DE69110136T2

DE69110136T2 - Kaffeinsaure-derivate,oraposid,ihre kosmetische oder pharmazeutische zusammensetzungen,insbesondere mit dermatologischer wirkung.

Info

Publication number: DE69110136T2
Application number: DE69110136T
Authority: DE
Inventors: Claude Andary; Patrice Andre
Original assignee: Parfums Christian Dior SA
Current assignee: Parfums Christian Dior SA
Priority date: 1991-03-21
Filing date: 1991-03-21
Publication date: 1996-01-11
Anticipated expiration: 2011-03-22
Also published as: EP0576420A1; US5719129A; WO1992016544A1; JPH06508601A; KR100194830B1; ATE123287T1; AU670742B2; DE69110136D1; EP0576420B1; ES2075437T3; JP3147900B2; AU7585091A; CA2102689A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen ein neues Kaffeesäure-Derivat, Oraposid, und eine kosmetische oder pharmazeutische, insbesondere dermatologische Zusammensetzung, welche dieses enthält.
Mehr im einzelnen ist das neue Derivat der Erfindung, Oraposid, ein Kaffesäure-Derivat, welches aus Pflanzen der Familie Orobanchaceae extrahiert wird. Die Erfindung betrifft auch bestimmte Oraposid-Derivate, insbesondere acylierte Derivate, sowie diese enthaltende Pflanzen-Extrakte, insbesondere Extrakte von Orobanche rapum genistae.
Voruntersuchungen haben bereits das Vorliegen von Kaffeesäure-Derivaten in Extrakten von Orobanchaceae, Schmarotzerblütenpflanzen ohne Chlorophyll, nachgewiesen (Andary et al. 1980, Il Farmaco, 1, 1-30; Bridel et Charaux, 1924, C.R. Acad. Sci. 178, 1839), ihre Struktur wurde jedoch nicht eindeutig festgelegt.
Der pharmakologische Nutzen von Kaffeesäure (oder 3,4-Dihydroxyzimtsäure) und verschiedenen natürlichen Derivaten hievon war bereits Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. So untersuchten Kimura et al. (Planta Medica, 1984, 473-477) die Wirkung von verschiedenen Tanninen und insbesondere Kaffee- und Cafeoylchinasäure-Derivaten, die aus Pflanzen der Art Artemisia extrahiert werden, und zeigten ihren Inhibitor-Effekt auf die Peroxidation von Lipiden in den Mitochondrien und Mikrosomen in der Leber bei Ratten. Die inhibierende Wirkung dieser Moleküle auf die Lipoxygenasen, die am Metabolismus von Leucotrienen und Arachidonsäure teilnehmen, und ihre potentielle Verwendung bei der Behandlung entzündlicher Erkrankungen, wie Asthma, wurde ebenfalls von Kimura et Okuda (J. of natural products, 1987, 50, 392-399) veröffentlicht.
Die FR-A-2 302 745 beschreibt Heterosidester von Kaffeesäure und diese enthaltende Medikamente zur Behandlung der Parkinsonschen Krankheit (Seite 4, Zeilen 11 bis 16, und Ansprüche 1 bis 14).
Das Dokument CA 107:46141C beschreibt die Isolierung von Phenylpropanoidglykosid aus Früchten von Forsythia Koreana und ihre antibakteriellen Wirkungen gegen Staphylococcus aureus.
Da die Wirksamkeit verschiedener Kaffeesäure-Derivate in Abhängigkeit von ihrer Struktur vielfältig und variabel ist, ist die Suche nach neuen Molekülen dieser Familie in Heil- oder anderen Pflanzen sowie die Suche nach neuen pharmakologischen Wirksamkeiten oder überlegenen Leistungen von Interesse.
Auf diese Weise wurde aus Extrakten von Pflanzen der Familie Orobanchaceae, die verschiedene Ginster (Cytisus scoparius und purgans) sowie Nahrungsnutzpflanzen, wie Linsen, Bohnen, Nachtschattengewächse (Tomaten, Auberginen) parasitieren, eine neue Verbindung erhalten, welche besonders interessante Eigenschaften aufweist. Die Orobanche ist eine perennierende Pflanze, die einen ährenförmigen Blumenstengel hat. Die gesamte Pflanze kann eine Länge von 20 bis 100 cm erreichen, wobei Schuppen allseitig am Stengel stehen, die an der Basis in einer ebenfalls mit Schuppen bedeckten Zwiebel enden. Die gesamte Pflanze ist reich an Kaffeesäure-Heterosidester-Derivaten. Die Zwiebel, das an den Wurzeln der Wirtspflanze durch kleine Haftwurzeln anhaftende Organ, ist das Organ, das an Kaffeesäure- Heterosidestern am reichsten ist.
Die aus Orobanche rapum genistae extrahierte Substanz wurde in reinem und kristallisiertem Zustand, beispielsweise durch Alkohol-Maceration von einem Pflanzen-Extrakt oder Pflanzenzellen, erhalten und verschiedenen klassischen Analysen unterworfen, welche die Festlegung der Molekülkonfiguration und Struktur ermöglichen (chromatographischen Trennverfahren, Schmelzpunktbestimmung, spektralen NMR-, Masse-, Röntgenstrahl-, IR- und UV-Untersuchungen sowie verschiedenen biochemischen Analysen). Die aus diesen Analysen abgeleitete Formel ist wie folgt: 3-0-(α-L-Rhamnopyranosyl)-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-1,2- ethyliden]-β-D-glucopyranosid-4-cafeat.
Diese Substanz, die als "Oraposid" bezeichnet wird, hat die nachstehende Formel (I), worin R ein Wasserstoffatom bedeutet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Derivate der Formel (I), worin eines oder mehrere R unabhängig ein Wasserstoffatom, ein C&sub1;-C&sub5;-nied.Alkyl, insbesondere Methyl, oder eine Acyl- Gruppe, insbesondere C&sub1;-C&sub6;, spezifisch Acetyl, bedeuten.
Gemäß einem anderen bevorzugten Merkmal sind nur die OR-Gruppen, die von den Phenyl-Ringen getragen werden, alkyliert, insbesondere methyliert.
