DE10215055A1

DE10215055A1 - Verwendung von Kaffeesäureestern zur Herstellung von kosmetischen nutrazeutischen sowie pharmazeutischen Präparaten und Arzneimitteln

Info

Publication number: DE10215055A1
Application number: DE10215055A
Authority: DE
Inventors: Matthias Hamburger
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2002-04-03
Filing date: 2002-04-03
Publication date: 2003-10-30

Abstract

Aufgabe war es, neue Wirkstoffe mit Radikalfängereigenschaften und/oder mit einer Hemmung von entzündlichen Prozessen und/oder mit einer Hemmung von präneoplastischen Läsionen anzugeben. DOLLAR A Überraschend wurde festgestellt, dass Kaffeesäureester von Triterpenen und Steroiden der allgemeinen Formel (I) DOLLAR F1, deren pharmazeutisch akzeptable Salze allein oder in Mischungen, eine solche, bisher nicht bekannte Wirkung zeigen. DOLLAR A Die Erfindung findet insbesondere Anwendung in der Medizin, Pharmazie und Kosmetikindustrie.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter Kaffeesäureester zur Herstellung von kosmetischen, nutrazeutischen sowie pharmazeutischen Präparaten und Arzneimitteln. Sauerstoff ist für die meisten Lebensprozesse essentiell, ist aber auf Grund der Bildung von hochreaktiven Sauerstoffspezies, z. B. Singulett-Sauerstoff, Wasserstoffperoxid, Hydroxyl- Radikal und weiteren Alkoxyl- und Peroxyl-Radikalen gleichzeitig potentiell schädigend. Reaktive Sauerstoffspezies verändern die Eigenschaften von Biomolekülen. Sie sind u. a. für den Verderb von Lebensmitteln und andern Produkten bei der Lagerung mitverantwortlich. Beispielsweise wird die Ranzigkeit und "Trocknung" von ungesättigten Fettsäuren in Fetten und fetten Ölen durch die Bildung von Hydroperoxiden und den sich daran anschließenden Abbau zu kürzerkettigen Aldehyden oder die radikalvermittelte Polymerisation durch Einwirkung von Luftsauerstoff bewirkt. Oxidative Prozesse greifen aber auch Biomoleküle in lebenden Zellen an, was zu Veränderungen von Struktur und Funktion der Zelle führt. Nach heutigem Wissensstand sind freie Radikale in die Entstehung von verschiedenen Erkrankungen impliziert, z. B. Krebs, Atherosklerose, entzündliche Prozesse, Asthma, Alzheimer und Parkinson'sche Krankheit (Potterat: Current Organic Chemistry 1, 1997, 415-440; Olanow: Trends in Neuroscience 16, 1993, 439-444; Butterfield: Alzheimer's Disease Review 1, 1996, 68-70; Marciniak und Petty: Drugs of the Future 21, 1996, 1037-1046).
Substanzen mit Antioxidans- und Radikalfängereigenschaften können deshalb als Stabilisatoren für Lebensmittel und andere Produkte sowie zur Vorbeugung oder Behandlung von radikalvermittelten pathologischen Prozessen eingesetzt werden. Verbindungen natürlicher Herkunft, die z. B. aus Arznei- und Nahrungspflanzen gewonnen werden können, sind dazu besonders geeignet. Viele pflanzliche Antioxidanzien sind polare Polyphenole, wie Flavonoide und Catechine. Diese sind auf Grund ihrer physikochemischen Eigenschaften nicht geeignet zur Stabilisierung lipophiler Produkte. Zudem ist ihre orale Bioverfügbarkeit gering, weshalb sich diese polaren Polyphenole nur begrenzt für systemische Anwendungen eignen.
Für präventive oder therapeutische Anwendungen werden deshalb lipophile Antioxidanzien bevorzugt (Lim et al., Journal of Neuroscience 21, 2001, 8370-8377; Marciniak und Petty, Drugs of the Future 21, 1996, 1037-1046; Gilgun-Sherki et al., Neuropharmacology 40, 2000, 959-975). Als lipophile Antioxidanzien natürlicher Herkunft sind die Carotinoide und Tocopherole von Bedeutung, da sie in verschiedenen Nahrungsmitteln vorkommen. Nachteilig dabei ist jedoch, dass sie auf Grund ihres Provitamin- resp. Vitamincharakters weitere pharmakologische und physiologische Wirkungen besitzen. Ihre Anwendung in höherer Dosierung über einen längeren Zeitraum ist deshalb nicht möglich, weil die langsame Elimination dieser lipophilen Verbindungen zu Hypervitaminosen führen kann. Andererseits sind eine Reihe von lipophilen Antioxidanzien synthetischer Herkunft beschrieben worden. Ausgewählte Verbindungen befinden sich in unterschiedlichen Phasen der Wirkstoffentwicklung (z. B. Graul und Castaner, Drugs of the Future 21, 1996, 1014-1016; Huh et al., European Journal of Pharmacology 389, 2000, 79-88; Civenni et al., European Journal of Pharmacology 370, 1999, 161-167; Noguchi und Niki, Free Radical Biology & Medicine 28, 2000, 1538-1546; Marciniak und Petty, Drugs of the Future 21, 1996, 1037-1046). Das Nutzen/Risiko-Verhältnis dieser synthetischen Verbindungen lässt sich aber derzeit noch nicht einschätzen. Da aber Antioxidanzien vorab in krankheitsvorbeugender Weise eingesetzt werden sollen, ist die Unbedenklichkeit einer Verbindung in der Langzeitanwendung von zentraler Bedeutung. Für die in Entwicklung befindlichen synthetischen Verbindungen liegen dazu noch keine Untersuchungen vor.
Wie bereits erwähnt, sind reaktive Sauerstoffspezies in eine Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen impliziert (Finkel und Holbrook, Nature 408, 2000, 239-247), so zum Beispiel in entzündlichen Prozessen und in der Entstehung von malignen Tumoren. Bei einer Entzündung werden Granulozyten und Makrophagen zur Freisetzung von aktiven Sauerstoffspezies stimuliert, die zur Zerstörung der Gewebematrix beitragen. Schlüsselenzyme der Arachidonsäurekaskade wie die Cyclooxygenasen generieren neben proinflammatorischen Eicosanoiden auch freie Radikale (Mutschler, Arzneimittelwirkungen - Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie, 8. Aufl., Stuttgart 2001). Reaktive Sauerstoffspezies können zu DNA-Schäden führen (Troll et al., in Food Phytochemicals for Cancer Prevention (Huang et al. Hrsg.), Washington, 1994, 116-121), und proinflammatorische Eicosanoide stimulieren das Wachstum von Tumorzellen und unterdrücken die Immunabwehr. Zusätzlich können Cyclooxygenasen carcinogene Verbindungen aktivieren und auf diese Weise das genetische Material schädigen (Jang et al., Science 275, 1997, 218-220).
