DE1959933B

DE1959933B - Verfahren zur Herstellung von Arznei mitteln mit antibiotischer Wirkung aus Materialien tierischen Ursprungs

Info

Publication number: DE1959933B
Authority: DE
Inventors: Der Anmelder Ist
Original assignee: Leikola, Erkki Ensio, Helsinki

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Arzneimitteln mit antibiotischen Wirkungen, die der Formel

O

H
ι

C —

N

Sialsäure ->

H

N
I

I

COOH

Οχ

-

\

\ΛΛΛ C =

Ii

I
^c\

ι
ι

und Sulfat (SO₄)

I
I

I
A~

H }

I

\ΛΛΛ C -

I

enthaltendes

H

I/
_!X

-JP

-OH

H

t

HO —

C —

H

Kohlenhydrat

I
I
I

Fettsäure

C-

-OH

j

— Ν —

— 0 —

_

C-

₂0H

j.

I

H

CH₂

CH

J

Ceramid

entsprechende Gangliosidsulfate enthalten. Lipoide, die eine Sulfatgruppe enthalten, werden als Sulfatide oder Sulfolipide bezeichnet, und man nimmt allgemein an, daß die Ceramid-Galactose-Sulfatester-Struktur besitzen. Die Bindung der Sulfatgruppe an die Sulfatide ist noch nicht geklärt. as

Sulfatide sind bisher im Gehirn gefunden worden (K. L. Landsteiner und P. A. Levene, 1925, J. Immunol., 10, S. 731, und P. A. Levene und K. L. Landsteiner, 1927, J. Biol. Chem., 75, S. 607), aber in letzter Zeit sind Sulfatide auch in anderen Geweben nachgewiesen worden, so z. B. in der Leber, Niere und Milz (I. H. Goldberg, 1961, J. Lipid Res., 2, S. 103, und R. Soper, 1963, Comp. Biochem. Physiol., 10, S. 325). Nieminen und Leikola (E. Nieminen und E. Leikola, 1967, Acta derm, venerol., 47, S. 327) haben in der menschlichen Epidermis ein sulfathaltiges Lipoid wahrgenommen, dessen Struktur vorläufig ungeklärt ist. Als Ganglioside (H. E. Carter, P. Johnson und E. J. Weber, 1965, Ann. Rev. Biochem., 34, S. 109) bezeichnet man Glucolipoide, in denen ein oder mehrere Sialsäuremoleküle vorkommen. Solche Ganglioside sind im normalen Gehimgewebe (R. Kuhn und H. Wiegandt, 1964, Z. Naturforsch., 19 b, S. 256) und insbesondere im Gehirn an einer gewissen Debilität (sogenannte Tay-Sachs-Idiotie) leidender Patienten (L. Svennerholm, 1962, Biochem. Biophys. Res. Commun.. 9, S. 346) gefunden worden. Auch aus der Milz ( L. Svennerholm, 1963, Acta Chem. Scand., 17, S. 860) und aus den Erythrozyten des Bluts (E. Klenk und G. Padberg, 1962, Z. Physiol. Chem., 327, S. 249) sind Ganglioside isoliert worden.

Bisher sind im Schrifttum keine Sulfolipoide erwähnt, die auch Sialsäure enthalten, d. h., man kennt keine Lipoidgruppe, die gleichzeitig sowohl Sulfat als auch eine Sialsäuregruppe enthält. Die jetzt entdeckte neue Lipoidgruppe, die zuerst aus dem Pferdehuf isoliert wurde und für die der Nachweis erbracht worden ist, daß sie sowohl die für Ganglioside typische Sialsäure als auch die für Sulfatide typische Sulfatgruppe enthält, wird im nachfolgenden als Gangliosidsulfat bezeichnet.

Dieses Gangliosidsulfat ist auch an Stelle aus Hufen aus Haaren, Wolle, Leder, Amniongewebe oder sonstigem Bindegewebe von Säugetieren, aus Vogelfedern und Eierschalen, aus Fischflossen oder -haut, aus Krebs- und Molluskenschalen, aus Stützgewebe der Insekten und aus ihren Absonderungen, z. B. Seidenspinnerpuppen, aus Spinnweben und Wespennestern, aus Stützgewebe von Stachelhäutern, z. B. vom Seestern, aus Stützgewebe von Schwammtieren, z. B. vom Badeschwamm, aus Stützgewebe von Protozoen und aus beim Behandeln der angeführten Substanzen anfallenden Neben- und Abfallprodukten isoliert worden.

Zum Isolieren dieser neuen Gruppe, der Gangliosidsulfate, aus tierischem Material sind übliche Verfahren zum Isolieren von Lipoiden angewendet worden, wobei vielleicht die Anwendung eines Gemischs von Chloroform und Methanol (R. Ledeen, 1966, J. Am. Oil Chemists Soc, 43, S. 57) am gebräuchlichsten ist. Im Schrifttum sind zahlreiche andere Lösungsmittel bekannt, die mit Erfolg zum Isolieren von Lipoiden aus tierischem Material benutzt worden sind. Am erwähnenswertesten ist die Untersuchung von Autilio und Norton (L. A. Autilio und W. T. Norton, 1963, J. Neurochem., 10, S. 733), in welcher sie die Fähigkeit von einunddreißig organischen Lösungsmitteln vergleichen, die Lipoide aus dem weißen Bestandteil des Gehirns zu extrahieren. Von den von ihnen angewandten Lösungsmitteln seien außer Chloroform und Methanol ferner Tetrahydrofuran, Pyridin und Eisessig erwähnt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man aus den Materialien, insbesondere Hufen, Klauen oder Nägeln, mit Hilfe von Methanol, Chloroform oder deren Mischungen oder Mischungen von Methanol und Wasser die Lipoide in bekannter Weise extrahiert, nach Entfernung des Lösungsmittels durch Destillation den Rückstand an Aluminiumoxyd oder Kieselgel chromatographiert, die neutralen Lipoide mit Chloroform eluiert, anschließend die polaren Lipoide durch Methanol eluiert und diese in bekannter Weise konfektioniert.

Die neuen Werkstoffe stellen eine Gruppe in ihrer chemischen Struktur einander nahestehender chemischer Verbindungen dar, welche die gleiche allgemeine Formel und die gleichen überraschenden und wertvollen Eigenschaften besitzen. Aus der Produktgruppe wurde eine Verbindung in reinem Zustand isoliert und bezüglich ihrer chemischen Struktur identifiziert; und zwar wurde sie aus Pferdehufen isoliert. Diese Substanz ist ihrer Hauptstruktur nach ein Gangliosid, jedoch enthält sie eine Sulfat-

3 4

gruppe und vertritt somit eine völlig neue Stoff- wurde noch massenspektrographisch mit dem Gasgruppe, die sich von sämtlichen bisher bekannten chromatograph-Massenspektrograph mit LKB ge-Sulfolipoiden darin unterscheidet, daß darin außer sichert, und es wurde Sphingosin mit 18 Kohlenden bisher bekannten Bestandteilen der Sulfolipoide Stoffatomen und zwei Hydroxylgruppen nachgeferner die für Ganglioside typische Sialsäure vor- 5 wiesen. Als Bezugsstoff wurde aus Sphingomyelin kommt. vom Ochsenhirn in entsprechender Weise isoin reinem Zustand ist Gangliosidsulfat ein weißer, liertes Sphingosin verwendet, das von den Mann kristalliner Stoff, der äußerst gut in Methanol und Research Laboratories, Inc., New York, bezogen etwas auch in Wasser löslich ist. Die Gruppeneigen- wurde.

schäften dieses Stoffs sind in bezug auf die Sulfat- io Zur Bestimmung des Aminozuckergehalts wurden gruppe und auf die Sialsäure einheitlich, während 5 mg der Verbindung in 2 n-Salzsäure-Methanoldagegen in den Fettsäuren als auch in den einfachen Wasser-Gemisch (1:1) bei 100° C im Verlauf von Kohlehydraten Variationen vorkommen können, je 40 Stunden hydrolysiert. Die Aminozucker wurden nachdem, aus was für Material der Stoff isoliert aus dem Hydrolysat mit einer Dowex-50-Ionenwurde. Die allgemeine Formel des Stoffs ist die vor- 15 austauschsäule nach dem Verfahren von Boas, stehend angegebene. (N. F. Boas, 1953, J. Biol. Chem., 204, S. 553) Im folgenden wird die Strukturaufklärung der abgetrennt. Die erhaltenen Aminozucker wurden Gangliosidsulfate beschrieben. trimethylsilyliert und gaschromatographisch unter-Die Homogenität der Gangliosidsulfatfraktion sucht, mit Sorbit-Trimethylsilyläther als internem wurde flächenchromatographisch mit den folgenden 20 Eichstoff. Die Verbindung enthielt einen Galactos-Lösungsmittelsystemen erhärtet: Chloroform—Me- aminrest. Zur Bestimmung des Sialsäuregehalts thanol—Wasser in verschiedenen Verhältnissen wurden 15 mg der Verbindung mit 5 ml der Mi-(24: 7:1, 65 : 25 :4, 60 : 35 : 8), Chloroform—Me- schung Äthanol—Chloroform-konz. HCl (7,4 : 6 : 3) thanol—2,5 n-NH₄OH (60 :35 : 8), Propanol—Was- bei 70° C im Verlauf von 3 Stunden hydrolysiert, ser (7: 3) und Propanol—konz. NH₄OH (7 : 3). Mit »5 Die erkaltete Mischung wurde im Vakuum zur allen diesen Mischungen ergab die Gangliosidsulfat- Trockne gedampft, und die »Nichtlipoide« wurden fraktion nur einen Fleck. mit Sephadex (G25fine) nach Wells und Dittmer Nach der Elementaranalyse enthielt die Verbin- (M. A. Wells und J. C. Dittmer, 1963, Biodung 56,7 %> C, 9,3 ⁰ZeH, 3,8% N, 2,4%. S und chemistry, 2, S. 1259) abgetrennt. Die Nichtlipoid-25,3% O. Nach dem osmometrischen Verfahren (mit 30 fraktion wurde zur Trockne gedampft und der RückMethanol als Lösungsmittel) ergab sich ein Mole- stand in Wasser gelöst. Aus dieser wäßrigen Lösung kulargewicht von 1280. wurde die Sialsäure nach Svennerholms Resorcin-Das Infrarotspektrum der Verbindung, in F i g. 1 verfahren bestimmt, welches in der Version von wiedergegeben, wies eine Absorptionsspitze bei Miettinen und Takki-Luukkainen (T. Miet-1240cm"¹ auf, was für die Sulfatgruppe typisch ist. 35 tinen und I. T. Takki-Luukkainen, 1959, Die Verbindung lieferte mit Resorcinchlorwasser- Acta Chem. Scand., 13, S. 856) angewendet wurde, stoffsäurereagens die für Sialsäure spezifisch rötlich- Aus dieser Lösung wurde noch der Galactosegehalt blaue Farbe. Die Struktur der Verbindung wurde nach dem Resorcinverfahren (N. S. Radin, durch Zerlegen derselben in ihre Komponenten und R. Brown und F. B. Lavin, 1956, J. Biol. Chem., getrenntes Identifizieren einer jeden Komponente 40 219, S. 977) bestimmt. Es konnte nachgewiesen bestimmt. werden, daß die Verbindung einen Sialsäurerest und 10 mg der Verbindung wurden in verschlossener einen Galactoserest enthielt. Als Bezugsstoffe dien-Ampulle mit 3 ml 2normaler methanolischer Salz- ten von Britisch Drug Houses, Ltd., Poole, England, säure bei 70° C im Verlauf von 20 Stunden hydro- hergestellte d (4- )-Galactose und Sialsäurekonzentrat lysiert. Aus dem erkalteten Hydrolysat wurden die 45 von der Nutritional Biochemical Corp., Cleveland, Fettsäuren mit 2-3 ml Petroläther extrahiert. Die Ohio, USA.

vereinigten Petrolätherfraktionen wurden zum Iden- Zur Bestimmung des Sulfatgehalts wurden 1,0 mg tifizieren der Fettsäuren und zur quantitativen Be- der Verbindung mit 200 μΐ 1 n-HCl in verschlossener Stimmung benutzt. Das methalonische Hydrolysat Ampulle bei 70° C über Nacht hydrolysiert. Das wurde durch eine Amberlite-IR-45-Säule geschickt; 50 Sulfat wurde nach dem Verfahren von Spencer Eluieren erfolgte mit 50 ml Methanol. Die Lösung (B. Spencer, 1960, Biochem., J., 75, S. 435) bewurde im Vakuum zur Trockne gedampft, und der stimmt. In der Verbindung wurde ein Sulfatrest nach-Rückstand wurde in Pyridin mit einer Mischung gewiesen.

(2:1) vom Hexamethyldisilazan trimethysilyliert. Das Die Fettsäuren wurden aus dem Petrolätherextrakt

überschüssige Silylierreagens wurde abgedampft und 55 als Methylester gaschromatographisch bestimmt (mit

der Rückstand in 2 ml Hexan gelöst. Diese Lösung Methylbehenat als internem Eichstoff, mit 10%-

wurde zur qualitativen und quantitativen Bestimmung DEGS-Säule und 175° C Chromatographiertempe-

der Kohlehydrate sowohl gaschromatographisch als ratur). In der Verbindung wurden nachgewiesen:

auch massensprektrographisch benutzt. Die Gas- 63,7% Stearinsäure, 19,7% Palmitinsäure, 12,0 %

chromatogramme wurden mit einem mit einem 60 Arachinonsäure sowie 4,6 % nichtidentifizierte Fett-

Servo-Riter-Integrator versehenen Varian-Aero- säuren. Als Bezugsstoff diente von der Sigma Chemi-

graph-Chromatographen (Modell 204) mit einer cal Company, St. Louis, Mo., USA., hergestellter

2,5 %-SE-30-Säule von 2 m Länge aufgenommen. Methylester von Fettsäuren, d (-t-)-Galaosaminhydro-

Die Temperatur betrug hierbei 165° C. Zur internen chlorid.

Eichung diente Trimethylsilyläther von Sorbit. In 65 Auf Grund mikrobiologischer Untersuchungen

der Verbindung wurden Spuren von Galactosamin wurde festgestellt, daß dieser neue Stoff über-

und Sialsäure sowie ein Galactoserest und ein raschende und wertvolle Eigenschaften besitzt. Sein

Sphingosinrest nachgewiesen. Der Sphingosinbefund Charakter hat sich als deutlich antibiotisch heraus-

gestellt, und zwar ist er einerseits bakterizid und andererseits bakteriostatisch, je nach der angewandten Konzentration. Zur Klärung dieser Eigenschaften wurde folgender Versuch angestellt.

Zur Untersuchung wurden Bakterien namens Streptococcus faecalis und Staphylococcus aureus ATC 6538 verwendet. Das Präparat wurde in der Ultra-Turrax-Zentrifuge mit Bakteriennährlösung homogenisiert, und das so erhaltene Substrat wurde mit den bei der Untersuchung verwendeten Mikroorganismen geimpft. Das Gangliosidsulfat war aus Pferdehufen isoliert worden.

Die Ergebnisse zeigten, daß das Wachstum des Bakteriums und Staphylococcus aureus in O,5⁽⁾/oiger Gangliosidsulfatemulsion inhibiert wird und dasjenige von Streptococcus faecalis in l,O°/oiger. Das Studium der bakteriostatischen Wirkung eines lipophilen Stoffs fällt verhältnismäßig schwer, da eine Zerteilung des in Frage stehenden Lipoids auf molekulare Größe in wäßriger Lösung nicht erzielt werden kann und Emulgieren recht variierende Resultate zeitigt. Deshalb kann hier, ebenso wie auch bei anderen lipophilen antibiotischen Stoffen, keine scharfe antibiotische Grenze angegeben werden. Das Ergebnis zeigt jedoch klar, daß die in Frage stehende Stoffgruppe eine recht überraschende antibiotische Wirkung hat. Nach der Untersuchung enthalten Hufe und Nägel diesen Stoff in genügender Menge, um unter normalen Verhältnissen den schädlichen Einfluß von Mikroorganismen abzuwehren und zugleich als besonderer Schutz gegen das Bestreben von Mikroorganismen zu wirken, in die vom Oberflächengewebe bedeckten, gegen Mikroorganismenangriff empfindlichen Regionen des Organismus einzudringen. Dies bedeutet, daß der Stoff äußerst wertvoll für den Organismus ist.

Mit Gangliosidsulfat aus Schweinsborsten (Ver such a) und aus Hühnerfedern (Versuch b) wurden gleichartige Versuche angestellt. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

	0,1	0,2	Konzentration in "In	=	0,5	0,6
0,0			0,3 0,4		—
ί		*+ -*

1,0

a) Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis

b) Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis

Die Ergebnisse zeigen, daß das Wachstum des Bakteriums Staphylococcus aureus bereits in 0,3°/oiger Gangliosidsulfatemulsion und dasjenige von Streptococcus faecalis in 0,l%iger Gangliosidlösung inhibiert wird, wenn bei der Herstellung des Gangliosidsulfats Schweinsborsten als Rohmaterial verwendet wurden, während bei Anwendung von aus Federn hergestelltem Gangliosidsulfat die entsprechenden Werte 0,4 bzw. 0,5 betrugen.