Vorzugsweise sind nur die OR-Gruppen, die von den Glucopyranosyl- oder Rhamnopyranosyl-Ringen getragen werden, acyliert, insbesondere acetyliert.
Insbesondere werden Oraposid oder seine Derivate aus einer Pflanze der Familie Orobanchaceae, insbesondere Orobanche rapum genistae, extrahiert.
Derartige Derivate können durch Fachleuten wohlbekannte, klassische Verfahren erhalten werden.
Insbesondere zur Herstellung peracetylierter Oraposid-Derivate kann gemäß einem einfachen Verfahren vorgegangen werden, welches darin besteht, daß Oraposid-Kristalle in einem Essigsäureanhydrid-Volumen gelöst werden, dem ein Pyridin-Volumen zugesetzt wird. Dieses wird eine ganze Nacht bei Umgebungstemperatur stehengelassen. Am nächsten Morgen wird das Derivat der Erfindung filtriert, resolubilisiert und lyophilisiert. Auf diese Weise wird das peracetylierte Oraposid-Derivat erhalten, d.h. daß hier alle OR-Gruppen, die von den Glucopyranosyl- oder Rhamnopyranosyl-Ringen getragen werden, acetyliert sind.
Nun wurde unerwartet gefunden, daß Oraposid und seine oben genannten Derivate zahlreiche chemische und biochemische Wirkungen aufweisen, wie als Fänger freier Radikale, Antioxidans, das insbesondere die Peroxidation von Lipiden verhindert, Aldosereduktase-Inhibitor, 5-Lipoxygenase-Inhibitor, Dopa- Decarboxylase-Inhibitor, adrenerger β-Blocker, Anti-Tremor- Mittel, Antiallergikum, Analgetikum, Anti-Bakterien- und Anti- Pilz-Mittel, und eine große Adsorptionsbande bei UVA- und UVB- Ultraviolettstrahlung aufweisen, wodurch sie vorteilhaft als Solarfilter verwendet werden können.
Daher sind Oraposid, seine oben genannten Derivate und diese enthaltende Pflanzen-Extrakte besonders wertvoll, insbesondere auf dem Gebiet der Pharmazie, Kosmetik und Nahrungsmittelindustrie.
Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher auch eine kosmetische oder pharmazeutische, insbesondere dermatologische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß diese als aktiven Bestandteil Oraposid oder seine Derivate der Formel (I), wie vorstehend definiert, worin eines oder mehrere R unabhängig ein Wasserstoffatom, ein C&sub1;-C&sub5;-nied.Alkyl, insbesondere Methyl, oder eine Acyl-Gruppe, insbesondere C&sub1;-C&sub6;, spezifisch Acetyl, bedeuten, oder einen diese enthaltenden Pflanzen-Extrakt umfaßt. Vorzugsweise sind acylierte Derivate derart, daß nur die OR-Gruppen, die von den Glucopyranosyl- oder Rhamnopyranosyl-Ringen getragen werden, acyliert, insbesondere acetyliert sind. Vorzugsweise sind die alkylierten Derivate auch derart, daß nur die von den Phenyl-Ringen getragenen OR-Gruppen alkyliert, insbesondere methyliert sind.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsvariante sind Oraposid oder seine oben genannten Derivate in einer Menge eingeschlossen, die zwischen etwa 0,001 und etwa 10 Masse-%, vorzugsweise zwischen 0,1 und 5 Masse-%, bezogen auf die Masse der End- Zusammensetzung, liegt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine Zusammensetzung mit Wirksamkeit als Fänger freier Radikale, Aldosereduktase-Inhibitor, 5-Lipoxygenase-Inhibitor, Dopa-Decarboxylase-Inhibitor, β-Blocker, Anti- Tremor-Mittel oder Mittel zur Filterung von UVA- und UVB-Ultraviolettstrahlung.
Gemäß einer vorteilhaften Variante enthalten die vorstehend definierten Zusammensetzungen der Erfindung weder ein zusätzliches Anti-Bakterien- oder Anti-Pilz-Konservierungsmittel, noch ein zusätzliches Antioxidans, insbesondere gegen die Oxidation von Lipiden der kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierung.
Die Formulierung wird natürlich in Abhängigkeit von der gewünschten Verwendung adaptiert. Daher kann die Zusammensetzung in injizierbarer Dosierungsform zur oralen Verabreichung oder zur externen Behandlung auf topischem Weg formuliert werden. Der Exzipient wird auch an diese Formulierung angepaßt und ist ein kosmetisch oder pharmazeutisch annehmbarer Exzipient.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind bei der Verhinderung der Alterung der Haut und bei der Behandlung entzündlicher Zustände, die häufig ein Sonnenerythem begleiten, besonders wirksam. Tatsächlich ist bei bestimmten Stoffwechselstörungen oder Perturbationen mit externer Ursache, wie Ultraviolett- Strahlung, die Reduktion des Sauerstoffs unvollständig und führt zur Bildung freier Radikale, welche die Phospholipide von Zellmembranen abbauen können. Die Erzeugung freier Radikale führt zu verschiedenen physiopathologischen Manifestationen, die zur Zellalterung und wahrscheinlich zur Entstehung von Krebs, entzündlichen Erscheinungen oder hepatischen Intoxikationsprozessen beitragen.
Daher sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen insbesondere bestimmt für die Bekämpfung von Entzündungen, sowohl bei lokaler als auch systemischer Anwendung, insbesondere von Entzündungen, die durch eine übermäßige Sonnenbestrahlung verursacht werden, für die Bekämpfung der Zellalterung, insbesondere der aktinischen Hautalterung, für den Schutz der Haut gegen UVA- und UVB-Ultraviolettstrahlung und für die Prävention und Behandlung von Hautpigmentflecken. Sie sind auch wirksam bei der Behandlung hepatischer Intoxikationen ungeachtet ihrer Ursache, bei der Behandlung von Diabetes, insbesondere Diabetes mellitus, von diesen begleitenden Augenlinsenstörungen, und als Analgetika, Antiallergika, psychotrope Mittel, Anti-Parkinson-Mittel und Antihypertensiva.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung im Rahmen einer Anti-Tremor-Behandlung, insbesondere der Parkinsonschen Krankheit, enthält die vorgenannte erfindungsgemäße Zusammensetzung außerdem eine therapeutisch wirksame Menge an L-DOPA. Tatsächlich haben Oraposid und seine oben angegebenen Derivate der Formel (I) einen Effekt der Potentialisierung von L-DOPA in seiner Anti-Tremor-Wirksamkeit, der insbesondere bei Morbus Parkinson wirksam ist. Oraposid und seine oben angegebenen Derivate der Formel (I) verringern in Kombination mit L-DOPA tatsächlich bei Versuchen mit Tieren und Menschen den Tremor, der durch eine tremogenen Faktor verursacht wird. Bei Morbus Parkinson wird eine Besserung der abnormalen Bewegungen (vom Chorea-Typ) und anderer sekundärer Beschwerden, die auf die Behandlung mit L-DOPA zurückzuführen sind, festgestellt.
Nun wird die Erfindung mit Bezugnahme auf einige Ausführungsbeispiele detaillierter beschrieben, die nur der Erläuterung dienen und daher den Umfang der Erfindung nicht einschränken. Diese Beispiele sind auch mit Bezugnahme auf die beigeschlossenen Zeichnungen angegeben, in denen:
Fig.1 die Menge an LDH (Lactatdehydrogenase) zeigt, die durch 4x10&sup6; Hepatozyten (8 Tage Kultur) im Kulturmedium 3 und 7 h nach der Behandlung ausgesalzt wird. Die Bezugszahl 1 der beiden Histogrammblöcke betrifft die Ergebnisse, die mit unbehandelten, als Kontrolle dienenden Kulturen erhalten wurden. Die Bezugszahl 2 bezeichnet Histogrammblöcke, die mit Kulturen erhalten wurden, welche mit Nitroxynil in einer Konzentration von 10&supmin;&sup4; M erhalten wurden. Die Bezugszahl 3 bezeichnet Histogrammblöcke, die mit Kulturen erhalten wurden, welche mit Nitroxynil in einer Konzentration von 10&supmin;&sup4; M und Verbascosid in einer Konzentration von 5x10&supmin;&sup5; M erhalten wurden. Die Bezugszahl 4 bezeichnet Histogrammblöcke, die mit Kulturen erhalten wurden, welche mit Nitroxynil in einer Konzentration von 10&supmin;&sup4; M und Oraposid in einer Konzentration von 5x10&supmin;&sup5; erhalten wurden. Die Bezugszahl 5 bezeichnet Histogrammblöcke, die mit Kulturen erhalten wurden, welche mit Nitroxynil in einer Konzentration von 10&supmin;&sup4; M und Arenariosid in einer Konzentration von 5x10&supmin;&sup5; M erhalten wurden. Nitroxynil ist ein hepatotoxisches Mittel, Verbascosid und Arenariosid sind Fachleuten bekannte, andere Heterosidester von Kaffeesäure;
Fig.2 die Menge an LDH (Lactatdehydrogenase) zeigt, die durch 4x10&sup6; Hepatozyten (24 h Kultur) im Kulturmedium 3, 7 und 24 h nach der Behandlung ausgesalzt wird. Wie in Fig.1 bezeichnet die Bezugszahl 1 Ergebnisse, die mit unbehandelten Kulturen erhalten wurden; die Bezugszahl 2 Ergebnisse, die mit Kulturen erhalten wurden, welche mit 10&supmin;&sup4; M Chloroform behandelt wurden; und die Bezugszahl 3 Ergebnisse, die mit Kulturen erhalten wurden, welche mit einer Kombination von 10&supmin;&sup4; M Chloroform und 5x10&supmin;&sup5; M Oraposid behandelt wurden. Chloroform ist ebenfalls ein hepatotoxisches Mittel;
Fig.3 die Inhibierung der Lipoperoxidation an hepatischen Mikrosomen durch verschiedene Phenol-Verbindungen bei 5x10&supmin;&sup5; M im Reaktionsmedium zeigt. Die Bezugszahl 1 betrifft Histogrammblöcke, die mit einem Kontröllos ohne Phenol-Verbindung erhalten wurden. Die Bezugszahl 2 bezeichnet Ergebnisse, die mit Verbascosid erhalten wurden. Die Bezugszahl 3 bezeichnet Ergebnisse, die mit Oraposid erhalten wurden. Die Bezugszahl 4 bezeichnet Ergebnisse, die mit Arenariosid erhalten wurden. Die Bezugszahl 5 bezeichnet Ergebnisse, die mit Rosmarinsäure erhalten wurden. Die Bezugszahl 6 bezeichnet Ergebnisse, die mit Isochlorogensäure erhalten wurden. Die Bezugszahl 7 bezeichnet Ergebnisse, die mit Zichoriensäure erhalten wurden. Die Bezugszahl 8 bezeichnet Ergebnisse, die mit Kaffeesäure erhalten wurden. Die Bezugszahl 9 bezeichnet Ergebnisse, die mit Vitamin E (α-Tocopherol) erhalten wurden. Verbascosid, Oraposid und Arenariosid sind Heterosidester von Kaffeesäure, und die angegebenen Säuren sind andere Kaffeesäureester; und
Fig.4 die Inhibierung der Lipoperoxidation an hepatischen Mikrosomen bei Kaninchen durch Oraposid bei verschiedenen Konzentrationen zeigt. Die Bezugszahl 1 bezeichnet Ergebnisse, die mit dem Kontrollos ohne Oraposid erhalten wurden; die Bezugszahl 2 Ergebnisse, die mit Oraposid bei einer Konzentration von 5x10&supmin;&sup5; M erhalten wurden; die Bezugszahl 3 Ergebnisse, die mit Oraposid bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; M erhalten wurden; die Bezugszahl 4 Ergebnisse, die mit Oraposid bei einer Konzentration von 5x10&supmin;&sup6; M erhalten wurden; die Bezugszahl 5 Ergebnisse, die mit Oraposid bei einer Konzentration von 2x10&supmin;&sup6; M erhalten wurden; und die Bezugszahl 6 Ergebnisse, die mit Oraposid bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup6; M erhalten wurden.

