DE2063070B2

DE2063070B2 - Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinstabilisierender Wirkung

Info

Publication number: DE2063070B2
Application number: DE2063070A
Authority: DE
Inventors: Hans 3550 Marburg Biel; Oswald Dr. 3550 Marbach Zwisler
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1970-12-22
Filing date: 1970-12-22
Publication date: 1974-12-05
Also published as: CH575235A5; DE2063070A1; AU3708871A; DK127227B; FR2119009A1; ES398016A1; FR2119009B1; DE2063070C3; NL159582B; IL38403A; BR7108490D0; IL38403A0; BE777136A; JPS5421402B1; NL7117363A; GB1380056A; AT310941B; AU432182B2; CA957943A; SE371930B

Description

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Der fibrinstabilisierende Faktor — auch Faktor XII! fenannt — spielt bei der Blutgerinnung eine wichtige Rolle. Fehlt er im Blut, so treten bei Verletzungen starke Nachblutungen auf, und die Wundheilung verjrösert s:;ch. Der Faktor-XIII-Mangel. kann erblich bedingt sein oder als Folge von Kranktieilen auftreten, so bei Lebercirrhose, Karzinom. Leukämie Und Yerbrauchskoagulopathie. Diese Zustände können lebensbedrohliche Formen annehmen, besonders bei 'Neugeborenen -,owie bei Schwangeren, bei denen der Faki:or-Xlii--Mangel zu 1 ehigeburten führt.

Durch Substitution können diese Mangelzustände behoben werden. Dabei hat man sich bisher damit geholfen, daß man Blut, Plasma odei Fibrinogen-Präparaiie verwendete. Hiervon muß jedoch jeweils ein größeres Volumen infundiert werden, was in vielen Fällen unerwünscht, zudem lästig und zeitraubend ist. Außerdem werden dem Patienten dabei zwangsläufig Begleitproteine und Hlutgruppensubstanzen verabreicht, die zu Unverträglichkeiten führen können. Es ist daher ein Präparat erwünscht, das eine hohe librinstabilisierende Aktivität besitze weit-

	Plasma	Faktor XIIl aus Thrombozytcn	Plazenta
Sedimentat. Koeffizient.... Molekulargewicht Kohlenhydrat- gehalt'in % ... Hexosen Fukose	8.4 S 300 000 4,9 1,9 0,2	7,4 S 150 000 bis 200 000 1,5 1,2 0,0	7,2 S 165 000 1,47 0,98 0.0
Hexosamin (N-Acetyl-) ... Neuraminsäure (N-Acetyl-) ... An.inosäurereste pro 100 Amino säuren Lvsin	1,6 1,2 63	0,16 0,15 5.7	0,2S 0,21 5,1
Histidin	2^5	2.0	1.9
Arcinin . . .	5.5 10.4 7.2 7.2	12,2 5,9 5.8	6.2
Asparaginsäure Threonin Serin . . .	12,7 5,7	10,8 4,6	12,2 6.2 6.1
Glutaminsäure Prolin ...	7,9 4,1	7,1 5,3	11,0 4,9
Glycin	7,5	9,9	7,0 5.3
Alanin	2,0 4,8 7,3	2,6 5,2 6,8	9,7
Valin .	50	4 ~"	2,6 5,0 6,7
Methionin .... Isoleucin...	3,9	4,5 1,2	4,4
Leucin ....	4,6 1,1
Tvrosin
Phenylalanin .. ¹Z, Cystein

Der im erfindungsgemaO erhältlichen Mittel enthaltene fibrinstabilisierende Faktor aus menschlichen Plazenten unterscheidet sich nicht charakteristisch vom Thrombozyten-Fakitor XIlI, woM aber vom Plasma-Faktor XIlI, Die chemischen und physikalisch-chemischen Daten sind in vorstehender Tabelle zusammengestellt.