Alle für das Verfahren gemäß der Erfindung angegebenen tierischen Gewebe eignen sich zum Isolieren von Gangliosidsulfat. Ihr Gehalt an Gangliosidsulfat varriiert nicht sehr stark, von 0,1 bis 0,5Vo, was auch ganz natürlich erscheint, wenn man die Aufgabe des betreffenden Stoffs in der Natur berücksichtigt. Er soll, wie bereits gesagt wurde, dasjenige Gewebe, in dem er vorkommt, und indirekt auch all das Gewebe, welches vom erstgenannten Gewebe möglicherweise umgeben wird, vor dem schädlichen Einfluß von Mikroorganismen schützen. Hierdurch werden solche Tatsachen, wie z. B. die gute Haltbarkeit des Wespennests und der Spinnweben unter den verschiedensten Temperatur- und Feuchtigkeitsverhältnissen in der freien Natur, gut verständlich. Ferner ist zu verstehen, weshalb die Puppe des Seidenspinners die Larve so gut während der Metamorphose schützt. Der Wirkungskreis der besagten Stoffgruppe in der Natur ist derart ausgedehnt und vielfältig, daß er für Jahrzehnte hinaus für aufklärende Arbeiten Stoff liefert. Die bisherigen Ergebnisse zeigen jedoch schon, daß die Stoffgruppe in ihren Eigenschaften sowohl äußerst überraschend als auch wertvoll ist. Medizinische Anwendungen werden in Zukunft zeigen, in wie großem Maß diese Stoffgruppe zur eigentlichen krankheitsheilung verwertet werden kann, doch sind jedenfalls dafür alle Vorraussetzungen vorhanden.

Deutliche mikrobiologische Schutzwirkung ist auch unter anderem aus dem folgenden Versuch ersichtlich. Eine poröse Extraktionshülse (Schleicher & Schüll Nr. 603) wurde mit 0,2 °/o Gangliosidsulfat getränkt. Durch diese Hülse hindurch erfolgte keinerlei Transport von Mikroorganismen aus innerhalb der Hülse befindlicher infizierter Nährlösung in sterile Lösung außerhalb derselben, obwohl der Durchgang von Bakterien durch diese Hülse völlig unbehindert war, wenn die Hülse in entsprechender Weise mit einem anderen Lipoid getränkt war. Diese besondere antibiotische Eigenschaft ist um so wertvoller, als sie erstmalig von einem im tierischen Organismus angetroffenen Lipoid bekannt wird.

Die dargestellte überraschende und wertvolle Eigenschaft des Gangliosidsulfats kommt indirekt auch zum Vorschein, wenn man alle bisher untersuchten Bauelemente des tierischen Organismus oder solche Absonderungen betrachtet, die ausdrücklich dem mikrobiologischen Einfluß der umgebenden Natur standhalten sollen.

Gangliosidsulfate können in der Antibiotik sowie in der Pflege solcher Hautkrankheiten eingesetzt werden, für die ein Mangel dieser Lipoide in der Epidermis charakterisch ist. Zur Verabfolgung der Verbindungen kann man sich der folgenden Applikationen bedienen:

1. Parenteral, wobei die Verbindung zusammen mit sterilem Wasser, physiologischer Salzlösung oder zu injizierendem öl in flüssige Form gebracht wird.

2. Oral, wobei aus der Verbindung Tabletten, Kapseln, Pulver, Dragees oder flüssige Präparate hergestellt werden.

3. Lokal, wobei die Verbindung einer geeigneten Salbe oder Krem beigemischt wird.

7 8

Zur Veranschaulichung der Erfindung werden fol- thanol und Wasser (24: 7 :1) als Fließmittel gerei-

gende Beispiele angeführt. rügt. Aus dem Plattenmaterial wird das Gangliosid-

. . , ₁ sulfat mit Methanol extrahiert; das Methanol wird

Beispiel 1 abgedampft, und der Rückstand wird einmal aus

50 g feinzermahlene Hufe werden unter Rückfluß 5 Methanol umkristallisiert. Ausbeute etwa 50 mg

1 Stunde mit 500 ml Chloroform-Methanol-Mischung (0,17%).

(2 + 1) extrahiert und abfiltriert; der Rückstand wird . .

noch 1 Stunde unter Rückfluß mit 500ml Chloro- Beispiel i

form-Methanol-Mischung (1 + 2) extrahiert. Die ver- 94,5 kg Federn werden mit einer CH₃OHZCH₂Cl₂-

einigten Filtrate werden mit wasserfreiem Natrium- io Mischung (2 +1) im Evitol-Apparat zweimal 7 Stun-

sulfit getrocknet und im Vakuum zur Trockne ge- den lang extrahiert. Die Ausbeute beträgt 2,2 kg

dampft. Die Ausbeute (etwa 1 g) ist ein hellgelbes (2,3%) hellbraunes Fett, das weiter entweder in der

Fett, in dem auch reichlich Neutrallipoide vorhanden Al₂O₃- oder in der Destrangelsäule gereinigt wird,

sind. Dieses Lipoidgemisch wird in 30 ml Chloroform a) 500 mg Federfett werden in 5 ml Chloroform

aufgelöst; die Mischung wird durch eine Aluminium- 15 gelöst, der nichtgelöste Teil wird filtriert und die Lö-

oxydsäule geschickt, die aus 50 g in Chloroform sus- sung durch eine Säule mit 10 g Al₂O₃ geschickt. Die

pendiertem Al₂O₃ besteht. Die neutralen Lipoide neutralen Lipoide werden mit 35 ml Chloroform

werden aus der Al_äO₃-Säule mit 500 ml Chloroform eluiert (Rückstand 220 mg, 44,0%) und die polaren

eluiert, wonach die polaren Lipoide aus der Säule Lipoide hiernach mit 100 ml Methanol (Rückstand

mit 500 ml Methanol eluiert werden. Diese Metha- 20 155,2 mg, 31,0%). Die Fraktion der polaren Lipoide

nolfraktion wird im Vakuum zur Trockne gedampft, enthält etwa 50% Gangliosidsulfat; dieses wird aus

wobei man etwa 0,5 g eines schwach hellgelben Li- der Fraktion durch dreimaliges Umkristallisieren

poidgemisches erhält, das nahezu ausschließlich aus Methanol gewonnen. Gangliosidsulfatausbeute

Gangliosidsulfat enthält. Man löst dieses Gemisch 62 mg (12,4%).

in 2 ml warmem Methanol auf und läßt es erkalten, 25 b) 5 g Federfett werden in 20 ml einer Mischung

wobei die in Methanol schlechter löslichen Lipoide aus CHCl₃ — MeOH — H₂O (60:30:4,5) suspen-

ausfallen, das Gangliosidsulfat aber in der Lösung diert, und der unlösliche Teil wird abfiltriert.

bleibt, die anschließend filtriert wird. Diese Metha- 10 g Destrangel (g 25 fine) werden in 50 ml der Mi-

nolbehandlung wird dreimal wiederholt; es ergeben schung aus CHCl₃ — MeOH — H₂O (60:30:4,5)

sich etwa 0,25 g weißes, wachsartiges Gangliosid- 30 suspendiert und in ein Ionenaustauschrohr geschüt-

sulfat. tet. Die Federfettlösung wird hindurchgeschickt, wo-

In der im Beispiel dargestellten Methanol-Reini- bei die neutralen Lipoide mit der Treiblösung laufen,

gungsbehandlung ist der Gangliosidsulfatverlust ver- Die polaren Lipoide werden aus der Säule mit 100 ml

hältnismäßig hoch. Beträchtlich bessere Ausbeuten einer Mischung aus CHCl₃ — MeOH (2+1) eluiert.

werden erzielt, indem man die hinter der Al₂O₃- 35 Die Fraktion der polaren Lipoide wird weiter plat-

Säule erhaltene Methanolfraktion entweder mit einem tenchromatographisch nach Beispiel 1 gereinigt.
Sephadexgelfilter oder mittels präparativer Dünn-

schichtchromatographie reinigt. Beispiel 4

Man kann auch so verfahren, daß von dem Roh- 378 kg Federn werden in der Wärme unter Rückmaterial direkt die zur therapeutischen Verwendung 40 fluß im Evitol-Apparat mit CH₂Cl₂ 3 Stunden lang vorgesehene Lipoidfraktion mit einem solchen Lö- extrahiert. Ausbeute 3,8 kg (1,0%) hellbraunes Fett, sungsmittel abgetrennt wird, das in der Hauptsache das weiter in der Al₂O₃-Säule gereinigt wird [vgl. nur diese Lipoidfraktion zu lösen vermag, während Beispiel 2, a)]. Das Fett enthält 60,6% neutrale Lidie übrigen Lipoide ungelöst bleiben. Dazu kann poide und etwa 11,4% polare Lipoide. Das Fett ent» man am zweckmäßigsten Methanol oder ein Gemisch 45 hält etwa 3,8% Gangliosidsulfat, das nach Beidesselben mit Wasser verwenden. An Stelle von Hu- spiel 2, a) separiert wird,
fen od. dgl. kann man bei der Behandlung derselben
entstandene Neben- und Abfallprodukte benutzen. Beispiel 5

η · 1 , , 30 kg Federn werden mit 1801 einer Mischung

^p 50 aus CH₃OH-CH₂Cl₂ (1:1) durch Perkolation

68 g Bindehaut werden gefriergetrocknet. Die über Nacht extrahiert. Die Ausbeute (3,1 kg, 2,1%)

trockene Haut wird zerkleinert. Die Fette werden wird weiter in der Al₂O₃-Säule gereinigt, wobei

zweimal mit 300 ml Methanol unter Rückfluß im 50,1% neutrale Lipoide, 25,0% polare Lipoide und

Verlauf von Vs Stunde extrahiert. Die vereinigten 8,3% Gangliosidsulfat (auf die Fettmenge bezogen)

Extrakte werden zur Trockne gedampft. Der erhal- 55 erhalten werden,
tene fettartige Rückstand (1,0844 g), der reichlich

Phospholipoide enthält, wird in der Al₂O₃-Säule ge- B e i s ρ i e 1 6
reinigt. 30 g Aluminiumoxyd werden in Chloroform 30,5 kg trockene Schweinsborsten werden im Evisuspendiert, und der fettartige in 30 ml Chloroform tol-Apparat mit 601 Methylenchlorid 6 Stunden lang gelöste Rückstand wird hindurchgetrieben. Die neu- 60 extrahiert. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, tralen Lipoide werden aus der Säule mit 90 ml ChIo- Rückstand 481 g (1,58%). Der Rückstand wird weiroform eluiert (Ausbeute 330 mg, 0,48%), und die ter in der Al_äO₃-Säule gereinigt, wobei 58,5% Neupolaren Lipoide werden anschließend mit 250 ml trallipoide, 12,3% polare Lipoide und 2,4% Methanol eluiert (Ausbeute 285 mg, 0,42%). Ein Gangliosidsulfat erhalten werden,
großer Teil der Proteine usw. bleibt noch in der 65

Säule zurück. Die Fraktion der polaren Lipoide wird Beispiel 7

mittels Dünnplattenchromatographie auf Silicagel- 30,5 kg trockene Schweinsborsten werden im Evi-

platten und mit einer Mischung von Chloroform, Me- tol-Apparat mit 60 1 einer Chloroform-MeOH-Mi-

Claims

9 10

schung (2: 1) 1 Stunde lang extrahiert. Die Ausbeute Beispiel 14
an Fett beträgi 432 g (1,42%); es wird weiter in der

Al.,O₃-Säule gereinigt. NeutraHipoide 46,4Vo, polare 2,4 g Seestern werden nach Beispiel 8 extrahiert.

Lipoide 16,1Vo und Gangliosidsulfat 8,0%. Der Rückstand (235 mg, 9,8*/«) wird weiter in der

η · . · ι ο ⁵ Al.>O₃-Säule gereinigt, wobei 5 g Al₂O., verwendet

^{B e}' ^{s p} ¹ ^{e 8} werden; es werden 75,7 mg (3,2 Vo) neutrale Lipoide

5 g Schafwolle werden zweimal mit 50 ml einer mit 75 ml Chloroform eluiert und 5,5 mg (0,23 Vo)

Mischung aus CHCl₃ — MeOH (2+1) insgesamt polare Lipoide mit 40 ml Methanol eluiert. Die Frak-

1 Stunde lang extrahiert. Ausbeute 505 mg (10,1Vo), tion der polaren Lipoide enthält neben 4,0 g (0,16Vo)

die weiter in der Al₂O₃-Säule gereinigt wird. Neutral- io Gangliosidsulfat etwas Proteine, die durch Filtrieren

lipoide 7,4%, polare Lipoide 2,7⁰Ai und Gangliosid- aus einer kalten CHClj-MeOH-Mischung (2: 1) ent-

sulfat 0,3 %. fernt werden.

Beispiel9 Beispiel 15

Eine Seidenspinnerpuppe, die 245 mg wog, wird 15 22,6 g Hühnereihäute werden zweimal mit 1000 ml

V₂ Stunde lang mit 15 ml einer Mischung aus einer Mischung aus CHCl, — MeOH (1 + 2) ex-

CHCl₃ — MeOH (2 + 1) extrahiert und anschließend trahiert. Der Fettrückstand (307 mg, 1,35%) wird in

V» Stunde lang mit 15 ml einer Mischung aus der Al.,O₈-Säule gereinigt, wobei die Fraktion neu-CHCl₃ — MeOH (1+2). Der Fettrückstand (4,7 mg, traler Lipoide in einer Menge von 21,5 mg (0,09Vo)

1,93%) wird plattenchromatographisch auf Kiesel- *o und die Fraktion polarer Lipoide ein einer Menge gelplatten nach Beispiel 1 gereinigt. Die Ausbeute von 172 mg (0,76%) erhalten wird. Die Fraktion

etwa 0,3 mg (0,12%) Gangliosidsulfat. der polaren Lipoide wird weiter plattenchromatogra-

. . phisch gereinigt, wobei 23,6 mg (0,2 %) Gangliosid-

Beispiel 10 sulfat erhalten werden.

3,3 g Spinnweben werden nach Beispiel 8 *5 Die Darreichungsformen der gemäß der Erfindung '/2 Stunde lang mit 75 ml CHCl₃ — MeOH (2+1) hergestellten Arzneimittel bestehen im wesentlichen und V» Stunde lang mit 75 ml CHCl₃ — MeOH aus pastenartigen, öligen Salbenpräparaten. Diese wer-(1+2) extrahiert. Die vereinigten Fraktionen werden den in der Weise hergestellt, daß man das Arzneifikriert und zur Trockne gedampft, Rückstand mittel in geeigneter Menge, z. B. in einer Menge von 768 mg (23,3 %) mit reichlichem Gehalt an Proteinen 30 2% indifferenten ölen, wie Oleum olivae, oder üb- und Kohlehydraten. Der Rückstand wird in 3,8 ml liehen Salbengrundlagen in an sich bekannter Weise Chloroform gelöst und in einer Säule mit 20 g Al₀O₃ beimischt. Die so gewonnenen öligen Präparate oder gereinigt, wobei 106,5 mg neutrale Fette (13,8Vo) Salben eignen sich sehr vorteilhaft zur Heilung von und 33,5 mg (4,35%) polare Fette erhalten werden. Verwundungen, insbesondere Brandwunden, indem Die Fraktion der polaren Fette wird weiter auf der 35 die Präparate auf die Stellen, an denen die körper-Platte nach Beispiel 1 gereinigt, wobei 1,6 mg eigene Schutzschicht zerstört wurde, appliziert (0,05%) Gangliosidsulfat erhalten werden. werden.

Eine weitere Darreichungsform der gemäß der Er-B ei spiel 11 findung erhaltenen Arzneimittel wird dadurch gewon-

Ein Wespennest mit einem Gewicht von 453 mg 40 nen, daß man das Arzneimittel in für Augensalben wird zerkleinert und nach Beispiel 8 Vs Stunde lang an sich bekannte Salbengrundlagen beimischt. Die mit einer Chloroform-Methanol-Mischung (2:1) und so gewonnene Salbe eignet sich ferner bei der Theraanschließend ¹Za Stunde lang mit einer Chloroform- pie verschiedener Geschwürbildungen (Ulzerationen), Methanol-Mischung (1: 2) extrahiert. Der Fettrück- wobei sehr wirksame Heileffekte beobachtet werden, stand (49,4 mg, 10,9%) wird weiter in der Al₂O₃- 45 Eine weitere Anwendungsform der gemäß der ErSäule gereinigt. Die neutralen Fette betragen 25,0 mg findung erhaltenen Arzneimittel in Form einer Salbe (50,5%) und die polaren Fette 15,0 mg (30,4Vo). Die besteht in der Behandlung infektiöser Hautausschläge, polaren Lipoide werden weiter plattenchromatogra- wobei das Arzneimittel in der jeweils gewünschten phisch nach Beispiel 1 gereinigt, wobei 3,5 mg (7,1%) Dosierung solchen Salbengrundlagen beigemischt Gangliosidsulfat erhalten werden. 50 wird, die üblicherweise bei der Behandlung von

Hautausschlägen zur Anwendung kommen.
Beispiel 12

2,1 g Badeschwamm (Euspongia officinalis) wer- Patentanspruch:

den nach Beispiel 8 extrahiert. Rückstand 19,2 mg Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln

(0,92 V»), der plattenchromatographisch nach Bei- 55 mit antibiotischer Wirkung aus Materialien tie-

spiel 1 gereinigt wird. Die Ausbeute beträgt 4,6 mg rischen Ursprungs, dadurchgekennzeich-

(0,22%) Gangliosidsulfat. net, daß man aus den Materialien, insbesondere

aus Hufen, Klauen und Nägeln, mit Hilfe von

Beispiel 13 Methanol, Chloroform oder deren Mischungen

6,6 g Schlangenhaut werden zerkleinert und mit 60 oder Mischungen von Methanol und Wasser die

50 ml Methanol 1 Stunde lang extrahiert. Rückstand Lipoide in bekannter Weise extrahiert, nach Ent-

996 mg, der weiter in der Al,O₃-Säule gereinigt wird. fernung des Lösungsmittels durch Destillation

Das Fett enthält 111 mg (1~68 Vo) neutrale Lipoide den Rückstand an Aluminiumoxyd oder Kieselgel

und 282 mg (4,26%) polare Lipoide. Die Fraktion chromatographiert, die neutralen Lipoide mit

der polaren Lipoide wird weiter plattenchromato- 65 Chloroform eluiert, anschließend die polaren Li-

graphisch gereinigt, wobei etwa 7 mg (0,1%) poide durch Methanol eluiert und diese in be-

Gangliosidsulfat erhalten werden. kannter Weise konfektioniert.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen