DE3787971T2

DE3787971T2 - Aktives prinzip, isoliert aus haigeweben.

Info

Publication number: DE3787971T2
Application number: DE87905581T
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Ishida; Takuo Kosuge; Yoshiki Kosuge; Kuniro Tsuji
Original assignee: JW Broadbent Nominees Pty Ltd
Current assignee: JW Broadbent Nominees Pty Ltd
Priority date: 1986-08-21
Filing date: 1987-08-21
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2007-08-22
Also published as: NZ221527A; US5470574A; WO1988001274A1; US5632997A; EP0329656A4; PT85573B; JPH02503554A; US5026883A; HK149394A; DE3787971D1; GR871312B; DK168742B1; PT85573A; DK218388A; EP0329656B1; DK218388D0; ZA876171B; EP0329656A1; ES2007401A6; JP2647882B2

Description

Diese Erfindung betrifft die Identifizierung, Isolierung und Herstellung eines aktiven Prinzips durch Extraktion aus natürlichen Geweben und insbesondere die Identifizierung, Isolierung und Herstellung eines solchen aktiven Prinzips durch Extraktion aus speziellen Haigeweben.
In Japan wurde seit langem ein als "Tiefseehaifischleberöl" bekanntes Präparat als Volksheilmittel verwendet. Hierbei handelt es sich um ein aus Haifischleber hergestelltes Öl, das normalerweise in Weichkapseln eingekapselt ist. Das Leberöl soll sich zur Behandlung zahlreicher Arten von Erkrankungen, insbesondere solcher, die in bezug zur Leber stehen, wie Hepatitis, Nephritis, Diabetes u. dgl., eignen. Bei externer Anwendung eignet sich das Leberöl ferner bekanntermaßen zur Behandlung von Verbrühungen, Verbrennungen oder sonstigen Arten von Hautproblemen. Schließlich ist es ein idealer Bestandteil von Kosmetika.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun dieses Material seit Jahren untersucht. Vor kurzem sind sie auf die unerwartete Tatsache gestoßen, daß in der wäßrigen Komponente von Haifischleber anstatt in der öllöslichen Komponente eine aktive Substanz enthalten ist. Diese Tatsache ergab sich aus einem Vergleich des praktischen Gebrauchs des Leberöls und eines aus der wäßrigen Komponente der Leber durch Verdampfen des Wassers hergestellten Pulvers. Bei Vergleichstests mit 900 mg des Leberöls pro Tag bzw. 60 mg des Pulvers pro Tag lieferte letzteres bessere klinische Ergebnisse als ersteres. Wurde darüber hinaus das Leberöl gründlich mit Wasser gewaschen, zeigte das erhaltene Öl nahezu keine Wirkung. Diese Tatsachen belegen, daß die aktive Substanz von Tiefseehaifischleber entgegen den bisherigen Vermutungen nicht öllöslich, sondern wasserlöslich ist.
Erfindungsgemäß wird ein aktives Prinzip bereitgestellt, das aus einem wäßrigen Extrakt der Leber und/oder Gallenblase eines Haifischs isoliert wird.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird in praktisch reiner Form eine Verbindung der allgemeinen Formel
worin A für ein Kation, z. B. ein Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Ammoniumion oder ein organisches Amin steht, bereitgestellt.
In anderen Ausführungsformen werden dem Fachmann ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) in praktisch reiner Form sowie eine solche Verbindung enthaltende pharmazeutische, diätetische oder kosmetische Zubereitungen an die Hand gegeben.
Aus der US-A-3 994 878 ist eine Verbindung der Formel:
bekannt. Aus der US-A-4 296 109 sind zusätzlich Verbindungen der Formel (III) und ihr Einsatz bei der Schockbehandlung bekannt:
mit R&sub1; gleich Wasserstoff, Hydroxy oder C&sub1;&submin;&sub8;-Acyloxy, R&sub2; gleich Wasserstoff oder Methyl und R³ und R&sub4; jeweils unabhängig gleich C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppen steht.
Unter Benutzung von Aktivitätstests, die später noch im einzelnen beschrieben werden, hat es sich gezeigt, daß das aktive Prinzip wasserlöslich ist und in der öllöslichen Komponente von Haifischleber nicht vorkommt. Diese Tests wurden im Rahmen einer Testreihe zur Feststellung, ob das aktive Prinzip lediglich in der Leber vorkommt, durchgeführt. Sämtliche Teile des Haifischkörpers, z. B. die Knochen, das Fleisch, die Gallenblase, die Eierstöcke, der Nahrungsaufnahmekanal u. dgl., wurden untersucht. Bei den Tests hat es sich gezeigt, daß die Gallenblase dieselben Aktivitäten zeigte wie die Leber. Dieses Ergebnis belegt, daß das aktive Prinzip lediglich in der Leber und in der Gallenblase vorkommt.
Allgemein gesprochen dienen die beiden genannten, zur Identifizierung von Quellen für das aktive Prinzip und zur Sicherstellung des Reinheitsgrades eines Extrakts benutzten Biotests zur Identifizierung der charakteristischen pharmakologischen Eigenschaften der Substanz. Insbesondere beruhen die mit (A) und (B) bezeichneten Biotests auf folgenden Aktivitäten:
