DE102007026156B4 - Kosmetische Zusammensetzung mit einem Limnocitrus Littoralis-Extrakt - Google Patents

Abstract

Kosmetische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff einen Limnocitrus littoralis-Extrakt, der mit Hilfe eines alkoholischen oder hydroalkoholischen Extraktionsmittels erhalten wird, in einem mit einer topischen Anwendung vereinbaren, kosmetisch akzeptablen Vehikel enthält.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Kosmetik. Sie betrifft insbesondere neuartige kosmetische Zusammensetzungen, die einen Extrakt aus Limnocitrus littoralis (Miq.) Swingle, nachfolgend als Limnocitrus littoralis bezeichnet, enthalten, sowie neue Verwendungen dieses Extrakts auf dem Gebiet der Kosmetik.
• Limnocitrus littoralis ist eine Pflanze der Familie der Rautengewächse oder Rutaceae, und ihr Basionym lautet Paramignya littoralis Miq. Sie stammt aus Sudostasien und ist laut unseren Informationen die einzige heute in der Gattung Limnocitrus registrierte Spezies. Sie kommt im wesentlichen in heißen und trockenen Gebieten vor.
• Es handelt sich um Büsche, welche in Form von Sträuchern vorliegen, die im wesentlichen, jedoch nicht einzig und allein, im Vietnam zu finden sind, von wo im übrigen auch diejenigen stammen, die im Rahmen der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
• Über traditionelle oder religiöse Verwendungen dieser Pflanze wird in Legenden sowie in der vietnamesischen Literatur ausführlich berichtet. Es wurden auch Anwendungen und herkömmliche therapeutische Wirkungen, insbesondere der Blätter der Limnocitrus littoralis, als auswurfförderndes Mittel, Hustenmittel oder für die Zubereitung von Dampfbädern beschrieben, die als wirkungsvolle Heilmittel für die Ausschwitzung und die Behandlung von Erkältungen und Fieber angesehen werden.
• Es sind auch unterschiedliche Verwendungen in der traditionellen Medizin bekannt, entweder der Wurzeln als fiebersenkendes Mittel oder der Blätter als Hustenmittel oder des Perikarps zur Behandlung von Asthmaanfällen oder Husten.
• Schließlich schlagen unterschiedliche traditionelle Heilmittel, insbesondere für Gebärmutterentzündung, Obstipation und Husten, Dekokte vor, die u. a. Teile der Limnocitrus littoralis, sei es frisch oder getrocknet enthalten.
• Es ist auch die Verwendung von Blättern beschrieben, die wegen ihrer wohlriechenden Dämpfe verbrannt werden.
• Die Familie der Rautengewächse, zu der Limnocitrus littoralis gehört, umfaßt vor allem die sehr verbreitete und sehr bekannte Gattung Citrus, die etwa 165 Spezies enthält.
• Es ist bekannt, daß eine gewisse Anzahl von Pflanzenspezies, die zu der Gattung Citrus gehören, entzündungshemmende Eigenschaften haben. Jedoch ist diese antiinflammatorische Eigenschaft weit davon entfernt, umfassend zu sein.
• Die Erfinder haben sich folglich auch für die zur Gattung Citrus gehörenden Pflanzenspezies interessiert, selbst wenn deren botanische Gattung sich von derjenigen von Limnocitrus littoralis unterscheidet.
• So weisen im Gegensatz einige Pflanzenspezies der Gattung Citrus eine proinflammatorische Eigenschaft auf. Darüber hinaus wären andere Pflanzenspezies der Gattung Citrus – wie dies durch die seitens der Anmelderin durchgeführten Versuche nachgewiesen wurde – an dem verwendeten Modell bei Dosen toxisch, bei denen sie eine antiinflammatorische Aktivität aufweisen.
• Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun durch Testen verschiedener Pflanzenspezies der Gattung Citrus entdeckt, daß es möglich war, aus der Pflanze Limnocitrus littoralis Extrakte herzustellen, die sowohl nicht toxisch bei den verwendeten Dosen als auch insbesondere kosmetisch aktiv sind.
• Genauer gesagt konnten die Erfinder der vorliegenden Erfindung im Zuge systematischer Versuche Extrakte selektieren, die in bemerkenswerter Weise geeignet sind, nicht pathologische Hauterscheinungen entzündlichen Ursprungs, insbesondere diejenigen, die empfindlicher Haut zugeordnet sind, durch eine hautberuhigende Wirkung zu bekämpfen.
• Unter empfindlicher Haut wird eine Haut verstanden, die auf die äußeren Angriffe mit den gleichen Anzeichen wie eine normale Haut reagiert, jedoch schneller und manchmal heftiger, ohne daß die Haut deswegen einen pathologischen Zustand aufweist.
• Die im allgemeinen sensibler Haut zugeordneten, nicht pathologischen Hauterscheinungen sind wohl bekannt. Sie kommen durch ein Gefühl von Unbehagen, das je nach Person mehr oder weniger ausgeprägt ist, im Bereich der Haut und insbesondere durch ein Empfinden von Hitze oder Brennen, durch Stechen oder Kribbeln, durch Juckreiz und/oder Ziehen oder auch durch das Auftreten von Rötungen zum Ausdruck. Diese Hautstörungen werden durch äußere Faktoren, wie zum Beispiel Emotionen, Umweltfaktoren (Verschmutzung, UV-Strahlung, Tabak, Temperatur etc.), die vor allem in kosmetischen Zusammensetzungen enthaltenen chemischen Wirkstoffe, wie oberflächenaktive Mittel, Konservierungsmittel, Duftstoffe oder einige kosmetische Wirkstoffe verursacht.
• Die Wirkungsmechanismen, die zu diesen Erscheinungen führen, sind in verschiedenartiger Weise bekannt, aber ihre Gemeinsamkeit sowie ihr Ursprung sind inflammatorische Prozesse. Diese werden zu einer mehr oder weniger starken Erregung der sensorischen Hautnerven führen, als Folge der Freisetzung von Überträgerstoffen der Entzündung, wie reaktiven Arten des Sauerstoffs, Zytokinen (wie Interleukin-8) oder Prostaglandinen, insbesondere Prostaglandinen des Typs E₂.