Beispiel 1: Herstellung des Pflanzen-Extrakts, Reinigung der Kristalle, Analyse und Festlegung der Formel von Oraposid

Das Ausgangsmaterial ist Pflanzenpulver (Orobanche), das mit Petroether entfettet wurde. Dieses Pulver wird in 80 % Ethanol oder 80 % Methanol bei 10 l pro 400 g Pflanzenpulver bei 50ºC mazerieren gelassen. Der erhaltene Extrakt wird konzentriert und lyophilisiert. Dieser lyophilisierte Extrakt, als "roher Orobanche-Extrakt" bezeichnet, enthält 3 bis 5 Masse-% Oraposid.
Dieser Alkohol-Mazeration werden nach Filtration rasch 20 ml einer frisch hergestellten, wässerigen 10 % Natriummetabisulfit-Lösung zugesetzt. Nach einer Pause über Nacht bei 4ºC wird dieser Extrakt filtriert, dann konzentriert, um den Alkohol zu entfernen. Der wässerig gewordene Extrakt wird einer definitiven Entfettung durch eine Mischung von 3:1 Ethylether ohne Peroxide - Petrolether unterzogen. Dieser entfettete Extrakt wird mit 20 l Ethylacetat (auf calciumchlorid redestilliert) entwässert. Die "Ethylacetat"-Phasen werden über reinem, trockenen Natriumsulfat getrocknet, dann vereinigt und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der erhaltene weißlich-cremefarbene Pulverrückstand, als "gereinigter orobanche-Extrakt" bezeichnet, enthält ungefähr 30 Masse-% Oraposid. Dieser gereinigte Extrakt kann in heißem Wasser gelöst und die Lösung bei Umgebungstemperatur, dann bei +4ºC kristallisieren gelassen werden, um eine erneute Reinigung durchzuführen.
Diese Kristalle werden getrocknet und heiß in einer Mischung von 5 % Ethanol und 95 % Wasser erneut gelöst, dann kalt umkristallisiert. Der Vorgang wird mehrfach wiederholt.
Die in Form reiner Kristalle erhaltene Zusammensetzung wird verschiedenen klassischen, biochemischen und chemisch-physikalischen Analysen unterzogen. Das Drehvermögen wird bestimmt (α)22D = -110,3º (Methanol). Der Schmelzpunkt beträgt 210ºC. Das ¹H-NMR-Spektrum (δ, ppm) ist wie folgt:
7,46 und 6,18 (2H, 2xd, J = 16 Hz, Bindung R - CH = CH - R trans), 5 (1H, d, J = 1 Hz, H - 1 Rha), 4,92 (1H, t, J = 9,5 Hz, H - 4 Glc), 4,57 (1H, t, J = 2,5,9 Hz, H - 7' Aglycon), 4,55 (1H, d, J = 7,8 Hz, H - 1 Glc), 4,05 (1H, t, J = 9,5 Hz, H - 3 Glc), 3,94-3,71 (2H, m, J = 12 Hz, 2H - 6 Glc), 3,57 (1H, dd, J = 1,3 Hz, H - 2' Rha), 3,45 (1H, m, H - 8' Aglycon), 3,38 (1H, dd, J = 7,8,9,5 Hz, H - 2 Glc), 1,05 (3H, d, J = 6 Hz, 3H - 1 Rha).
Das mit einer Vorrichtung vom Typ Kontron Uvikon 860 erhaltene UV-Spektrum zeigt ein UVA-Absorptionsmaximum bei 330 nm und einen UVB-Peak bei 290 nm. Die Integration der UVB-Peak- Flächen ermöglicht den Vergleich von Oraposid mit Parsol MCX , wobei festgestellt werden kann, daß die UvB-Absorptionswirksamkeit von Oraposid das 0,4-fache jener von Parsol MCX beträgt. Wenn auch eine Integration der UVA-Peak-Fläche von Oraposid im Vergleich mit Parsol 1 789 durchgeführt wird, wird festgestellt, daß die UVA-Absorption von Oraposid ungefähr das 0,2-fache jener von Parsol 1 789 beträgt. Die Auswertung der obigen Ergebnisse und der Massen-, Röntgen- und IR-Spektren ermöglicht den Nachweis, daß das Oraposid 3-0-(α-L-Rhamnopyranosyl)-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-1,2-ethyliden]-β-D-glucopyranosid-4-cafeat ist.