Die Aktivität des fibrinstabilisierenden Faktors wird durch einen Verdönnungstest (vgl. Thromb. diathes. haemorrh., 23, 455 [1970]) bestimmt. Man macht sich dabei die unterschiedliche Löslichkeit des vernetzten und (mangels fibrinstabilisierenden Faktors) nicht vernetzten Fibrins in l%iger Chloressigsäure zunutze. Mit steigenden Verdünnungen der zu bestimmenden Lösung werden zunächst aus Faktor-XIII-freiem Fibrinogen mittels Thrombin Fibringerinnsel erzeugt und mit l%iger Chloressigsäure inkubiert. Danach wird diejenige Verdünnung, in der das FibringerinnsJ, gerade noch erhalten bleibt, bestimmt. Diese isc die Faktor-XIII-Konzentration, die zur Vernetzung gerade ausreicht. In der nächsthöhcien Verdünnung löst sich das Fibringerinnsel auf.

Als Bezugssubstanz dient normales menschliches Mischplasma. Die in 1 ml enthaltene Faktor-XIII-Aktivität ist als eine Einheit definiert. Die gesuchte fibrinstabilisierende Aktivität errechnet sich aus dem Verhältnis der Grenzwerte für die Verdünnung von Mischplasma und Testlösung.

Als Anwendung für den das erfindungsgemäß erhaltene Arzneimittel, das den Faktor XtII enthält, kommen alle Faktor-Xllt-Mangel?^tlstände in Frage, so bei angeborenem Mangel und daraus sich ergebenden haemorrhagischen Syndromcn, Blutungen und Wundheilungsstörungcn sowie bei vorübergehendem Faktor-XIII-Mangel, z. B. nach Operationen und daraus resultierender Wundheilungsverzögerung. Die den Faktor XIII enthaltende Lösung wird intravenös injiziert. Man geht zweckmäßig von einer Menge aus, die der Faktor-XIII-Aktivität von 250 ml frischem Humanplasma entspricht. Je nach Bedarf kann bi? zur vierfachen Menge appliziert werden.

Beispiel 1

50 kg gefrorene Plazenten vom Menschen werden fein zerkleinert und mit 501 einer 0,5%igen NaCl-Lösung verrührt. Das Gemisch wird auf -}-10°C erwärmt und zentrifugiert. 451 dieses Extraktes werden mit einer 3%igen Diaminoätli ixyacridinlactat-Lösung bis zu einer Konzentration von 8 g Diaminoäthoxyacridinlactat pro 100 g Eiweiß versetzt, die dadurch entstandene Fällung in neutralem Wasser suspendiert und Natriumchloridiösung bis zu einer NaCl-Konzcntration von 2% zugegeben. Nach 15 Minuten Rühren werden bei 20⁰C 4,55 1 Äthanol zugefügt und 1 Stunde gerührt. Der bei der Zcntrifugation entstandene Rückstand wird verworfen.

Der Überstand, in dem sich die librinstabilisierende Aktivität befindet, wird mit Aktivkohle geklärt, die Natriumchloridkonzentration durch Zugabe von neutralem Wasser auf 1 "/„ erniedrigt, die Lösung auf O⁰C abgekühlt und 3,7 1 Äthanol eingerührt. Der pH-Wert wird auf pH 5,8 eingestellt. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgegossen und verworfen.

Der Rückstand wird in 100 ml Äthylendiamintetracssigsäure (EDTA)-Natriumhydroxid-Puffer pH 7,0, der 0,1 % EDTA, 1 % Natriumchlorid, 0,1 % Natriumazid und 0,5% Glukose enthält und auf 0⁰C vorßekühlt wurde, aufgenommen. Nach dem Lösen wird der pH-Wert auf 7,0 nachgestellt. Durch Zugabe von frischem Natriumchlorid wird die Natriumchlorid-{Conzentration auf 2% erhöht. Unlösliches wird durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wird mittels dreidimensional vernetzten! Dextran fraktioniert und mit Tris-ihydroxymethyD-aramomethan-HCl-Puffer, der 0,005 Mol/l EDTA und 0,1% Natriwnazid enthält, eluiert. Das Eluat wird fn einem Fraktionssammler aufgefangen. Die vereinigten aktiven Fraktionen enthalten etwa 1200 mg Eiweiß, das an Diäthylenaminoäthyl-Cellulose mit einer von 100 bis 200 μ. und einer Kapazität von 0,9 bis 1,0 mäq/g adsorbiert wird. Dafür werden 24 ml Cellulose gebraucht.

Für die Elution werden 50 ml einer Lösung auf 0,6 % Natriumchlorid und 0,1 % ε-Aininocapronsäure pH 7,0 verwendet Das Eluat wird 24 Stunden gegen 50 1 eines 0,015 %igen Natriumphosphatp^.-.^ pH 7,0, der 5 mg Glukose pro Milliliter enthält, dialysiert.

ίο Aus dem Endprodukt wurden 241 Abfüllungen mit der Aktivität von jeweils 250 ml Frischplasma gewonnen. Diese Menge entspricht mehr als 120 1 Blut.

Da die Aktivität des Ausgangsmaterials nicht immer gleichbleibend ist, können auch die Ausbeuten

as schwanken. Aus einem analogen Ansatz mit 451 Plazentenextrakt wurden 147 Abfüllungen mit der Aktivität von jeweils 250 ml Frischplasma gewonnen, entsprechend einer Menge von mehr als 70 1 Blut. Aus beiden Ansätzen hat sich jedoch gezeigt, daß das ertindungsgemäße Verfahren technisch vorteilhaft ist.

Beispiel 2

50 kg gefrorene Plazenten vom Menschen werden fein zerkleinert und mit 501 einer 0,2%igen NaCl-Lösung verrührt. Das Gemisch wird auf +10⁰C erwärmt und zentrifugiert. 451 dieses Extraktes werden mit einer 3%igen Dia.ninoäthoxyacridin-Lösung bis zu einer Konzentration von 6 g Diaminoäthoxyacridinlactat pro 100 g Eiweiß versetzt, die dadurch entstandene Fällung in neutralem Wasser suspendiert und Natriumchloridiösung bis zu einer NaCl-Konzentration von 3% zugegeben. Nach 15 Minuten Rühren werden bei 10⁰C 4,551 Äthanol zugefügt und 1 Stunde gerührt. Der bei der Zentrifugation entstandene Rückstand wird verworfen.

Der Überstand, in dem sich die fibrinstabilisierende Aktivität befindet, wird mit Aktivkohle geklärt, die Natriumchloridkonzentration durch Zugabe von neutralem Wasser auf 1% erniedrigt, die Lösung auf 0°C abgekühlt und 3,7 1 Äthanol eingerührt. Der pH-Wert wird auf pH 5,8 eingestellt. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgegossen und verworfen.

Der Rückstand wird in 100 ml EDTA-Natriumhydroxifi-Puffcr pH 7,0, der 0,1 % EDTA, 1 % Natriumchlorid, 0,1 % Natriumazid und 0,5% Glukose enthält und auf 0⁰C vorgekühlt wurde, aufgenommen. Nach dem Lösen wird der pH-Wert auf 7,0 nachgestellt. Durch Zugabe von frischem Natriumchlorid wird die Natriiimchlorid-Konzentratton auf 2% erhöht. Unlösliches wird durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wird mittels dreidimensional vernetztem Dextran fraktioniert und mit Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer, der 0,005 Mol/l EDTA und 0,1'% Natriumazid enthält, eluiert. Das Eluat wird in einem Fraktionssammler aufgefangen. Die vereinigten aktiven Fraktionen enthalten etwa 1200 mg Eiweiß, das an Diäthylaminoäthyl-Cellulose mit einer

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Standardkörnung von 100 bis 200 |«n und einer Kapazität von 0,9 bis 1,0 m8q/g adsorbiert wird. Dafür werden 24 ml Cellulose gebraucht.

Für die Elution werden 50 ml einer Lösung aus 0,6% Natriumchlorid und 0,1% e-Aminocapronsäure pH 7,0 verwendet. Das Eluat wird 24 Stunden gegen 501 eines 0,0X5 %igen Natriumphosphatpuffers pH 7,0, der 5 mg Qlukose pro Milliliter enthalt, dialysiert.

Beispiel 3

50 kg gefrorene Plazenten vom Menschen werden fein zerkleinert und mit 501 einer l,0%igen NaCl-Lösung verrührt. Das Gemisch wird auf +10⁰C erwärmt und zentrifugiert. 45 1 dieses Extraktes werden mit einer 3%igen Diaminoäthoxyacridin-Lösung bis zu einer Konzentration von 10 g Diaminoäthoxy-

acridinlactat pro IQOg Eiweiß versetzt, die dadurch entstandene Fällung in neutralem Wasser suspendiert und Natriumchloridlösung bis zu einer NaCI-Konzentration von 3% zugegeben. Nach 15 Minuten Rühren werden bei 23°C 4,551 Äthanol zugefügt und 1 Stunde gerührt. Der bei der Zentrifugation entstandene Rückstand wird verworfen.

Der Überstand, in dem sich die fibrinstabilis^!erende Aktivität befindet, wird mit Aktivkohle geklärt, die

ίο Natriumchloridkonzentration durch Zugabe von neutralem Wasser auf 1% erniedrigt, die Lösung auf 0⁰C abgekühlt und 3,71 Äthanol eingerührt. Der pH-Wert wird auf pH 6,5 eingestellt. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgegossen und verworfen.

Der Rückstand wird gemäß Beispiel 2 weiterverarbeitet.

Claims

Patentanspruch:

Verfuhren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinstabilisierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen mittels NaCl-Lösung aus menschlichen Plazenten hergestellten, von festem Verunreinigungen befreiten Extrakt bei pH 5,0 bis 7,5 mit einet etwa 3%igen Lösung \on Diamino ätlioxyacridinlactat versetzt,

b) den ausgefallenen Niederschlag in neutralem wälßrigem Medium mit 1,5 bis 3% NaCl zerlegt, 12 bis 20 Volumprozent eines niederen Alkohols zuEtbt und den Niederschlag abinsnnt,

c) den Überstand klärt, die Natriumchlorid-Konzentration durcli Zugabe von Wasser auf i2°„ erniedrigt, die Lösung bei —5 bis + 5^CC und pH 5.5 bis 6,5 mil. 12 bis 20°_o eines niederem Alkohols versetzt.

d) den Rückstand in neutralem Athylendiamin-'tnraessigsäure-Alkalihydroxidpuflfer, der außerdem geringe Mengen NaCl, NaN-, und Glucose enthalten kann, bei etwa OC lost, einen e\entuell hinterbleibenden unlöslichen Rückstand entfernt und die Lösung mittels Gelfiltration fraktioniert,

e) die aktiven Fraktionen an einem Ionenaustauscher auf Cellulose-Ba-.is Chromatographien, mit verdünnter, eine geringe Menge ε-Aminocapronsäure enthaltender neutraler NaCl-Lösung eiuiert und das Eluat gegen neutialen 0,01- bis 0,02 "„igen Na-Phosphatpuffer, der eine geringe Menge Glucose enthält, dialysiert,

f) die dialysierte Lösung gegebenenfalls mit einem Stabilisator versetzt, sterilfiltriert, standardisiert und iyophil trocknet.

gehend frei von Begleitproteinen ist und auch keine Blutgruppensubstanzen enthält.

Es ist zwar bereits bekannt, daß der Faktor XTJI im Blutplasma und in Thrombozyten enthalten ist und aus ihm gewonnen werden kann. Seine Darstellung erfolgte durch Fällung mittels Ammonsulfat, Erhitzen und DEAE-Cellulose-Chromatographie, Die Konzentration des fibrinstabilisierenden Faktors in Plasma ist jedoch niedrig und die Ausbeute des angegebenen Verfahrens daher gering. Die Erhitzung, bei der der Faktor XIII vom Fibrinogen getrennt wird, ist nur mit kleineren Ansätzen durchführbar. Das Verfahren hat daher in die Technik keinen Eingang gefunden und keinerlei Bedeutung erlangt.

Auch ist Plasma als Ausgangsmaterial für die gewerbliche Gewinnung des Faktors XIlI zu teuer. Aus dem gleichen Grunde sind die Tk ombozyten keine Quelle für die industrielle Herstellung des Faktors XIII.

Es wurde nun gefunden, daß man den fibrinstabilisierenden Faktor XIH in guten Ausbeuten aus menschlichen Plazenten isolieren kann. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinostabilisierender Wirkung, gekennzeichnet durch die im Patentanspruch wiedergegebenen Maßnahmen.

Geeignete Stabilisatoren [vgl.(f)] sind z. B. Humanalbumin oder hydrolytisch abgebaute, mittels Isoc >anat quervernetzte Gelatine, wie sie unter dem geschützten Warenzeichen Haemaccel im Handel erhältlich ist.