• Die Erfinder haben überdies feststellen können, daß sich diese gleichen Extrakte bei anderen kosmetischen Anwendungen, insbesondere auf dem Gebiet der Hautalterung, aufgrund ihrer Fähigkeit, die Kollagensynthese anzuregen, als wirkungsvoll erwiesen haben.
• So betrifft die Erfindung nach einem ersten Aspekt eine kosmetische Zusammensetzung, die einen Extrakt der Pflanze Limnocitrus littoralis enthält.
• Nach einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung des genannten Extraktes als Wirkstoff in Zusammensetzungen, um ihnen unterschiedliche kosmetische Eigenschaften zu verleihen, die ermöglichen, nicht pathologische Hauterscheinungen entzündlichen Ursprungs zu bekämpfen und den Folgen der Hautalterung vorzubeugen und/oder diese zu bekämpfen.
• Nach einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein kosmetisches Behandlungsverfahren, das für die Pflege der Haut, insbesondere für eine Pflege, welche nicht pathologische Hauterscheinungen entzündlichen Ursprungs bekämpfen soll, oder für eine Pflege, welche den Folgen der Alterung der Haut vorbeugen und/oder diese bekämpfen soll, insbesondere eine Antifaltenpflege bestimmt ist.
• So betrifft die Erfindung nach einem ersten wesentlichen Merkmal eine kosmetische Zusammensetzung, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als Wirkstoff einen Extrakt aus Limnocitrus littoralis, der mit Hilfe eines alkoholischen oder hydroalkoholischen Extraktionsmittels erhalten wird, in einem mit einer topischen Anwendung vereinbaren, kosmetisch akzeptablen Vehikel enthält.
• Nach einem zweiten wesentlichen Merkmal betrifft die Erfindung eine Verwendung – in einer kosmetischen Zusammensetzung oder für die Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung – eines erfindungsgemäßen Limnocitrus littoralis-Extrakts als Wirkstoff, welcher der kosmetischen Zusammensetzung kosmetische Eigenschaften verleiht, die ermöglichen, nicht pathologische Hauterscheinungen entzündlichen Ursprungs, wie diejenigen, die der sensiblen Haut zugeordnet sind, durch eine hautberuhigende Wirkung zu bekämpfen.
• Nach dieser ersten Verwendung betrifft die Erfindung die Verwendung der genannten kosmetischen Zusammensetzung, um nicht pathologische Hauterscheinungen entzündlichen Ursprungs, wie das Empfinden von Hitze oder Brennen, Rötungen, Ziehen, Juckreiz und Stechen oder Kribbeln zu lindern.
• Nach einer zweiten Verwendung betrifft die Erfindung eine Verwendung – in einer kosmetischen Zusammensetzung oder für die Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung – eines erfindungsgemäßen Limnocitrus littoralis-Extrakts als die Kollagensynthese anregendes Mittel.
• Nach dieser zweiten Verwendung betrifft die Erfindung die Verwendung der Zusammensetzung, um den Folgen der intrinsischen und/oder lichtinduzierten Alterung der Haut vorzubeugen und/oder diese zu bekämpfen.
• Nach einem weiteren wesentlichen Merkmal betrifft die Erfindung ein kosmetisches Behandlungsverfahren, das vor allem dazu bestimmt ist, nicht pathologische Hauterscheinungen entzündlichen Ursprungs zu lindern und/oder den Folgen der intrinsischen und/oder lichtinduzierten Alterung vorzubeugen und/oder diese zu bekämpfen, und das die Anwendung einer erfindungsgemäßen kosmetischen Zusammensetzung auf der Haut umfaßt.
• Nach diesem letzten Merkmal betrifft die Erfindung insbesondere ein kosmetisches Behandlungsverfahren, welches für eine Antifaltenpflege bestimmt ist.
• Weitere Merkmale der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung sowie den nachfolgenden detaillierten Beispielen hervorgehen.
• Die kosmetischen Zusammensetzungen der Erfindung sind durch das Vorliegen eines von einem Limnocitrus littoralis-Extrakt gebildeten Wirkstoffs gekennzeichnet.
• Dieser Extrakt wird in einem Verfahren erhalten, das wenigstens einen Extraktionsschritt mittels eines alkoholischen oder hydroalkoholischen Extraktionsmittels umfaßt.
• Die seitens der Erfinder der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuche haben gezeigt, daß es vorzuziehen ist, die Luftteile der Pflanze für den Erhalt der erfindungsgemäßen nützlichen Extrakte zu verwenden.
• Nach einer besonders vorteilhaften Variante der Erfindung ist der Extrakt ein Extrakt aus Blättern.
• Die verwendeten Alkohole, ob rein oder in hydroalkoholischen Mischungen, sind vorteilhafterweise C₁- bis C₅-Monoalkohole oder C₂- bis C₅-Glykole.
• Als für die Herstellung der erfindungsgemäßen nützlichen Extrakte besonders bevorzugte Alkohole werden Ethanol, Butylenglykol sowie Ethanol-Wasser- und Butylenglykol-Wasser-Gemische genannt.
• Im Laufe der durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuche zeigte sich, daß die Qualität der Extrakte und vor allem die zeitliche Stabilität ihrer intrinsischen Eigenschaften weitgehend verbessert war, wenn das Extraktionsmittel relativ geringe Mengen an Wasser enthielt oder gar wasserfrei war.
• So ist das Extraktionsmittel nach einer vorteilhaften Variante Ethanol oder ein Ethanol-Wasser-Gemisch mit höchstens 50% Wasser, vorzugsweise höchstens 4% Wasser.
• Nach einer weiteren, besonders bevorzugten Variante der Erfindung wird der Extrakt unter Verwendung von reinem Butylenglykol als Extraktionsmittel erhalten.
• So werden die erfindungsgemäßen Limnocitrus littoralis-Extrakte vorteilhafterweise unter Verwendung eines wasserfreien Lösungsmittels und ganz besonders von Butylenglykol erhalten.
