DE1959933C - Verfahren zur Herstellung von Arznei mitteln mit antibiotischer Wirkung aus Materialien umsehen Uvsprungs - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfuhren zur Herstellung von neuen Arzneimitteln mit antibiotic h.n Wirkungen, die der Formel

\ΛΛΛ C=C

HO-

■N

\ΛΛΛ C — N — C — H

Fettsäure H

CH—Οι , ~

Ceramid

( H..N

COOH

Sialsäure -> und Su'fat (SO₁) enthaltendes Kohlenhydrat

, OH

H-C -OH
H-C-OH

CH₃OH J

entsprechende Gangliosidsulfate enthalten. Lipoide, ao die eine Sulfatgruppe enthalten, werden als Sulfatide oder Sulfolipide bezeichnet, und man nimmt allgemein an, daß die Ceramid-Galactose-Sulfatester-Struktur besitzen. Die Bindung der Sulfatgruppe an die Sulfatide ist noch nicht geklärt. as

Sulfatide sind bisher im Gehirn gefunden worden (K. L. Landsteincr und P. A. Levene, 1925, J. Immunol., 10. S. 731, und P. A. Levene und K. L. Landstt.ner, 1927. J. Biol. Chem., 75. S. 607). aber in letzter Zeit sind Sulfatide auch in anderen Geweben nachgewiesen worden, so z. B. in der Leber, Niere und Milz (I. H. joldberg, 1961, J. Lipid Res., 2, S. 103, und R. Soper, 1963, Comp. Biochem. Physiol., 10, S. 325). Nieminen und Leikola (E. Nieminen und E. Leikola, 1967, Acta derm, venerol., 47, S. 327) haben in der menschlichen Epidermis ein sulfathaltiges Lipoid wahrgenommen, dessen Struktur vorläufig ungeklärt ist. Als Cianglioside (H. E. Carter, P. Johnson und E. J. Weber, 1965, Ann. Rev. Biochem., 34, S. 109) bezeichnet man Glucolipoide, in denen ein oder mehrere Sialsäurcmoleküle vorkommen. Solche Cianglioside sind im normalen Gehirngewebe (R. Kuhn und H. Wiegandt, 1964, Z. Naturforsch., 19b, S. 256) und insbesondere im Gehirn an einer gewissen Debilität (sogenannte Tay-Sachs-Idiotie) leidender Patienten (L. Svennerholm. 1962. Biochem. Biophys. Res. Commun.. 9, S. 346) gefunden worden. Auch aus der Milz ( L. Svenncrhulm, 1963, Acta Chcm. Scand., 17, S. 860) und aus den Erythrozyten des Bluts (E. Klenk und Ci. Padbcrg. 1962, Z. Physiol. Chem.. 327. S. 249) sind Cianglioside isoliert worden.

Bisher sind im Schrifttum keine Sulfolipoide erwähnt, die auch Sialsäure enthalten, d. h., man kennt keine l.ipoidgruppc. die gleichzeitig sowohl Sulfat als auch eine Sialsüuregruppc enthält. Die jetzt ent deckte neue Lipoidgruppe, die zuerst aus dem Pfcrdcluif isolieft wurde und für die der Nachweis erbracht worden ist, daß sie sowohl die für Ganglioside typische Sialsäure als auch die für Sulfatidc typische Sulfalgruppe enthält, wird im nachfolgenden ills Ciangliosidsulfat bezeichnet,

Dieses Gangliosidsulfat ist auch an Stelle aus Kufen aus Haaren, Wolle, Leder, Amniongewebe )dcr sonstigem Bindegewebe von Säugetieren, aus Vogelfedern und Eierschalen, aus Fischflossen oder ■haut, aus Krebs- und Molluskenschalen, aus Stützgewebe der Insekten und aus ihren Absonderungen. z. B. Seidenspinnerpuppen, aus Spinnweben und Wespennestern, aus Stützgewebe von Stachelhäutern. z. B. vom Seestern, aus Stützgewebe von Schwamrntieren, z. B. vom Badeschwamm, aus Stützgewebe von Protozoen und aus beim Behandeln der angeführten Substanzen anfallenden Neben- und Abfallprodukten isoliert worden.

