iger Chloressigsäure zunutze. Mit steigenden Verdünnungen der zu bestimmenden Lösung werden zunächst aus Faktor Xlll-freiem Fibrinogen mittels Thrombin Fibringerinnsel erzeugt und mit 1 $ iger Chloressigsäure inkubiert. Danach wird diejenige Verdünnung, in der das Fibringerinnsel gerade noch erhalten bleibt, bestimmt. Diese ist die Faktor XIII-Konzentration, die zur Vernetzung gerade ausreicht. In der nächsthöheren Verdünnung löst sich das Fibringerinnsel auf.

Als Bezugssubstanz dient normales menschliches Mischplasma. Die in 1 ml enthaltene Faktor XIII-Aktivität ist als eine Einheit definiert. Die gesuchte fibrinstabilisierende Aktivität errechnet sich aus dem Verhältnis der Grenzwerte für die Verdünnung von Mischplasma und Testlösung.

Als Anwendung für den erfindungsgemäß erhaltenen Faktor XIII kommen alle Faktor XIII-Mangelzustände in Frage, so bei angeborenem Mangel und daraus sich ergebenden haemorrhagischen Syndromen, Blutungen und Wundheilungsstörungen, sowie bei vorübergehendem Faktor XIII-Mangel, z. B. nach Operationen und daraus resultierender ¥undheilungsverzögerung. Die den Faktor XIII enthaltende Lösung wird intravenös injiziert. Man geht zweckmäßig von einer Menge aus, die der Faktor XIII-Aktivität von 25O ml frischem Humanplasma entspricht. Je nach Bedarf kann bis zur vierfachen Menge appliziert werden.

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Beispiel

50 kg gefrorene Plazenten vom Menschen werden fein zerkleinert und mit 50 Liter einer 0,5 fo igen NaCl-Lösung verrührt. Das Gemisch wird auf +10 C erwärmt und zentrifugiert. 45 Liter dieses Extraktes werden mit einer 3 /° igen Rivanollösung (ca. 6 - 10 g, vorzugsweise 8 g Rivanol auf 100 g Eiweiß) versetzt, die dadurch entstandene Fällung in neutralem Wasser suspendiert und Natriumchloridlösung bis zu einer NaCl-Konzentration von 1»5 - 3 $» vorzugsweise 2 $, zugegeben. Nach 15 Minuten Rühren werden bei 10 - .25 C, vorzugsweise 20 C, 4,55 Liter Äthanol zugefügt und eine Stunde gerührt. Der bei der Zentrifugation entstandene Rückstand wird verworfen,

Der Überstand, in dem sich die fibrinstabilisierende Aktivität befindet, wird mit Aktivkohle geklärt, die Natriumchloridkonzentration durch Zugabe von neutralem Wasser auf 1 % erniedrigt, die Lösung auf 0 C abgekühlt und 3i7 Liter Äthanol eingerührt. Der pH-Wert wird auf pH 5? 8 einges-tellt. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgegossen und verworfen.

Der Rückstand wird in 100 ml EDTA-Natriumhydroxid-Puffer pH 7,0, der 0,1 # EDTA, 1 $ Natriumchlorid, 0,1 $ Natriumazid und 0,5^ Glukose enthält und auf O⁰C vorgekühlt wurde, aufgenommen. Nach dem Lösen wird der pH-Wert auf J_t 0 nächgestellt. Durch Zugabe von frischem Natriumchlorid wird die Natriumchlorid-Konzentration auf 2 $ erhöht. Unlösliches wird durch Zentrifugieren entfernt. Der überstand wird mittels Sephadex fraktioniert und mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Puffer, der 0,005 mol/l EDTA und Oj 1 fo Natriumazid enthält, eluiert. Das Eluat wird in einem Fraktionssammler aufgefangen. Die vereinigten aktiven Fraktionen enthalten etwa 1200 mg Eiweiß, das an uellulose adsorbiert wird. Dafür werden 24 ml Cellulose gebraucht.

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Für die Elution werden $0 ml einer Lösung aus 0,6 $ Natriumchlorid und 0,1 °p £-Aminocapronsäure pH 7t 0 verwendet. Das Eluat wird Zh Stunden gegen 50 Liter eines 0,015 ?° igen Natriumphosphatpuffers pH 7»0, der 5 mg Glukose pro ml enthält, dialysiert.

Axis dem Endprodukt wurden 2ht Abfüllungen mit der Aktivität von jeweils 25O ml Fx'ischplasma gewonnen. Diese Menge entspricht mehr als 120 Liter Blut.

Da die Aktivität des Ausgangsniaterials nicht immer gleichbleibend ist, können auch die Ausbeuten schwanken. Atis einem analogen Ansatz mit 45 Liter Plazentenextrakt wurden 1^7 Abfüllungen mit der Aktivität von jeweils 25O ml Frischplasma gewonnen, entsprechend einer Me^nge von mehr als 70 Liter Blut. Aus beiden Ansätzen hat sich jedoch gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren technisch vorteilhaft ist.

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Claims

tj Verfahren -zur Isolierung eineg fibrinstabilisierenden Falttors,; * gek©ni).zelclinet._t, daß mart

a) einen mittels NaCl-JLo'sung; aus menschlichen Plazenten hergestellten,, von festen Yerunreinigtiiigen befreiten Extrakt bei pH 5t,0 "* 7*5* vorzugsweise 6,O_t mit einer ca. 3 $ igen Mtsjung Λ?Όοα Dianiijioatlioxyacriciinlactat (Rivanol - ) ver-

b) den ausgefallenen Niederschlag in netitralera ■ "wäßrigen Medium mit 1:,,5 - 3 ^> VQrzugsvoise 2 <fo_t, Alkaliehlorid, vorzugsweise N-aC'l zearlegt,. 12^; -■ 2:0 Volumprozente eines niederen Alkohols, vorzugsweise Äthanol, zugibt und den Niederschlag abtrennt,,

o) de.» ijbers.tandi klärt,, die Alkaliehlorid-Konzentration

durelx, Ztigafee -worn. Hasser auf ■=· 2 fo, vorzugsweise ca. 1; ^, die Liisung· %&±. —$■ b±.s +5 G* vorzugsweise © C,

umdi pH 5*5 - ^«5» vccrz^gsweise 5»®* ¹Sit Λ 2. -■ ZQ ^ eines

l» versetzt.

dien Rtiekstandl in neutraleia EJD/EÄ-Älkalihvdiroxidpuffer^ der a.uß;er«lem: geringe Mengen KaCl* NaKo, tmd ©lu«3iO;se; enthalten kann, bei ca« © G lost,, einen» eyentiiell foimterbXeibendem tmlöslichen Rückstand entfernt und die Lösung mittels fraktioniert:*

e)j die aktiven FxaktJ.onien. aii €;e:llulose mit verdiiinn-ter,, ©ine- geiringe Menge ^-

neutraler· HaGl«iiisung; elusier-t, undi cEas

.geringe'

f) die dialysierte Lösung gegebenenfalls mit einem Stabilisator versetzt, sterilfiltriert, standardisiert und lyophil trocknet.
2) Verfahren zur Isolierung eines fibrinstabilisierenden Faktors, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliche Plazenten als Ausgangsmaterial verwendet.

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