• Außerdem erweist es sich nach einer besonders vorteilhaften Ausführungsform, selbst wenn der Extrakt nicht direkt durch eine Extraktion mit Butylenglykol erhalten wird, als vorteilhaft, ihn in die erfindungsgemäße Zusammensetzung in Form einer Lösung in Butylenglykol, insbesondere in Form einer Lösung einzubringen, die zwischen 0,05 und 5 Gew.-%, besser zwischen 0,1 und 1 Gew.-% Trockenextrakt bezogen auf das Butylenglykol-Gewicht enthält.
• Nach noch weiteren Varianten wird der Extrakt vor seinem Einbringen in eine Zusammensetzung, und während er sich noch in dem erfindungsgemäß verwendeten Extraktionsmittel in Lösung befindet, einem Fest-Flüssig-Trennschritt unterzogen, um den festen Teil zu entfernen.
• Der Extrakt kann auch unterschiedlichen Entfärbungsschritten, insbesondere einem Entfärbungsschritt über Aktivkohle unterzogen werden.
• Die Extraktkonzentration der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, welche in Gewichtsprozent Trockenextrakt ausgedrückt wird, kann in weiten Verhältnissen variieren.
• Jedoch wird diese Konzentration vorteilhafterweise zwischen 10^–4 und 5 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 0,01 und 2 Gew.-% Trockenextrakt bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung liegen, wobei der Extrakt vorzugsweise ein Extrakt aus Blättern der Limnocitrus littoralis ist.
• Die Zusammensetzungen der Erfindung können wenigstens ein Konservierungsmittel enthalten, das unter den herkömmlicherweise auf dem Gebiet der Kosmetik verwendeten Konservierungsmitteln ausgewählt ist.
• Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch wenigstens ein Antioxidans enthalten.
• Als erfindungsgemäß besonders bevorzugte Antioxidantien werden Alphatocopherol, Ascorbinsäure sowie deren kosmetisch akzeptable Derivate und insbesondere deren Ester genannt.
• Die Zusammensetzungen der Erfindung können sehr variabel formuliert werden und in jedweder mit einer topischen Anwendung auf der Haut vereinbaren Form vorliegen.
• Sie können insbesondere in Form von Creme, Gel, Lotion, eines Sticks, von Lidschminke oder Teintgrundierung vorliegen.
• Die bevorzugten Zusammensetzungen der Erfindung werden besonders geringe Mengen Wasser enthalten oder werden in wasserfreier Form vorliegen.
• Als Beispiel für solche Zusammensetzungen werden Teintgrundierungen, Lidschminke oder Sticks genannt.
• Wie zuvor dargelegt, ist der Vorteil der Zusammensetzungen im wesentlichen mit den Eigenschaften zur Linderung von nicht pathologischen Hauterscheinungen entzündlichen Ursprungs sowie mit einer Aktivität zum Bekämpfen oder Vorbeugen der Folgen der intrinsischen und/oder lichtinduzierten Alterung der Haut, insbesondere von Falten verbunden.
• Es wurde durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung nachgewiesen, daß die Linderungseigenschaften im wesentlichen mit einer Aktivität zur Hemmung der Prostaglandine vom Typ E₂ (PGE₂) und die Anti-Aging-Aktivität mit einer Aktivität zur Anregung der Kollagensynthese verbunden waren.
• Die Extrakte, wie sie zuvor definiert sind, können aufgrund ihrer Eigenschaften in kosmetischen Zusammensetzungen oder für die Herstellung dieser Zusammensetzungen als hautberuhigendes Mittel eingesetzt werden.
• Die so erhaltenen Zusammensetzungen können eingesetzt werden, um nicht pathologische Hauterscheinungen entzündlichen Ursprungs, wie das Empfinden von Hitze oder Brennen, Stechen oder Kribbeln, Rötungen, Ziehen, Juckreiz zu lindern, deren Ursprung Erscheinungen inflammatorischer Art der Haut sind.
• Aufgrund ihrer zweiten Art von Aktivität bezüglich der Kollagensynthese können die erfindungsgemäßen Extrakte in kosmetischen Zusammensetzungen oder für die Herstellung derartiger Zusammensetzungen als die Kollagensynthese anregendes Mittel verwendet werden.
• Derartige Zusammensetzungen können in all den Fällen eingesetzt werden, in denen den Folgen der intrinsischen und/oder lichtinduzierten Alterung der Haut, insbesondere Falten vorgebeugt und/oder diese bekämpft werden sollen.
• Die oben genannten Erscheinungen inflammatorischer Art spielen auch eine Rolle bei der Beschleunigung der Hautalterung, wie dies durch S. Pillai, C. Oresajo und J. Hayward in dem Artikel laut International Journal of Cosmetic Science, 2005, 27, Seiten 17–34 beschrieben ist.
• Somit sind die erfindungsgemäßen Extrakte aufgrund ihrer zweifachen Aktivität gegen nicht pathologische Hauterscheinungen entzündlichen Ursprungs auf der einen Seite und zur Anregung der Kollagensynthese auf der anderen Seite besonders für das Gebiet der Hautalterung geeignet.
• Wie zuvor dargelegt betrifft die Erfindung auch ein kosmetisches Behandlungsverfahren, das vor allem dazu bestimmt ist, die Hautstörungen entzündlichen Ursprungs zu lindern und/oder den Folgen der intrinsischen und/oder lichtinduzierten Alterung vorzubeugen und/oder diese zu bekämpfen und das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Anwendung einer kosmetischen Zusammensetzung, wie sie vorangehend definiert ist, auf der Haut umfaßt.
• BEISPIELE
• I. HERSTELLUNG ERFINDUNGSGEMÄßER NÜTZLICHER EXTRAKTE
• a. Herstellung eines Extrakts durch hydroethanolische Extraktion
• 10 g gemahlenen Blättern in einem 250 ml-Kolben werden 150 ml eines Ethanol-Wasser-Gemischs in den Verhältnissen 90/10 Volumen/Volumen (V/V) zugegeben.