Epidemiologische Studien, und eine Vielzahl von in vitro und in vivo Untersuchungen, haben nun gezeigt, dass zum Beispiel nicht-steroidale Entzündungshemmer (NSAIDs) die Häufigkeit von präkanzerogenen Läsionen und die Entstehung von Tumoren herabsetzen (Vane et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 38, 1998, 97-120). NSAIDs entfalten ihre klinische Wirkung über eine Hemmung der Cyclooxygenasen. Eine Langzeitanwendung dieser Verbindungen ist aber von z. T. gefährlichen Nebenwirkungen begleitet, wie Ulzerazionen der Magenschleimhaut, Nierenfunktionsstörungen, Hemmung der Thrombozytenaggregation (Mutschier, Arzneimittelwirkungen - Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie, 8. Aufl., Stuttgart 2001), so dass sie sich nicht zur Daueranwendung und zu einer präventiven Verabreichung eignen.
Andererseits weisen epidemiologische Erhebungen zu Ernährungsgewohnheiten und eine wachsende Zahl an in vitro und in vivo Studien auf chemopräventive Eigenschaften von pflanzlichen Sekundärstoffen in Nahrungs-, Gewürz- und Arzneipflanzen hin (Ren und Lien, Progress in Drug Research, 48, 1997, 147-171; Johns und Chapman, in Phytochemistry of Medicinal Plants (Arnason et al., Hrsg.), New York, 1995, 161-188; Hahn, Nahrungsergänzungsmittel, Stuttgart, 2001, 193-200).
Auch entzündungshemmende Inhaltsstoffe in Arzneipflanzen sind bekannt. Viele der in dieser Richtung untersuchten Pflanzenstoffe sind polare Polyphenole mit schlechter Bioverfügbarkeit, oder aber sie weisen aus dem Spektrum von Antioxidans-, chemopräventiver und entzündungshemmender Wirkung nur eine oder zwei Wirkrichtungen in einer relevanten Potenz auf.
Oenothera biennis (Nachtkerze), aus der ein bevorzugter Extrakt der eben genannten Art erhalten werden kann, ist eine bekannte Pflanze, deren Samenöl als Nahrungsergänzungsmittel und zur Herstellung von Kosmetika verwendet wird. Das fette Öl enthält Triglyceride mit einem hohen Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere Linolsäure (18:2n-6) und γ-Linolensäure (18:3n-6), daneben Ölsäure, Palmitin- und Stearinsäure. In den andern Pflanzenteilen kommen verschiedene phenolische Inhaltsstoffe, wie Flavonoide und Procyanidine, vor (Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, 5. Auflage, Band 5, 929-936).
Die Gewinnung des fetten Öles ist seit langem bekannt. Die Öle werden nach der Pressung oder Lösungsmittelextraktion üblicherweise nachbehandelt zur Neutralisierung von freien Fettsäuren, zur Desodorierung und Entfärbung. Diesen Produkten müssen zur Stabilisierung fettlösliche Antioxidanzien wie Tocopherole, Ascorbinpalmitat und dergleichen zugesetzt werden.
Zur Wirkung von Nachtkerzenöl liegen eine Vielzahl von Untersuchungen in vitro und in vivo sowie eine Reihe von klinischen Studien beim Menschen vor (Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, 5. Auflage, Band 5, 929-936; P. F. Morse et al., British Journal of Dermatology 121, 1989, 75-90; Belch und Hill, American Journal of Clinical Nutrition 71, 2000, Supplement 352-356). Sie belegen eine Verbesserung der Symptomatik und des Entzündungsbildes bei atopischer Dermatitis, Neurodermitis, bei diabetischer Neuropathie, sowie eine Normalisierung eines erhöhtes Blutdruckes. Die Wirkung des Nachtkerzenöls wird dabei dem hohen Gehalt an γ-Linolensäure zugeschrieben. Diese Fettsäure dient im Organismus als Vorstufe zur Bildung der Arachidonsäure und höherer mehrfach ungesättigter Fettsäuren, die in verschiedene Körperlipide eingebaut werden. Gleichzeitig sind sie notwendig für die Bildung von physiologisch wichtigen Mediatoren der Eicosanoidreihe, wie gewisse Prostaglandine, Prostacycline und Thromboxane.
Eine Vielzahl von Schriften beziehen sich auf die oben beschriebenen Fettsäuren und ihre Wirkungen: GB 1 082 624 beschreibt die Verwendung von Nachtkerzenöl zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen. In FR 2 770 975 wird die Verwendung von Nahrungsmittelzusätzen, darunter Nachtkerzenöl, zur Erleichterung von Menstrual- und Prostatabeschwerden erwähnt. Zu kosmetischen und dermatologischen Anwendungen beschreibt FR 2 606 279 die antioxidativen Eigenschaften von topischen Zubereitungen mit Nachtkerzenöl und weiteren Wirkstoffen.
Auch in anderen Schriften werden Kombinationen von Nachtkerzenöl mit weiteren Wirkstoffen beschrieben. So beschreibt z. B. WO 99 53 907 eine Kombination von Nachtkerzenöl, Vitamin E und Vitaminen des B-Komplexes zur Behandlung von Psoriasis. In US 6,274,176 wird ein Gemisch von 7 Arznei- und Gewürzpflanzen als entzündungshemmendes Mittel und zur Erleichterung von Arthritis und Gicht erwähnt. DE 38 21 922 beschreibt ein Gemisch von verschiedenen Pflanzensäften und -ölen, darunter Nachtkerzenöl, zur Behandlung von Leukämien, Osteoporose, perniziöser Anämie und weiterer Krankheiten. In allen Fällen lassen sich die erwähnten Wirkungen aber nicht einzelnen Bestandteilen zuordnen.
Öle mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind wenig haltbar und unterliegen einer Reihe bekannter Reaktionen in Gegenwart von Luftsauerstoff. Dies trifft auch für das raffinierte, fette Öl von Oenothera biennis zu. Zur Stabilisierung werden deshalb den Handelsprodukten lipophile Antioxidanzien wie Tocopherole zugesetzt. Verschiedene Schriften beschreiben die Stabilisierung und Qualitätsverbesserung von Nachtkerzenöl durch Antioxidanzien. In CN 1,053,930 wird z. B. das Öl mit Tannin behandelt und damit der Peroxidgehalt erniedrigt.
WO 00 18 416 beschreibt polare Extrakte mit antioxidativen Eigenschaften aus Nachtkerzen-Arten, die vornehmlich Gerbstoffe wie Pentagalloylglucose enthalten. Aus den Nachtkerzensamen und dem nach der Ölgewinnung verbleibenden Filterkuchen werden polare Extrakte mit hohen Radikalfängereigenschaften erhalten (Wettasinghe und Shahdidi, Journal of Agricultural and Food Chemistry 47, 1999, 1801-1812; Birch et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 49, 1999, 1801-1812).

Es ist Aufgabe der Erfindung, neue Wirkstoffe mit Radikalfängereigenschaften und/oder mit einer Hemmung von entzündlichen Prozessen und/oder mit einer Hemmung von präneoplastischen Läsionen anzugeben, welche die genannten Nachteile nicht aufweisen.

Es wurde überraschend gefunden, dass natürlich vorkommende, aber auch synthetisch zugängliche Kaffeesäureester der allgemeinen Formel (I) von Triterpenen und Steroiden

deren pharmazeutisch akzeptable Salze bzw. Mischungen, welche Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) oder deren pharmazeutisch akzeptable Salze enthalten, mit einem der in den Unteransprüchen 2 bis 18 genannten Rest R die in der Aufgabe zur Erfindung beschriebene sowie für diese Verbindungen (I) bisher nicht bekannten Wirkungen entfalten und sich damit sehr zur Herstellung von kosmetischen, nutrazeutischen und pharmazeutischen Präparaten und Arzneimitteln mit Radikalfängereigenschaften und/oder mit einer Hemmung von entzündlichen Prozessen und/oder mit einer Hemmung von präneoplastischen Läsionen eignen. Beispiele hierzu sind in den Unteransprüchen 19 bis 24 angeführt.

Spezielle Untersuchungen haben ergeben, dass Verbindungen vorgenannter Art eine entzündungshemmende Wirkung am TPA-induzierten Mäuseohrödem aufweisen und eine starke Hemmung der Prostaglandin-Synthese in HEL-Zellen bewirken. Es konnte dabei gezeigt werden, dass diese Verbindungen eine ausgeprägte Hemmwirkung auf die Cyclooxygenase-1 (COX-1) ausüben. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass solche Verbindungen in einem Organkultur-System tumorpräventive Eigenschaften besitzen.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), deren pharmazeutisch akzeptable Salze bzw. Mischungen können mit den zur Herstellung von flüssigen, halbfesten oder festen Zubereitungen üblichen Adjuvantien, Streckmitteln, Trägern, Tablettierungshilfsmitteln, Aromastoffen und weiteren Wirkstoffen in an sich bekannter Weise verarbeitet werden. Typische Dosierungen werden im Bereich von 1-100 mg/Tag liegen, doch ist die Obergrenze voraussichtlich nicht kritisch, da bisher in den relevanten Bereichen keine Toxizität für Warmblütler festgestellt werden konnte.

Bevorzugte Stoffmischungen zur erfindungsgemäßen Verwendung sind Extrakte und fette Öle, insbesondere aus Oenothera biennis, die mindestens einen Wirkstoff der Formel (I) enthalten und bisher für Oenothera biennis unbekannte lipophile Verbindungen mit Radikalfängereigenschaften und/oder mit einer Hemmwirkung von entzündlichen Prozessen und/oder mit einer Hemmwirkung von präneoplastischen Läsionen darstellen. Derartige Produkte können bereits als solche, d. h. ohne Isolation von Wirkstoff, und lediglich nach Wirkstoffkontrolle durch Abpacken in die Form der entsprechenden Produkte gebracht werden.

Extrakte von Oenothera biennis und anderen, mindestens einen der Wirkstoffe der Formel (I) enthaltenden Pflanzen sind vorteilhaft nach an sich bekannten Extraktionsmethoden erhältlich. Dabei wird insbesondere die Kaltpressung bevorzugt. In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Gewinnung durch Hochdruckextraktion mit flüssigen (unterkritischen) oder überkritischen Gasen, z. B. Niederalkanen, wie z. B. Propan, Butan, oder (bevorzugt) CO₂ in reinem Zustand oder in Mischung mit unter Normalbedingungen flüssigen organischen Lösungsmitteln.

Allgemein können erfindungsgemäß verwendbare Extrakte mit Hilfe von Lösungsmitteln bzw. Lösungsmittelgemischen erhalten werden, die in der Lage sind, lipophile bis mäßig polare Inhaltsstoffe des zu extrahierenden Pflanzenmaterials, wie insbesondere Oenothera biennis, zu extrahieren. Außer der genannten Hochdruckextraktion kann auch mit normalerweise flüssigen Lösungsmitteln, z. B. Alkoholen, wie Ethanol, Ketonen, z. B. Aceton, Halogenkohlenwasserstoffen, wie Dichlormethan, und Petrolether, extrahiert werden.

In einer Ausführungsform werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) aus den gewonnenen Extrakten durch weitere Trennschritte aufgereinigt. Es hat sich gezeigt, dass sich dies durch Flüssig-Flüssig-Extraktion bewerkstelligen lässt. Beispielsweise kann das kaltgepresste oder durch Extraktion gewonnene Öl durch nicht mischbare Lösungsmittel oder geeignete Lösungsmittelgemische ausgezogen werden. Dies ist mit Ethanol, Acetonitril, Aceton und Essigester sowie in wässerigen Mischungen dieser Lösungsmittel möglich. In einer weiteren Ausführungsform wird das erhaltene Produkt durch einen weiteren Flüssig-Flüssig-Extraktionsschritt weiter aufgereinigt, was mit Kombinationen von miteinander nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie Kohlenwasserstoffen und Alkoholen, Kohlenwasserstoffen und wässerigen Alkoholen, Kohlenwasserstoffen und wässerigen Ketonen erreicht werden kann.

Ein besagter Extrakt aus Oenothera biennis wird in der Regel aus den Samen und Früchten gewonnen, kann aber auch aus andern Pflanzenteilen erhalten werden. Solche Extrakte enthalten neben den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) noch eine Vielzahl unterschiedlicher chemischer Stoffe, insbesondere Triglyceride, Flavonoide, Procyanidine, Glycoside und organische Säuren.

Erfindungsgemäß kann sowohl der bereits erwähnte, praktisch nicht nachbehandelte und z. B. lediglich kontrollierte sowie abgepackte Gesamtextrakt verwendet werden, als auch ein solcher, der beispielsweise durch Wahl des Extraktionsmittels und/oder der Nachbehandlung bezüglich der normalerweise im Extrakt enthaltenen Komponenten angereichert oder abgereichert worden ist. Des Weiteren kann die Verwendung sowohl in flüssiger als auch in halbfester oder in fester Form sowie mit oder ohne die üblichen Adjuvantien, fetten Ölen, Tablettierungshilfsmittel, Löslichkeitsvermittler, Konservierungsmittel, Geschmacksstoffe und andere Zusatzstoffe erfolgen, wie sie der Fachwelt zur Herstellung von medizinisch verwendeten Pflanzenextrakten bekannt sind.

Untersuchungen haben ergeben, dass Extrakte von Oenothera biennis, die durch Pressung oder durch Extraktions- und Reinigungsverfahren der oben genannten Art erhalten worden sind, eine signifikante antioxidative, entzündungshemmende und chemopräventive Wirkung besitzen.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von den Schutzumfang nicht beschränkenden Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Es zeigen:

Fig. 1 HPLC-Chromatogramm eines in Beispiel 4 erhaltenen Extraktes

Fig. 2-4 DAD-UV Spektren von Peak 1, 2 und 3 des in Fig. 1 dargestellten HPLC-Chromatogramms

Fig. 5-7 Electrospray-Massenspektren von Peak 1, 2 und 3 des in Fig. 1 gezeigten HPLC-Chromatogramms

Beispiel 1

Jeweils 1 kg frischer Samen oder Früchte von Oenothera biennis wurden grob zerstoßen und anschließend durch mechanische Pressung bei Raumtemperatur ein leicht trübes, gelblich-grünes Öl erhalten. Die Ausbeute betrug 215 g bei den Samen und 143 g bei den Früchten.

Beispiel 2

100 g frischer Samen von Oenothera biennis wurde mit 800 ml Aceton oder Chloroform in einem Labormixer unter Zerkleinerung bei Raumtemperatur während 10 Minuten extrahiert. Nach Entfernung des Extraktionsmittels wurde ein dickflüssiger, öliger Extrakt (25 g respektive 23 g) erhalten.

Beispiel 3

100 g frischer Samen von Oenothera biennis wurden grob zerstoßen und mit CO₂ bei 40°C und 500 bar während 4 Stunden extrahiert. Es wurden 21 g eines öligen Extraktes erhalten.

Beispiel 4

343 g des unter Beispiel 1 erhaltenen Öles wurden in einem Scheidetrichter mit jeweils 4 × 200 ml wässerigem Ethanol (80%) ausgezogen. Der vereinigte ethanolisch-wässerige Extrakt wurde in einem Scheidetrichter mit 3 × 200 ml Petrolether ausgeschüttelt, und die ethanolische Phase zur Trockene eingeengt. Es wurden 1850 mg eines leicht gefärbten, festen Rückstandes erhalten.

Beispiel 5

500 g des unter Beispiel 1 erhaltenen Öles wurden in einer Apparatur zur Flüssig-Flüssig- Gegenstrom-Verteilung nach dem "Mixer-Settler"-Prinzip gegen wässeriges Ethanol (80%) (1200 ml) verteilt. Die wässerig-ethanolische Phase wurde anschliessend nach demselben Prinzip gegen Petrolether (500 ml) verteilt. Die wässerig-ethanolische Phase wurde zur Trockene eingeengt. Dabei wurde ein leicht gefärbter, fester Rückstand (1120 mg) erhalten.

Beispiel 6

Die Extrakte wurden jeweils durch ihre Chromatogramme charakterisiert, die mit Hilfe der Dünnschicht- und der Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) aufgenommen wurden. Hierzu wurde eine binäre Hochdruckgradienten-Anlage (Agilent 1100) mit Diodenarray- Detektor, Probengeber und Säulenofen verwendet. Die HPLC-Anlage war zusätzlich an ein PE SCIEX API 165 Massenspektrometer mit Electrospray Ionisierung gekoppelt. Die Trennbedingungen waren wie folgt:
Trennsäule: Hypersil ODS Säule (4.6 × 250 mm; 5 µm mittlere Partikelgrösse)
Elutionsmittel: Acetonitril (mit 2% Essigsäure); Wasser (mit 2% Essigsäure)
Gradientenprogramm: t = 0 min: 0% Acetonitril, 100% Wasser
t = 30 min: 100% Acetonitril, 0% Wasser
t = 45 min: 100% Acetonitril, 0% Wasser
Flussrate: 1.0 ml/min
Detektion: UV bei 330 nm; DAD 190-500 nm; Electrospray im negativen Ionisierungsmodus, Aufnahme des Massebereichs m/z 200-1500.

Es sind das HPLC-Chromatogramm des Extraktes von Beispiel 4 in Fig. 1, die dazu gehörenden DAD-UV-Spektren von Peak 1, 2 und 3 in Fig. 2-4 und die Electrospray- Massenspektren von Peak 1, 2 und 3 in Fig. 5-7 gezeigt.

Beispiel 7

Der unter Beispiel 4 erhaltene Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel aufgereinigt. Dabei wurde die Säule mit Chloroform/Methanol (90 : 10) eluiert. Mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie und Detektion mittels DPPH-Sprühreagens wurden die Fraktionen mit Radikalfängereigenschaften vereinigt. Dabei wurden 130 mg eines Rückstandes erhalten, der mittels HPLC aufgetrennt wurde. Die Bedingungen waren wie folgt:
Trennsäule: Hypersil ODS Säule (4.6 × 250 mm; 5 µm mittlere Partikelgrösse)
Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser 98 : 2
Flussrate: 0.75 ml/min; Detektion bei 360 nm

Unter Anwendung der beschriebenen Methode wurden die in den Unteransprüchen 2 bis 4 aufgeführten Verbindungen gemäß den Formeln (II), (III) und (IV) entsprechend den Peaks 1, 2 und 3 im HPLC-Chromatogramm (Fig. 1), in chromatographisch reiner Form erhalten.

Beispiel 8

Die in den Unteransprüchen 2 bis 4 aufgeführten Verbindungen gemäß den Formeln (1I), (III) und (IV) wurden mittels spektroskopischer und weiterer physiko-chemischer und chemischer Methoden charakterisiert.

Saure Hydrolyse wurde mit je 1 mg der Verbindungen gemäß den Formeln (II), (III) und (IV) durchgeführt. Die Verbindung wurde jeweils in 1 ml Methanol gelöst, mit 5 ml wässeriger Trifluoressigsäure (1.0 N) und 10 mg Ascorbinsäure versetzt und unter Stickstoff 1 Stunde bei Raumtemperatur auf 100°C erhitzt. Anschließend wurde das Methanol unter reduziertem Druck abrotiert, die Lösung mit Ethylacetat extrahiert. Kaffeesäure wurde mittels DC auf Kieselgel GF254, mit dem Laufmittel Toluol/Dioxan/Methanol/Essigsäure 90 : 25 : 5 : 4 gegen eine Referenzprobe von Kaffeesäure chromatographiert. Detektion bei UV 254, 366 nm und nach Besprühen mit Naturstoff- Reagens. Die Triterpensäuren wurden auf Kieselgel GF254, mit dem Laufmittel Toluol/Ethylacetat/Methanol 76 : 19 : 5 gegen Referenzproben von Betulinsäure, Oleanolsäure und Morolsäure chromatographiert. Detektion mit Godin Reagens, 105°C, 3 Minuten.

Die Verbindung gemäß Formel (II) wurde als 3-O-Kaffesäureester der Betulinsäure identifiziert. Die Verbindung ist bereits u. a. aus Celastrus stephanotifolius isoliert worden (Chen et al., Phytochemistry 51, 1999, 683-687). UV λ_max MeOH: nm 245, 293, 324. ESIMS (negative Ionisierung): m/z 617 [M-H]^-. ¹H NMR: δ7.01 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-2'), 6.75 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-5'), 6.90 (1H, dd, J = 8.3, 1.6 Hz, H-6'), 7.51 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7'), 6.23 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8'). δ38.4 (C-1), 23.8 (C-2), 81.2 (C-3), 38.1 (C- 4), 55.4 (C-5), 18.2 (C-6), 34.2 (C-7), 40.7 (C-8), 50.4 (C-9), 37.1 (C-10), 20.9 (C-11), 25.4 (C-12), 38.4 (C-13), 42.3 (C-14), 29.7 (C-15), 32.1 (C-16), 56.3 (C-17), 49.3 (C-18), 46.9 (C-19), 150.3 (C-20), 30.6 (C-21), 37.1 (C-22), 28.0 (C-23), 16.0 (C-24), 16.6 (C-25), 16.2 (C-26), 14.7 (C-27), 180.8 (C-28), 109.8 (C-29), 19.3 (C-30), 127.0 (C-1'), 113.8 (C- 2'), 144.6 (C-3'), 147.1 (C-4'), 115.1 (C-5'), 122.2 (C-6'), 144.8 (C-7'), 115.5 (C-8'), 167.7 (C-9').

Die Verbindung gemäß Formel (III) ist der 3-O-Kaffeesäureester der Morolsäure. Diese Verbindung ist bisher noch nicht beschrieben worden. UV λ_max MeOH: nm 245, 294, 325. ESIMS (negative Ionisierung): m/z 617 [M-H]^-. ¹H NMR: 1.04 (1H, H-1a), 1.77 (1H, H- 1b), 1.68 (2H, m, H-2), 4.55 (1H, dd, J = 6.2, 11.1 Hz, H-3), 0.87 (H-5), 1.38 (H-6a), 1.52 (H-6b), 1.35 (H-7a), 1.42 (H-7b), 1.35 (H-9), 1.58 (H-11), 1.58 (H-12), 2.2.5 (H-13), 1.21 (H-15a), 1.65 (H-15b), 1.58 (H-16), 5.10 (H-19), 1.90 (H-21a), 2.10 (H-21b), 0.87 (H-23), 0.93 (H-24), 1.02 (H-25), 0.93 (H-26), 0.81 (H-27), 0.95 (H-29), 0.92 (H-30), 7.00 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2'), 6.75 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5'), 6.91 (1H, dd, J = 8.2, 1.9 Hz, H-6'), 7.51 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7'), 6.21 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8'). ¹³C NMR: δ38.4 (C-1), 23.5 (C-2), 80.9 (C-3), 37.7 (C-4), 55.7 (C-5), 17.8 (C-6), 34.3 (C-7), 40.5 (C-8), 51.1 (C-9), 37.0 (C-10), 20.8 (C-11), 25.7 (C-12), 41.1 (C-13), 42.3 (C-14), 29.2 (C-15), 33.2 (C-16), 48.2 (C-17), 137.5 (C-18), 132.1 (C-19), 31.6 (C-20), 33.2 (C-21), 33.3 (C-22), 27.1 (C- 23), 15.9 (C-24), 15.2 (C-25), 15.8 (C-26), 14.1 (C-27), 179.1 (C-28), 29.4 (C-29), 28.1 (C-30), 126.3 (C-1'), 113.7 (C-2'), 145.4 (C-3'), 148.1 (C-4'), 115.1 (C-5'), 121.5 (C-6'), 145.2 (C-7'), 114.2 (C-8), 167.8 (C-9').

Die Verbindung gemäß Formel (IV) wurde als 3-O-Kaffeesäureester der Oleanolsäure identifiziert. Diese Verbindung ist bereits früher von Odinokova et al. (Khimia Prirodni Soedini., 1985, 270) aus der Rinde von Betula dahurica isoliert worden. UV λ_max MeOH: nm 245, 295, 325. ESIMS (neg. ion mode): m/z 617 [M-H]^-. ¹H NMR: δ7.00 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2'), 6.75 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5'), 6.90 (1H, dd, J = 8.2, 1.9 Hz, H-6'), 7.51 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7'), 6.23 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8'). ¹³C NMR: δ38.1 (C-1), 25.8 (C-2), 80.9 (C-3), 37.9 (C-4), 55.3 (C-5), 18.2 (C-6), 32.6 (C-7), 39.2 (C-8), 47.5 (C-9), 36.9 (C-10), 23.4 (C-11), 122.2 (C-12), 144.8 (C-13),41.7 (C-14), 27.6 (C-15), 23.6 (C- 16), 46.3 (C-17), 41.2 (C-18), 45.9 (C-19), 30, 6 (C-20), 33.8 (C-21), 32.5 (C-22), 28.0 (C- 23), 16.6 (C-24), 15.3 (C-25), 16.8 (C-26), 25.8 (C-27), 180.6 (C-28), 33.0 (C-29), 23.5 (C-30), 127.0 (C-1'), 113.8 (C-2'), 144.6 (C-3'), 147.1 C-4'), 115.1 (C-5'), 122.2 (C-6'), 144.8 (C-7'), 115.5 (C-8'), 167.7 (C-9').

Für keine der genannten Verbindungen sind bisher antioxidative, entzündungshemmende und chemopräventive Wirkungen bekannt geworden.

Beispiel 8

Ester der Kaffeesäure sind nach bekannten Methoden synthetisch zugänglich, zweckmäßig durch Umsetzung der entsprechenden Triterpene und Steroide mit dem an der o-Dihydroxy-Gruppierung geeignet geschützten Kaffeesäurechlorid, mit anschließender Entfernung der Schutzgruppe (siehe z. B. Furniss B. S. et al., Practical Organic Chemistry 5. Auflage, 1989; March J., Advanced Organic Chemistry, 3. Auflage, 1985). Eine andere Herstellungsmethode ist die Umsetzung von Kaffeesäure mit dem entsprechenden Triterpen unter Verwendung von Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphat (BOP) oder ähnlicher Reagenzien als Kupplungsreagens (siehe z. B. Li und Xu, Journal of Organic Chemistry 65, 2000, 2951-2958; Son und Lewis, Journal of Agricultural and Food Chemistry 50, 2002, 468-472).

Beispiel 9

Unter Anwendung des oben beschriebenen Syntheseweges wurden u. a. folgende Triterpenester synthetisiert:

Beispiel 10 a.) Nachweis der Radikalfängereigenschaften auf dem Dünnschichtchromatogramm (DC)

Methanolische Lösungen der aufgereinigten Extrakte (jeweils 10 mg/ml) aus Beispielen 4 und 5, sowie die Verbindungen gemäß den Formeln (II), (III) und (IV) mit jeweils 1 mg/ml aus Beispiel 6 wurden auf eine Kieselgel DC-Platte aufgetragen und aufgetrennt.
Kieselgel: GF254
Laufmittel: Chloroform/Methanol 90 : 10
Laufstrecke: 9 cm
Detektion: UV 254 nm, 366 nm; Besprühen mit Godin Reagens und anschließendes Erhitzen der Platte auf 105°C während 3 Minuten. Parallel dazu wurde ein identisches Chromatogramm mit einer DPPH-Lösung (1 mg/ml in Ethanol gelöst) besprüht. Substanzen mit Radikalingereigenschaften erschienen als gelbliche Zonen vor einem rotvioletten Hintergrund.
Auswertung: Die in Beispiel 4 und 5 erhaltenen Proben zeigten bei Rf 0.35 unter UV 254 nm eine fluoreszenzlöschende Zone, die unter UV 366 eine blaue Fluoreszenz aufwies. Nach dem Besprühen mit DPPH-Reagens erschien diese Zone gelblich gefärbt.

b.) Nachweis der Radikalfängereigenschaften in Lösung

Die gemäß den Beispielen 4, 5 und 6 erhaltenen Substanzen wurden anhand des DPPH- Radikals auf ihre Radikalfänger-Eigenschaften in Lösung geprüft. Im Wesentlichen erfolgte der Test nach der Vorschrift von Fujita et al. (Yakugaku Zasshi, 108, 1988, 129-135). Stammlösungen von Testsubstanzen wurden mit einer ethanolischen DPPH-Lösung (300 µM) in Mikrotiterplatten während 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Absorption bei 515 nm bestimmt.

Probe	IC₅₀ [µg/ml]
Rückstand gemäss Beispiel 4	7.9
Rückstand gemäss Beispiel 5	5.4
Verbindung gemäß Formel (II)	3.5
Verbindung gemäß Formel (III)	3.9
Verbindung gemäß Formel (IV)	3.1
Verbindung gemäß Formel (VIII)	2.9
Verbindung gemäß Formel (XIII)	4.1
Verbindung gemäß Formel (XIV)	5.2

Beispiel 11 Entzündungshemmende Wirkung

Die gemäß den Beispielen 4, 5 und 6 erhaltenen Substanzen wurden auf ihre entzündungshemmende Wirkung beim TPA-induzierten Oedem am Mäuseohr nach der von Stanley et al. (Skin Pharmacology, 4, 1991, 262-271), beschriebenen Methode geprüft. Dabei wurde die Hemmung des durch 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) induzierten Oedems bestimmt.

Eine Lösung von TPA in Aceton wurde an 4 Tagen einmal pro Tag auf ein Ohr (2.5 µg TPA/Ohr) von weiblichen Swiss Mäusen aufgetragen. Die in Aceton gelöste Prüfsubstanz wurde sofort danach und 6 Stunden später auf dasselbe Ohr (0.5 mg/Ohr) aufgetragen. Dexamethason (50 µg/Ohr) diente als Vergleichssubstanz, Aceton als Kontrolle. Die Tiere wurden getötet und das Gewicht der Ohren bestimmt. Die entzündungshemmende Wirkung wurde als Hemmung der Oedembildung im Vergleich zu Kontrolle und Vergleichssubstanz errechnet.

Probe	Hemmung [%]
Rückstand gemäss Beispiel 4	34
Rückstand gemäss Beispiel 5	42
Verbindung gemäß Formel (II)	38
Verbindung gemäß Formel (III)	46
Verbindung gemäß Formel (IV)	37
Verbindung gemäß Formel (VIII)	32
Verbindung gemäß Formel (XIII)	19
Verbindung gemäß Formel (XIV)	23
Dexamethason	74

Beispiel 12 Hemmung der Cyclooxygenase 1

Die Hemmung der Cyclooxygenase 1 wurde mit Hilfe der HEL-Zelllinie bestimmt nach der von Berg et al (Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 37, 1997, 179-86), beschriebenen Methode bestimmt.

HEL-Zellen wurden in RPMI 1640 Medium mit 10% fetalem Kälberserum vermehrt und für den Test auf eine Zellzahl von 1 × 10⁷/ml eingestellt. Zellsuspension wurde zu den Testlösungen pipettiert und für 30 Minuten präinkubiert. Anschließend wurde eine Arachidonsäurelösung zupipettiert (Endkonzentration 30 µM) und 15 Minuten inkubiert. Danach wurde die Reaktion bei 4°C gestoppt, zentrifugiert und im Überstand die Thromboxan B2-Konzentration mittels ELISA bestimmt. Die Hemmwirkung wurde im Vergleich zu einem Blankwert und einer Vergleichssubstanz (Indometacin) errechnet.

Probe	IC₅₀ [µg/ml]
Rückstand gemäss Beispiel 4	5.3
Rückstand gemäss Beispiel 5	4.9
Verbindung gemäß Formel (II)	1.8
Verbindung gemäß Formel (III)	0.9
Verbindung gemäß Formel (IV)	1.4
Verbindung gemäß Formel (VIII)	2.3
Verbindung gemäß Formel (XIII)	4.6
Verbindung gemäß Formel (XIV)	5.2

Beispiel 13

Chemopräventive Wirkung

Die gemäss der Beispiele 4, 5 und 6 erhaltenen Substanzen wurden in einem Organkultur- System im Wesentlichen nach der von Mehta und Moon (Anticancer Research, 11, 1991, 593-596), beschriebenen Methode geprüft. Bestimmt wurde dabei die Hemmung von Dimethylbenz[a]-anthracen (DMBA)-induzierten präkanzerösen Läsionen in der weiblichen Brustdrüse von Mäusen.

Neugeborene weibliche BALB/c Mäuse wurden während 9 Tagen mit Oestradiol und Progesteron vorbehandelt. Am 10. Tag wurden die Mäuse getötet und das zweite thorakale Brustdrüsenpaar in Organkultur genommen. Die Drüsen wurden für 10 Tage unter Zusatz der wachstumsfördernden Hormone Insulin, Prolactin, Aldosteron und Hydrocortison inkubiert. Vom 3. auf den 4. Tag wurden die Organkulturen während 24 Stunden dem Karzinogen DMBA ausgesetzt. Die voll ausdifferenzierten Organe wurden durch Hormonentzug über 14 Tage zurückgebildet. Die Prüfsubstanzen wurden den Kulturen während der ersten 10 Tage zugesetzt. Die in den Brustdrüsen-Kulturen aufgetretenen präneoplastischen Läsionen wurden bestimmt.

Die Dosierung von erfindungsgemäß verwendbaren Oenothera-Extrakten und -Substanzen, die sich durch die oben erläuterten Chromatogramme charakterisieren lassen, liegt allgemein in dem für vergleichbare Pflanzen-Extrakte und -Substanzen üblichen Bereich von 50 mg bis 1000 mg/Tag. Eine kritische toxizitätsbedingte Obergrenze konnte bisher nicht ermittelt werden. Dabei können die Extrakte, wie vorgeschlagen, als solche oder in Mischung mit den zur Herstellung fester, halbfester oder flüssiger Arzneimittelzubereitungen bekannten Zusatz- oder Hilfsstoffen und/oder kombiniert mit anderen therapeutisch wirksamen oder präventiv wirkenden Substanzen verwendet werden.

Zusammenfassend bietet die Erfindung neue Mittel, die sich zur Stabilisierung von Nachtkerzenöl und anderen lipophilen Zubereitungen zur nutrazeutischen, kosmetischen und pharmazeutischen Verwendung eignen, und zur Behandlung oder Vorbeugung von Leiden, die mit oxidativem Stress und präkanzerösen Läsionen in direktem oder indirektem Zusammenhang stehen, insbesondere als Antioxidanzien und chemopräventive Mittel, zur präventiven oder adjuvanten Behandlung von Dauermedikation, insbesondere zur Prävention und adjuvanten Behandlung neoplastischer Erkrankungen.

Claims

1. Verwendung von Kaffeesäureestern der allgemeinen Formel (I)

deren pharmazeutisch akzeptable Salze bzw. Mischungen, welche Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) oder deren pharmazeutisch akzeptable Salze enthalten, mit dem nachfolgend bezeichneten Rest R zur Herstellung von kosmetischen, nutrazeutischen und pharmazeutischen Präparaten und Arzneimitteln mit Radikalfängereigenschaften und/oder mit einer Hemmung von entzündlichen Prozessen und/oder mit einer Hemmung von präneoplastischen Läsionen.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Betulinsäure der allgemeinen Formel (II)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

3. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Morolsäure der allgemeinen Formel (III)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

4. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Oleanolsäure der allgemeinen Formel (IV)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

5. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Betulin der allgemeinen Formel (V)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

6. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Hederagenin der allgemeinen Formel (VI)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

7. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch 18β-Glycyrrhetinsäure der allgemeinen Formel (VII)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

8. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Sojasapogenol C der allgemeinen Formel (VIII)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

9. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Quillajasäure der allgemeinen Formel (IX)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

10. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Ursolsäure der allgemeinen Formel (X)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

11. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch 11-Keto-β-boswelliasäure der allgemeinen Formel (XI)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

12. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Faradiol der allgemeinen Formel (XII)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

13. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Taraxasterol der allgemeinen Formel (XIII)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

14. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch β-Sitosterol der allgemeinen Formel (XIV)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

15. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Stigmasterol der allgemeinen Formel (XV)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

16. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Smilagenin der allgemeinen Formel (XVI)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

17. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Sarsapogenin der allgemeinen Formel (XVII)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

18. Verwendung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Diosgenin der allgemeinen Formel (XVIII)

als Rest R der allgemeinen Formel (I).

19. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kaffeesäureester, Salze bzw. Mischungen, welche diese enthalten, zur Herstellung von Arzneimitteln für die präventive oder adjuvante Krebsbehandlung eingesetzt werden.

20. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kaffeesäureester, Salze bzw. Mischungen, welche diese enthalten, zur Herstellung von Arzneimitteln für die präventive oder adjuvante Dauermedikation bei Altersbeschwerden eingesetzt werden.

21. Verwendung gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stoffmischung zum Einsatz kommt, bei welcher zumindest ein Wirkstoff entsprechend Formel (I) aus einem Extrakt von Pflanzenmaterial, beispielsweise von Oenothera biennis gewonnen wurde.

22. Verwendung gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Stoffmischung durch mechanische Pressung des Pflanzenmaterials hergestellt wird.

23. Verwendung gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Stoffmischung durch Extraktion des Pflanzenmaterials hergestellt wird.

24. Verwendung gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion des Pflanzenmaterials mit einem flüssigen Lösungsmittel und/oder mit einem bei Normalbedingungen gasförmigen Lösungsmittel in flüssigem bzw. überkritischem Zustand erfolgt, vorzugsweise Kohlendioxid, gegebenenfalls in Mischung mit mindestens einem anderen und bei Normalbedingungen flüssigem Lösungsmittel.