Zum Isolieren dieser neuen Gruppe, der Gan·;-liosidsulfate. aus tierischem Material sind übliche Verfahren zum Isolieren von Lipoiden angewendei worden, wobei vielleicht die Anwendung eines Gt mischs von Chloroform und Methanol (R. Ledeen. 1966, J. Am. Oil Chemists Soc, 43, S. 57) am gebräuchlichsten ist. Im Schrifttum sind zahlreiche andere Lösungsmittel bekannt, die mit Erfolg zum Isolieren von Lipoiden aus tierschem Material benutzt worden sind. Am erwähnenswertesten ist die Untersuchung von Autilio und Norton (L. A. Autilio und W. T. Norton, 1963, J. Neurochem., 10, S. 733). in welcher sie die Fähigkeit von einunddreißig organischen Lösungsmitteln vergleichen, die Lipoide aus dem weißen Bestandteil des Gehirns zu extrahieren. Von den von ihnen angewandten Lösungsmitteln seien außer Chloroform und Methanol ferner Tetrahydrofuran, Pyridin und Eisessig erwähnt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man aus den Materialien, insbesondere Hufen, Klauen oder Nägeln, mit Hilfe von Methanol, Chloroform oder deren Mischungen oder Mischungen von Methanol und Wasser die Lipoide in bekannter Weise extrahiert, nach Entfernung des Lösungsmittels durch Destillation den Rückstand an Aluminiumoxyd oder Kicselgcl chromatographiert, die neutralen Lipoide mit Chloroform eluiert, anschließend die polaren Lipoide durch Methanol eluiert und diese in bekannter Weise konfektioniert.

Die neuen Werkstoffe stellen eine Gruppe in ihrer chemischen Struktur einander nahestehender chemischer Verbindungen dar, welche die gleiche allgemeine Formel und die gleichen überraschenden und wertvollen Eigenschaften besitzen, Aus der Produktgruppe wurde eine Verbindung in reinem Zustand isoliert und bezüglich ihrer chemischen Struktur identifiziert; und zwar wurde sie aus Pferdehufen isoliert. Diese Substanz ist ihrer Hauptstruktur nach ein Gangliosid, jedoch enthält sie eine Sulfat-

c und vciiiiu somit eine vüllii· iiuue Sloli gmppc, die sich von sämtlichen bisher bekannten Sulfolipoiden darin unterscheidet, daß durin außer dun bisher bekannten Bestandteilen der Sulfnlinoide ferner die fur Ganghoside typische Sialsäure vor- j KOIl 11 ill.

In reinem Zustand ist Gangliosidsulfat ein weißer kriuilliner Stoff, der äußerst gut in Methanol und civ. as auch in Wasser löslich ist. Die Gruppeneigensduiften dieses Stoffs sind in bezug auf die Sulfatgr:,,ipe und auf die Sialsäure einheitlich, während dangen in den Fettsäuren als auch in den einfachen Kohlehydraten Variationen vorkommen können, ic ruididem, aus was für Material der Stoff isoliert wiii Ic. Die allgemeine Formel des Stoffs ist die vorski vine angegebene.

Im folgenden wird die Strukturaufklärung der Gangiiosidsulfate beschrieben.

Die Homogenität der Gangliosidsulfau'raktion wuiJc fiachcnchromatographisch mit den folgenden LiK'ingsmittelsystemen erhärtet: Chloroform—Methanol—Wasser in verschiedenen Verhältnissen (24-7:1, 65:75:4, 60:35:8), Chloroform—Meth -.1.'IuI-2,5 n-NH₄OH (60 : 35 : 8), Propanol—Wasser (7 : 3) und Propanol—konz. NH₄OH (7 : 3). Mit alien diesen Mischungen ergab die Gangliosidsulfatfraktion nur einen Fleck.

Nach der Elementaranalyse enthielt die Verbindurg 56,7% C, 9,3% H, 3,8% N, 2,4% S und 2.\3 0 O. Nach dem osmometrischen Verfahren (mit Methanol als Lösungsmittel) ergab sich ein Molekulargewicht von 1280.

Das Infrarotspektrum der Verbindung, in Fig. 1 wiedergegeben, wies eine Absorptionsspitze bei lltOcm-' auf, was für die Sulfatgruppe typisch ist. Die Verbindung lieferte mit Resorcinchlorwassersto.isaureieagens die für Sialsäure spezifisch rötlichblaue Farbe. Die Struktur der Verbindung wurde durch Zerlegen derselben in ihre Komponenten und getrenntes Identifizieren einer jeden Komponente bestimmt.