• Das Gemisch wird für 30 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird der Extrakt über einem Büchner-Trichter mit 2 GF/F-Filtern (Whatmann) gefiltert, anschließend wird der Filterkuchen mit 50 ml Ethanol-Wasser-Gemisch (90/10 V/V) gespült. Dann wird das Filtrat mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bis zur Trockne eingedampft.
• Aus dem so erhaltenen Trockenextrakt werden 3 Lösungen hergestellt:
• – eine 1%ige Gewicht/Volumen (G/V) Lösung in einem Ethanol-Wasser-Gemisch (50/50, V/V), nachfolgend als Extrakt A bezeichnet,
• – eine 1%ige (G/V) Lösung in 1,3-Butylenglykol, nachfolgend als Extrakt B bezeichnet,
• – eine 1%ige (G/V) Lösung in Ethanol-Wasser (50/50, V/V) mit 30 μl/ml eines Antioxidantien enthaltenden Gemischs, die nachfolgend als Extrakt C bezeichnet wird.
• Dieses Antioxidantien-Gemisch besteht aus 0,20 g Alphatocopherol + 0,05 g Lecithin-Palmitoyl + 0,01 g Ascorbylpalmitat, das Ganze in 6 ml eines Wasser-Ethanol-Gemischs (16/84 V/V).
• b. Herstellung eines Extrakts durch Extraktion mit Butylenglykol
• 10 g gemahlenen Blättern in einem 250 ml-Kolben werden 150 ml 1,3-Butylenglykol zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 50°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird der Extrakt über einem Büchner-Trichter mit 1 Filter von 0,45 μm (Millipore) gefiltert. Der Filterkuchen wird mit 50 ml 1,3-Butylenglykol gespült. Der Trockenextrakt der Lösung beträgt etwa 0,4 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung.
• Der so erhaltene Trockenextrakt wird nachfolgend als Extrakt D bezeichnet.
• c. Herstellung eines entfärbten Extrakts
• Die unter b) erhaltene Lösung in Butylenglykol wird über Aktivkohle (CxV) (Lieferant: CECA) entfärbt, indem entsprechend dem nachfolgend beschriebenen Verfahren vorgegangen wird.
• Ein erster Schritt wird mittels 50,07 ml obiger Lösung mit 10 mg Aktivkohle (also etwa 5 Gew.-% bezogen auf das Trockensubstanzgewicht) durchgeführt. Das Ganze wird 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösung wird über einem GF/F-Filter (Whatmann) gefiltert.
• Dieser Lösung werden erneut 10 mg Aktivkohle zugegeben. Das Ganze wird 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösung wird über einem GF/F-Filter (Whatmann) gefiltert.
• Dieser Lösung werden wiederum 20 mg Aktivkohle zugegeben. Das Ganze wird 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösung wird über einem GF/F-Filter (Whatmann) gefiltert, anschließend bis zur Trockne eingedampft.
• Der so erhaltene Trockenextrakt dieser Lösung beträgt 0,28 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung. Er wird nachfolgend als Extrakt E bezeichnet.
• II. NACHWEIS DER ANTIINFLAMMATORISCHEN AKTIVITÄT
• 1. Prinzip des Tests
• Der Test wird an menschlichen Keratinozyten durchgeführt und hat zum Ziel, die Hemmung der Freisetzung der Prostaglandine vom Typ E₂ in Anwesenheit von erfindungsgemäßen Extrakten zu bestimmen.
• 2. Protokoll des Tests zum Messen der antiinflammatorischen Aktivität
• a. Herstellung der Positiv-Kontrolle und der zu testenden Probe
• Die Positiv-Kontrolle, die verwendet wird, um die Freisetzung von PGE₂ zu hemmen, ist Indometacin (Sigma Produktnummer: 17378). Eine 3.10^–3 molare Stammlösung wurde in DMSO hergestellt. Das Indometacin wurde in das Kulturmedium mit 0,1% V/V, also der Endkonzentration an Wirkstoff von 3.10^–6 M eingebracht. Parallel hierzu wurde eine Trägersubstanz-Kontrolle (DMSO) mit einer Endkonzentration von 0,1% V/V hergestellt. Jeder zu testende Limnocitrus littoralis-Extrakt wird in DMSO mit der Konzentration von 5% V/V in Lösung gebracht, anschließend auf die Konzentration von 3,125 mg/ml verdünnt.
• Jeder zu testende Limnocitrus littoralis-Extrakt wird anschließend in das Kulturmedium mit 0,1% V/V, also einer Endkonzentration an Wirkstoff von 3,125 μg/ml eingebracht. Parallel hierzu wurde eine Trägersubstanz-Kontrolle (DMSO) mit einer Endkonzentration von 0,1% V/V hergestellt.
• Es wurde zuvor die Zellebensfähigkeit mittels der XTT-Methode getestet (Test, der nach 24 Stunden Behandlung durchgeführt wird), um die Abwesenheit von Zytotoxitität an den Keratinozyten bei der untersuchten Limnocitrus littoralis-Dosis zu überprüfen.
• b. Behandlung der Zellen
• Die Keratinozyten (Typ HaCaT) werden in einem komplementierten KSFM-Medium (Gibco Nummer: 17005-034 + 37000-015) kultiviert. Die Keratinozyten werden in 96-Loch-Mikroplatten mit 10000 Zellen pro Loch ausgesät. Dieser erste Kulturtag wird als J0 betrachtet. Nach einer Inkubation von 24 Stunden (J1) wird das Medium durch KSFMc-Medium ersetzt, das entweder einen Limnocitrus littoralis-Extrakt, wie er unter Punkt I beschrieben ist, oder Indometacin oder die Lösungsmittelkontrolle (DMSO) enthält.
• Nach 48 Stunden (J3), also 24 Stunden Behandlung, wird das Kulturmedium zurückgewonnen, anschließend bei –20°C eingefroren, die Zellen werden einmal mit PBS gespült und bilden den Gegenstand einer Proteindosierung mittels der BCA-Methode.
• Das Kulturmedium nach dem Auftauen wird nach dem Protokoll des EIA-Kit (Enzyme Immuno Assay) mit der Nummer 514010, welcher durch die Gesellschaft Cayman vertrieben wird, dosiert.
• Gleichzeitig wird ein Eichbereich nach dem gleichen Protokoll erstellt (Bereich von 0 bis 1 ng/ml).
• c. Ergebnisse
• In der nachfolgenden Tabelle I sind die in Prozent ausgedrückten Ergebnisse der Hemmung der Prostaglandine vom Typ E₂ in Anwesenheit der verwendeten Extrakte A, B, C, D und E bei 1 mg/ml und 0,1 mg/ml in DMSO aufgeführt. TABELLE I

  Extrakte	1 μg/ml	0,1 μg/ml
  A	42%	23%
  B	62%	45%
  C	61%	36%
  D	60%	42%
  E	57%	39%

• Man stellt fest, daß die Extrakte A, B, C, D und E alle eine Aktivität zur Hemmung der PGE-2 aufweisen und daß bei einer höheren, aber für die Zellen nicht toxischen Konzentration die Aktivität zur Hemmung der PGE-2 sogar sehr signifikant wird.
• III. NACHWEISE DES VORTEILS VON LIMNOCITRUS LITTORALIS IM VERGLEICH ZU ANDEREN, ZUR GATTUNG CITRUS GEHÖRENDEN PFLANZEN
• Die nachfolgend geschilderten Versuche veranschaulichen den Vorteil von Limnocitrus littoralis im Vergleich zu anderen Citrus-Pflanzen hinsichtlich der antiinflammatorischen Aktivität und der Toxizität.
• Bei der in diesem Teil durchgeführten Untersuchung wurde für die Bestimmung der antiinflammatorischen Aktivität der im obigen Teil II beschriebene Test verwendet.
• Gegenstand der Untersuchung waren die fünf nachfolgenden Spezies der Gattung Citrus:

I:

Citrus maxima (Burm. Ex Rumph.) Merr.

II:

Citrus aurentifolia (Christm.) swingle

III:

Citrus nobilis (Lour.)

IV:

Citrus hystrix (DC.)

V:

Citrus reticulata (Blanco.)

• Die Erfinder der vorliegenden Erfindung wollten die Fähigkeiten zur Hemmung der PGE₂ zwischen dem Extrakt A aus Limnocitrus littoralis und hydroalkoholischen Extrakten unterschiedlicher Citrus-Pflanzen, die unter den gleichen Extraktionsbedingungen wie sie für Extrakt A beschrieben sind erhalten und in gleichen Konzentrationen getestet wurden, vergleichen.
• Darüber hinaus wurde die Toxizität der Extrakte I bis V im Vergleich zu derjenigen des unter den gleichen Bedingungen erhaltenen Extraktes A aus Limnocitrus littoralis überprüft.
• 1. Bestimmung der Zytotoxizitätsgrenze
• Für die Bestimmung der Zytotoxizitätsgrenze wurde die Grenze, die einer Lebensfähigkeit der Zellen von 90% entspricht, als akzeptable Grenze der Nicht-Zytotoxizität betrachtet.
• Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle II aufgeführt: TABELLE II

  Bezeichnung bzw. Nummer	Grenze der Zytotoxizität
  Limnocitrus littoralis	12.5 μg/ml
  I	12.5 μg/ml
  II	6.25 μg/ml
  III	3.125 μg/ml
  IV	80% Lebensfähigkeit bei 0.19 μg/ml
  V	70% Lebensfähigkeit bei 0.19 μg/ml

• Die Proben IV und V werden unter den eingesetzten Versuchsbedingungen als zytotoxisch angesehen.
• 2. Bestimmung der PGE2-Freisetzung
• Alle Extrakte wurden mit 3.125 μg/ml unter den unter II b) beschriebenen Bedingungen getestet, wobei für die Dosierung ein durch die Gesellschaft Cayman in den Handel gebrachter EIA-Kit (Nummer: 514010) verwendet wurde. Die aus den Spezies der Gattung Citrus IV und V erhaltenen Extrakte weisen ab dieser Dosis ein Zytotoxizitäts-Plateau auf.
• Die in der nachstehenden Tabelle aufgeführten Werte sind Prozentsätze der PGE₂-Freisetzung, die durch Vergleich zwischen der PGE₂-Freisetzungsaktivität einer gegebenen Probe und derjenigen einer Kontrolle ohne Effktor, deren PGE₂-Freisetzungsaktivität willkürlich auf 100% festgelegt ist, da sie der PGE₂-Freisetzungsgrundaktivität der Zellen entspricht, erhalten werden. TABELLE III

  	Limnocitrus littoralis	I	II	III	IV	V
  PGE2-Freisetzung	–52	–32,76	36,86	46,86	78,14	56,73
  Standardabweichung	12,59	14,96	15,86	20,22	36,90	9,16

• Dieses in nur 3 Punkten erzielte erste Ergebnis (daher ziemlich hohe Standardabweichungen) zeigt an, daß mit dem verwendeten Modell und unter den Betriebsbedingungen lediglich die Citrus maxima (I) unter allen anderen getesteten Spezies der Gattung Citrus eine negative PGE₂-Freisetzung von –32,76 gegenüber der Kontrolle aufweist, was in der Praxis eine PGE₂-Hemmaktivität zum Ausdruck bringt. Man stellt auch fest, daß diese Aktivität deutlich geringer ist als diejenige der Limnocitrus littoralis mit –52, d. h. eine weit höhere Fähigkeit zur Hemmung der PGE₂.
• IV. NACHWEIS DER „ANTI-AGING”-AKTIVITÄT
• 1. Prinzip und Ziel des Tests
• Die freien Radikale sind durch ihre direkte und indirekte Wirkung mittels ihrer proinflammatorischen Aktivität an der Beschleunigung der chronologischen Alterung der Haut beteiligt. Es wurde folglich ein Modell für oxidativen Streß durch UVA- und UVB-Strahlung gewählt, das ermöglicht, eine beschleunigte chronologische Alterung zu simulieren (Rittié et coll. UV-light-induced cascades and skin aging. Ageing Research Review 2002, 2: 705–720).
• Es wurde die Wirkung von erfindungsgemäßen Extrakten aus Limnocitrus littoralis auf die Kollagensynthese ausgewertet.
• 2. Versuchsmodell von am Leben gehaltener und einem oxidativen Streß ausgesetzter menschlicher Haut
• Es wurden Hautfragmente bei Frauen nach plastischer Chirurgie (8 unterschiedliche Spenderinnen) erhalten. Die Fragmente wurden in Inserts abgelegt, die selbst über Kulturlöchern aufgehängt angeordnet waren. In den Boden der Löcher wird Kulturmedium gegeben, wobei sich durch langsame Diffusion zwischen den zwei Fächern mittels einer porösen Membran (12 μm) ein Übergang vollzieht. Dieses Kulturmedium der Löcher wurde jeden dritten Tag erneuert.
• Es wurde ein Versuchsmodell für oxidativen Streß mittels einer Sitzung (bei J0) zur UVA-Bestrahlung (8 J/cm²) und zur UVB-Bestrahlung (16 J/cm²) entwickelt, um die Erzeugung freier Sauerstoffradikale zu bewirken. Anschließend wurde ein zu testender erfindungsgemäßer Limnocitrus littoralis-Extrakt einmal täglich auf die Oberfläche der Haut aufgetragen.
• Das Protokoll umfaßt folglich die nachfolgenden Bedingungen:
• – Kontrollhaut (ohne oxidativen Streß und unbehandelt)
• – Haut + oxidativer Streß (Kontrollhaut)
• – Haut + oxidativer Streß + zu testender erfindungsgemäßer
Limnocitrus littoralis-Extrakt
• Die Hautkulturen wurden anschließend bei J7 für die verschiedenen Analysen gestoppt.
• 3. Analyse der Wirkung eines Limnocitrus littoralis-Extraktes auf die Kollagensynthese
• Im Bereich der Lederhaut wird durch biochemische Dosierung des Kollagens die Wirkung eines Limnocitrus littoralis-Extraktes auf die Anregung des Stoffwechsels der Fibroblasten der Haut im Bereich der Kollagensynthese ausgewertet.
• Die Hautfragmente werden im Laufe einer Nacht bei +4°C in einer Pepsin enthaltenden, 0,5 molaren Essigsäurelösung enzymatisch gespalten. Diese Methode ermöglicht, das neu synthetisierte Kollagen zurückzugewinnen. Nach mechanischem Mahlen, beispielsweise mit Hilfe eines Potter, wird die Kollagenmenge (μg/ml) durch eine Methode zur spektrokolorimetrischen Dosierung bei 540 nm ausgewertet: Das säurelösliche Kollagen wird nach spezifischer Fixierung des Farbstoffs Sirius-Rot (Sircol Collagen Assay, Interchim) erfaßt.
• Um die verschiedenen Ergebnisse zu vergleichen, wird die Kollagenmenge auf die Gesamtproteinmenge der Probe bezogen. Die Dosierung der Proteinkonzentration erfolgt spektrophotometrisch bei 562 nm (BCA Assay, Pierce).
• Die Ergebnisse werden in μg Kollagen/mg Protein angegeben.
• 4. Statistische Anlaysen
• Es wurde eine Vergleichsuntersuchung der Ergebnisse zwischen den mit einem Limnocitrus littoralis-Extrakt behandelten Häuten und den unbehandelten, jedoch einem oxidativen Streß durch UV-Strahlung ausgesetzten Häuten durchgeführt, die folgendes zum Gegenstand hat:
• – Kontrollhaut
• – durch UVA- und UVB-Strahlung experimentell gealterte Haut (Kontrollhaut)
• – Haut + UVA/B + erfindungsgemäßer Limnocitrus littoralis-Extrakt
• Aus den an den 8 Häuten erzielten Ergebnissen wurde ein Mittelwert gebildet.
• Die statistische Analyse wurde durch den sogenannten Student-Test der reduzierten Abweichung oder Test der gepaarten Stichproben, mit einem Risiko von 5% durchgeführt.
• 5. Ergebnisse der biochemischen Dosierung des Kollagens
• Die in Tabelle IV aufgeführten Ergebnisse wurden mit Extrakt D erzielt. TABELLE IV Synthese des Kollagens (μg/mg Gesamtproteine):

  	μl/mg
  Kontrollhaut	114,5 ± 32,2
  Haut + UV	87,3 ± 22,3 * p = 0,02
  Haut + UV + Extrakt D	128,4 ± 52,6 # p = 0,04

  *: Im Vergleich zur Kontrollhaut statistisch signifikante Differenz (gepaarter Student-Test, p < 0,05)
  #: Im Vergleich zur UV-Kontrollhaut statistisch signifikante Differenz (gepaarter Student-Test, p < 0,05)
• Man stellt einerseits eine statistisch signifikante Verringerung der Kollagensynthese mit einer Rate von 87,3 μg/mg im Bereich der oxidativem Streß unterzogenen Haut im Vergleich zur Kontrollhaut fest, deren Rate bei 114,5 μg/mg (p = 0,02) liegt.
• Auf der anderen Seite stellt man fest, daß die Behandlung mit dem Extrakt D aus Limnocitrus littoralis ermöglichte, eine statistisch signifikante Anregung der Kollagensynthese mit einer Rate von 128,4 μg/mg versus 87,3 bei der Kontrollhaut (p = 0,04) zu erzielen.
• 6. Schlußfolgerung
• Mit Hilfe eines Modells einer am Leben erhaltenen und einem oxidativem Streß unterzogenen Haut, welches eine beschleunigte Hautalterung simulierte, wurde eine statistisch signifikante Anregung der Kollagensynthese nachgewiesen, wodurch eine Anti-Aging-Aktivität eines erfindungsgemäßen Limnocitrus littoralis-Extraktes bewiesen ist.
• V – ERFINDUNGSGEMÄßE FORMULIERUNGSBEISPIELE
• Es werden die nachstehend beschriebenen kosmetischen Zusammensetzungen mit topischer Anwendung aus den folgenden Zusammensetzungen in Gew.-% auf herkömmliche Weise hergestellt. Gel

  Entionisiertes Wasser	73,5%
  96,2 Vol.-% Alkohol	21%
  AMPS-Polymer (Sepigel 305)	3%
  Konservierungsmittel	0,3%
  Parfumkonzentrat	0,1%
  Extrakt D aus Limnocitrus littoralis	2%
  Natriumhyaluronat (hohes Molekulargewicht)	0,1%

  Körperemulsion

  Octylpalmitat	7,0%
  Triglyceride Glycerin-Caprylat-/Caprat	3,0%
  Octyloctanoat	2,0%
  Phenyltrimethicon	2,0%
  Glycerin	2,0%
  Stearinsäure	1,0%
  Sorbitanstearat	1,0%
  Cetylalkohol	0,5%
  Stearylalkohol	0,5%
  Extrakt E aus Limnocitrus littoralis	1%
  Konservierungsmittel, Parfum, Farbstoffe, Neutralisierungsmittel	0,1%
  Wasser	qs

  Lotion

  Butylenglykol	3%
  EDTA	0,1%
  Lösungsvermittler	1%
  Parfumkonzentrat	0,1%
  Alkohol	5,2%
  Extrakt A aus Limnocitrus littoralis	0,5%
  Benzophenon-4	0,13%
  Konservierungsmittel, Parfum, Farbstoffe, Neutralisierungsmittel	0,1%
  Wasser	qs

  Teintgrundierung

  Polyglyceryl-4 Isostearat/Cetyl-Dimethicon-Copolyol/Hexyllaurat
  (wird beispielsweise unter der Bezeichnung Abil WE 09 in den Handel
  gebracht)	5,1%
  Cyclopentasiloxan und Cyclohexasiloxan	5,0%
  (beispielsweise: Fluid DC345 von Dow Corning)
  Cetyl-Dimethicon (z. B. Abil wax 9840)	1,0%
  Caprylic/Capric Triglyceride	2,2%
  Octylstearat	1,4%
  Mineralöl	3,5%
  Hydriertes Rizinusöl	1,2%
  Bienenwachs	0,8%
  Polymethylmethacrylat	1,1%
  Eisenoxide	0,5%
  Titandioxid	5,2%
  Wasser	67,3%
  NaCl	0,6%
  Exrakt D aus Limnocitrus littoralis	2%
  Parfumkonzentrat	0,1%
  Octylmethoxycinnamat	3%

  Wasserfreie Teintgrundierung

  Mica	46,0%
  Titandioxid	22,4%
  Talkum	11,0%
  Extrakt D aus Limnocitrus littoralis	1,0%
  Wasserfreies Siliziumdioxid	5,0%
  Nylon-12	4,0%
  Octylmethoxycinnamat	2,0%
  Benzophenon-3	2,0%
  Stearinsäure	2,0%
  Magnesiumstearat	1,5%
  Farbstoffe und Pigmente (Eisenoxid)	2,5%
  Duftstoffe	0,3%
  Konservierungsmittel	0,3%

  beruhigendes Après-Sun-Gel

  Glycerin	5,0%
  Caprylic/Capric/Succinic Triglyceride	5,0%
  Octylmethoxycinnamat	1,0%
  Dimethiconcopolyole	0,5%
  Acrylate/C10-C30 Alkylacrylat Crosspolymer	0,5%
  Extrakt B aus Limnocitrus littoralis	3%
  N-Acetyl-Cystein	0,2%
  Konservierungsmittel, Parfum, Farbstoffe	0,1%
  Wasser	qs

  Sonnenschutzfluid

  Pentacylcomethicon	49,0%
  Titandioxid	15,0%
  Octylmethoxycinnamat	7,5%
  Glycerin	5,0%
  Phenyltrimethicon	5,0%
  Dimethiconcopolyole	3,0%
  Polymethylmethacrylat	2,5%
  Extrakt C aus Limnocitrus littoralis	5%
  Konservierungsmittel, Parfum, Farbstoffe, Neutralisierungsmittel	0,1%
  Wasser	qs

  Antifaltenpflegecreme

  Glycerylstearat + PEG 100 Stearat	6,0%
  Hydriertes Polyisobuten	3,0%
  Squalan	3,0%
  Triglyceride Glycerin-Caprylat-/Caprat	3,0%
  Glycerin	2,0%
  Octylmethoxycinnamat	2,0%
  Cetostearyl-Octanoat	1,5%
  Bienenwachs	1,5%
  Cetylalkohol	1,0%
  Stearylalkohol	1,0%
  Dimethicon	1,0%
  Xanthangummi	0,2%
  Extrakt E aus Limnocitrus littoralis	2%
  Konservierungsmittel, Parfum, Farbstoffe	0,2%
  Wasser	qs

Claims (20)

1. Kosmetische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff einen Limnocitrus littoralis-Extrakt, der mit Hilfe eines alkoholischen oder hydroalkoholischen Extraktionsmittels erhalten wird, in einem mit einer topischen Anwendung vereinbaren, kosmetisch akzeptablen Vehikel enthält.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt aus einem Luftteil der Limnocitrus littoralis erhalten wird.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt aus Blättern der Limnocitrus littoralis erhalten wird.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel aus der Gruppe bestehend aus C₁- bis C₅-Monoalkoholen und C₂- bis C₅-Glykolen ausgewählt ist.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel aus der Gruppe bestehend aus Ethanol, Butylenglykol sowie Ethanol-Wasser- und Butylenglykol-Wasser-Gemischen ausgewählt ist.
6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel Ethanol oder ein Ethanol-Wasser-Gemisch mit höchstens 50% Wasser, vorzugsweise höchstens 4% Wasser ist.
7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel Butylenglykol ist.
8. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der in dem Extraktionsmittel in Lösung befindliche Extrakt einem Fest-Flüssig-Trennschritt unterzogen worden ist, um den festen Teil zu entfernen.
9. Zusammensetzung nach irgendeinem einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt einem Entfärbungsschritt, insbesondere einem Entfärbungsschritt über Aktivkohle unterzogen wurde.
10. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie 10^–4% bis 5%, vorzugsweise 0,01% bis 2%, ausgedrückt in Gewicht Trockenextrakt bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, eines Extrakts aus Limnocitrus littoralis, insbesondere eines Extrakts aus Blättern enthält.
11. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem wenigstens ein Antioxidans, wie Alphatocopherol, Ascorbinsäure sowie deren kosmetisch akzeptable Derivate, insbesondere deren Ester enthält.
12. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form von Creme, Gel, Lotion, eines Sticks, Lidschminke oder Teintgrundierung vorliegt.
13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie in wasserfreier Form vorliegt und daß es sich insbesondere um eine Teintgrundierung, eine Lidschminke, einen Stick handelt.
14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt in Form einer Lösung in das Butylenglykol eingebracht wird, insbesondere in Form einer Lösung, die 0,05 bis 5 Gew.-%, besser 0,1 bis 1 Gew.-% des genannten Extrakts, ausgedrückt in Trockengewicht bezogen auf das Butylenglykol-Gewicht enthält.
15. Verwendung – in einer kosmetischen Zusammensetzung oder für die Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung – eines Extraktes, wie er in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 definiert ist, als Wirkstoff, welcher in der Lage ist, der kosmetischen Zusammensetzung kosmetische Eigenschaften zu verleihen, die ermöglichen, nicht pathologische Hauterscheinungen, nämlich diejenigen, die sensibler Haut zugeordnet sind, durch eine hautberuhigende Wirkung zu bekämpfen.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die kosmetische Zusammensetzung dazu bestimmt ist, nicht pathologische Hauterscheinungen, nämlich das Empfinden von Hitze oder Brennen, Rötungen, Ziehen, Juckreiz sowie Stechen oder Kribbeln zu lindern.
17. Verwendung – in einer kosmetischen Zusammensetzung oder für die Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung – eines Extrakts, wie er in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert ist, als die Kollagensynthese anregendes Mittel.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung dazu bestimmt ist, den Folgen der intrinsischen und/oder lichtinduzierten Alterung der Haut vorzubeugen und/oder diese zu bekämpfen.
19. Kosmetisches Behandlungsverfahren, das vor allem dazu bestimmt ist, nicht pathologische Hauterscheinungen entzündlichen Ursprungs zu lindern und/oder den Folgen der intrinsischen und/oder lichtinduzierten Alterung vorzubeugen und/oder diese zu bekämpfen, dadurch gekennzeichnet, daß es die Anwendung einer kosmetischen Zusammensetzung, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 14 definiert ist, auf der Haut umfaßt.
20. Kosmetisches Behandlungsverfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es für eine Antifaltenpflege bestimmt ist.