Beispiel 2: In vitro-Untersuchung der Eigenschaften von Oraposid für den Schutz von kultivierten Kaninchen-Hepatozyten

Das gewählte Versuchsmodell ist die Untersuchung der Freisetzung von Lactatdehydrogenase (LDH) durch Kaninchen-Hepatozyten in Primärkultur, wobei diese LDH-Freisetzung einen Marker für den Abbau der Hepatozyten darstellt.
Die Hepatozyten werden absichtlich mit bis 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup5; M Nitroxynil oder bis 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup4; M Chloroform vergiftet.
Die Wirkung von Oraposid wird für eine End-Konzentration von 0,05 mM im Kulturmedium untersucht.
Fig.1 zeigt, daß Oraposid das Aussalzen von LDH durch mit Nitroxynil vergifteten Hepatozyten äußerst signifikant verringert, und Fig.2 zeigt einen weniger ausgeprägten Effekt auf die mit Chloroform behandelten Zellen, dieses hat jedoch eine geringere toxische Wirkung.
Oraposid selbst hat keine Zelltoxizität, auch nicht bei einer Konzentration von 100 um.

Beispiel 3: In vitro-Untersuchung der Inhibierung der Lipoperoxidation an hepatischen Kaninchen-Mikrosomen

Es kommt zu einer Lipoperoxidationsreaktion, wenn hepatische Kaninchen-Mikrosomen in Anwesenheit von NADPH inkubiert werden.
Nach der Behandlung mit Ultraschall werden die Mikrosomen gewonnen.
Die Lipoperoxidation wird durch die Bildung von Malonyldialdehyd gemäß dem Verfahren von Placer et al., 1966, (Anal. Biochem. 16, 359-364) untersucht.
Die Reaktion wird in Abwesenheit (Kontrolle) und in Anwesenheit von Kaffeesäure oder Oraposid bei einer Konzentration von 5x10&supmin;&sup5; M oder in Anwesenheit von 5x10&supmin;&sup5; M α-Tocopherol (Sigma) (bekannte Inhibitor-Wirksamkeitsreferenz) durchgeführt.
Fig.3 zeigt deutlich, daß Kaffeesäure und α-Tocopherol eine äquivalente Inhibitor-Wirksamkeit aufweisen und Oraposid eine stärkere (100 %) Inhibierung sicherstellt.
Die Oraposid-Dosis, die erforderlich ist, um eine 50 % Inhibierung zu erhalten, beträgt 10&supmin;&sup5; M (Fig.4).
Außerdem ist es möglich, die oxidation von Membranlipiden durch Erzeuger freier Radikale (CCL&sub4; und H&sub2;0&sub2;) zu potenzieren; unter diesen Bedingungen beträgt die Inhibierung durch Oraposid 100 % mit CCl4 und 90 % mit H&sub2;0&sub2;.

Beispiel 4: Nachweis einer Anti-Bakterien- und Anti- Pilz-Wirksamkeit

Es ist bekannt, daß bestimmte Kaffeesäure-Derivate die Multiplikation von Bakterien und Pilzen inhibieren. Diele Eigenschaft wurde bei Oraposid an 40 verschiedenen Stämmen von 10 Bakteriengattungen sowie an 25 verschiedenen Stämmen von 25 Pilzarten bestätigt.
Bei allen Bakterienstäminen wird eine 100 % Inhibierung ab einer Dosis von 0,5 mg/ml festgestellt. Die getesteten Bakterienstämme sind: Staphylococcus aureaus; Streptococcus (Gruppe A und Gruppe D); Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; Proteus sp.; Providentia sp.; Seratia mercescens; Enterobacter cloacae; Pseudomonas aeruginosa; Salmonella (S. typhi und S. para-typhi).
Eine detailliertere Untersuchung, die an 29 Bakterienstämmen von Staphylococcus aureus durchgeführt wurde, zeigte eine 70 % Inhibierung ab einer Konzentration von 0,06 mg/ml und eine 80 % Inhibierung ab 0,12 mg/ml.
Die Anti-Pilz-Wirksamkeit wurde an kontaminierten Mikromyceten getestet, die häufig in der Nahrung vorkommen. Der Test wurde an 25 Arten durchgeführt: Adelomyceten (z.B. Altermaria tenuis; Fusarim avenceum; Geotricom candidum, ...), Mucoralen (z.B. Mucor mucedo, cunninghamella elegans, Rhizopus nigricans, ...), Endomycetalen (z.B. Candida lipolytica; Saccharomyces cerevisiae, ...), Plectomyceten (z.B. Aspergillus clavatus, A. niger; Penicillium chrysogenum, P. rubrum, ...), Pyrenomyceten (z.B. Chaetomium globosum, Sordaria himicola, ...). getestete Moleküle Stämme mit inhibiertem oder verringertem Wachstum (%) Stämme mit inhibiertem Wachstum für MIC < 10 mg/ml (%) Rosmarinsäure Oraposid Kaffeesäure Chlorogensäure Verbascosid

Beispiel 5: Test auf die Inhibierung von Aldosereduktase (EC1.1.1.21) (=A.R.)