10 mg der Vorbindung wurden in verschlossener Ampulle mit 3 ml 2normaler methanolischer SaIzsiiurc bei 7O⁰C im Verlauf von 20 Stunden hydrolysiert. Aus dem erkalteten Hydrolysat wurden die Fettsäuren mit 2 · 3 ml Petroläther extrahiert. Die vereinigten Petrolätherfraktionen wurden zum Identifizieren der Fettsäuren und zur quantitativen Bestimmung benutzt. Das methalonische Hydrolysat wurde durch eine Amberlite-IR-45-Säule geschickt; Eluiercn erfolgte mit 50 ml Methanol. Die Lösung wurde >m Vakuum zur Trockne gedampft, und der Rüdstand wurde in Pyridin mit einer Mischung (2:1) vom Hexaniethyldisilazan trimethysilyliert. Das überschüssige Silylierreagens wurde abgedampft und der Rückstand in 2 ml Hexan gelöst. Diese Lösung wurde zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Kohlehydrate sowohl gaschromatographisch als auch masscnsprcktrographisch benutzt. Die Gaschromatogramme wurden mit einem mit einem Servo- Riter -Integrator versehenen Varian-Aerograph-Chromatographen (Modell 204) mit einer 2,5%-SE-30-Säule von 2 m Länge aufgenommen. Die Temperatur betrug hierbei 165⁰C. Zur intimen Eichung diente Tfim-ithylsilyWther von Sorbit. In der Verbindung wurden Spuren von Galactosamin und Sialsäure sowie ein Galactoserest und ein Sphingosinrest nachgewissen. Der Sphingosinbcfund ^wurde ""'I' mussenspekirogrupliisch mil dem Cm,-chromatograph-Massenspcklrograph mil LKB ge^si«-'^rt. und es wurde Sphingosin mil 18 KohlensiolTatomen und zwei Hydroxylgruppen nad,gewiesen. Als Bezugsstoff wurde aus sjhingomyclin ^vom Ochsenhirn in entsprechender Weise isoliertes Sphingosin verwendet, das von den Mann Research Laboratories, Inc., New York, bezogen wurde

Zur'Bestimmung des Aminozuckergehalts wurden 5 mg der Verbindung in 2 n-Salzsäure-Methanol-Wasser-Gemisch (1 : 1) bei 100⁰C im Verlauf von 40 Stunden hydrolysiert. Die Aminozucker wurden aus dem Hydrolysat mit einer Dowex-50-Ionenaustauschsäule nach dem Verfahren von Boas, _{(N R BoaS]} ^^ _{; Bio}, ^^ _{2Q4< s 5}-₃₎ abgetrennt. Die erhaltenen Aminozucker wurden trimethylsilyliert und gaschrumatographisch untersucht, mit Sorbit-Trimethylsilyläther als internem Eichstoff. Die Verbindung enthielt einen Galactosaminrest. Zur Bestimmung des Sialsäuregehalts wurden 15 mg der Verbindung mit 5 ml der Mischung Äthanol—Chloroform-konz. HCl (7,4 : 6 : 3) bei 70³C im Verlauf von 3 Stunden hydrolysiert. Die erkaltete Mischung wurde im Vakuum zur Trockne gedampft, und die »Nichtlipoide« wurden mit Sephadex (G25fine) nach Wells und Dittmer (M. A. Wells und J. C. Dittmer, 1963, Biochemistry, 2, S. 1259) abgetrennt. Die Nichtlipoidfraktion wurde zur Trockne gedampft und der Riickstand in Wasser gelöst. Aus dieser wäßrigen Lösung v^^e _die sialsäure nach Svennerholms Resorcinverfahren bestimmt, welches in der Version von Miettinen und Takki-Luukkainen (T. Miettinen und I. T. Takki-Luukkainen, 1959, Acta Chem. Scand., 13, S. 856) angewendet wurde. Aus dieser Lösung wurde noch der Galactosegehalt nach dem Resorcinverfahren (N. S. Radin, R. Brown und F. B. Lavin, 1956, J. Biol. Chem., 219, S. 977) bestimmt. Es konnte nachgewiesen werden, daß die Verbindung einen Sialsäurerest und einen Galactoserest enthielt. Als Bezugsstoffe dienten von Britisch Drug Houses, Ltd., Poole, England, hergestellte d (f-)-Galactose und Sialsäurekonzentrat von der Nutritional Biochemical Corp., Cleveland, Ohio, USA.

Zur Bestimmung des Sulfatgehalts wurden t,0mg der Verbindung mi' 200 μΐ 1 n-HCt in verschlossener Ampulle bei 70⁰C über Nacht hydrolysiert. Das Sulfat wurde nach dem Verfahren von Spencer (B. Spencer, 1960, Biochem., J., 75, S. 435) bestimmt. In der Verbindung wurde ein Sulfatrest nachgewiesen.