(A) Das aktive Prinzip verhindert bei Mäusen durch Tetrachlorkohlenstoff hervorgerufene Leberbeschwerden.
(B) Das aktive Prinzip erhöht bei Mäusen nach Verabreichung einer toxischen Substanz, z. B. von Nikotin, die Atmungsgeschwindigkeit.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung eines aktiven Prinzips der beschriebenen Art durch Zubereiten eines wäßrigen Extrakts der Leber und/oder Gallenblase eines Hais und Isolieren des aktiven Prinzips aus dem wäßrigen Extrakt.
Die folgende Beschreibung erläutert allgemeine Maßnahmen zur Isolierung des aktiven Prinzips aus dem wäßrigen Extrakt der Leber und/oder Gallenblase eines Haifischs in folgenden Stufen: Extraktion mit polaren organischen Lösungsmitteln, Adsorption an geeigneten Adsorbentien und/oder Durchführung chromatographischer Techniken.
Zur Bestimmung, ob das aktive Prinzip in polaren organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Aceton u. dgl., löslich ist, wurde das durch Gefriertrocknen von Haifischgalle gewonnene Pulver mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert, worauf die Tests (A) und (B) sowohl mit dem löslichen Teil als auch mit dem unlöslichen Teil durchgeführt wurden. Eine Aktivität zeigte sich lediglich bei den Tests mit dem löslichen Anteil. Dies belegt also, daß das aktive Prinzip in polaren organischen Lösungsmitteln löslich ist.
Bei Versuchen zur Bestimmung, ob das aktive Prinzip unter Verwendung von Adsorbentien isoliert werden kann, wurden zahlreiche Adsorbentien untersucht. Es hat sich gezeigt, daß das aktive Prinzip durch Ionenaustauscherharze vom basischen Anionenaustauschertyp oder durch synthetische Adsorbentien, wie XAD (eingetragenes Warenzeichen), HP-20 (eingetragenes Warenzeichen), Sep-pak c18 (eingetragenes Warenzeichen) u. dgl. oder Holzkohle adsorbiert werden kann. Dieser Adsorptionstest wurde durch Extrahieren von Haifischleber und/oder -gallenblase mit Wasser durchgeführt. Das jeweils zu testende Adsorptionsmittel bzw. Adsorbens wurde zu dem Extrakt zugegeben und (darin) über Nacht liegengelassen. Anschließend wurde das jeweilige Gemisch filtriert. Das jeweilige Filtrat wurde mit Hilfe der Tests (A) und (B) auf seine Aktivität getestet. Die Ergebnisse zeigen, daß die aktive Substanz durch die zuvor genannten Adsorptionsmittel adsorbiert wird. Von den Adsorptionsmittelharzen kann das aktive Prinzip durch Extraktion mit einer Säure, einem Alkali oder mit Salzen, aus den synthetischen Adsorptionsmitteln und Holzkohle durch Extraktion mit polaren organischen Lösungsmitteln rückgewonnen werden.
Eine weitere Reinigung des aktiven Prinzips erreicht man durch Chromatographieren, beispielsweise in einer Silikasäule, Sephadex LH-20 (eingetragenes Warenzeichen)-Säule oder durch präparative Dünnschichtchromatographie oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und dergleichen. Jedes Verfahren liefert akzeptable Ergebnisse, bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erreichte man jedoch die beste Reinigung. Das durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie isolierte aktive Prinzip war sehr rein, da es einen sehr scharfen Einzelpeak und ferner bei der Dünnschichtchromatographie einen einzelnen Fleck eines annähernd repräsentativen Rf-Werts von 0,36 lieferte. Das aktive Prinzip stellt in gereinigter Form ein weißes Pulver eines Fp von 140ºC dar.
Beim Testen des gereinigten aktiven Prinzips mit Vanilinschwefelsäure trat eine purpurrote Färbung auf. Dies zeigt, daß es Gallensäure oder Gallenalkohol in seiner Struktur enthält. Es wurde bereits gefunden, daß die Haifischgalle einen mit Scymnol bezeichneten Gallenalkohol enthält. Nach teilweiser Acetylierung des aktiven Prinzips mit Essigsäureanhydrid und anschließende mehrtägige Behandlung des Rohprodukts mit trockener Dioxan-Trichloressigsäure wurde aus dem Reaktionsgemisch Scymnol identifiziert. Das Ergebnis zeigt, daß es sich bei dem aktiven Prinzip um ein Scymnolderivat handelt. Es handelte sich um die erste Isolierung des reinen in der Haifischgalle enthaltenen Scymnolderivats als das aktive Prinzip.
Eine bevorzugte Maßnahme zur Isolierung des aktiven Prinzips aus der lyophilisierten Galle von Rhizoprinodon acutus (erhalten durch Homogenisieren und Gefriertrocknen von Gallenblasen) ist im folgenden Reaktionsschema dargestellt:
Lyophilisierte Galle von Rhizoprionodon acutus extrahiert mit 1. n-Hexan (100 ml · 3)
2. MeOH (100 ml · 3)

Fraktion I (MeOH-Extrakt)

1. gelöst in H&sub2;O
2. Amberlite XAD-2 (eingetragenes Warenzeichen) c.c., Eluieren mit
i. H&sub2;O (400 ml)
ii. MeOH (400 ml)

Fraktion II (MeOH-Eluat)

1. gelöst in CHCl&sub3;-MeOH (1 : 1)
2. Sephadex LH-20 (eingetragenes Warenzeichen) c.c., eluiert mit
i. CHCl&sub3;-MeOH (1 : 1) (300 ml)
ii. MeOH (500 ml)

Fraktion III

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: YMC-Pack A-324 (eingetragenes Warenzeichen) (ODS)

Farbloses Pulver (Verbindung I).

Wie bereits ausgeführt, wird bei diesem Verfahren das lyophilisierte Material mit n-Hexan "entleert" und danach mit Methanol extrahiert. Das hierbei erhaltene Konzentrat wird chargenweise auf eine Amberlite XAD-2 (eingetragenes Warenzeichen)-Säule appliziert, wobei H&sub2;O und Ethanol als Eluiermittel verwendet wurden. Da das Ethanoleluat das aktive Prinzip (bestimmt durch ein Farbreagens) enthält, wird diese Fraktion nach und nach einer Gelfiltration auf Sephadex LH-20 (eingetragenes Warenzeichen) mit Chloroform-Methanol und Methanol unterworfen. Das aktive Prinzip ist im Methanoleluat so effektiv enthalten, daß seine Endreinigung durch anschließende Hochleistungsflüssigchromatographie mit einer Reversed Phase- Säule erreicht wird.
Es wurde vermutet, daß Scymnol in Form eines Sulfatesters vorliegen könnte, es wurde jedoch keine positive Information über die Stellung des Sulfatesters veröffentlicht. Scymnol weist nämlich sechs Hydroxylgruppen auf, an denen die Sulfatestergruppe hängen könnte. Das vorliegende Scymnolderivat wurde niemals als Reinsubstanz isoliert. Das durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigte aktive Pulver wurde einer Elementaranalyse unterworfen. Die Analysenergebnisse waren folgende: Berechnet für C&sub2;&sub7;H&sub5;&sub1;O&sub9;NS C = 57,34; H = 9,02; N = 2,47; S = 5,66. Gefunden C = 57,23; H = 8,92; N = 2,45; S = 5,30.
Diese Ergebnisse ließen vermuten, daß die aktive Verbindung in ihrer Struktur einen Ammoniumsulfatester enthält. Eine Kernresonanzspektralanalyse des aktiven Pulvers zeigte folgende Eigenschaften:
¹H-NMR(in d&sub4;-MeOH) δ(ppm): 4.22(dd, 1H, J=4.5 und 10.0Hz), 4.11(dd, 1H, J=10.0 und 16.7Hz), 4.00(bs, 1H), 3.80(d, 1H, J=1.2Hz) 3.60-3.80(m, 4H), 3.30-3.45 (m, 1H), 0.72(s, 3H).
¹³C-NMR(in d&sub4;-MeOH) δ(ppm): 74.1(d), 72.9(d), 71.3(d), 69.1(d), 66.7(t), 61.2(t), 48.4(d), 47.8(d), 47.5(s), 43.1(d), 43.0(d), 41.0(d), 40.4(t), 37.0(d), 36.5(t), 35.9(s), 35.8(t), 33.3(t), 32.1(t), 31.2(t), 29.6(t), 28.8(t), 27.9(d), 24.3(t), 23.2(q), 18.1(q), 13.1(q).
Das ¹³C-NMR-Spektrum zeigt, daß die aktive Verbindung 27 Kohlenstoffatome in Form von drei Methyl-, 11 Methylen-, 11 Methin- und zwei tertiären Kohlenstoffen enthält. Die Signale im tiefen Feld (0,72-2,35) beim ¹H-NMR-Spektrum lassen vermuten, daß es sich um ein Coprostanderivat handelt. Im höheren Feld im ¹³C-NMR-Spektrum sind Signale bei 74.1(d), 72.9(d), 71.3(d) und 69.1(d) dem Methinkohlenstoff mit Hydroxylgruppe zuzuordnen. Die beiden Signale bei 66.7(t) und 61.2(t) sind dem O-substituierten Methylenkohlenstoff zuzuschreiben. 2D0COSY0NMR-Spektren und C-H-Verschiebung-COSY-Beziehung zeigen, daß diese beiden Kohlenstoffe an einem Methinkohlenstoff hängen und einer derselben mit schwacher chemischer Verschiebung (66.7) im ¹H-NMR-Spektrum zwei unäquivalente Protonen bei 4.22(dd) und 4.14(dd)ppm aufweist. Dies zeigt, daß die aktive Verbindung in ihrem Molekül die Teileinheit HOCH&sub2;-CH-CH&sub2;OR enthält. Aufgrund der Ergebnisse der Elementaranalyse ist R -SO&sub3;NH&sub4;.
Aus diesen NMR-Spektren und Elementaranalysedaten wird das Pulver als 3α, 7α, 12α, 24ξ, 26-Pentahydroxycoprostan-27- ammoniumsulfatester charakterisiert. Das Ammoniumion in der Struktur stammte möglicherweise durch Ersatz eines Natriumions aus dem als mobile Phase bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie benutzten Phosphatammoniumpuffer. Um dies zu verifizieren, wurde ein durch XAD-2 und anschließend Säulenchromatographie auf Sephadex LH-20 gereinigtes aktives Pulver durch Atomabsorptionsspektralphotometrie auf Natrium und durch Elementaranalyse auf Stickstoff untersucht. Die Ergebnisse waren folgende: Berechnet für C&sub2;&sub7;H&sub4;&sub7;O&sub9;SNa Na = 4,03; N = 0,00. Gefunden Na = 3,57; N = 0,02.
Die Stereochemie der C-24-Stellung in der Struktur wurde durch röntgenkristallographische Analyse von Scymnol als 24R bestimmt. Die spezifische Drehung von Natriumscymnolsulfat ist positiv. Daraus ist folglich zu schließen, daß das aus Haifisch isolierte aktive Prinzip aus dem 24R-(+)- 3α, 7α, 12α, 24, 26-Pentahydroxycoprostan-27-Natriumsulfatester besteht.
Das Natrium- oder Ammoniumion in dem Sulfatester läßt sich ohne Schwierigkeiten durch andere Metallionen, wie Kalium, Calcium u. dgl. oder durch organische Aminkationen, z. B. Aminosäuren u. dgl., nach üblichen bekannten Maßnahmen ersetzen.
Die folgenden Tabellen veranschaulichen die Aktivität der wäßrigen Extrakte dieser Erfindung: TABELLE 1 Dosierung Biotest (A) (Einheiten) Biotest (B) (s) Öllöslicher Teil von Haifischleber Wasserlöslicher Teil von Haifischleber Kontrolle TABELLE 2 Extrakt von Haifischgallenblase, gereinigt durch: Dosierung Biotest (A) (Einheiten) Biotest (B) (s) Adsorption an Holzkohle Adsorption an XAD-2 (eingetragenes Warenzeichen) Adsorption an ein Anionenaustauscherharz gereinigtes aktives Prinzip Kontrolle
Die in der vorhergehenden Beschreibung genannten Standardbiotests wurden wie folgt durchgeführt:

Biotest (A)

Biologischer Test bezüglich einer Schutzaktivität gegen Tetrachlorkohlenstoff (CCl&sub4;)-induzierte Leberschädigungen bei Mäusen.
Std:ddy Mäuseböcke (Gewicht: 30-35 g) wurden in Gruppen von 5 Tieren eingesetzt. Proben der Testmaterialien wurden 7 Tage lang in geeigneter täglicher Dosis oral verabreicht. 24 h nach Verabreichung der letzten Probe wurde 0,1 ml 5% CCl&sub4; in Olivenöl oral gegeben. 24 h nach der CCl&sub4;-Verabreichung wurde aus dem Orbitalsinus Blut entnommen. Durch Zentrifugieren (3 000 U/min, 10 min) wurde das Serum gewonnen. Die Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transaminsase (GPT)-Aktivität wurde nach der Reitman-Frankel-Momose-Methode bestimmt. Die Aktivität ist als Vergleich von GPT-Werten zwischen Gruppen, denen die Probe verabreicht wurde, und Vergleichsgruppen angegeben.

Biotest (B)

Einfluß auf die Atmung bei Mäusen, denen Nikotin verabreicht wurde.
Std:ddy Mäuseböcke (Gewicht: 20-22 g) wurden in Gruppen von 5 Tieren eingesetzt. Nikotintartrat (3 mg) wurde subkutan injiziert. Proben der Testmaterialien wurden 3 h vor der Nikotinverabreichung oral gegeben. 5 min nach der Nikotinverabreichung wurde die für 30 Atmungsvorgänge benötigte Zeit bestimmt. Die Aktivität wurde als Vergleich der ermittelten Zeit zwischen den Gruppen, denen die Probe verabreicht wurde, und Kontrollgruppen ausgedrückt.
Erfindungsgemäß wird ferner eine Arzneimittelzubereitung mit einer aktiven Substanz der beschriebenen Art sowie einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel für diese bereitgestellt. Nur beispielsweise kann die aktive Substanz nach dem Vermischen in Pulverform mit einem bekannten Träger oder Streckmittel zu stabilen Tabletten formuliert werden. Andererseits kann die aktive Substanz auch zur topischen Applikation in eine Lotion- oder Cremegrundlage eingearbeitet werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die aktive Substanz beispielsweise gewünschtenfalls nach dem Vermischen mit Haifischleberöl in Weichgelatinekapsel abgefüllt werden. Solche pharmazeutische Zubereitungen können beispielsweise zum Schutz der Leber oder Aktivierung der Leberfunktion bei der Behandlung von die Leber beeinträchtigenden Erkrankungen oder Zuständen, wie Hepatitis, Nephritis, Diabetes u. dgl., eingesetzt werden. Solche Zubereitungen eignen sich ferner zur Aktivierung einer Regenerierung von Hautgewebe, beispielsweise bei der Behandlung von Dermatitis, Verletzungen oder Akne.
Unter Verwendung von die aktive Substanz enthaltenden Zubereitungen durchgeführte klinische Tests haben insbesondere ihre Aktivität bei der Wiederherstellung der Leberfunktion und bei der Behandlung von Seborrhöe belegt.
Erfindungsgemäß wird ferner eine diätetische Zubereitung bzw. Gesundheitsnahrungsmittelzubereitung mit dem beschriebenen aktiven Prinzip zusammen mit einem oder mehreren geeigneten Grundlage- oder Trägermaterial(ien) bereitgestellt. Eine solche Zubereitung kann beispielsweise zur Behandlung eines "Katzenjammers" eingenommen werden.
Erfindungsgemäß wird ferner eine kosmetische Zubereitung mit dem beschriebenen aktiven Prinzip und eine kosmetischen Grundlage bereitgestellt.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können bekannte Arzneimittel oder sonstige aktive Bestandteile, beispielsweise Antibiotika oder sonstige antibakterielle Substanzen, enthalten.
Die folgenden Beispiele sollen ohne irgendwelche Beschränkung die Erfindung näher veranschaulichen.

BEISPIEL 1

Zubereitung von rohem aktiven Prinzip

280 g eines aus 4 kg Haifisch isolierten Gemischs aus Leber und Gallenblase wurden in 300 ml Wasser homogenisiert, worauf das Gemisch 30 min lang mit 12 000 U/min zentrifugiert wurde. Hierbei wurde eine klare wäßrige Schicht erhalten. In die wäßrige Schicht wurden 50 g eines Ionenaustauscherharzes vom basischen Anionenaustauschertyp eingetragen, worauf das Gemisch über Nacht stehengelassen wurde. Das Harz wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Danach wurde das Harz mit 200 ml 0,5% Natriumchloridlösung extrahiert. Der Extrakt wurde mit 100 g XAD2 (eingetragenes Warenzeichen) versetzt. Das XAD2 wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Danach wurde das XAD2 mit 200 ml Ethanol extrahiert. Aus dem Extrakt wurde das Ethanol abdestilliert, wobei 45 mg rohes aktives Pulvers erhalten wurden.

BEISPIEL 2

Silikagelsäulenchromatographie

100 g der durch Adsorption an eine XAD-2-Säule erhaltenen rohen aktiven Verbindung wurden auf einer Silikagelsäule chromatographiert. Als Lösungsmittel wurde MeOH-CHCl&sub3;-H&sub2;O (30 : 70 : 6) verwendet. Hierbei wurde ein weißes Pulver (40 g) erhalten.

BEISPIEL 3

Dünnschichtchromatographie (TLC)

Die rohe aktive Verbindung wurde auf einer vorbeschichteten Silikagel 60-Dünnschichtplatte (Merck) unter Verwendung des Systems (Volumenteile):
n-BuOH(85)-AcOH(10)-H&sub2;O(5) und MeOH(40)-CHCl&sub3;(60)-H&sub2;O(10) dünnschichtchromatographiert. Das aktive Prinzip erschien auf dem Dünnschichtchromatogramm als einzelner Fleck. Dieser wurde durch Besprühen mit Vanillinschwefelsäurereagens sichtbar gemacht.

BEISPIEL 4

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die endgültige Reinigung des rohen aktiven Pulvers erfolgte durch anschließende Durchführung einer präparativen HPLC mit einer Reversed Phase-Säule. Aus 100 g XAD-2 (eingetragenes Warenzeichen) gereinigter Probe wurden 31 g der aktiven Verbindung in Form eines weißen Pulvers eines Fp von 140º erhalten. Die ungefähre repräsentative Retentionszeit der aktiven Verbindung betrug 16 min. Die HPLC-Bedingungen waren folgende: Säule: YMC-Pack A-324 (eingetragenes Warenzeichen) (ODS); Strömungsgeschwindigkeit: 20 ml/min; mobile Phase: CH&sub3;CN-0,02N Phosphatammoniumpuffer (pH-Wert: 7,45) (8 : 2); Detektor: Brechungsindex.

BEISPIEL 5

Säulenchromatographie auf Sephadex LH-20

100 g an durch Adsorption auf einer XAD-2 (eingetragenes Warenzeichen)-Säule erhaltener roher aktiver Verbindung wurden unter Verwendung von MeOH-CHCl&sub3; (1 : 1) und anschließend MeOH als Eluiermittel einer Gelfiltration auf einer Sephadex LH-20 (eingetragenes Warenzeichen)-Säule unterworfen, wobei aus der MeOH-Fraktion 45 g eines weißen Pulvers erhalten wurden. Beim Rechromatographieren auf derselben Säule wurden 30 g nahezu reines weißes Pulver erhalten.

BEISPIEL 6

65 g Gallenblasen von fünf Haien der Art Rhizoprionodon acutus (ca. 8 kg Gewicht) wurden homogenisiert und anschließend gefriergetrocknet. Dieses Material (10,25 g) wurde als Quelle für das aktive Prinzip Natriumscymnolsulfat benutzt. Nach dem Entfetten des Materials mit auf Rückflußtemperatur befindlichem n-Hexan (100 ml · 3) wurde es bei Rückflußtemperatur 1 h lang mit Methanol (100 ml · 3) extrahiert. Das Konzentrat (3,67 g) wurde in H&sub2;O (80 ml) gelöst und auf eine Amberlite XAD-2 (eingetragenes Warenzeichen)-Säule (3,0 · 16,0 cm) appliziert. Die Säule wurde mit H&sub2;O (400 ml) und anschließend Ethanol (400 ml) eluiert. Danach wurde das Ethanoleluat (1,95 g) auf eine Sephadex LH-20 (eingetragenes Warenzeichen)-Säule (3,0 · 32,0 cm) unter Verwendung von Chloroform und Methanol (1 : 1) appliziert. Nach dem Eluieren mit Chloroform und Methanol (200 ml) wurde die Säule mit 50 ml Methanolchargen entwickelt. Beim Einengen des das Natriumsalz enthaltenden Methanoleluats wurde ein weißer Gummi (1,06 g) erhalten. Die Reinigung dieses Materials (120 mg) durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie lieferte 85,6 mg Natriumscymnolsulfat als weißes Pulver. Die Bedingungen bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie waren folgende:
Säule, YMC-Pack A-324 (eingetragenes Warenzeichen) (ODS) 10 · 300 mm; Strömungsgeschwindigkeit: 2 ml/min; mobile Phase: 35% CH&sub3;CN-0,1 N Natriumphasphatpuffer (pH-Wert: 6,43); Detektor: Brechungsindex; das Natriumscymnolsulfat besitzt folgende physikalische Daten:
Weißes Pulver [α]25D = 21,75 (0,5 c in MeOH);
Elementaranalyse: Berechnet für C&sub2;&sub7;H&sub4;&sub7;O&sub9;SNa:
C = 56,82; H = 8,30; S = 5,62; Na = 4,03.
Gefunden: C = 56,99; H = 8,79; S = 5,62; Na = 4,23. SIMS-Massenspektrum (m/e):
654[C&sub2;&sub7;H&sub4;&sub7;SO&sub9;·HN(C&sub2;H&sub6;O)&sub2;], 574(C&sub2;&sub7;H&sub4;&sub7;O&sub6;·HN(C&sub2;H&sub6;O)&sub2;. IRθ cm&supmin;¹: 3420, 2950, 1470, 1380, 1230, 1070, 980, 910, 810. ¹H-NMR (in CD&sub3;OD); δ(ppm): 4.22(1H,dd,J=4.5, 10.0Hz), 4.11(1H,dd,J=6.6, 10.0hz), 4.00(1H, breit), 3.80(1H, m), 3.80-3.62(3H, m), 3.45-3.30(1H, m), 2.35-2.15(2H, m), 2.05-1.02(23H, m), 1.02(3H, d, J=6.2Hz), 0.92(3H, s), 0.72(3H, s). ¹³C-NMR (in CD&sub3;OD); δ(ppm) : 74.1(d), 72.9(d), 71.4(d), 69.1(d), 66.7(t), 61.2(t), 48.3(d), 47.8(d), 47.5(s), 43.1(d), 43.0(d). 41.0(d), 40.3(t), 37.0(d), 36.5(t), 35.9(s), 35.8(t), 33.3(t), 32.1(t), 31.2(t), 29.5(t), 28.8(t), 27.9(d), 24.3(t), 23.2(q), 18.1(q), 13.1(q).

BEISPIEL 7

Es wurden Versuche unter Verwendung des aktiven Prinzips gemäß der Erfindung in einer Antiseborrhöelotion durchgeführt. Diese wurde auf 40 männliche und weibliche Patienten, die seit langem (72 Jahre) von einer Gesichtshyperseborrhöe befallen waren, topisch appliziert. Die Versuche wurden als Doppelblindversuche mit 20 Patienten, denen ein Placebo appliziert wurde, und 20 Patienten, denen die Lotion mit dem aktiven Prinzip appliziert wurde, durchgeführt.
Bei diesen Versuchen erfolgte eine dreimalige tägliche Behandlung (morgens, mittags und abends) über 20 Tage. Die Bewertung der Seborrhöe (Seborrhöe Index) erfolgte an den Tagen 0 (vor der Behandlung) 10 und 21 (am Ende der Behandlung).
Die Ergebnisse zeigten eine signifikante stärkere Besserung der Seborrhöe bei den die Lotion mit dem aktiven Prinzip benutzenden Patienten gegenüber denjenigen, die das Placebo benutzten. Diese Verbesserung war sowohl bei den männlichen als auch bei den weiblichen Patienten feststellbar.

BEISPIEL 8

Zubereitungen

1. Kalte Creme
Spermacetti 6,0 g
Bienenwachs 6,0 g
Carbopol 934 10,0 g
Natriumcarbonat 4,75 g
Rosenwasser 5,0 ml
Rosenöl 0,02 ml
ausgepreßtes Mandelöl 56,0 g
aktives Prinzip 0,05 g
destilliertes Wasser 20,0 g
2. Tonikum
Ethanol 30 ml
aktives Prinzip 20 mg
Geschmacksstoff in ausreichender Menge
destilliertes Wasser in zum Auffüllen auf 100 ml ausreichender Menge

Claims

1. Verbindung der allgemeinen Formel I in praktisch reiner Form

worin A für ein Kation steht.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Kation aus einem Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Ammoniumion oder einem organischen Amin besteht.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) entsprechend der Definition von Anspruch 1 in praktisch reiner Form durch Zubereiten eines wäßrigen Extrakts der Leber und/oder Gallenblase eines Haifischs und Isolieren der Verbindung aus dem wäßrigen Extrakt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Isolierung aus dem wäßrigen Extrakt mindestens eine Stufe, ausgewählt aus Lösungsmittelextraktion, Adsorption und Chromatographie, umfaßt.

5. Arzneimittelzubereitung, umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel I in der Definition gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel hierfür.

6. Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 5 in Form einer Tablette, Kapsel, Lotion oder Creme.

7. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I in der Definition gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zum Schutz der Leber oder Aktivierung der Leberfunktion bei der Behandlung von die Leber beeinträchtigenden Erkrankungen oder Zuständen.

8. Zubereitung zur Behandlung der Haut, umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel I in der Definition gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem topisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel hierfür.

9. Zubereitung nach Anspruch 8, zusätzlich umfassend ein Antibiotikum oder eine sonstige antibakterielle Substanz.

10. Kosmetische Zubereitung, umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel I in der Definition gemäß Anspruch 1 zusammen mit einer kosmetischen Grundlage.

11. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I in der Definition gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung der Haut.