Voraangsweise

Die enzymatische Inhibierung wird in vitro an einem Extrakt von rohem, aus Augenlinsen isolierten Enzym untersucht, die frisch von Rindern und Ratten erhalten wurden. Das Reaktionsprinzip ist wie folgt:
Glyceraldehyd + NADPH Glycerin + NADP
Diese Reaktion erfolgt bei ph = 6,2 bei Umgebungstemperatur und Extinktionsmessungen bei 340 nm. Die getesteten Moleküle werden in bidestilliertem Wasser gelöst.
Die erhaltenen Ergebnisse pro Glycerin-Dosierung sind als IC 50 ausgedrückt (Konzentration, die eine 50 % Inhibierung der Enzymaktivität ermöglicht).

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefaßt A.R.-Kälber-Augenlinsen getestete Moleküle I.C.50 (mol x 1&supmin;¹) Oraposid Verbascosid Arenariosid A.R.-Ratten-Auaenlinsen Oraposid Verbascosid Arenariosid
Die Aldosereduktase-Inhibitor-Wirksamkeiten verschiedener Heterosidester von Kaffeesäure (1) und (2) entsprechen zwei verschiedenen Versuchsreihen.

Schlußfolgerung

Die vier Moleküle sind ebenso gute Rinder- wie Mäuse- Aldosereduktase-Inhibitoren. Das wirksamste Molekül ist Oraposid mit einer IC 50 von 1,6 x 10&supmin;&sup7; mol/l. Es scheint-wirksamer als eines der derzeit vielversprechendsten Moleküle auf dem Markt, nämlich Sorbinil , das ein Synthesemolekül ist der Formel 6-Fluorspirochroman-4,4'-imidazolin-2',5'-dion, dessen IC 50 5x10&supmin;&sup7; mol/l beträgt.

Beispiel 6: Nachweis der Wirksamkeit gegen freie Radikale von Oraposid in Keratinozyten-Kulturen

Einführung

Die Wirksamkeit von Oraposid gegen freie Radikale wurde an einer kultivierten Human-Keratinozytenlinie verglichen mit wohlbekannten Mitteln gegen freie Radikale untersucht.
Die Schutzwirkung des Mittels gegen freie Radikale wurde durch die Messung von Malonaldehyd (MDA) im Kulturmedium (reflektiert die Lipoperoxidation von Lipiden der Zellmembran) nach Kontakt der Zellen mit einer Quelle freier oxygenierter Radikale (gemäß dem Verfahren von Placer Z.A. et vol., 1966, Anal. Biochem. 16, 359-64, oben angegebene Literaturstelle) untersucht.
Die Zytotoxizität dieser Substanzen wird auch durch die Analyse von Lactatdehydrogenase (LDH) bei einer erhöhten Konzentration gemessen (Z. Klin. Chem. 1970, 8, 658, und Klin. Biochem. 1972, 10, 182).
Nach der Auswertung der gesamten Ergebnisse wird eine Klassifizierung der Moleküle vorgenommen, wobei gleichzeitig ihre Wirksamkeit gegen freie Radikale und ihr zytotoxisches Potential auf der Zellenebene berücksichtigt werden.

Materialien und Methoden

Materialien

- Zellen: Human-Keratinozyten aus einem Schuppenkarzinom.
- Kulturmedium: Basismedium DMEM (1/2), HAM F12 (1/2) (von GIBCO), ergänzt mit 5 % fötalem Kälberserum (von INTERMED).

Methoden

- Zellkultur und Behandlung
Diese werden mit 60 mm Petri-Schalen (NUNC) durchgeführt, Beimpfungsdichte: 5000 Zellen pro cm².
Eine Woche nach der Beimpfung wird die Zellmonokultur zur Konfluenz mit 500 l einer Lösung behandelt, enthaltend ein System zur Erzeugung oxygenierter Radikale, bestehend aus 10&supmin;³ M Vitamin C, 10&supmin;&sup4; M FeCl&sub3;, 10&supmin;&sup4; M FeSO4, in PBS-Puffer bei pH 8, erganzt mit dem zu testenden Molekül (= Reaktionsmedium).
Nach 2 h Inkubieren bei 37ºC wird dieses Inkubierungsmedium zur MDA-Analyse gewonnen.
- LDH-Messung
Die Verbindungen werden bei 200 pm, gelöst in DMSO, getestet, die Kontroll-Kulturen enthalten eine identische Menge an Lösungsmittel.
Nach 24 h, dann nach 6 Tagen wird die Menge an LDH bestimmt, die im Kulturmedium nach täglicher Behandlung durch Moleküle gegen freie Radikale ausgesalzt wird.
Der Kulturüberstand wird Natriumpyruvat und NADH ausgesetzt, wobei die Kinetik der LDH-Wirksamkeit im Spektrophotometer gemessen wird (BÖHRINGER-Kit).
Die LDH-Wirksamkeit wird durch eine Erhöhung der OD/nm (OD = optische Dichte) bestimmt, welche die Zytotoxizität des Moleküls reflektiert.
- MDA-Messung
Nach 2 h Inkubieren mit den Zellen werden 500 ul Reaktionsmedium entnommen, und Thiobarbitursäure wird zugesetzt, um MDA bei 532 nm zu analysieren.
Die Ergebnisse sind als % Inhibierung der Bildung von MDA angegeben.
- Testsubstanzen
- α-Tocopherol
- BHT (Referenzsubstanzen)
- Oraposid

Diskussionsergebnisse

- Zytotoxizität
Sie wurde an 200 uM für drei Produkte getestet. Die Ergebnisse sind für die 3 ersten Tage des Kontakts und als % Erhöhung der OD in bezug auf die Kontrolle (+DMSO) angegeben. α-Tocopherol BHT Oraposid (Mittel von 3 Messungen)
Es wurde eine starke Zytotoxizität von BHT festgestellt, die ab dem ersten Tag eine starke LDH-Aussalzung bewirkt. Die Erscheinung ist bei α-Tocopherol weniger ausgeprägt, wohingegen Oraposid keinerlei zytotoxische Wirkung auf die Zellen hat.
-MDA-Analyse
Die Untersuchung wurde bei einer Konzentration von 100 uM für die 3 Produkte nach 2 h Inkubieren mit der Reaktionsmischung durchgeführt. Der erzeugte MDA, verfolgt durch Spektrophotometrie, führt zu Ergebnissen, ausgedrückt in % Inhibierung dieser Erzeugung in bezug auf die Kontrolle (Reaktionsmedium allein).
Dann wird die Schutzwirkung der Substanz gegen freie Radikale untersucht. α-Tocopherol BHT Oraposid (1. Versuch) (2. Versuch) (Mittel von 3 Messungen)
Eine Schutzwirkung von Oraposid wird festgestellt, die in der Nähe jener von BHT liegt und geringfügig weniger stark ist als jene von α-Tocopherol.

Schlußfolgerung

Die MDA-Analyse im Kulturüberstand ermöglichte die Untersuchung der Wirkung von Oraposid gegen freie Radikale bei 100 um. Es erwies sich als ebenso wirksam wie BHT, jedoch weniger wirksam als α-Tocopherol.
Es ist aber festzustellen, daß es im Gegensatz zu diesen beiden Referenzmolekülen keinerlei zytotoxische Wirkung bis 200 uM zeigt.
Nachstehend sind verschiedene Beispiele kosmetischer oder pharmazeutischer Formulierungen dieser erfindungsgemäßen Derivate mit Oraposid angegeben.
Die Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, wenn nichts anderes angegeben ist. Beispiel 7: After Sun-Gel (entzündungshemmend) -roher Orobanche-Extrakt (gemäß Beispiel I) - 2,5 % carbopol 940 -Gel mit 2,5 % Glycerin - Hyaluronsäure - übliche Konservierungsmittel - Parfums - H&sub2;O q.s.p. 100 %

Beispiel 8: Anti-Alterungscreme

in Liposomen eingekapseltes Oraposid (*)
Weizenkeimöl
autoemulgierbare Basis
Wasser, enthaltend Konservierungsmittel,
Parfums, übliche Antioxidantien, q.s.p.
(*) Die Oraposid enthaltende Liposomen-Zuaammensetzung besteht aus:
- Sojalecithin 3,6
- β-Sitosterol 0,4
- Oraposid 0,4
- Sojapeptid 1,0
- Wasser, ausreichende Menge auf
Das Oraposid liegt in der wässerigen Phase vor.

Beispiel 9: Anti-Flecken-Serum

- gereinigter Orobanche-Extrakt (gemäß Beispiel 1)
- Ethanol
- glyceriniertes Wasser
- Gelbildner
- Parfums
- übliche Konservierungsmittel
- Wasser q.s.p.

Beispiel 10: Sonnenschutz

- gereinigter Orobanche-Extrakt (gemäß Beispiel 1)
- mikronisiertes Titan
- nicht-ionische Emulgatoren
- Ölebildner
- 2,5 % neutralisiertes Carbopol 940 -Gel
- Silikon
- Wasser, enthaltend Konservierungsmittel, Antioxidantien, Parfums q.s.p.

Beispiel 11: Pharmazeutische Zusammensetzung

Gelatinekapseln zur oralen Verabreichung, enthaltend 60 mg Oraposid oder seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) in einem für Gelatinekapseln üblichen Exzipienten, werden hergestellt.
Diese Kapseln können insbesondere zur Behandlung der Parkinsonschen Krankheit bei einer Posologie von 4 bis 6 Gelatinekapseln pro Tag verwendet werden, was allgemein 1 bis 6 mg reinem Oraposid pro kg Körpergewicht pro Tag entspricht.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen, insbesondere dermatologischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß es den Einschluß einer wirksamen Menge von Oraposid oder seinen oben angegebenen Derivaten in einem kosmetisch oder pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger oder Vehikel umfaßt. Vorzugsweise werden zwischen 0,001 Masse-% und ungefähr 10 Masse-%, bevorzugter zwischen ungefähr 0,1 und 5 Masse-%, Oraposid oder seiner Derivate in der Zusammensetzung eingeschlossen, insbesondere im Rahmen einer topischen Anwendung.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, die durch freie Radikale verursacht werden, ungeachtet ihres Ursprungs, dadurch gekennzeichnet, daß es die Verabreichung einer wirksamen Menge von Oraposid oder seinen Derivaten der oben angegebenen Formel (I) in geeigneter Form an einen Patienten, der an einer dieser Krankheiten leidet, umfaßt.
Gemäß einer Ausführungsvariante dieses Behandlungsverfahrens, insbesondere im Rahmen einer topischen Anwendung, wird eine Zusammensetzung in einer Dosis von 0,001 bis 10 Masse-%, vorzugsweise 0,01 bis 5 Masse-%, Oraposid oder seiner oben angegebenen Derivate verabreicht.
Gemäß einer besonderen Ausführungsvariante werden Entzündungen, insbesondere Entzündungen, die durch übermäßige Sonnenbestrahlung verursacht werden, sowohl durch lokale Anwendung als auch auf oralem, rektalen Weg oder durch Injektion, mit einer wirksamen Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) behandelt, um die gewünschte Wirkung zu erzielen.
Gemäß einer anderen Variante wird die Zellalterung, insbesondere die Hautalterung und speziell aktinische Alterung durch topische Anwendung einer wirksamen Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) verhindert oder behandelt, um die gewünschte Wirkung zu erzielen.
Gemäß noch einer anderen Variante wird ein Hautschutz gegen UVA- und UVB-Ultraviolettstrahlung durch topische Anwendung einer wirksamen Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) bewirkt, um den gewünschten UV- Schutzeffekt zu erzielen.
Gemäß noch einer anderen Variante werden Hautpigmentflecken durch topische Anwendung einer wirksamen Menge-an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) verhindert oder behandelt.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsvariante wird die Behandlung hepatischer Intoxikationen ungeachtet ihres Ursprungs durch vorzugsweise orale Verabreichung oder durch Injektion einer wirksamen Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) durchgeführt.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsvariante wird die Behandlung von Diabetes, insbesondere Diabetes mellitus, oder damit assoziierten Augenlinsenstörungen durch die Verabreichung einer wirksamen Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) in geeigneter Form an einen Patienten, der an dieser Erkrankung leidet, durchgeführt.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsvariante wird die Behandlung von Schmerzen durch die Verabreichung einer wirksamen Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) in geeigneter Form an einen Patienten, der an Schmerzen leidet, durchgeführt.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsvariante wird eine antiallergische Behandlung durch die Verabreichung einer wirksamen Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) in geeigneter Form an einen Patienten, der an einer Allergie leidet, durchgeführt.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsvariante wird die Behandlung der Parkinsonschen Krankheit durch die Verabreichung einer wirksamen Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I), vorzugsweise in Kombination mit L-DOPA, in geeigneter Form an einen Patienten, der an dieser Krankheit leidet, durchgeführt.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsvariante wird eine antihypertensive Behandlung durch die Verabreichung einer wirksamen Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) in geeigneter Form an einen Patienten, der an arterieller Hypertension leidet, durchgeführt.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsvariante wird eine Anti-Tremor-Behandlung durch die Verabreichung einer wirksamen Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) in geeigneter Form an einen Patienten, der an Tremor, insbesondere Tremor aufgrund der Parkinsonschen Krankheit, leidet, in geeigneter Form durchgeführt. Gemäß noch einer anderen Ausführungsvariante wird einem Patienten eine wirksame Menge an Oraposid oder eines seiner oben angegebenen Derivate der Formel (I) in geeigneter Form zum Erzielen einer psychotropen Wirkung verabreicht.

Claims

1. Neues Kaffeesäure-Derivat, dadurch gekennzeichnet, daß es sich handelt um Oraposid oder seine Derivate der folgenden Formel (I):

worin eines oder mehrere R unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-Gruppe, niederer als C&sub1;-C&sub5;, insbesondere Methyl, oder eine Acyl-Gruppe, insbesondere C&sub1;-C&sub6;, spezifisch Acetyl, bedeuten.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nur die OR-Gruppen, die von den Glucopyranosyl- oder Rhamnopyranosyl-Ringen getragen werden, acyliert, insbesondere acetyliert sind.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß nur die OR-Gruppen, die von den Phenyl-Ringen getragen werden, alkyliert, insbesondere methyliert sind.

4. Verbindung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Oraposid oder seine Derivate aus einer Pflanze der Familie Orobanchaceae, insbesondere Orobanche rapum genistae, extrahiert werden.

5. Kosmetische oder pharmazeutische, insbesondere dermatologische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß diese als aktiven Bestandteil Oraposid oder seine Derivate der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, umfaßt.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß diese etwa 0,001 bis etwa 10 Masse-%, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 5 Masse-%, Oraposid oder deiner Derivate, bezogen auf die Gesamtmasse der End-Zusammensetzung, umfaßt.

7. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen, insbesondere dermatologischen Zusammensetzung mit Wirksamkeit gegen freie Radikale.

8. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen, insbesondere dermatologischen Zusammensetzung mit entzündungshemmender Wirksamkeit.

9. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit Hepato- Schutzwirksamkeit.

10. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen, insbesondere dermatologischen Zusammensetzung mit Wirksamkeit gegen die Alterung von Zellen, insbesondere gegen die Alterung von Hautzellen und spezifisch gegen die Alterung durch aktinische Strahlung.

11. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen, insbesondere dermatologischen Zusammensetzung mit Wirksamkeit bei der Prävention oder Behandlung von Hautpigmentflecken.

12. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit Aldosereduktase-Inhibitor-Wirksamkeit.

13. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen, insbesondere dermatologischen Zusammensetzung mit 5-Lipoxygenase-Wirksamkeit.

14. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (1), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen, insbesondere dermatologischen Zusammensetzung mit DOPA-Decarboxylase- Inhibitor-Wirksamkeit.

15. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit β-Blocker- Wirksamkeit.

16. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen, insbesondere dermatologischen Zusammensetzung mit Wirksamkeit bei der Filterung von UVA- oder UVB-Ultraviolettstrahlung.

17. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen, insbesondere dermatologischen Zusammensetzung mit analgetischer Wirksamkeit.

18. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen, insbesondere dermatologischen Zusammensetzung mit anti-allergischer Wirksamkeit.

19. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit Anti-Tremor- Wirksamkeit.

20. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit psychotroper Wirksamkeit.

21. Verwendung von Oraposid oder seinen Derivaten der Formel (1), wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit Anti-Hypertonie-Wirkung.

22. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusammensetzung kein Anti-Bakterien- oder Anti-Pilz-Konservierungsmittel und/oder Antioxidans-Konservierungsmittel aufgrund der antibakteriellen oder antioxidativen Wirksamkeit von Oraposid oder seinen Derivaten zugesetzt wird.