Die Fettsäuren wurden aus dem Petrolätheiextrakt als Methylester gaschromatographisch bestimmt (mit Methylbehenat als internem Eichstoff, mit 10%-DEGS-Säule und 175° C Chromatographiertcmperatur). In der Verbindung wurden nachgewiesen· 63,7% Stearinsäure, 19,7% Palmitinsäure, 12,0% Arachinonsäure fowie 4,6% nichtidentifizicrtc Fe11-säuren. Als Bezugsstoff diente von der Sigma Chcmical Company, St. Louis, Mo., USA., hergestellter Methylester von Fettsäuren, d ( + )-Galaosaminhydrochlorid,

Auf Grund mikrobiologischer Untersuchungen wurde festgestellt, daß dieser neue Stoff liberraschende und wertvolle Eigenschaften besitzt. Sein Charakter hat sich als deutlich antibiotisch hernns-

'!CSk¹¹It. und /vnr ist er einerseits bakterizid und andererseits baM"riostaliscb. je nach <!er nngewand· •en Konzentration. Zur Klärung dieser F.igcnschaftcn wurde folgender Versuch angestellt.

Zur Untersuchung wurden Bakterien namens S Strep'ococcus faecalis und Staphylococcus nureir; \TC K538 verwendet. Das Präparat wurde in der l'ltru-Turrax-ZcntriiiK'e mit Baktericnnährlösiing honvseiiisiert. und das so erhaltene Substrat wurde mit den bei der Untersuchung verwendeten Mikrn-Organismen geimpft. Das GangliosidsuHat war aus l'fcnielnifcn isoliert worden.

Die Ergebnisse zeigten, daß das Wachstum des Üaktcriums und Staphylococcus aureus in O.5ⁿ/oiger Gangliosidsulfatemulsion inhibiert wird und dasjenige vim Streptococcus faecalis in l,(Woigcr. Das Studium der .bakteriostatischcn Wirkung eines lipophilen StolTs fällt verhältnismäßig schwer, da eine Zerleihmg des in Frage stehenden Lipoids auf molekulare Größe in wäßriger Lösung nicht erzielt werden 2η

kann und Emulgieren recht variierende Resultate ■/fitigt. Deshalb kann hier, ebenso wie auch bei anlcren lipophilen antibiotischen Stoffen, keine scharfe intibiotische Grenze angegeben werden. Das Ergebnis zeigt jedoch klar, daß die in Frage stehende St off gruppe eine recht überraschende antibiotische Wirkung hat. Nach der Untersuchung enthalten Hufe und Nägel diesen Stoff in genügender Menge, um inter normalen Verhältnissen den schädlichen Einfluß von Mikroorganismen abzuwehren und zugleich als besonderer Schutz gegen das Bestreben von Mikroorganismen zu wirken, in die vom Oberflächengewebe bedeckten, gegen Mikroorganismenangriff empfindlichen Regionen des Organismus einzudringen. Dies bedeutet, daß der Stoff äußerst wertvoll für den Organismus ist.

Mit Gangliosidsulfat aus Schweinsborsten (Ver such a) und aus Hühnerfedern (Versuch b) wurden gleichartige Versuche angestellt. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

a) Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis

b) Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis

n.o

0,1

-t-

Konzentration in
n.3 0,4

0.5

0.6

1,0

Die Ergebnisse zeigen, daß das Wachstum des Bakteriums Staphylococcus aureus bereits in 0.3" niger Gangliosidsulfatemulsion und dasjenige von Streptococcus faecalis in O,l°/oigcr Gangliosidlösung inhibiert wird, wenn bei der Herstellung des Gangliosidsulfats Schweinsborsten als Rohmaterial verwendet wurden, während bei Anwendung von aus Federn hergestelltem Gangliosidsulfat die entsprechenden Werte 0.4 bzw. 0.5 betrugen.

Alle für das Verfahren gemäß der Erfindung angegebenen tierischen Gewebe eignen sich zum Isolieren von Gangliosidsulfat. Ihr Gehalt an Gangliosidsulfat varriiert nicht sehr stark, von 0,1 bis 0.5°/o, was auch ganz natürlich erscheint, wenn man die Aufgabe des betreffenden Stoffs in der Natur berücksichtigt. Er soll, wie bereits gesagt vurdc. dasjenige Gewebe, in dem er vorkommt, und indirekt auch all das Gewebe, welches vom erstgenannten Gewebe möglicherweise umgeben wird, vor dem schädlichen Einfluß von Mikroorganismen schützen. Hierdurch werden solche Tatsachen, wie z. B. die gute Haltbarkeit des Wespennests und der Spinnweben unter den verschiedensten Temperatur- und Feiichtigkeitsverhältnissen in der freien Natur, Liut verständlich. Ferner ist zu verstehen, weshalb die Puppe des Seidenspinners die Larve so gut während der Metamorphose schützt. Der Wirkungskreis der besauten Stoffgruppe in der Natur ist derart luseeck-hnt und vielfältig, daß or für Jahrzehnte ijn;<i^ für aufklärende Arbeiten Stoff liefert. Die bisheriaen Ergebnisse zeigen jedoch schon, daß die ^tnfTaruppe in ihren Eigenschaften sowohl äußerst überraschend als auch wertvoll ist. Medizinische Vnv-cndunacn werden in Zukunft zeigen, in wie großem Maß diese Stoffgruppe zur eigentlichen krankheitsheiliing verwertet werden kann, doch sind jedenfalls dafür alle Voraussetzungen vorhanden.

Deutliche mikrobiologische Schutzwirkung ist auch unter anderem aus dem folgenden Versuch ersichtlich. Eine poröse Extraktionshülse (Schleicher & Schüll Nr. 603) wurde mit 0,2 °/o Gangliosidsulfat getränkt. Durch diese Hülse hindurch erfolgte keinerlei Transport von Mikroorganismen aus innerhalb der Hülse befindlicher infizierter Nährlösung in sterile Lösung außerhalb derselben, obwohl der Durchgang von Bakterien durch diese Hülse völlig unbehindert war. wenn die Hülse in entsprechender Weise mit einem anderen Lipoid getränkt war. Diese besondere antibiotische Eigenschaft ist um so wertvoller, als sie erstmalig von einem im tierischen Organismus angetroffenen Lipoid bekannt wird.

Die dargestellte überraschende und wertvolle Eigenschaft des Gangliosidsulfats könnet indirek' auch zum Vorschein, wenn man alle bisher unter suchten Bauelemente des tierischen Organismus odei solche Absonderungen betrachtet, die ausdrücktet dem mikrobiologischen Einfluß der umgebender Natur standhalten sollen.

Gangliosidsulfate können in der Antibiotik sowii in der Pflege solcher Hautkrankheiten eingesetz werden, für die ein Mangel dieser Lipoide in de Epidermis charakterisch ist. Zur Verabfolgung de Verbindungen kann man sich der folgenden Appli kationen bedienen:

1. Parenteral, wobei die Verbindung zusamme] mit sterilem Wasser, physiologischer Salzlösun oder zu injizierendem Öl in flüssige Form ge bracht wird.

2. Oral, wobei aus der Verbindung Tabletten. Kap sein. Pulver, Dragees oder flüssige Präparat hergestellt werden.

3. Lokal, wobei die Verbindung einer geeignete Salbe oder Krem beincmischt wird.

/ur \ eiaiischauiiclHing der Erfindung werden folgende Beispiele angeführt.

Beispiel I

50 g fein/Lrmahlcnc Hufe werden unter Rückfluß I '.tunde mit 500 ml Chloroform-Methanol-Mischutig (2 I) extrahiert und abfiltriert; der Rückstand wird noch I Stunde unter Rückfluß mit 500 ml ChloroliHMi-Methanol-Miscliung (I ' 2) extrahiert. Die vereinigten Filtrate werden mit wasserfreiem Natriumsullil getrocknet und im Vakuum zur Trockne gedampft. Die Ausbeute (etwa I g) ist ein hellgelbes Fett, in dem auch reichlich Ncutrallipoidc vorhanden sind. Dieses Lipoidgeniisch wird in 30 ml Chloroform aufgelöst: die Mischung wird durch eine Aluminiumoxulsiiilc geschickt, die aus 50 g in Chloroform suspendiertem AL₁O., besteht. Die neutralen Lipoide werden aus der AI₂O₁₁-SaIiIe mit 500 ml Chloroform eluierl. wonach die polaren Lipoide aus der Säule mit 500 ml Methanol eluierl werden. Diese Methaiiolfraktion wird im Vakuum zur Trockne gedampft, wobei man etwa 0,5 g eines schwach hellgelben Lipoidgemisches erhält, das nahezu ausschließlich (iangliosidsulfat enthält. Man löst dieses Gemisch in 2 ml warmem Methanol auf und läßt es erkalten. wobei die in Methanol schlechter löslichen Lipoide auffallen, das Gangliosidsulfat aber in der Lösung i'ieibt. die anschließend filtriert wird. Diese Methaiiolbeh^tullung wird dreimal wiederholt; es ergeben sich etwa 0,25 g weißes, wachsarliges Gangliosidsulfat.

In der im Beispiel dargestellten Methanol-Reinigungsbehandlung ist der Gangliosidsulfatverlust verhältnismäßig hoch. Beträchtlich bessere Ausbeuten werden erzielt, indem man die hinter der Al₂O.,-Säule erhaltene Methanolfraktion entweder mit einem Sephadcxgelfilter oder mittels präparativer Dünnschiclitchromatographie reinigt.

