DE2609533A1 - Verfahren zur extraktion von wirkstoffen, insbesondere von heterosidestern, der kaffeesaeure, sowie diese verbindungen enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER . DR.-ING. ANNEKATE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE D-8 MÜNCHEN 19 · FLÜGGENSTRASSE 17 · TELEFON 089/177061

1210 WK/rm

Societe Civile de Recherches et d'Etudes Nouvelles S.C.R.E.E.N., Paris/Frankreich

Verfahren zur Extraktion von Wirkstoffen, insbesondere von Heterosidestern der Kaffeesäure, sowie diese Verbindungen

enthaltende Arzneimittel

Die Erfindung betrifft neue Arzneimittel und die Herstellung ihrer Wirkstoffe durch Extraktion von Pflanzenmaterialien.

Es ist bereits bekannt, daß man aus bestimmten Pflanzen Heterosidester der Kaffeesäure extrahieren kann. So hat man z.B. schon den Heterosidester hergestellt, der sich

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von der Kaffeesäure, der Rhamnose, der Glukose und von Dihydroxyphenyläthanol ableitet. Man hat diesen als Verbaskosid "bezeichnet, um einen Hinweis auf die besondere Pflanze zu geben, aus der er extrahiert worden ist, nämlich aus Verbascum sinuatum. Die hinsichtlich dieser Produkte durchgeführten Untersuchungen haben sich jedoch auf Strukturuntersuchungen beschränkt und man hat bislang noch keine Eigenschaft dieser Verbindungen gefunden, die sie für irgendeine technische Anwendung geeignet machen würde.

Die vorliegende Erfindung baut sich nun auf der Entdekkung auf, daß Heterosidester der Kaffeesäure, die man aus verschiedenen Pflanzen und insbesondere aus Pflanzen der Familien Scrophulariaceae, der Orobanchaceae, der Labintae oder der Acanthaceae extrahieren kann, interessante pharrnakologische Eigenschaften zeigen, die sie für die Bildung von Arzneimitteln geeignet machen.

Gemäß der Erfindung kann man die Wirkstoffe, die insbesondere Heterosidester der Kaffeesäure darstellen und die für die pharmazeutische Verwendung geeignet sind, nach dem folgenden Verfahren herstellen, bei dem man Pflanzen, nämlich Tumifloralae-Pflanzen, vorzugsweise Scrophulariaceae, Orobanchaceae, Labiatae, Acanthaceae oder analoge Pflanzen, in einem Alkohol einweicht, die alkoholische Lösung gewinnt, den Alkohol verdampft, die zurückbleibende wäßrige Phase einer Extraktion mit Äthylacetat unterwirft und bei dem man die Fraktion gewinnt, die in Äthylacetat löslich ist. Als Alkohol kann insbesondere Äthanol oder Methanol verwendet v/erden.

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Unter anderem ist es vorzuziehen, die zu verwendenden Pflanzen einer vorhergehenden Entfettung, vorzugsweise mit Petroläther, zu unterwerfen.

Diese Behandlung wird vorteilhafterweise mit einer Entfettung des Rückstandes der alkoholischen Lösung vervollständigt, die vor der Extraktion mit Äthylacetat vorgenommen wird. Hierzu wird ein entfettendes Lösungsmittel, z.B. Äthyläther oder Petroläther, verwendet. So kann man z.B. insbesondere wie folgt vorgehen: Die gesamte Pflanze wird getrocknet, zerrieben und sodann mit Petroläther in einer Soxhlet-Vorrichtung entfettet. Der erhaltene Rückstand oder Treber, der von Petroläther befreit worden ist, wird in Äthylalkohol von 80 C eingeweicht bzw. damit ausgelaugt. Die alkoholische Lösung wird im Vakuum konzentriert, bis der Alkohol entfernt ist. Die zurückbleibende wäßrige Flüssigkeit wird hierauf durch Behandlung mit Äther entfärbt . und dieser wird entfernt. Hierauf wird mit Äthylacetat behandelt. Die Äthylacetatphase wird entwässert und zur Trockene konzentriert. Auf diese Weise wird als Rückstand ein cremeweißes Pulver erhalten, das den erfindungsgemäß hergestellten Extrakt darstellt.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden insbesondere Pflanzen der Familie der Orobanchaceae verwendet, die parasitische Phanerogamen sind, die von Chloroform entblößt sind. Unter diesen Pflanzen werden insbesondere die Spezies der Gattung Orobanche und derjenigen von Phelypaea bevorzugt. Diese Spezies haben den Vorteil, daß sie relativ reich an den Derivaten der Kaffeesäure sind und daß sie daher gute Extraktionsausbeuten ergeben ■.

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Dennoch sind auch die Pflanzen der Familie der Scrophulariaceae, wie z.B. von Verbascum, und diejenigen der Familie der Acanthaceae, wie z.B. von Acanthus, von Interesse, da sie häufig besser verfügbar sind. Das Verfahren wird insbesondere in diesem Falle vorteilhafterweise durch eine Reinigung des Extrakts im wäßrigen Milieu, insbesondere auf Cellulose, und sodann durch eine erneute Extraktion durch mit Methanol versetztem Äthylacetat vervollständigt.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet es insbesondere, Extrakte zu erhalten, die im folgenden als "Polyphenol-Extrakte" bezeichnet werden. Bei diesen hat nämlich die Analyse gezeigt, daß es sich um Mischungen handelt, die im wesentlichen verschiedene Isomere enthalten, welche Heterosidester von Kaffeesäurederivaten eines Heterosids eines Dihydroxyphenylalkanols darstellen, und die insbesondere die folgende Formel haben:

HO * - . · OH

HO -Js^ X-0-(Glukose-Rhamnose)-OOC-CH=CH-^^\^-OM (I)

Darin bedeutet X die Gruppe:

-(CH₂)_n-, wobei η eine ganze- Zahl von 1 bis 6 ist

oder -CH-(CH₀V, wobei m eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist. OH

Bestimmte dieser Isomeren können vorteilhafterweise ausgehend von diesem Mischextrakt abgetrennt werden, indem man ■ das Verfahren durch eine oder mehrere Umkristallisationen in Wasser vervollständigt.

f *

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Die relativen Verhältnismengen der Isomeren in dem PoIyphenol-Extrakt können je nach den Behandlungsbedingungen und nach der genauen Natur der verwendeten Pflanzen variieren.

Die Erfindung betrifft auch Verbindungen, die nach diesem Verfahren erhalten worden sind.

Unter den Verbindungen der Formel I sind bevorzugte Verbindungen gemäß der Erfindung die Heterosidester der Kaffeesäurederivate von Heterosiden von Dihydroxyphenyläthanol und von Dihydroxyphenylglykol der Formeln:

CH-CH₀ -O- (Glukose-Rhamnose) -0OC-CH=CH-

OH

und

CH₂-CH₂-O- (Glukose-Rhamnose) -0OC-CH=CH- <ζ y— OH(HI)

Von diesen Verbindungen finden sich besonders wichtige Mengen in den Polyphenol-Extrakten der Acanthaceae ocier 3crophulariaceaen für eine Verbindung der Formel III, der ™an den Namen Verbaskosid gegeben hat, und in den Polyphenoi-Extrakten der Orobanchaceaen für eine Verbindung der Formel II, der man den Namen Orobanchosid gegeben hat. Sie können durch Kristallisation aus den wäßrigen Lösungen des Polyphenol-Extrakts isoliert und durch Umkristallisation in Wasser oder Alkohol gereinigt werden.

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Andere Isomere der Kaffeesäureester gemäß der Erfindung können erhalten werden, indem man das Verbaskosid oder das Orobanchosid in schwach saurein Medium oder ihre Mischungen oder direkt den Polyphenol-Extrakt erhitzt. Das Erhitzen im schwach sauren Medium des Orobanchosids, vorzugsweise durch Kochen bei einem pH-Wert von 6 bis 6,8, führt zu einem Isomeren der oben angegebenen allgemeinen Formel, das man als "Isoorobanchosid" bezeichnet hat. Gleichermaßen führt das Erhitzen des Verbaskosids im schwach sauren Medium bei analogen Bedingungen zu einem Isomeren der gleichen allgemeinen Formel, das man als "Isoverbaskosid" bezeichnet hat.

Alle auf diese Weise isolierten Isomeren zeigen wie dtü-Polyphenol-Extrakt pharrnakologische Eigenschaften, die sie zu Wirkstoffen machen, die für die Bildung von Arzneimitteln geeignet sind. Sie haben weiterhin den Vorteil, daß sie leicht durch das erfindungsgemäße Verfahren ent weder getrennt oder im Gemisch im kristallinen Zustand erhalten werden können.

Die Erfindung zieht daher auch Arzneimittel in Betracht, die als Wirkstoff wenigstens einen Heterosidester der Kaffeesäure enthalten. Insbesondere werden solche Arzneimittel in Betracht gezogen, die mindestens einen Heterosideste.r eines.Kaffeesäurederivats eines Heterosids eines Dihydroxyphenylalkanols, vorzugsweise der obigen Formel I oder insbesondere der obigen Formel II, enthalten, oder die wenigstens einen Wirkstoff enthalten, wie er durch das erfindungsgemäße Verfahren mit verschiedenen Betriebsva-

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rianten aus Pflanzen der Familie der Orobanchaceaen, der Scrophulariaceaen, der Labiataen oder der Acanthaceaen extrahiert werden kann.

Diese Wirkstoffe zeigen insbesondere eine potentiierende Wirkung für Dihydroxyphenylalanin oder Dopa. Sie können mit Vorteil in Kombination mit Dopa für dessen verschiedene therapeutische Indikationen verabreicht werden. Die wichtigste derzeitige Indikation ist die Behandlung der Parkinson'sehen Krankheit.

Es ist bekannt, daß Dopa, und zwar insbesondere in der linksdrehenden Form oder als L-Dopa, derzeit als wirksamstes Medikament gegen die Parkinson'sehe Krankheit angesehen wird. Nachteiligerweise hat jedoch dieses Medikament eine Reihe von Nebenwirkungen, die die kardiovaskuläre Funktion beeinträchtigen und deren Intensität bis zu einer Unverträglichkeit führen kann. Es ist weiterhin bekannt, daß diese Nebenwirkungen auf die Anwesenheit einer großen Dopaminmenge zurückzuführen sind, welches von einer extrazerebralen Aktivität der Dopadecarboxylase herrührt, welche die Decarboxylierung von Dopa bewirkt. Für die Behandlung der Parkinson'sehen Krankheit ist es daher von großem Interes-' se, mit dem L-Dopa einen Inhibitor für die extrazerebrale Dopadecarboxylase verbinden zu können. Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe haben sich nun als Inhibitoren dieses Typs erwiesen. Weiterhin haben die erfindungsgemäßen Wirkstoffe den Vorteil, daß sie eine langer andauernde und wirksamere Aktivität als die ursprünglichen synthetischen chemischen Verbindungen, wie z.B. die Kaffeesäure selbst,

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haben und daß sie keine Nebenwirkungen haben.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe haben auch v/eitere pharmakologische Eigenschaften. Insbesondere haben die PoIyphenol-Extrakte eine ß-blockierende Aktivität, die ebenfalls ihr Interesse für die Behandlung der Parkinsonschen Krankheit verstärkt. Man vermeidet daher die parallele Verabreichung von ß-blockierenden Medikamenten mit Dopa-potentiierenden Arzneimitteln, wie es bei der Behandlung der Parkinson'sehen Krankheit üblich ist, oder man kann mindestens die zu verabreichenden Dosen verkleinern. Die erforderlichen Aktivitäten finden sich in einem einzigen Produkt pflanzlicher Herkunft vereinigt und die Aktivität hält länger an und das Mittel wird besser vertragen als die Produkte, die auf klassische Weise verwendet werden.

Die Erfindung betrifft daher auch pharmazeutische Zubereitungen, insbesondere zur Behandlung der Parkinson'sehen Krankheit, die einen Heterosidester der Kaffeesäure oder insbesondere einen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Wirkstoff zusammen mit Dihydroxyphenylalanin, das vorzugsweise in linksdrehender Form vorliegt, enthalten.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Darin werden die Herstellung der Wirkstoffe, ihre Konstitution . und ihre pharmakologisehen Eigenschaften beschrieben. -

Beispiel 1

Herstellung eines Polyphenol-Extrakts:

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Aus Pflanzen der Gattung Orobanche, insbesondere der Spezies Orobanche hederae Duby und Orobanche rapura Thuill, wird ein Polyphenol-Extrakt hergestellt.

Die ganzen Pflanzen, die im Juni/Juli gesammelt worden sind, werden unmittelbar nach dem Sammeln an einem belüfteten Ort und unter Ausschluß von Licht getrocknet.

400 g der ganzen getrockneten Pflanzen werden nach dem Zerreiben zu ej.nem halbfeinen Pulver mit 6 1 Petroläther (40 bis 60°C) 10 bis 12 h lang in einer Soxhlet-Vorrichtung entfettet und depigmentiert bzw. entfärbt.

Das so erhaltene Pflanzenpulver wird an der Luft getrocknet und hierauf bei einer Temperatur von 4O⁰C mit 5x21 Äthanol bei 80 C unter mechanischem Rühren eingeweicht bzw. ausgelaugt.

Nach dem Abfiltrieren des Trebers bzw. des extrahierten Materials v/erden die 10 1 der alkoholischen Lösung mit 20 ml einer 10%igen wäßrigen Natriummetabisulfitlösung versetzt, wodurch die Oxidation der phenolischen Wirkstoffe vermindert wird.

Diese Lösungen werden eine Nacht im Kühlschrank belassen (4°C) und sodann abfiltriert und konzentriert, indem der Alkohol in einem Drehverdampfer im Vakuum bei mäßiger Temperatur (30⁰C) abgetrieben wird.

Der nunmehr wäßrig gewordene Extrakt wird seinerseits entfettet und entfärbt, indem er mit einem Gemisch aus folgendem verrührt wird:

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Äthyläther (von seinen Peroxiden befreit) Petroläther (40 bis 6O⁰C).

Die jeweiligen Volumina sind 2,5/0,5 1.

Dieser wäßrige Extrakt, der von Ätherspuren befreit worden ist, wird sodann durch Zugabe von weiterem Wasser stärker wäßrig gemacht und mit 18 1 frisch destilliertem Äthylacetat (das die Wirkstoffe mitnimmt) in Dekantierungsampullen, die mechanisch durchbewegt werden, hineinextrahiert.

Die Äthylacetatphasen werden durch Natriumsulfat (rein, trocken, von Prolabo) getrocknet und zur Trockene im Vakuum eingedampft, bis das organische Lösungsmittel vollständig verschwunden ist.

Auf diese Weise werden 40 g eines Produkts in Form eines leichten Pulvers mit einer cremeweißen Farbe erhalten, das den Polyphenol-Extrakt darstellt.

Ausbeute: 10 Gew.-?6, bezogen auf die trockene Pflanze.

Beispiel 2

Herstellung des Orobanchosids:

Der gemäß Beispiel 1 hergestellte Polyphenol-Extrakt wird in einer solchen Menge warmem destillierten Wasser aufgelöst, daß eine 2O?oige Lösung des Extrakts erhalten wird. Nach dem Abk'ühlen der Lösung auf Umgebungstemperatur bilden sich lange nadeiförmige Kristalle mit hellbeiger Farbe. Diese werden gesammelt und sie stellen das rohe 0robanchosid dar.

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Die Orobanchosidkristalle werden durch Auflösen in absolutem Äthanol in der Wärme und in Gegenwart von etwas pulverförmiger Pflanzenkohle des Typs "Norit" (Prolabo) gereinigt. Die Lösung wird durch eine kleine, mit Cellulose (300 M.N.) gefüllte Säule mit einer Höhe von 1 cm und einem Durchmesser von 2 cm, die zuvor mit Wasser und mit Äthanol gewaschen worden war, filtriert.

Das alkoholische Filtrat wird im Vakuum in einem Drehverdampfer bis zum Auftreten einer Trübung konzentriert. In einem Kühlschrank (mit 4 C) wird kristallisieren gelassen. Die erhaltenen Kristalle werden abzentrifugiert, getrocknet und ein- oder zweimal in absolutem Äthanol umkristallisiert.

Ausbeute an gereinigtem Orobanchosid: 2 Gew.-°/o, bezogen auf die trockenen Pflanzen.

Das erhaltene Produkt hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

a) ' Physikalische Eigenschaften:

Schmelzpunkt: bestimmt auf einer Kofier-Bank Beginn des Aufweichens bei 196 bis 200°C klares Schmelzen: 209 - 1°C}

Löslichkeit: unlöslich in kaltem Wasser

genügend löslich in siedendem Wasser löslich in alkoholischen und alkoholischwäßrigen Lösungen unlöslich in Äther, Chloroform und Benzol.

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b) Elementaranalys e:

Gefunden: C = 54,50% H = 5,78%

C = 54,62% H = 5,87%

Berechnet! C = 54,37% H=5,62% für C₂₉H₃₆O₁₆

c) Analyse durch Dünnschichtchromatographie:

Adsorptionsmittel: Schicht von Merck-Cellulose auf einer Aluminiumfolie

Lösungsmittel: 2%ige wäßrige Essigsäurelösung Wanderungsdauer: 1 h 30 min

Entwicklungsmittel: UV-Licht und diazotiertes p-Nitroani-

lin (gelbbeige Farbe)

Rf: 0,43 bis 0,44.

d) Spektralanalyse:

UV-Spektrum (in Methanol): Maximum 223-(233)-(246)-291-335

Minimum 265

Infrarotspektrum (in KBr-Tablette) - Ort der Banden in cm"¹: 3420 - 2960 - 2935 - 1720 - 1605 - 1520 1450 - 1380 - 1300 - 1270 - 1130 - 1060 1040 - 1020 - 980 - 850 - 810 - 780 - 570. Kernresonanzspektrum (NMR):

6 aromatische Protonen 6,4 ppm < 6<7,2. ppm

2 Protonen einer trans-Doppelbindung J = 15 Hz

(S = 6,2 ppm S = 7,5 ppm)

3 Methylprotonen J = 6 Hz S = 1,05 ppm 1 Proton S= 5,03 ppm (C₁ Rhamnosyl)

1 Proton S= 4,58 ppm (C₁ Glukosyl) (J = 7 Hz) +13 oder 14 Protonen zwischen 3 ppm und 5,1 ppm.

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e) Chemische Formel:

Aufgrund der oben angegebenen Analysenergebnisse und der Untersuchung der durch Dünnschichtcliromatographie auf Cellulose abgetrennten Produkte nach alkalischer Hydrolyse des Orobanchosids kann geschlossen werden, daß dieses Produkt aus folgendem gebildet ist:

1 Molekül Kaffeesäure
1 Molekül Glukose
1 Molekül Rhamnose

1 Molekül ß-Hydroxy-ß(dihydroxy-3,^phenylethylalkohol, gemäß der Formel II.

Beispiel 3

Herstellung des Isoorobanchosids:

Das gemäß Beispiel 2 hergestellte Orobanchosid wird im wäßrigen Milieu bei einem geringfügig unterhalb 7, nämlich in der Gegend von 6,5, liegenden pH-Wert erhitzt und die Lösung wird 3 h lang beim Sieden gehalten.

Sodann wird die Lösung abkühlen gelassen. Es scheiden sich Kristalle ab, die wie im Beispiel 2 abzentrifugiert und gereinigt werden. Das erhaltene Produkt, d.h. das Isoorobanchosid, ist ein Isomeres des Orobanchosids des Beispiels 2, das die gleiche allgemeine Formel II besitzt.

Beispiel 4

Herstellung des Verbaskosids:

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Das Verbaskosid wird aus den Mutterlaugen extrahiert, die nach der Abtrennung des kristallisierten Orobanchosids gemäß Beispiel 2, ausgehend von einem gemäß Beispiel 1 hergestellten Polyphenol-Extrakt, zurückbleiben, und es wird in Wasser aufgelöst.

Die Mutterlaugen werden in einem Kühlschrank (4⁰C) in einem Becherglas stehen gelassen, das mit einem Uhrglas bedeckt ist, welches eine gewisse Verdampfung gestattet. Nach ungefähr einer Woche erscheinen in dem Becherglas Kristalle, die in Form von kleinen Kügelchen zusammengeballt sind.

Diese Kristalle werden abzentrifugiert und sie werden nach Wiederauflösung in Wasser von Umgebungstemperatur (Lösung mit 25 bis 3O?ö) im Kühlschrank kristallisieren gelassen.

Nach 48 h kristallisiert das Verbaskosid. Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis auf den Chromatogrammen ein einziger Flecken des Verbaskosids erhalten wird.

Das erhaltene Produkt hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

a) Physikalische Eigenschaften:

Schmelzpunkt (Kofier-Bank)

Erweichen bei ungefähr 158 bis 16O°C klares Schmelzen bei ungefähr 170 bis 180 C Löslichkeit: löslich in kaltem Wasser löslich in Alkohol
unlöslich in Äther, Chloroform und Benzol.

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b) Chromatographie:

Das Produkt wird durch Dünnschichtchromatographie bei den gleichen Bedingungen wie das Orobanchosid im Beispiel 2 analysiert.

Der dem Verbaskosid entsprechende Flecken verfärbt sich durch diazotiertes p-Nitroanilin zu gelblich-braun, das

malvenfarbig umsäumt ist.
Rf = 0,57 (Lösungsmittel: 2%ige Essigsäure).

c) Spektralanalyse:

UV-Spektrum (in Methanol): λ Maximum: 223-(234)-(246)-

291-333 Minimum: 265

Infrarotspektrum (in KBr-Tabletten) - Ort der Banden in cm"¹: 3400 - 2920 - 1690 - 1595 - 1510 - 1440 1370 - 1260 - 1160 - 1115 - 1060 - 1030 980 - 810 - 780
Kernresonanzspektrum (NMR):

6 aromatische Protonen (6,4<£> <7,2 ppm)

2 Protonen einer trans-Doppelbindung J= 15Hz (^=

6,25 ppm und b = 7,55 ppm)

3 Methylprotonen J = 6 Hz ^ = 1,05 ppm T Proton &= 5,12 (C₁ Rhamnosyl)

1 Proton h= 4,40 ppm (C. Glukosyl) J = 7 Hz +14 Protonen zwischen 2,6 ppm und 5,0 ppm.

Die Ergebnisse der Analyse der Hydrolyseprodukte des Verbaskosids zeigen, daß dieses sich von den gleichen Bestandtei-

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len, nämlich Glukose, Rhamnose und Kaffeesäure, wie das Orobanchosid und von ß-(Dihydroxy-3,4-phenyl)äthanol ableitet und daß es die Formel III hat.

Beispiel 5

Herstellung des Isoverbaskosids:

Das gemäß Beispiel 4 hergestellte Verbaskosid wird gemäß Beispiel 3 in einem wäßrigen, leicht sauren Milieu erhitzt, wodurch das Isoverbaskosid erhalten wird, das die gleiche allgemeine Formel III hat.

Beispiel 6

Ein Eolyphenol-Extrakt von Orobanche wird wie im Beispiel 1 hergestellt und durch Dünnschichtchromatographie auf Cellulose mit 2?oiger wäßriger Essigsäure analysiert. Nach Entwicklung des Chromatogramms durch UV-Licht und diazotiertes p-Nitroanilin kann folgendes unterschieden werden:

in starker Konzentration - Verbaskosid: Rf = 0,57

Orobanchosid: Rf = 0,43

in sehr schwacher Konzentration:

Isoverbaskosid: Rf = 0,24-0,25 Isoorobanchosid: Rf = 0,18-0,20

in Spurenmengen - Kaffeesäure: Rf = 0,10.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Polyphenol-Extrakts sind wie folgt:

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Löslichkeiten: augenblicklich löslich in Wasser von Umgebungstemperatur zu einer Lösung mit mittlerer Konzentration (nach 1 h scheiden sich in der Kälte einige Orobanchosid-Kristalle ab)·

löslich in Alkoholen und Äthylacetat unlöslich in Äther, Chloroform und Benzol.

UV-Spektrum (in Methanol): das gleiche wie der Kaffeesäureester

λ Maximum: 221-(248)-291-335 Minimum: 266

Beispiel 7

Pflanzen der Gattung Verbascum werden getrocknet und zerrieben. Sodann werden sie gemäß Beispiel 1 durch Entfetten, Extraktion mit Alkohol, Entfetten und Extraktion mit Äthylacetat behandelt. Es wird wie im Beispiel 1 verfahren, bis nach dem Abdampfen des Äthylacetats der zurückbleibende Äther-Acetat-Extrakt erhalten wird.

Dieser Extrakt wird hierauf in Wasser aufgelöst und durch Durchleiten durch eine Säule aus Cellulose und durch Eluierung mittels einer V/oigen wäßrigen Essigsäurelösung gereinigt. Die wäßrige Phase wird sodann durch Äthylacetat, das mit 3% Methanol versetzt worden ist, extrahiert.

Nach dem Trocknen auf wasserfreiem Natriumsulfat und Eindampfen' zur Trockene wird ein pulverförmiger cremefarbener Rückstand erhalten. Die Analyse zeigt, daß es sich zum großen Teil um das Verbaskosid der Formel III handelt.

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Beispiel 8

Toxikologische Untersuchung:

Die gemäß der Erfindung hergestellten Wirkstoffe pflanzlicher Herkunft haben keine Toxizität und sie haben eine sehr gute Verträglichkeit.

Für den gemäß Beispiel 1 erhaltenen Polyphenol-Extrakt sind die Ergebnisse der toxikologischen Untersuchung wie folgt:

akute Toxizität: DL. 50 > 6 g/kg per os bei der Maus

Dl. 50 > 6 g/kg i.p. bei der Maus

Der "Traktions"-Test ist 2 h nach Aufnahme des Produkts in hoher Dosis (1 g/kg i.p.) positiv. Dieser Test besteht im -wesentlichen darin, daß man die Wirkung des Produkts auf den Muskeltonus nach der Technik von Julou und Courvoisier: Psychotropic drugs, Mailand (1957), 373, abschätzt .

Chronische Toxizität: bei 500 mg/kg Körpergewicht der Ratte während acht Wochen werden keine Anzeigen festgestellt.

Analoge Ergebnisse werden mit jedem Wirkstoff, hergestellt gemäß den Beispielen 2 bis 7, erhalten.

Beispiel 9

Potentiierende Aktivität für L-Dopa:

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Die Untersuchungen über die Potentiierung der Antiparkinson-Aktiyität von L-Dopa werden in der Weise vorgenommen, daß.man den Antagonismus dieser beiden Substanzen gegen das bei der Maus durch Oxotremonin hervorgerufene Zittern untersucht. "

Die Zitterbewegungen werden graphisch registriert. In jedem Fall wird folgendes Protokoll verfolgt:

Zeitpunkt O = der Wirkstoff wird per os ver

abreicht

Zeitpunkt 20 min = L-Dopa wird per os verabreicht Zeitpunkt 40 min = 500 Jf /kg Oxotremonin werden i.p

verabreicht.

Die Zitterbewegungen werden 45 min lang nach Verabreichung des Oxotremonins registriert.

Die Untersuchung der Ergebnisse zeigt dieselbe Antioxotremonin-Aktivität bei:

L-Dopa allein = 500 mg/kg per os,

oder jeder der folgenden Kombinationen aus Wirkstoff + L-Dopa:

1) Polyphenol-Extrakt von Orobanche (Beispiel 1) = 50 mg/kg per os
L-Dopa = 50 mg/kg per os

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2) Polyphenol-Extrakt von Orobanche (Beispiel 1) = 100 mg/kg per os

L-Dopa = 25 mg/kg per os

3) ' Orobanchosid (Beispiel 2) = 100 mg/kg per os

L-Dopa =100 mg/kg per os

4) Verbaskosid (Beispiel 4) =100 mg/kg per os L-Dopa =100 mg/kg per os.

Der Wirkungsmechanismus für die Potentiierung von L-Dopa wird in vitro bei den folgenden Bedingungen untersucht:

Substrat = L-Dopa

Enzym = in Aceton zerriebene pulverförmige Meer

schweinchenniere, hergestellt bei sehr tiefer Temperatur

enzymatischer Kontrollinhibitor = Kaffeesäure.

Mit dem gemäß Beispiel 1 erhaltenen Polyphenol-Extrakt ist bei den Versuchsbedingungen (pH = 6,8) die Inhibierungswirkung auf die Dopadecarboxylase negativ. Dagegen setzt bei einem alkalischen pH-Wert im Darm bei 37 C dieser Extrakt Kaffeesäure frei, die aktiv ist. Dies könnte die inhibierende Aktivität gegenüber der Dopadecarboxylase erklären, wenn man annimmt, daß diese sich in dem Organismus nach Hydrolyse des Extrakts bildet.-

Beispiel 10
Kardiovaskuläre Wirkung:

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Zentraler Druck:

Der Halsschlagaderdruck wird bei männlichen Ratten vom Wistar-Stamm gemessen.

Die'Verabreichung von 50 mg/kg Polyphenol-Extrakt des Beispiels 1 auf intravenösem Weg bewirkt ohne Veränderung der Herzfrequenz einen freien und u.vorübergehenden Bluthochdruck. - Isolierte Herzkammer der Ratte. Der gleiche Polyphenol-Extrakt von Orobanche hebt bei einer Dosis von 50 mg in einem Volumen von 40 ml alle positiven chronotropen und inotropen Wirkungen, die durch 0,5 g- Isoprenalin beim Test der isolierten Herzkammer der Ratte hervorgerufen werden, auf. Dieser Test besteht darin, daß man den Rhythmus und die Kontraktionen einer isolierten Herzkammer bzw. eines isolierten Herzvorhofs mißt,· welche überlebend in einer Nährflüssigkeit gehalten wird. Diese Technik ist in J. Physiol. (1926) - 61, 547, beschrieben.

Der Extrakt besitzt demnach eine ß-blockierende Wirkung. Antihypertensive Aktivität:

Ein durch rhenale Ischämie realisierter experimenteller Bluthochdruck (Technik von Grollman: Proc. Soc. Biol. Med. 1944, 57, 102 bis 104) wird um zwei Punkte durch tägliche Verabreichung von 300 mg/kg per os des Polyphenol-Extrakts von Orobanche, hergestellt gemäß Beispiel 1, vermindert.

Das Abfallen des arteriellen Drucks, das drei Tage nach Beginn der Behandlung beginnt, hält sich während der gan-

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zen Dauer der Behandlung aufrecht. 10 Tage nach Beendigung der Behandlung geht der arterielle Druck wieder auf seinen Anfangswert hinauf.

Es ist zu beachten, daß der Extrakt den arteriellen Druck von normal-tonisierten Tieren nicht modifiziert. Aktivität gegen Flimmern:

Der gleiche Polyphenol-Extrakt antagonisiert nicht das bei der Maus nach der Methode von Lawson erzeugte Chloroformflimmern .

Beispiel 11
Analgetische Aktivität:

Man bestimmt bei den angegebenen i.p.-Dosen des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Polyphenol-Extrakts von Orobanehe die Anhebung der Schmerzschwelle bei zwei Techniken, bei denen eine thermische Stimulierung (Test der Heizplatte) und eine chemische Stimulierung (Test mit Phenylbenzochinon) verwendet werden.

Heizplatte: nach der Methode von Woolfe (G.) - MacDonald (A.D.) in J. Pharmacol, exptl. ther. (1944), 80, 300.

Dieser Test ist auf folgendem Prinzip aufgebaut: Eine Maus, die auf eine auf 56°C erhitzte Platte aufgebracht wird, reagiert 5 bis 6 see durch Lecken der Vorderpfoten oder durch einen Sprung. Die Verabreichung eines Analgetikums hat den Effekt, daß die Zeitspanne bis zum Auftreten dieser Antwort verlängert wird.

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Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt, die die prozentuale Vergrößerung der Zeit bis zum Erscheinen der Antwort auf den Schmerz zeigt.

Zeit nach Verabreichung

30 min 60 min 90 min

Dosis: 500 mg/kg i.p. Dosis: 1 g/kg i.p.

92 170

80 130

50 100

Phenylbenzochinon: nach der Methode von Sigmund: J. Pharmacol, exptl. ther. (1957), 119, 184.

Dieser Test baut sich auf folgendem Prinzip auf: Nach prophylaktischer Verabreichung eines Ana-lgetikums wird eine alkoholische Lösung von Phenylbenzochinon injiziert, die bei dem Tier Verdrehungen bewirkt. Die Analgetika mildern oder inhibieren dieses Verdrehungssyndrom.

Die erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend als prozentuale Verringerung zusammengestellt:

Zeit in min

10

15

20

25

Dosis: 500 mg/kg i.p. Dosis: 1 g/kg i.p.

100	78	69	74	67	65
100	94	91	85	83	85

Bei den Versuchsbedingungen und bei zwei verwendeten Dosen zeigte der untersuchte Extrakt eine starke anaigetisehe Aktivität.

Beispiel 12

Antiinflammatorische Aktivität:

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Nach, der Methode von Winter - Proc. Soc. Exp. biol. med. (1962), 111,544 bis 547.

Die Injektion einer Kaolinsuspension in die Sohlensehnenhaut der Hinterpfote der Ratte führt zu einer Entzündungsreaktion, die durch antiinflammatorische Substanzen vermindert werden kann.

In der folgenden Tabelle sind die mit dem Polyphenol-Extrakt des Beispiels 1 erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt. Sie sind als prozentuale Verminderung der Schwellung angegeben:

Zeit in h 12 3 4 5 6

Dosis: 500 mg/kg i.p. 10 42 25 35 .20 10

Bei den Versuchsbedingungen zeigt das untersuchte Produkt eine antiinflammatorische Aktivität.

Beispiel 13
Psychotrope Wirkungen:

Das untersuchte Produkt ist der Polyphenol-Extrakt von Orobanche, erhalten gemäß Beispiel 1.

Auffassungsgabe und Motilität:

Schweizer-Mäuse werden nach der Methode von Boissier (Therapie (1962), 17, 1225 bis 1232) auf die Mobilität und die Auffassungsgabe untersucht.

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Die erhaltenen Ergebnisse sind als prozentuale Variierung der Auffassungsgabe und der Motilität, bezogen auf die Kontrolltiere, in folgender Tabelle zusammengestellt:

Dosen 500 mg/kg i.p. 1 g/kg i.p.

Auffassungsgabe ' -3^% -79%

Motilität -33% -65?o

Bei den untersuchten Dosen vermindert das Produkt die Auffassungsgabe und die Motilität.

Untersuchung der Reflexe:

Traktionstest: Test positiv (keine "Wirkung des Produkts) bei

einer Dosis von 1 g/kg i.p.

Drehungstest nach der Technik von Gross (Schw. med. wshr.

(1955), 85, 305).

Bei diesem Test wird diejenige Zeitspanne bestimmt, über die sich eine Maus im Gleichgewicht auf einer horizontalen Welle, die sich um sich selbst dreht, halten kann: Test positiv (keine Wirkung des Produkts) bei einer Dosis von 1 g/kg i.p.

Schlafpotentiierung:

Die Potentiierung der Narkose ist ein Test, der angewendet wird, um eine allgemein sedierende Wirkung zu erfassen. Eine Substanz, die den Schlaf selbst nicht hervorruft, kann in "Verbindung die Wirkungsdauer eines Hypnotikums verlängern.

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Die Potentiierung der Narkose wird bei männlichen Schweizer Mäusen durch die Technik der Einschläferung bestimmt (Technik von Courvoisier in Arch. int. pharmacod. ther. (1952), 92, 305: Der Schlaf, der durch eine subhypnotische Dosis induziert worden ist, wird durch den Effekt einer Vorbehandlung durch ein PsycholeptikTim verlängert).

500 mg/kg der Verbindung, die intraperitoneal verabreicht worden ist, bringen im Vergleich zu der Schlafzeit der Kontrolltiere eine SchlafZeitverlängerung von k-3% mit sich.

Der untersuchte Wirkstoff vermindert ohne Einwirkung auf die Reflexe die Auffassungsgabe und die Motilität und er potentiiert eine Barbituratnarkose, was eine psycholeptische Aktivität beweist.

Beispiel 14

Kapseln, die für die Humantherapie geeignet sind, haben eine Dosis von 50 mg Polyphenol-Extrakt von Orobanche gemäß Beispiel 1 pro Kapsel.

Dieser Extrakt kann in Tagesdosen von 1 bis 5 mg/kg in Verbindung mit Tagesdosen von L-Dopa von 6 bis 30 mg/kg verabreicht werden.

Beispielsweise kann man einem Patienten, der an Parkinson¹ scher Krankheit leidet, 200 mg Extrakt pro Tag in 3 oder 4 Dosen und in Verbindung mit einer Dosis von 1 g L-Dopa pro Tag verabreichen.

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Claims (12)

1. 26Ü9533

   Patentansprüche

   Verfahren zur Extraktion von Wirkstoffen, insbesondere von Heterosidestern der Kaffeesäure aus Pflanzen der Familien Scrophulariaceae, Orobanchaceae, Labiatae oder Acanthaceae, dadurch gekennzeichnet , daß man die Pflanzen in einem Alkohol wie Äthanol oder Methanol einweicht, die alkoholische Lösung gewinnt, den Alkohol verdampft, den erhaltenen Rückstand in Wasser wieder aufnimmt und mit Äthylacetat extrahiert und daß man die in Äthylacetat lösliche Fraktion gewinnt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die Pflanzen zuvor mit einem Entfettungslösungsmittel, vorzugsweise mit Petroläther, entfettet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Rückstand der alkoholischen Lösung mit einem Lösungsmittel wie Äthyläther, Petroläther oder einem Gemisch davon vor der Extraktion mit Äthylacetat entfettet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die trockene Pflanze zerreibt und mit Petroläther entfettet bzw. reinigt, daß man den von Petroläther befreiten Rückstand in Äthylalkohol einweicht bzw. damit auslaugt, daß man die alkoholische Lösung im Vakuum bis zur Eliminierung des Alkohols konzentriert, daß man die zurückbleibende wäßrige flüssige Phase sodann durch Behandlung mit Äther entfärbt, daß man diesen entfernt, daß man hierauf mit Äthylacetat behandelt, daß

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   man die Äthylacetatphase entwässert und zur Trockne eindampft und daß man das Pulver gewinnt, welches kristallisiert.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man die in Äthylacetat lösliche Fraktion, die zuvor in einem wäßrigen Milieu gelöst ist, vorzugsweise durch Absorption der Verunreinigungen auf Cellulose und Eluierung durch eine verdünnte Essigsäurelösung reinigt und daß man sie sodann mit Äthylacetat, das vorzugsweise mit Methanol versetzt worden ist, -extrahiert.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß der vorzugsweise entwässerte und konzentrierte Äthylacetatextrakt einer Trennungs- bzw. Abtrennungsstufe seiner Bestandteile durch Auflösen in heissem Wasser, Abkühlen und Abtrennen des beim Abkühlen kristallisierenden Produkts unterwirft und daß man dieses hierauf vorteilhafterweise durch Umkristallisation in Alkohol und Filtration, insbesondere auf Cellulose, reinigt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach dieser Trennung bzw. Abtrennung zurückbleibenden Mutterlaugen in der Kälte, vorzugsweise bei ungefähr + 4⁰C bis zur Kristallisation eines anderen Produktes hält, das man gewinnt und vorteilhafterweise durch Umkristallisation aus Wasser reinigt.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet , daß man das erhaltene Produkt sodann durch Kochen in einem leicht sauren wäßrigen Milieu mit einem pH-Wert in der Gegend von 6 bis 6,8 vor-

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   zugsweise in der Gegend von 6,5, erhitzt.
9. 9. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff wenigstens einen Heterosidester der Kaffeesäure, insbesondere einen Extrakt aus Pflanzen der Familie Scrophulariaceae, Orobanchaceae, Labiatae oder Acanthaceae, enthält.
10. 10. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet , daß es wenigstens einen Heterosidester des Kaffeesäurederivats eines Heterosids von Dihydroxyphenylalkanol, insbesondere von Dihydroxyphenyläthanol oder ß-Hydroxy-ß-(dihydroxyphenyl)-äthanol, enthält.
11. 11. Arzneimittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Heterosidester die Formel

    (D

    X~0-(Glukose-Rhamnose)-OOC~CH=CH -—<fV

    aufweist, worin X eine Gruppe -(^CH ₂)-, wobei η eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, oder -CH-(CH₀) -, wobei m eine ganze

    OH

    Zahl von 0 bis 5 ist,
    darstellt.
12. 12. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet , daß es wenigstens einen Heterosidester der Kaffeesäure, insbesondere ein Arzneimittel nach einem der Ansprüche 9 bis 11 zusammen mit Dihydroxyphenylalanin, das vorzugsweise in linksdrehender Form vorliegt, enthält.

    ORIGINAL INSPECTED

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