DE2204053A1

DE2204053A1 - Insulinderivate

Info

Publication number: DE2204053A1
Application number: DE19722204053
Authority: DE
Inventors: Derek George; Ko Arthur Sai Chun; Mill Hill London Smith (Großbritannien)
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: National Research Development Corp UK
Priority date: 1971-01-28
Filing date: 1972-01-28
Publication date: 1972-08-17
Also published as: AU3821372A; IE36225B1; FR2123524A1; SE382452B; FR2123524B1; AU472582B2; CH547777A; BE778538A; NL7201179A; IE36225L

Description

DR. MÜLLER-BORE DlPL-PHYS. DR. MANITZ DIPL.-CHEM. DR. DEUFEL DIPL-ING. FINSTERWALD DIPL-ING. GRÄMKOW

Jan. 1272

Ph/th - N 1055

EATIOUAL RESEARCH DEVELOPMENT CORPORATION 66/74 Victoria Street, London, S.W.1

England

Insulinderivat e

Priorität: Großbritannien vom 28. Januar 1971 ■ Nr. 3387/71 und 3388/71

Die Erfindung betrifft Insulinderivate. TJa eingehendere Methoden zum Nachweis von Diabetes mellitus eingeführt werden und da die normale Lebenserwartung langer wird, steigt das verzeichnete Auftreten dieser Krankheit ständig. Die derzeitige Behandlung besteht in diätetischer Steuerung, gewöhnlich in Kombination mit Insulininjektionen oder mit einem oralen Antidiabetesmittel, und in vielen Fällen sind einmalige oder zweimalige Injektionen pro Tag während des ganzen Lebens des Patienten notwendig. Selbst bei einer solchen Behandlung variiert der Blutzuckerspiegel des Patienten beträchtlich gegenüber dem Normalen, was strikte Diät notwendig macht. Orale Mittel sind nur in milden Fällen von Diabetes geeignet und werden jetzt als mit unerwünschten

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Dr. Müller-Bor« Dr. Manltz · Dr. Deufel · Dlpl.-Ing. Finsterwald Dlpl.-Ing. Qrämkow Braunschweig, Am Bürgerpark 8 8 München 22, Robert-Koch-Siraße 1 7 Stuttgart-Bad Cannetatt, MarktetraSe

Nebenwirkungen behaftet angesehen. Zusätzlich zu den vorgenannten Nachteilen der derzeitigen Behandlung erzeugt ein Teil der Diabetiker Antikörper gegen das Insulin und wird zunehmend resistent gegenüber seiner Wirkung.

Ziel der Erfindung ist es, verbesserte therapeutische Mittel zu schaffen, die eine bessere Steuerung des Bl'tzuckerspiegels bieten, als sie durch gegenwärtige Behandlungsverfahren erreicht wird. Dazu wurden eingehende Untersuchungen der Eigenschaften von Insulinderivaten durchgeführt, ein Feld, auf dem trotz der Anstrengungen vieler Forscher bislang wenig definierte Schlüsse hervorgegangen sind, weitgehend aufgrund des FehlSchlages, die einzelnen.Komponenten des komplexen Gemische zu trennen und angemessen zu identifizieren, das aus der Acylierung und anderen Reaktionen, denen die ursprünglichen Insuline unterworfen wurden, hervorgeht .

Insbesondere ist eines der Ziele dieser Erfindung die Schaffung von Insulinderivaten, die leicht wasserlöslich sind, aus einem fieaktionsgemisch leicht isoliert werden, annehmbare immunologische Eigenschaften besitzen und ein beträchtliches Maß an hypoglykämischer Aktivität der ursprünglichen Substanz beibehalten.

Erfindungflgemäße Insulinderivate, die die vorgenannten Ziele zu einem hohen Maß erfüllen, sind solche, bei denen wenigstens eine der Aminogruppen der A^- (Glyzin), B. (Phenylalanin) und B₂Q- (Lysin) Aminosäureeinheiten in eine blockierte Aminogruppe mit einem zur Bildung eines Anions befähigten Substituenten umgewandelt ist. Vorzugsweise ist der Substituent ein solcher, der, wenn er ionisiert ist, eine negative Ladung

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trägt und so frei beispielsweise von anderen Resten wie etwa Aminogruppen ist, die insgesamt auf den Substituenten elektrischen Ausgleich liefern könnten.

Vorteilhafterweise sind wenigstens zwei und erwünschtermaßen alle drei der genannten Aminogruppen durch Ersatz eines oder mehrerer Wasserstoffatome in blockierte Aminogruppen überführt.

Die zuvor definierten neuen InsuÜnderivate sind nicht nur biologisch wirksam auf ihrem eigenen Gebiet, sondern von zusätzlichem Interesse als Zwischenstufen, mit denen weitere chemische Modifizierung des Insulinmoleküls durchgeführt werden kann, wodurch ein weiterer Portschritt in Richtung auf die Schaffung stärker gesteuerter und wirksamerer Therapie als bisher ermöglicht wird. Die genannten zusätzlichen hodifizierungen gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung sind an den in Tyrosineinheiten der Insulinmoleküle enthaltenen Hydroxylgruppen realisiert. Das Blockieren der Hydroxylgruppen des Tyrosins läßt gewöhnlich ein verhältnismäßig inaktives Derivat entstehen, während aber die Blockierung von Aminogruppen im allgemeinen von Dauer ist, ist die Tyrosinblockierung als vorübergehende Maßnahme beabsichtigt, wobei die Verbindung langsam in vivo zu ihrem biologisch aktiven Vorläufer zurückführt. Die letztere Wirkung findet als Folge enzymatischer oder chemischer Hydrolyse in vivo statt, und in Abhängigkeit von der Wahl der blockierenden Gruppe unterscheidet sich die Umkehrrate von Derivat zu Derivat. Der Zweck der l'yrosinblockierung ist die Senkung des anfänglichen hypoglykämischen Effekts nach der Anwendung der Substanz, was die Anwendung einer höheren Dosis ermöglicht. Hach und nach erfolgende Rückumwandlung zu einem

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aktiven. Derivat führt daher zu einem spiegelartigen Küster der Steuerung des Blutzuckers. Die durch. Anwendung von Insulinderivaten auf diese Weise insgesamt erzielte Wirkung ist eine Verlängerung der hypoglykämischen Wirksamkeit.

Erfindungsgemäß geschaffene Derivate haben einen hypoglykämisehen Effekt bewirkt, der längere Zeit dauerte als der des 4. International Standard für Insulin, bei einem Test an .Meerschweinchen.

Der Einfachheit halber werden die Prinzipien, die auf das Blockieren der Aminogruppen und der Hydroxylgruppen angewendet werden, getrennt erörtert.

Blockierung der Aminogruppe

Eine besonders bequeme Art einer blockierenden Gruppe für die erfindungsgemäßen Zwecke ist die Acylgruppe, und hervorragende Ergebnisse wurden durch gesteuerte Acylierung des ursprünglichen Ausgangsinsulins mit funktionellen Derivaten von Disäuren wie beispielsweise Dicarbonsäuren, unter Einsatz der geeigneten Säuraanliydride, Säurehalogenide oder äquivalenter peagentien/. Viele Acylierungsverfahren, die gut bekannt /mä auf dem Gebiet der Peptidchemie ausgiebig verwendet wurden, sind zur Herstellung von erfindungsgemäßen Derivaten anwendbar. Acylierung mit solchen Reagentien führt zur Bildung von N-Substituenten mit freien Carboxylgruppen, die leicht ionisieren und somit die negative Gesamtladung des Insulinmoleküls erhöhen. Als Ergebnis ihrer erhöhten negativen Ladung neigen Moleküle des Insulinderivats weniger zum Aggregieren als die des

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Ausgangsinsulins und sind aus diesem Grunde in wäßrigen Lösungsmitteln viel leichter löslich. Weiterhin mag diese Eigenschaft auch für die beobachtete Senkung der Antigenreaktion der Acyl- und anderen Derivate verantwortlich sein, die eine sehr wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen neuen Derivate darstellt (Antigenreaktion gegen Antikörper, die gegen Insulin gerichtet sind).

Eine große Zahl von Dicarbonsäure-Acylgruppen kann in das Insulinmolekül eingeführt werden, es wurde aber gefunden, daß die Aktivität der Derivate nach einem bestimmten Punkt mit zunehmender Größe der Substituentengruppen abfällt,und aus diesem Grunde enthalten die Substituenten bevorzugt nicht mehr als etwa sechs oder acht Kohlenstoffatome. Besonders gute Ergebnisse werden mit Acylgruppen erhalten, die sich von Bernsteinsäure, Glutarsäure, Haieinsäure, Honomethy!maleinsäure und Dirnethylmaleinsäure ableiten.

Acylierung von Insulinen mit funktionellen Derivaten von Dicarbonsäuren, z. B. Anhydriden, ist sehr bequem zu steuern. Wird die Heaktion mit einem verhältnismäßig kleinen Überschuß an Acylierungsmittel, z. B. 2 bis 3 Mol pro Aminogruppe, und bei neutralem oder schwach alkalischem pH, z. B. 7 - 8, durchgeführt, läuft die Heaktion in sehr hoher Ausbeute unter Bildung des disubstituierten Derivats ab, das aus der Reaktion der A,.- und B_x.-Aminogruppen resultiert. Wird der Überschuß an Acylierungsmittel bedeutend erhöht, z. B. auf bis zu 10 molar, kann auch die B2q-Aminogruppe unter Bildung des trisubstituierten Derivats umgesetzt werden. Bei einem pH in dem betrachteten Bereich wird die Heaktion nicht durcn die Ü-Acylierung von Tyrosinresten verkompliziert, weil unter diesen Bedingungen stabile

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0-Acylderivate nicht gebildet werden. Die erhaltenen Derivate sind bei saurem pH unlöslich und können so leicht aus dem Reaktionsgemisch durch Ausfällen, z. B. bei pH 3> entfernt werden. Die so erhaltenen Produkte können durch Filtrieren oder Zentrifugieren getrennt und als trockene, leicht handhabbare Pulver zu Rezepturen verarbeitet werden. Die Produkte sind in wäßrigen Tledien bei pH 5 - ö leicht löslich, was ihre Zubereitung und Anwendung im Vergleich zu den ursprünglichen Insulinen vereinfacht. In manchen Fällen werden bestimmte Acylgruppen unter stark sauren Bedingungen entfernt, und daher ist Vorsicht bei der Gewinnung von Produkten nach dem beschriebenen Verfahren nötig.

Wie oben angegeben, werden wenigstens eine und vorzugsweise zwei der Insulin-Aminogruppen durch anionenbildende Substituenten blockiert. Die anderen Aminogruppen in dem Insulinmolekül können unsubstituiert gelassen, oder, wenn gewünscht, mit Gruppen der gleichen oder iinterschiedlicher Natur blockiert werden, d. h., die nicht notwendigerweise anionenbildende Reste, z. B. Acetyl, Carbamyl, N-substituiertes Carbamyl, z. B. N-Methylcarbamyl und andere N-Alkylcarbamylreste enthalten. Weiterhin wird in Betracht gezogen, daß Derivate, die eine Vielzahl von blockierenden Gruppen in dem gleichen Holekül enthalten, erwünscht sein können, um optimale Verlängerungswirkung aufgrund verbesserter Beständigkeit gegenüber Aminopeptidase zu erzielen. Weiterhin wird die Verwendung von Gemischen von Derivaten, die eine Optimierung der Wirkungen oder eine andere vorteilhafte Steuerung der Therapie erlauben, in mit der Erfindung betrachtet.

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Es wurde gefunden, daß typische, erfindungsgeiaäß hergestellte Produkte, z. B. di- und tri-Succinyl-Derivate, vergleichbare, ah er gewöhnlich anfänglich xfeniger hypoglykanische Wirksamke.it hatten als die Ausgangsinsuline. Dies ermöglicht die Anwendung höherer Dosierungen, und aufgrund der Tendenz der Derivate, langer im Körper zu verbleiben, ist die Wirkung eine Verlängerung der hypoglykanischen Wirksamkeit.

Blockieren der Hydroxylgruppe

Insulinderivate mit O-Acylgruppen an einem oder mehreren Tyrosinresten zusätzlich zu einer oder mehreren H-Acylgruppen sind ebenfalls in Übereinstimmung mit der Erfindung beabsichtigt. Gewöhnlich erfordert die O-Acylierung unterschiedliche Bedingungen gegenüber der IT-Acylierung. So liegen die Iiengen des "benötigten Reagens gewöhnlich über denen für die N-Acylierung, und Holüberschüsse in der Größenordnung von 1Ö - 50 können für vollständige Umsetzung am Tyrosin notwendig sein. Auch sind die Eeaktions-pH höher, beispielsweise etwa 9» in. Anbetracht der starken Labilität der O-Acyltyrosin-Verbindungen hei diesen höheren pH-Werten wird der pH des Reaktionsgemische gesenkt, sobald das gewünschte Maß an Umsetzung erfolgt ist. Zudem können bei O-Acylierung verschiedene Acylierungsgruppen für die besten Ergebnisse erforderlich sein. So sind Succinyl- und bestimmte andere Gruppen, wie oben angegeben, die ausgezeichnete Η-blockierende Gruppen sind, nicht genügend stabil als ü-blockierende Gruppen. Da U-Acylierung fast unweigerlich zu einem inaktiven Derivat führt, ist es, damit die Aktivität zur Geltung kommt, wesentlich, daß die O-blockierende Gruppe in vivo entfernt wird. Daher wird die Wahl des blockierenden

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Kittels durch das gewünschte Haß an Stabilität der blockierten Hydroxylgruppen bestimmt. Acetyl- und Glutarylgruppen sind beispielsweise aus diesen Gründen gegenüber Succinyl-

Reste ■ gruppen bevorzugt. Cyclische , die gegenüber Hydrolyse sterische Hinderung bieten und daher eine Verzögerung in der Rückreaktion zu einer aktiven Substanz verursachen, sind auch attraktiv z. B. Cyclopropyl-carbonyl und Cyclobutyl-carbonyl. Weiter liegen in Insulinmolekül vier Tyrosinreste vor, und sowohl partielle als auch vollständige Tyrosinblockierung liegt im ,Bereich der Erfindung. Die Tyrosinacylierung oder eine andere Form der Blockierung kann leicht durch Messung der Abnahme der charakteristischen Tyrosinabsorption bei etwa 275 liillimikron registriert werden. Beispielsweise kann ein H-trisubstituiertes Derivat zunehmend acyliert und die Reaktion beendet werden, wenn die Verminderung der Absorption anzeigt, daß der gewünschte Grad an Substitution stattgefunden hat. Wenn 'fyrosinreste acyliert werden, wird festgestellt, daß zwei Hydroxylgruppen leicht blockiert werden, während die anderen zwei schwerer zugänglich sind.

Alternativen zur Acylierung sind für die Blockierung von Hydroxylgruppen möglich, und überragende Ergebnisse wurden durch Carbamylierung erzielt, die beispielsweise durch Umsetzung mit einem Alkalimetallcyanat bequem durchgeführt wird. Um dem Problem der Instabilität von D-Carbamylgruppen bei höheren pH-Werten (z. B. 8) und der Instabilität des Reagens bei niederen pH-Werten (z. B. 6) Rechnung zu tragen, wird der pH im allgemeinen während der Reaktion stufenweise gesenkt (beginnend bei b und aufhörend bei 6). Auch können N-substituierte Carbamylgruppen eingeführt werden. Die Carbamylierung ist eine verhältnismäßig zeitraubende Reaktion, und

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es wird in der Praxis gefunden, daß ein Gleichgewichtsgemisch erhalten wird, "bei dem selten mehr als 70 % der maximalen theoretischen Blockierung erzielt werden.

Die verwendeten Verfahren und Gi¹UPpen v/erden zum !eil durch Betrachtungen der Leichtigkeit der Isolierung der Produkte, aber hauptsächlich im Hinblick auf die gewünschte Rate der Entfernung der Gruppe oder Gmrppeii in vivo bestimmt; letzteres kann leicht durch in vitro - Hydrolyseversuche ermittelt werden, die physiologische Bedingungen simulieren, was es ermöglicht, die Endprodukte auf die Erfordernisse bestimmter Patienten zuzuschneiden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden als bei saurem pH ausgefällte Pulver bequem gehandhabt und zusammengestellt. In einer solchen Form sind die Derivate beim isoelektrischen Punkt. Jedoch können physiologisch annehmbare Salze der Derivate, wenn gewünscht, verwendet xirerden. Wie bei den Ausgang sinsul inen kann Zink in irgendeiner Form in den Derivaten vorliegen. Erfindungsgemäße Iiisulinderivate können in der gleichen Weise als pharmazeutische Zubereitungen zusammengestellt werden, wie die Ausgangsinsuline und können klinisch

,en
in geringer/ vergleichbaren oder höheren Dosierungsmengen verwendet v/erden. So liegt die normale Tagesdosis an Insulin bei 20 bis 80 IE pro Tag für Erwachsene, und für resistente Patienten bei über 200 Einheiten und in manchen IPällen über 5>00 Einheiten an Standardinsulin. Die erfindungsgemäßen Derivate können als Lösungen, Suspensionen oder gefriergetrocknete Präparate hergestellt werden. Eine typische Lösung ist eine Kozeptur von neutralem oder physiologischem pH und enthält 0,136 % Gew./Vol./, %,7 ffiWw./'Vol. Natriumchlorid und 0,1 % Gew./Vol. Methylhydroxybenzoat in von fiebererregenden Stoffen freiem Wasser.

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Me Erfindung ist auf alle Insuline und insbesondere auf Schweine- und Hinder-lnsuline anwendbar, die viele Jahre bei der Behandlung von Diabetes und anderen Störungen klinisch verwendet worden sind. Sie ist auch auf synthetische Insuline dieser Art und auch auf synthetisches menschliches Insulin anwendbar.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:

Beispiel 1

Herstellunp; von K-;M_<I\f' _i -£-IJ"-^fJr i succinylinsulin

Succinylierung

500 mg· Insulin werden in 12 LiI 0,5 molarem Phosphatpuffer von pH 7»2 (41,6 mg pro ml) suspendiert, und au dieser Suspension werden direkt 250 mg festes Bernsteinsäureanhydrid (10-facher molarer Überschuß des !Reagens pro Aminogruppe) augefügt. Das lieaktionsgeDiiscn wird kontinuierlich bei Kaumtemperatur 20 Stunden gerührt, iis wird darauf geachtet, daß die (nach der Reaktion) klare Lösung homogen bleibt, wenn der ph" auf 5>5 eingestellt wird.

Einstellen des Salzgehaltes der Heaktionsmischung entweder durch (i) oder (ii)

(i) Das gesamte Heaktionsgemiseh wire durch eine S Säule (dreidimensional vernetztes lolysaccharid) (150 x 1,5 geführt, mit 0,05 iß iyridinacetatpulVer von pn 5>5 eluiuri. Die Insulinderivate v/erden von den Abbauprodukten des

BAD ORIGINAL.

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lieageiis gut getrennt. Die Derivate laufen in einem vc-rhältnismllEig großen Volumen des gewählten Elutioiis-Liittels aus, sind aber noch.für Chromatografie geeignet.

(ii) Alternativ werden die Insulinderivate bei 4- ⁰C durch .ansäuern des Keaktionsgemischs auf pH 3»8 mit Eisessig ausgefällt. Der Niederschlag wird dann zweimal mit kaltem, destilliertem, zuvor auf pH 4- mit Essigsäure angesäuertem Wasser gewaschen. Die"Ausbeute der Insulinderivate in dem Wiederschlaf ist über 90 %. Der Niederschlag wird in 5 ml Pyridinacetat von pH 6 zur Chromatografie gelöst.

Reinigung der Insulinderivate

Die Lösung der Insulinderivate wird auf eine DEAE-Sejxhadex A-2^^:- Säule (^c?!> λ 1,5 cm) aufgebracht. Elution erfolgt anfangs mit 60 ml 0,O^ id Pyridinacetat von ph 5,5» bevor ein linearer HaCl-Gradient bis zur Grenzkonzentration von 2,0 m angewandt wird. Das disuccinylierte Derivat wird zuerst bei einer NaCl-Iiolarität von 0,4-75 aus dem A-25-Gel eluiert; das trisuccinylierte bei 0,6. Die Trennung der Derivate wird auf diese Weise ohne Verwendung von 7 m Harnstoff in dem Elutionsmittel durchgeführt, und die Ausbeute der Derivate liegt über 90 %.

Charakterisierung der Derivate

Das erhaltene reine Insulinderivat wird entweder in geeigneter Weise mit einer ßephadex G-15-ßäule auf Salz eingestellt oder wie zuvor ausgefällt. Weiteres Waschen des Niederschlags mit kaltem 9!^ ^xgem Äthanol, gefolgt von Diäthyläther (zweimal) vor dem Trocknen in einem Vakuum-Exsiccator führt zu einem weißen IuIver, das dann folgendermaßen charakterisiert wird:

^209834/1212 BADORlG₁NAt

i. Trypsin-Abbau bei pH 9>5 mit einem T.P.C.K.-behandelten · Trypsin [L--(1--a?osylaiiiido-2-plienyl)--ätliyl-clilormetliylketon| mit einem Substrat-Verhältnis von 1 zu 7 zur Freisetzung von B-50-Alanin*

ii. Celluloseacetat-Elektrophorese und Anfärben mit Pancean S, iii. Carbamylierung mit KCNO zur quantitativen Bestimmung von -iffio^-En-ä-gruppen.

iv·. Gelscheibenelektrophorese (Acrylamid).

Bei Verwendung dieses Herstellungsverfahrens waren die Ausbeuten an tri- und disuccinylierten Derivaten 90,6 % bzw. 9,5 %» S¹Ur kein Derivat können -NHg-Endgruppen festgestellt werden. Freies Alanin kann durch Trypsinabbau aus dem disuccinylierten Derivat freigesetzt werden; keines aus dem Srisuccinylinsulin. Die beiden Derivate können durch Elektrophorese getrennt werden.

Beispiel 2 Herstellung' νοηα-Ν,Ν*-Diauccinylinsulin

ISn spezifisch Disuccinylinsulin herzustellen, werden die in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen der Succinylierungsreaktion folgendermaßen abgewandelt: 3 molarer Überschuß an Bernsteinsäureanhydrid pro Aminogruppe und Reaktion für 4 Stunden bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wird durch Ausfällen entsalzen und das Insulinderivat in einem Puffer von pH 8 gelöst und vor der Reinigung 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.

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Beispiel 3 Herstellung von c^-N-Succinylphenylalanininsulin, fi-N-Succinyl- Klyzininsulin, fc-N-Succinyllysininsulin und cx-N-Succinyl-

glyzin-o-N-Succinyllysininsulin

Diese Derivate werden zusammen mit denen der Beispiele 1 und 2 durch die Verwendung verschiedener Succinylierungsreaktions-"bedingungen hergestellt, wobei die verschiedenen Derivate chromatografisch getrennt werden.

Reaktion von Insulin mit Bernsteinsäureanhydrid

Kristallines Rinderinsulin (200 mg, mit 0,336 % Zink) wird in 10 ml m-Iris HCl pH 8,6 [tris(Hydroxymethyl)-aminomethanJ gelöst. Hierzu wird Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt (20,4· mg', dem zweifachen molaren Überschuß pro Aminogruppe äquivalent). Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Die Insulinderivate werden durch Gelfiltration auf einer Säule (35 χ 2,5 cm) Sephadex G-25 (grober Qualität) in 0,1 % N-Äthylmorpholin-acetat von pH 8,5 entsalzt und durch Lyophilisieren isoliert.

Chromatografische Trennung der Ineulinderivate

Das gefriergetrocknete Gemisch wird in 5 ml 0,1 m-Tris HCl pH 7 mit 8 m Harnstoff (durch Ansäuern von Cyanat befreit) gelöst und auf eine DEAE Sephadex A-25-Säule (95 x 1>5 cm) gegeben, die ins Gleichgewicht gebracht und anfangs mit 200 ml des obigen Puffers entwickelt wird. Dann wird ein linearer NaCl-Gradient bis zu einer Grenzkonzentration von 0,2 m angewandt, in dem 0,1 m-Tris pH 7 mit 8 m Harnstoff

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und 0,2 m NaGl (250 ml) in einen !tischbehälter gebracht werden, der 250 ml des Ausgangspuffers enthält. Die !Fließgeschwindigkeit ist 15 ml pro Stunde. Mt diesem Chromatografierverfahren werden sechs Insulinderivate erhalten, wie in der folgenden Tabelle angegeben:

Verbindung

substitu- NaCl-MoIa- Ausierte NHp- rität beim beute Gruppen Eluieren (%) (D

Insulin

ot-N-Succinylphenylalanininsulin (B.-substituiert)

C-N-Succinyllysininsulin (Bpq-substituiert)

ot-N-Succinylglyzininsulin (A.-substituiert)

α.-Ν,Ν' -Disuccinylinsulin (A.B.rsubstituiert)

40

ι ι

<x-N-Succinylglyzin-£-N-succinyllysininsulin (A.Bpq-substituiert) od-N,N¹ -£-N"-Trisuccinylinsulin (A.B.Bgo-substituiert)

Phe,	GIy
	Lys
Giy,	Phe,
Lys

0,13

0, 2

12

0,12 12

(1) Die freien oc-NHp-Gruppen werden nach der Charakterisierungsiaethode (iii) von Beispiel 1 bestimmt, während die ε-NHp-Gruppen nach der Charakterisierungsmethode (i) des Beispiels 1 bestimmt werden.

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Beispiel 4 Herstellung von o(-H,N'-£-N''-irrip;lutarylinsulin

Dieses Derivat wird unter Verwendung von Glutarsäureanhydrid nach, einem dem in Beispiel 1 für das Trisuccinylderivat beschriebenen genau analogen Verfahren hergestellt.

Beispiel 5 Herstellung von a-N,N'-disuccinyl-6-lJr"-carbamylinsulin

Reines Disuccinylinsulin wird bei pH 8 mit 0,5 m KCNO carbamyliert. Das Reaktionsgemisch wird bei Bäumtemperatur 12 Stunden gerührt und dann durch Hindurchführen durch eine Sephadex G-15-Säule (150 χ 1,5 cm) mit 0,05 m Phosphatpuffer pH 9 entsalzen. Durch Trypsinabbau kann aus dem erhaltenen Derivat kein freies Alanin freigesetzt werden.

Bei einem Alternativverfahren ist der beim Entsalzen verwendete Puffer 0,1 % N-lthylmorpholinacetat bei pH 8,5.

Beispiel 6 Herstellung von 0-acetyliertem ot-IiUU'-e-^-TriBuccinylinsulin

6 mg ^-N,N'-£-N"-Trisuccinylinsulin, hergestellt nach Beispiel 1, wird in 0,5 m Trispuffer (pH 9,0, 5 ml) gelöst und mit Acetanhydrid in aufeinanderfolgenden Mengen von 5» 5» 10, 10, 10 Mikrolitern bei Raumtemperatur unter gutem Rühren nach jedem Zusatz behandelt. Die Reaktion wird nach jedem Zusatz durch Hessen der Spektralabsorption bei 275 Mikron überwacht. Das Endprodukt ist schätzungsweise zu annähernd 80 % an den Hydroxylgruppen substituiert. Das Produkt wird durch Einstellen

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des pH der Lösung auf 4,0 mit Essigsäure ausgefällt und durch Zentrifugieren gewonnen. Bei einer Untersuchung in vitro durch Hydrolyse bei pH 7,4 und 37 ⁰C besitzt es eine Halbwertzedt von etwa 14 Stunden.

Beispiel 7 Herstellung des O-Glutarylderivats des <X-N,N^l-6-N"-Q?risuccinyl-

insulins

6 mg oC-N,N'-£.-N"-.!rrisuccinylinsulin werden in 0,25 m Phosphatpuffer (pH 8,0 3 nil) gelöst und mit einer Lösung von Glutaranhydrid in Dioxan (50 % Gew./Vol.) in aufeinanderfolgenden Mengen von 1, 1, 1, 3» 3» 5» 5» 10, 10 Mikrolitern behandelt und die Reaktion, wie in Beispiel 6 beschrieben, überwacht. Das Produkt wird durch Einstellen des pH der Lösung auf 3 oder darunter mit Salzsäure ausgefällt und durch Zentrifugieren gewonnen. Die entsprechende Halbwertzeit (vergleiche Beispiel 6) ist etwa 7 Stunden.

Beispiel 8 ' O-Carbamylierung von t*-N, N'-£-N"-Trisuccinylinsulin

oC-N,N^l-£-N"-Trisuccinylinsulin (200 g) wird in 8 m wäßrigem Harnstoff gelöst, und Kaliumcyanat wird zu einer Konzentration von 2 m zugesetzt. Man läßt die Reaktion bei Raumtemperatur 1 Stunde bei pH 8,0, 4 Stunden bei pH 7,0, 2 Stunden bei pH 6,5 und dann 1 Stunde bei pH 6,0 weiterlaufen, wobei der pH mit fortschreitendem Versuch durch automatischen Zusatz von Essigsäure bei dem gewünschten Wert gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird dann auf pH 4,5 durch Zusatz von Salzsäure angesäuert, fünffach mit Wasser verdünnt und bei 4 ⁰C

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über Nacht stehengelassen. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in 0,1 %igem wäßrigem Pyridinacetat bei pH 6,0 wieder gelöst. Entsalzen wird mit einer Säule (40 χ 2,5 cm) mit Sephadex G-25 unter Verwendung von 0,1 °/o Pyridinacetat bei pH 6,0 als Elutionsmittel durchgeführt, wobei die Elution bei 4 ⁰C erfolgt. Sobald die Elution des Proteins aus der Säule beendet ist, werden die Fraktionen vereinigt und das Produkt in Trockenform durch Lyophilisieren isoliert. Der Carbamylierungsgrad liegt im Bereich von 50 %, wie durch Messungen der optischen Dichte bei 200 mn ermittelt wurde. Die Halbwertszeit der Decarbamylierung des Produktes bei pH 7,4 und 37 ⁰C in physiologischem Puffer ist 75 Minuten, wobei die Tyrosinabsorption des Trisuccinylinsulins voll zurückkehrt.

-Patentansprüche-

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Claims

Patentansprüche

SSB SS S SBSXJGSBB SBSSS BB SSB a SB SSS

1. Insulinderivat, "bei dem wenigstens eine der Aminogruppen der A^- (GKLyzin), B.- (Phenylalanin) und Boq"" (Lysin) Aminosäureeinheiten in eine blockierte Aminogruppe mit einem zur Bildung eines Anions befähigten Substituenten überführt ist.

2. Insulinderivat nach Anspruch 1, bei dem der Substituent eine bei Ionisation negative Ladung trägt.

3· Insulinderivat nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Substituent eine von einer dibasischen Säure abgeleitete Acylgruppe ist.

4-. Insulinderivat nach Anspruch J, bei dem die Säure eine Dicarbonsäure ist.

5. Insulinderivat nach Anspruch 4, bei dem die Säure Bernsteinsäure ist.

6. Insulinderivat nach einem der Ansprüche 1 bis J?, bei dem wenigstens zwei der genannten Aminogruppen substituiert sind.

7. Insulinderivat nach Anspruch 6, welches W-trisubstituiert ist.

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8. Insulinderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5,

dem eine oder zwei der genannten Aminogruppen carbamyliert oder N-alkyl-carbamyliert ist bzw. sind.

9. A^-Kono-succinylinsulin.

10. B^-Iiono-succinylinsulin.

11. Bpq-Mono-succinylinsulin.

12. A., B.- Disuccinylinsulin.

13. A., B_x., Bpq-Trisuccinylinsulin.
1A-. A^ , B_xJ, BpQ

15. A_x., B_x. -N-Disuccinyl-Bpq-H-carbamylinsulin.

16. Insulinderivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit zusätzlich wenigstens einer durch einen Substituenten, der in vivo unter Rückbildung der freien Hydroxylgruppe abspaltbar ist, blockierten Hydroxylgruppe des Tyrosins.

17. Derivat nach Anspruch 16, bei dem der die Hydroxylgruppe blockierende Substituent eine Acylgruppe ist.

18. Derivat nach Anspruch 16, bei dem der die Hydroxylgruppe blockierende Substituent Carbamyl oder N-substituiertes Carbamyl ist.

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19. Derivat nach Anspruch. 16, 17 oder 18, bei dem zwei oder mehr der Hydroxylgruppen substituiert sind.

20. Derivat nach Anspruch 18 oder 19, bei dem alle Hydroxylgruppen blockierende Substituenten Carbaniyl oder II-substituierte Carbamylgruppen sind.

21. Verfahren zur Herstellung eines Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennz eich net, daß ein Insulin mit einer Dicarbonsäure oder einem funktioneilen Derivat davon durch Umsetzung mit einer oder mehreren Aminogruppen darin acyliert wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion unter Bedingungen durchgeführt wird, die zur Bildung eines überwiegend disubstituierten Derivats führen.

2J. Verfahren nach. Anspruch £1, dadur^i gekennzeichnet, daß die Reaktion unter icäingvaige'i durchgeführt wird, die zur Bildung eines überwiegend tri&ubstituierten Derivats führen.

24. Verfahren nach Anspruch 21, 22 oder 23, dadurch g e k e η nz eichnet, daß die Reaktion zur Blockierung ungeschützter Aminogruppen und zum Einführen von blockierenden Gruppen an einer oder mehreren Hydroxyleinheiten des Tyrosine weitergeführt wird.

2% Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch {■ ekennzeichnet, daß das Produkt vom Reaktionsgemisch durch Ausfällen bei saurem pH abgetrennt wird.

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26. Verwendung eines Derivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20 als aktiven Bestandteil eines für parenterale Anwendung geeigneten pharmazeutischen Kittels.

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