Man kann auch so verfahren, daß von dem Rohmaterial direkt die zur therapeutischen Verwendung vorgesehene Lipoidfraktion mit einem solchen Lösungsmittel abgetrennt wird, das in der Hauptsache nur diese Lipoidfraktion zu lösen vermag, während die übrigen Lipoide ungelöst bleiben. Dazu kann man am zweckmäßigsten Methanol oder ein Gemisch desselben mit Wasser verwenden. An Stelle von Hufen od. dgl. kann man bei der Behandlung derselben entstandene Neben- und Abfallprodukte benutzen.

B e i s ρ i e 1 2

68 g Bindehaut werden gefriergetrocknet. Die trockene Haut wird zerkleinert. Die Fette werden zweimal mit 300 ml Methanol unter Rückfluß im Verlauf von ' 2 Stunde extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zur Trockne gedampft. Der erhaltene fettartige Rückstand (1,0844 g), der reichlich Phospholipoide enthält, wird in der AL₁O₁₁-SaUIe gereinigt. 30 e Aluminiumoxyd werden in Chloroform suspendier., und der fettartige in 30 ml Chloroform gelöste Rückstand wird hindurchgetrieben. Die neutralen Lipoide werden aus der Säule mit 90 ml Chloroform eluiert (Ausbeute 330 mg, 0.48%), und die polaren Lipoide werden anschließend mit 250 ml Methanol eluiert (Ausbeute 285 mg. 0.42%). Ein großer Teil der Proteine usw. bleibt noch in der 6j Säule zurück. Die Fraktion der polaren Lipoide wird mittels Diinnplattenchromalographic auf Silicagelplaitcn und mit einer Mischung vmi Chloroform, Methanol und Wasser (24:7: I) als lließmillel gereinigt. Aus dem Platlenmaterial wird das Gangliosidsulfiit mit Methanol extrahiert; das Methanol wird abgedampft, und der Rückstand wird einmal aus Methanol umkristallisicrt. Ausbeute etwa 50 nm (0.17"Ai).

H c i s ρ i e 1 3

¹M.5 kg Federn werden mit einet CH₁OII CR₁CL,-Mischung (2¹I) im Fvitol-Apparal zweimal 7 Stunden lang extrahiert. Die Ausbeute beträgt 2.2 kg (2.3%) hellbraunes Fett, das weiter entweder in der AI₂O,- oder in der Destrangelsätilc gereinigt wird.

a) 500 mg Fedcrfctl werden in 5 ml Chloroform gelöst, der nichtgelöste Teil wird filtriert und die Lösung durch eine Säule mit IO g AI..O., geschickt. Die neutralen Lipoide werden mit 35 ml Chloroform eluiert (Rückstand 220 mg, 44.O⁰Zn) und die polaren Lipoide hiernach mit 100 ml Methanol (Rückstand 155,2 mg. 31.0%). Die Fraktion der polaren Lipoide enthält etwa SO⁰Zn Gangliosidsulfat; dieses wird aus der Fraktion durch dreimaliges Umkristallisieren aus Methanol gewonnen. Gangliosidsulfatausbcute 62 mg (12.4%)/

b) 5 g Federfett werden in 20 ml einer Mischung aus CHCL₁-MeOH-H₂O (60:30:4,5) suspendiert, und der unlösliche Teil wird abfiltriert. 10 g Destrangel (g 25 fine) werden in 50 ml der Mischung aus CHCL₁-MeOH-H₂O (60:30:4,5) suspendiert und in ein Ionenaustauschrohr geschüttet. Die Fcderfettlösung wird hindurchgescliickt. wobei die neutralen Lipoide mit der Treiblösung laufen. Die polaren Lipoide werden aus der Säule mit 100 ml einer Mischung aus CHCL₁ — MeOH (2-1 1) eluiert. Die Fraktion der polaren Lipoide wird weiter plattcnchronialographisch nach Beispiel 1 gereinigt.

Beispiel 4

378 kg Federn werden in der Wärme unter Rückfluß im L-vitol-Apparat mit CR₁CL, 3 Stunden lang extrahiert. Ausbeute 3,8 kg (l,0%)~heIlbraunes FeU. das weiter in der ΑΙ.,Ο.,-Säule gereinigt wird [vgl. Beispiel 2. a)]. Das Fett enthält 60,6⁰Z₀ neutrale Lipoide und etwa 1 l,4°/o polare Lipoide. Das Fett enthält etwa 3.8⁰Zn Gangliosidsulfat, das nach Beispiel 2. a) separiert wird.

Beispiel 5

30 kc Federn werden mit 1801 einer Mischung aus CR₁OH-CH₂Cl₂ (1:1) durch Perkolation über Nacht extrahiert. Die Ausbeute (3.1 kg. ZA ⁿ «) wird weiter in der AI.,O₃-Säule gereinigt, wobei 50.1 ° 0 neutrale Lipoide, 25,0⁰Zo polare Lipoide und 8.3" 0 Gangliosidsulfat (auf die Fettmenge bezogen) erhalten werden.

Beispiel 6

30.5 kg trockene Schweinsborsten werden im Evitol-Apparat mit 60 1 Methylenchlorid C- Stunden lang extrahiert. Das Lösungsmittel wird abdestilliert" Rückstand 481 g (1.58%). Der Rückstand wird weiter in der Al₂O._rSäule gereinigt, wobei 58.5% Neutrallipoide, 12,3% polare Lipoide und 2,4% Gangliosidsulfat erhalten werden.

Beispiel 7

30.5 kij trockene Schweinsborsten werden im Ivitol-Apparal mit M)I einer Chloroform-MeOH-Mi-

109 682/342

Claims (1)

1. I 959 933

   9 10

   schling (2:1) I Stunde lang extrahiert. Die Ausbeute Beispiel 14
   an Fett betrügt 432 g (1,42"O); es wird weiter in der

   AL₁O₁-SiUiIe gereinigt. Neutrallipoide 46,4⁰Zn, polare 2.4g Scestern werden nach Beispiels extrahiert.

   Lipoide 16.1 % und Gangliosid.ulfat 8,0%. Der Rückstand (235 mg, 9,K¹Vn) wird weiter in der

   5 ΑΙ.,Ο.,-Siiulc gereinigt, wobei 5 g ΛΙ.,Ο, verwendet

   F3 e i s ρ ι e I 8 werden: es würden 75.7 mg (3,2"Ai) neutrale Lipoide

   5 g Schafwolle werden zweimal mit 50 ml einer mit 75 ml Chloroform cluiert und 5,5 mg (0.23",π)

   Mischung aus CHCl₃ — MeOH (2 H) insgesamt polare Lipoide mit 40 ml Methanol eluicrt. Die Frak-

   1 Stundenlang extrahiert. Ausbeute 505 mg (10,1%). tion der polaren Lipoide enthalt neben 4,Og(0.16·',π)

   die weiter in der ΑΙ.,Ο.,-Säule gereinigt wird. Neutral- io Ciangliosidsulfat etwas Proteine, die durch Filtrieren

   lipoide 7.4"Ό. polare Lipoide 2.7°/o und Gangliosid- aus einer kalten CHCI^-MeOH-Mischung (2: I) ent-

   «iiilfal 0.3%. fern! werden.

   Beispiele Beispiel 15

   Line Seidenspinnerpuppe, die 245 mg wog, wird 15 22.(S g Hühnereihäute werden zweimal mit 1000 ml ■■2 Stunde lanu mit 15 ml uincr Mischung aus einer Mischung aus CHCI₁ — MeOH (I 2) ex-(UCl₁-MeOH (2 11) extrahiert und anschließend träniert. Der Fettrückstand (307 mg, 1,35%) wird in ¹ j Stunde lang mit 15 ml ;iner Mischung aus der ΑΙ,Ο.,-Säule gereinigt, wobei die Fraktion neu-CHCl,— MeOH (I l· 2). Der Fsttrückstand (4,7 mg, traler Lipoide in einer Menge von 21,5 mg (0.0«)%) 1,93%) wird plattenchromatographisch auf Kiesel- ao und die Fraktion polarer Lipoide ein einer Menge gelplatten nach Beispiel 1 gereinigt. Die Ausbeute von 172 mg (0,76%) erhalten wird. Die Fraktion etwa 0.3 mg (0,12%>) Gangliosidsulfat. der polaren Lipoide wird weiter plattenchromatographisch gereinigt, wobei 23,6 mg (0.2%)· Gangliosid-^BeisP^{iel l0} sulfat erhalten werden.

   3.3 g Spinnweben werden nach Beispiel S 25 Die Darreichungsformen der gemäß der Frfindimj ^: ·.· Stunde lang mit 75 ml CHCI₁-MeOH (2(1) hergestellten -Vrzneimittel bestehen im wesentlicher und ' j Stunde lang mit 75 ml CHCI₁-MeOH aus pastenartigen, öligen Salbenpräparaten. Diese wer-(1-2) extrahiert. Die vereinigten Fraktionen werden den in der Weise hergestellt, daß man das Ar/ncitiltriert und zur Trockne gxlampft, Rückstand mittel in geeigneter Menge, z. B. in einer Menge von 768mg(23.3%) mit reichlichem Gehalt an Proteinen 30 2% indifferenten Ölen, wie Oleum olivae. oder üb und Kohlehydraten. Der Rückwand wird in 3,8 ml liehen Salbengrundlagen in an sich bekannter Weist Chloroform gelost und in einer Säule mit 20 g AL₁O₃ beimischt. Die so gewonnenen öligen Präparat j c-Jci gereinigt, wobei 106,5 mg neutrale Fette (1.i,8"ⁿ/o) Salben eignen sich sehr vorteilhaft zur Heilung vor und 33.5 mg (4.35%) polare Fette erhalten werden. Verwundungen, insbesondere Brandwunden, inden-Die Fraktion der polaren Fette wird weiter auf der 35 die Präparate auf die Stellen, an denen die körper-Platte nach Beispiel I gereinigt, wobei 1.6 mg eigene Schutzschicht zerstört wurde, applizien (0.05%) Ciangliosidsulfat erhalten werden. werden.

   Eine weitere Darreichungsform der gemäß der Er-Beispiel Il findung erhaltenen Arzneimittel wird dadurch gev.on-

   Ein Wespennest mit einem Gewicht von 453 mg 4° nen. daß man das Arzneimittel in für Augensalber wird zerkleinert und nach Bcispi ;1 8 > ₂ Stunde lang an sich bekannte Salbengrundlagen beimischt. Die mit einer Chloroform-Methanol-Mischung (2:1) und so gewonnene Salbe eignet sich ferner bei der Theraanschließend ^! 2 Stunde lang mit einer Chloroform- pie verschiedener Geschwürbildungen (Ulzerationen) Methanol-Mischung (1 : 2) extrahiert. Der Fettrück- wobei sehr wirksame HcilefTekte beobachtet werden stand (49.4 mg, 10,9%) wird weiter in der AL₁O₁- 45 Eine weitere Anwendungsform der gemäß der Fr Säule gereinigt. Die neutralen Fette betrauen 25.0 nig findung erhaltenen Arzneimittel in Form einer Salbt (50,5%) und die polaren Fette 15,0 mg (30,4%). Die besteht in der Behandlung infektiöser Hautausschläge polaren Lipoide werden weiter plattencliromatogra- wobei das Arzneimittel in der jeweils gewünschter phisxh nach Beispiel I gereinict. wobei 3.5 nief7.f%) Dosierung solchen Salbengrundlagen beigemisch Gangliosidsulfat erhalten werden 50 wird, die üblicherweise bei der Behandlung \or

   Hautau>schlöeen zur Anwenduni: kommen.
   Beispie! 12

   -1 1 11 1 1 /r- · r,- · ι- ι Patentanspruch:

   2.1g Badeschwamm (Eusponuia oflicuiahs) werden nach Beispiels extrahiert. Rückwand 10.2mg Verfahren zur Herstellung von Arzneimittel! (0.92",·). der plattenchromatonraplmch nach Bei- 55 mit an:ibiotischer Wirkung aus Materialien tie spiel I vereinigt wird. Die Ausbeute beträgt 4.6 mg rischen Ursprungs, d ad u rch ge ken η ze ich ■ (0.22" if) Ganciiiisidsiilfat. net. daß man aus den Materialien, insbesonden

   aus Hufen. Klauen und Nägeln, mit Hilfe voi

   Beispiel 13 Methanol. Chloroform oder Jeren Miscluingei

   6.6 u Schlangenhaut werden zerkleinert und mit 60 oder Mischungen von Methanol und Wasser dii

   50 ml "Methanol I Stunde lang extrahiert. Rjckstar·"' Lipoide in bekannter Weise extrahiert, nach F.nt

   996 m«. der weiter in der Al.,O.,-Säule Bereinigt wird. fernung des Lösungsmittels durch Destillaiioi

   Das Fett enthält 111 mg (L6S%) neutrale Lipoide den Rückstand an Aluminiumoxyd oder Kieselge

   und 282 ma (4.26%) polare Lipoide. Die Fraktion Chromatographien, die neutrale» Lipoide mi

   der polaren Lipoide wird weiter plattenchromato- «5 Chloroform eluiert. anschließend die polaren Li

   «•r-iphiscli üereinigt, wobei etwa 7 mg (0.1°·..) poide durch Methanol eluiert und die:,e in be

   f'.aiiülioshlsnll.it erhalten werden. ' kannter Weise konfektioniert.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen