DE1693020C

DE1693020C - Verfahren zur Abtrennung von Madecass Saure bzw von Madecassosid und diese enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE1693020C
Application number: DE19671693020
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Laboratoires Laroche Navarron; Leval lois Perret (Frankreich)
Priority date: 1966-08-08
Filing date: 1967-08-05
Publication date: 1973-06-14

Description

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Die Erfindung betrifft die Abtrennung von Madecassäure bzw. von Madecassosid, die wertvolle therapeutische Eigenschaften aufweisen. Sie eignen sich insbesondere zur Behandlung von Brandwunden und anderen Wunden.

Besitzt die empirische Formel C₄₈H₇₈O₂₀ und das zugehörige Aglykon Madecassäure die empirische Formel C₃₀H₄₈O₆. Diese beiden Verbindungen können aus der Pflanze Centella Asiatica (Linne) Urban extrahiert werden. Centella Asiatica ist eine Pflanze, die im französischen Arzneibuch von 1884 enthalten ist. Die Gattung Centella gehört zum Stamm der Hydrocotyleen und zur Familie der Doldenpflanzen. Diese pantropische Art weist geographische Formen auf, von deneii jede eine besondere biochemische Zusammensetzung hat. Für die Zwecke der Erfindung wird die Form bevorzugt, die auf Madagaskar wächst.

Es wurde bereits in »Ind. J. Pharm.«, Bd. 23 (1961), S. 106 und 107, beschrieben, daß man die Pflanze CenteHa Asiatica mit Alkohol extrahieren kann. Bei der Behandlung des heißen eingeengten Alkoholextrakts mit Petroläther (40 bis 6O⁰C) Äther und Chloroform wird eine unlösliche Masse erhalten, die in Wasser aufgenommen und so von anorganischen Salzen befreit und mit neutralem Bleiacetat versetzt wird. Das bleifreie Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne abgedampft, wobei eine braune amorphe Glycosidfraktion erhalten wird. Nach der Hydrolyse erhält man daraus ein der Asiatsäure entsprechendes Aglycon vom Schmelzpunkt 241⁰C.

Es wurde nun gefunden, daß Madecassosid und Madecassäure im Extraktionsrückstand der Asiatsäure und ihres Osids vorhanden sind.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Abtrennung von Madecassäure der Formel C₃₀H₄₈O₆ mit spezifischer Drehung [«]·;' von - 19⁰C (C = 2,2% in Wasser) bzw. +31⁰C (C = 1,5% in Methanol) bzw. von Madecassosid der Formel C₄₈H₇₈O₂₀, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die nach der Extraktion der Pflanze Centella Asiatica mit Alkohol, Einengen des alkoholischen Auszugs und Abtrennen der abgeschiedenen Kristalle von Asiatsaure bzw. von Asiaticosid erhaltene Mutterlauge in üblicher Weise zur Trockne eindampft und das erhaltene Rohprodukt entweder in an sich bekannter Weise, wie durch fraktionierte Kristallisation, oder durch' Lösen des Rohproduktes in Äthanol und Zugabe von Äthylacetat oder durch Adsorption ar· Kieselsäure und Eluieren mittels eines Alkanol-Wasser-Gemisches reinigt und/oder in wäßriger saurer Lösung in der Wärme hydrolysiert.

Nach dem in »Ind. J. Pharm.« beschriebenen Verfahren erreicht man keine Isolierung der Madecasssäure und ihres Osids, da sie erst isoliert werden können, wenn die Asiatsäure die sie begleitenden Produkte aus dem Mazerationssatz der Pflanze abgetrennt sind.

Die Erfindung betrifft ferner Madecassäure bzw. Madecassosid enthaltende Arzneimittel.

Das folgende Beispiel beschreibt die Abtrennung von rohem Madecassosid.

Beispiel 1

Man engt 501 Mutterlauge aus der Herstellung von Asiatsäure und Asiaticosid unter vermindertem Druck ein, bis eine pastenförmige Masse erhalten wird (hierbei müssen 45 1 Wasser abgedampft werden). Die erhaltene Paste wird anschließend, in einem Vakuuinschrank getrocknet, bis eine feste Masse erhalten wird, die etwa 5 kg wiegt und das rohe Madecassosid darstellt.

Es ist möglich, ein reineres rohes Madecassosid zu

erhalten, indem man die Mutterlauge aus der Kristallisation von Asiatsäure und Asiaticosid über Kationen- und Anionenaustauscher leitet, wodurch die anwesenden organischen Säuren entfernt werden. Nach der Einengung des perkolieren Auszugs wird die eingeengte Flüssigkeit mit einem Alkohol, z. B. Butanol, extrahiert, wodurch das Madecassosid und Asiaticosid löslich gemacht werden. Die Butanollösung wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in heißem Wasser aufgenommen. Durch Kühlung kristallisiert der größere Teil des Asiaticosids, das abfiltriert wird. Das rohe Madecassosid wird zur Trockne eingedampft.

Um aus dem rohen Madecassosid ein reines Produkt zu erhalten, kann eine fraktionierte Kristallisation wie folgt durchgeführt werden:

a) Man löst 30 g rohes Madecassosid in 200 ml siedendem 95%igem Äthylalkohol. Nach Abkühlung gibt man 200 ml Äthylacetat zu und läßt die Mischung 24 Stunden stehen. Das Produkt, das auskristallisiert, wird abgenutscht und getrocknet. Hierbei werden 15 g eines Produkts erhalten, das gemäß Chromatographie 90% Madecassosid enthält.

b) Durch Wiederholung der vorstehend unter a) beschriebenen Behandlung, d. h. durch Auflösen von 15 g des bereits gereinigten Produkts in 100 ml 95%igem Alkohol und anschließende Ausfällung durch Zusatz von Äthylacetat, erhält man IO g chromatographiscli reines Madecassosid.

Gemäß einer Varianten ist es möglich, das rohe Madecassosid an Kieselsäuregel zu adsorbieren und mit einem Gemisch von Butanol und Wasser zu

diuieren. Hierdurch kann eine Fraktion isoliert werden, lie ausschließlich Madecassosid enthält. Durch Einingung dieser Fraktion wird das reine Produkt

erhalten. . .

Da die Madecassäure nur in geringer Menge in den Auszügen der Pflanze enthalten ist, ist ihre direkte Extraktion schwierig. Zu ihrer Gewinnung ist es somit vorzuziehen, das Madecassosid in wäßriger saurer Lösung heiß zu hydrolysieren. Diese Herstellungsweise wird durch das folgende Beispiel veranschaulicht. _, . -IT

Beispiel 2

SO u Madecassosid werden in 200 ml Wasser gelöst. Nach" Zusatz von 100 ml konzentrierter Salzsäure wird das Gemisch 1 Stunde auf dem Wasserbad erhitzt Nach einigen Minuten wird die Lösung trübe, und eine immer stärker werdende Fällung scheidet sich ab Nach Abkühlung wird die Fällung abgenuischl, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei werden 23 g Madecassäure erhalten.

Chemisch können Madecassosid und Madecassäure wie iolgt charakterisiert werden:

a) Madecassosid: Diese Substanz der empirischen

-w

an Kieselsäuregel G (M e r c k). Die chromatographischen Platten werden in klassischer Weise hergestellt. Das zu chromatographierende Produkt wird 1,5 cm vom unteren Rand mit einer Mikropipette aufgebracht. Diese Platten werden in einen Entwicklungsbehälter gestellt, in den das Lösungsmittel bis zu einer Höhe von etwa 0,5 cm gefüllt worden ist. Das Lösungsmittel besteht in diesem Fall aus einem Gemisch der folgenden Bestandteile:

Butanol 60 Raumteile

Äthylacetat 40 Raumieile

Ammoniak 10 Raumieile

Wasser 5 Raumteile

S Wenn die Lösungsmittelfront etwa 12 cm durchlaufen hat, wird die Platte herausgenommen und getrocknet. Anschließend wird ein Gemisch von Essigsäureanhydrid (9 Teile) und konzentrierter Schwefelsäure (1 Teil) zerstäubt. Diese Platte wird an-ιυ schließend einige Minuten im Trockenschrank (110° C) gehalten, wobei die getrennten Substanzen mit den verschiedenen Rf-Werten und Farben erscheinen.

Rf (ungefähr)

Formel C₄₈H₇₈O₂₀ besteht aus

einem Triterpenteil, der Madecassäure ist (Gewichtsantcil 47% der Gesamtsubatanz);
und einem Zuckerrest, der aus 1 Molekül Rhamnose und 2 Molekülen Glucose besteht (die Glucosemoleküle sind in der gleichen Weise wie in Gentiobiose miteinander verbunden).
b) Madecassäure: Diese Säure ist das Aglykon der vorstehenden Substanz, und zwar eine Triterpensäure der Formel C₃₀H₄₈O₆, die eine äthylenische Bindung und Hydroxylgruppen enthält.

Weitere physikalisch-chemische Kennzeichen dieser beiden Verbindungen sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Madecassosid 0,06
Asiaticosid 0,1
Madecassäure 0,27
Asiatsäure 0,43

Farbe der Flecken

violett blaugrün malvenfarbig blaugrün

a) Organoleptische Eigenschaften

b) Löslichkeit

c) Spezifisches
Drehvermögen

d) Schmelzpunkt

Madecassosid

weißes Pulver,
leicht bitterer
Geschmack

in Wasser gut
löslich,
g/l

löslich in
Äthyl- und
Butylalkohol,
Pyridin und
Essigsäure

M= -19-

(C = 2,2%;
Wasser)

wird bei 220
pastenförmig

Madecassäure

weißes Pulver, süßlicher Geschmack

in Wasser schwer löslich, in verdünntem Natriumhydroxyd löslich

löslich in Äthyl- und Butylalkohol, Pyridin und Essigsäure

[>«]' = +3Γ (C = 1,5%; Methanol)

265 bis 268 C

Bei den pharmakologischen Untersuchungen, die an Madecassosid und Madecassäure vorgenommen wurden, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

I. Ermittlung der Toxizität

1. Akute Toxizität von Madecassosid bei der Maus und Ratte

Bei der Maus

a) oral

Da ein Vorversuch an zwei Gruppen von 30 Mäusen mit Dosen von 5, 3, 1, 0,5 und 0,1 g/kg keine Mortalität ergab, wurde der endgültige Test mit den beiden stärksten Dosen, d.h. 5 g und 3 g/kg durchgeführt. Der Versuch wurde an zwei gleichen Gruppen von 20 männlichen und weiblichen Mäusen gleicher Herkunft vorgenommen, die ein mittleres Gewicht von 20 g (18 bis 21 g) hatten und Standardfutter erhielten. Die Tiere wurden 8 Tage vor dem Versuch beobachtet und erhielten am Vorabend der Behandlung kein Futter. Das in destilliertem Wasser gelöste Produkt wurde ihnen in einem gleichmäßigen Volumen von 0,25 ml/ 20 g einzeln mit einer Speiseröhrensonde verabfolgt. Die Mäuse wurden bei der Temperatur des Laboratoriums (24° C) gehalten und dann 14 Tage beobachtet und gewogen.

Ergebnisse

Die beste Methode zur Identifizierung von Madecassosid und Madecassäure. die es ferner ermöglicht, diese Verbindungen von den in der Pflanze Centcila Asialica vorliegenden Bcglcitstoffen zu differenzieren, ist die Dünnschichtchromatographie (Dicke 0.3 mm) Dosis

pH

5 3

Zahl der Tiere	weiblich
männlich	10
10	10
10

Mortalität I Prozent

020 0 20

Die Gewichtszunahme war normal.

b) subkutan

Da der Vorversuch das gleiche Ergebnis v.ie unter a) hatte, wurde der endgültige Versuch in zwei gleichen Gruppen von 20 männlichen und weiblichen Mäusen durchgeführt, die am Vorabend der Injektion kein Futter erhielten. Das in physiologischem Serum gelöste Produkt wurde subkutan in gleichmäßigem Volumen von 0,25 ml/2ö g injiziert.

Ergebnisse

Si"" m

und weibvon

120g.

120g. ■ . _{J n}

2 Mute Toxizität von Madecassäure be. der Ratte

chen Weise
cassosid

und

gleichen Ergebg _s

und &t⁸einmal erreicht werden.

Zahl der Tiere
männlich I weiblich

10
10

Mortalität

0/20 0/20

Prozent

0 0

Die Gewichtszunahme war normal. Die akute Toxizität von Madecassosid war somit Null bei männlichen und weiblichen Mäusen von 20 g bis zu einer Dosis von 5 g/kg oral und subkutan.

Akute Toxizität bei Ratten

a) Oral

Der Versuch wurde unter den gleichen Bedingungen wie bei den Mäusen an zwei gleichen Gruppen von 20 weißen männlichen und weiblichen Ratten durchgeführt, die ein durchschnittliches Gewicht von 120 g hatten. Das Produkt wurde in Wasser gelöst und in einem gleichmäßigen Volumen von 2 ml/100 einzeln mit Hilfe einer Speiseröhrensonde verabfolgt.

Ergebnisse

20 SÄ" und zwa'r «fflnf gleichen Gruppen in männlichen und 25 weiblichen erwachsenen von 10 männlichen ^unü _{dje die g]eiche} Herkunft

_Tte erS wäh^d' der' Versuchsdauer von < 6Monalen ungehinderten Zugang zu Wasser unü Standardfütter Dieses Futter wurden einmal wochent-

Hct, durch Zusatz von Vitamin B₁₂ und Lebertran

T£äru_PPen von männlichen und weiblichen ,o Tieren wurden gebildet. Eine dieser Gruppen, die als vSeichsgruppe diente, erhielt Wasser mitZusatz VOT 5% Pflanzenharz. Zwei Gruppen erhielten das Produkt oral und die restlichen be.den Gruppen

Dosis
g/kg

Zahl der Tiere
männlich weiblich

10
10

Mortalität

0/20 0/20

Prozent

0 0

Die bei der Laboratoriumstemperatur (24° C) gehaltenen und 8 Tage beobachteten Tiere zeigten normale Gewichtszunahme.

b) subkutan

Der Versuch wurde unter den gleichen Bedingungen an zwei gleichen Gruppen von männlichen und weiblichen weißen Ratten durchgeführt, die ein durchschnittliches Gewicht von 120 g hatten. Das Produkt wurde in physiologischem Serum gelöst und in einem gleichmäßigen Volumen von 2 ml/100 g subkutan injiziert.

Ergebnisse

Dosis

Zahl der Tiere
männlich I weiblich

10
10

Mortalität

0/20 0/20

Prozent

0 0

Die Ratten wurden 14 Tage bei der Temperatur des Laboratoriums gehalten und regelmäßig gewogen. Die Wachstumskurve war normal. Keinerlei Mortalität wurde festgestellt. Die akute Toxizität von Madecassosid war somit Null bis zu einer Dosis von rur aie ora.c ν crabfolgung wurde die Madecassaurc in Wasser das 5% pflanzenharz enthiet suspendier« uml das Madecassosid in destilliertem Wasser gelost. Für die Verabfolgung wurden die be.den folgenden Dosen gewählt:

5 me'kg Körpergewicht bei einer der Gruppen, 25 mg/kg Körpergewicht bei der zweiten Gruppe. Für die subkutane Behandlung wurde die Madecasssäure in physiologischem Serum suspendiert und das Madecassosid in physiologischem Serum gelost. Fur diese Behandlung wurden die folgenden Dosen gewählt:

10 mg/kg ^{bei einer der Gru}PP^en> 50 mg/kg bei der anderen Gruppe.

Der gesamte Versuch wurde bei der Temperatur des Laboratoriums (20 bis 25°C) durchgeführt Wahrend der gesamten Versuchsdauer wurde das Verhalten der Tiere überwacht. Die Tiere wuiden wahrend

der ersten drei Monate zweimal wöchentlich und wahrend der drei letzten Monate einmal wöchentlich eewoeen Während des Versuchs wurden zwei mannfsrhe und zwei weibliche Tiere jeder Gruppe getötet und die Hauptorgane zur histologischen Untersuchung

entnommen (die übrigen Tiere wurden gepaart). Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Während der Versuchsdauer wurde keinerlei Veränderung im Verhalten der Tiere beobachtet: Weder Aggressivität noch Schläfrigkeit wurden festgestellt.

Die Tiere behielten normale Motilität.

Bei keiner der Gruppen wurde während der Versuchsdauer Mortalität festgestellt. Sämtliche Tiere überlebten.

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Untersuchung der Gewichtskurven: Der Verlauf der ermittelten Kurven war typisch für eine Wachstumskurve. Er zeigt eine erste Phase schnellen Wachstums gefolgt von einer leicht . nsteigenden Phase, während der das Wachstum erheblich verlangsamt ist.

Die Kurven der Gewichtszunahme lassen sich in jeder Gruppe praktisch übereinanderlegen. Das Wachstum der behandelten Gruppe sowohl bei oraler als auch bei subkutaner Behandlung ist identisch mit dem Wachstum der Vergleichstiere während der gesamten Versuchsdauer, und zwar sowohl bei den männlichen als auch bei den weiblichen Tieren.

Histologie: Die Untersuchung der Hauptorgane ergab keinerlei Läsion oder Anomalie.

Als Schlußfolgerung kann gesagt werden, daß Madecassäure und Madecassosid von Wistar-Ratten, die sechs Monate behandelt werden, vollkommen vertragen werden. Während der Versuchsdauer ist keinerlei Mortalität festzustellen. Die Histologie der Hauptorgane ist normal. Bei keiner der männlichen oder weiblichen Gruppen, die das Produkt subkutan erhielten, wurden Abszesse oder Schorf an der Einstichstelle festgestellt.

Die Tiere zeigten vollkommene Toleranz für beide Produkte bei den vier angewendeten Dosen und bei den beiden Verabfolgungsweisen. Dieser Versuch erhält erst seinen vollen Wert, wenn man berücksichtigt, daß die bei diesem Versuch angewendeten Dosen sehr erheblich sind und eine Behandlungsdauer von sechs Monaten bei der Ratte einer gleichen Behandlung für eine Dauer von fünf Jahren beim Menschen entspricht.

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II. Untersuchung der therapeutischen Wirkung

1. Ermittlung der Heilwirkung von Madecassosid
und Madecassäure

a) an experimentellen Hautwunden

Der Versuch wurde parallel mit jedem der beiden Produkte unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Zwei Gruppen von jungen männlichen Ratten von etwa 70 g werden isoliert in Käfigen gehalten. Nachdem die Rückenhaare abrasiert worden sind, wird bei jeder Ratte mit Hilfe einer Schere ein halbkreisförmiges Hautstück von etwa 2 cm 0 im mittleren Lendenbereich entnommen. Mit Transparentpapier wird von der Wunde ein Abdruck genommen und dann auf gleichmäßiges Bristol-Papier von 40 mg/cm² übertragen, das anschließend gemäß dem Umriß der Wunde zugeschnitten und gewogen wird. Da das erhaltene Gewicht der betreffenden Oberfläche proportional ist, werden die Ergebnisse nach dieser Größe ausgedrückt.

Während der Versuchsdaue: von 11 Tagen erhalten die Ratten Wasser und ausgeglichenes Futter nach Belieben. Sis werden regelmäßig gewogen. Die Tiere erhalten täglich Injektionen in einem gleichmäßigen Volumen von 0,5 ml/100 g Körpergewicht, und zwar subkutan unter das Bauchfell von dem Tage ab, an dem die Wunden erzeugt wurden. Die folgenden Injektionen wurden bei den Vergleichstieren und bei den behandelten Tieren gegeben:

Vergleichstiere:

10%ige wäßrige Alkohollösung bei Madecasssäure.
Physiologische Lösung bei Madecassosid.

Behandelte Tiere:

Madecassäure in einer Menge von 2 mg/ml in einer 10%igen wäßrigen Alkohollösiung entsprechend 10 mg/kg;

Madecassosid in einer Menge von 10 mg/kg als wäßrige Lösung mit 2 mg/ml.

Die tägliche Beobachtung der Tiere zeigt, daß die Wunden der Ratten, die Madecassosid und Madecasssäure erhalten, intensiver rot sind. Die Vaskularisation scheint schneller zu verlaufen. Das Vernarbungsgewebe breitet sich bei den behandelten Tieren schneller aus.

Aus diesem Versuch ergibt sich, daß Madecassosid und Madecassäure bei einer Dosis von 10 mg/kg/Tag die Vernarbung bzw. Heilung von Oberflächenwunden bei der Ratte erheblich beschleunigen.

b) Experimentelle Brandwunden auf der Hornhaut des Kaninchenauges

Bei männlichen Kaninchen der gleichen Herkunft (Gewicht etwa 1 kg), die ein ausgeglichenes Futter erhalten, wird nach örtlicher Betäubung des Auges mit Novokain die Hornhaut in bekannter Größe und Intensität verbrannt. Diese Verbrennung hat bei allen Tieren eine starke örtliche Reaktion mit Rötung der Hornhaut, ödem des Augenlides und allgemeiner Hypervaskularisation zur Folge.

Bei den unbehandelten Vergleichstieren wird vom zweiten Tage ab ein undurchsichtiger Flecken auf der traumatisierten Zone festgestellt. Diese Undurchsichtigkeit wird im allgemeinen permanent. In den seltenen Fällen, in denen sie spontan zurückgeht, geschieht dies in jedem Fall erst nach wenigstens einem Monat.

Bei den Kaninchen, die 1 mg Madecassäure oder Madecassosid subkutan unmittelbar nach der Verbrennung und dann alle 2 Tage erhielten, war die Heilung der Hornhaut, überwacht durch Einträufeln von Fluorescein, am zehnten Tage abgeschlossen Die wiedergewonnene Transparenz war vollständig

2. Entzündungshemmende Eigenschaften

Die entzündungshemmende Wirkung von Madecassosid und Madecassäure wurde nach der Methode des Kaolinödems ermittelt. Diese Methode wird wif folgt durchgeführt:

Bei der Ratte erzeugt die Injektion eines bestimmter Volumens einer Kaolinsuspension in die Sohle einei der Hinterpfoten ein Udem, dessen Intensität nacl Sektion der beiden Hinterpfoten durch den Gewichts unterschied zwischen der Vergleichspfote und de: Pfote, in die das Kaolin injiziert wurde, festgestell wird. Untersucht wird der Einfluß der Behandlung mit den beiden zu untersuchenden Produkten au die Entwicklung dieses Ödems.

In jedem Fall dienen als Versuchstiere gleichmäßig Gruppen von 30 männlichen Wistar-Ratten mit einer mittleren Gewicht von 120 g, die 8 Tage vor dem Vei such im Laboratorium überwacht werden und Wassc und Standardfutter nach Belieben erhalten. Die erst Gruppe dient als Vergleichsgruppe, and die zweit Gruppe erhält ein bekanntes entzündungshemmende Mittel als Vergleichssubstanz, und von den beide letzten Gruppen erhält die eine das Madecassosi und die andere die Madecassäure.

Eine 10%ige Kaolinsuspension in destilliertem Wasser wird hergestellt, und die Suspension wird in einem gleichmäßigen Volumen von 0,1 ml Ratte in eine Hinterpfote injiziert. Die Behandlung erfolgt zweimal am Vortage des Versuchs (24 Stunden und 17 Stunden vor der Kaolininjektion) und einmal am Tage des Versuchs (1 Stunde vor der Kaolininjektion).

Die erste Gruppe erhält somit drei Injektionen von physiologischem Serum.

Die zweite Gruppe erhält eine Suspension von Cortisonacetat in einer Dosis von 20 mg/kg.

Die dritte Gruppe erhält eine Suspension von Madecassäure in destilliertem Wasser in Dosen von 75 mg/kg bis 2 g/kg.

Die vierte Gruppe erhält eine Lösung von Madecassosid in den gleichen Dosen.

Jede Injektion erfolgt subkutan in einem gleichmäßigen Volumen von 0,5 ml 100 g Körpergewicht. 5 Stunden nach der Kaolininjektion werden die Tiere mit Äther betäubt, worauf ihnen in Höhe des Mittelfußgelenks die beiden Hinterpfoten abgeschnitten werden, die gewogen werden. Der Entzündungsgrad wird für jede Ratte durch den Gewichtsunterschied zwischen den beiden Pfoten festgestellt. Anschließend wird für jede Gruppe der Durchschnitt der Unterschiede ermittelt und der prozentuale Schutz berechnet.

Die entzündungshemmende Wirkung von Madecassosid und Madecassäure tritt unter den obengenannten Versuchsbedingungen erst bei einer Schwellendosis von 250 mg'kg subkutan ein. Der mit Cortison erzielte Schutzgrad variiert bei einer Dosis von 20 mg/kg von 13 bis 20% je nach Versuch. Ein gleicher Schutz wird mit Madecassosid und Madecassäure bei Dosen von 300 bis 500 mg/kg erzielt.

Gegenüber dem Asiatsäure oder deren Glycosid enthaltenden Gesamtextrakt der Pflanze Centella Asiatica besitzen die erfindungsgemäß abgetrennten Stoffe folgende überlegenden Eigenschaften:

1. Eine wesentlich geringere akute Toxizität, bestimmt an Maus und Ratte. Der Gesamtextrakt von Centelia Asiatica ruft toxische Erscheinungen bereits bei Dosen von 0,5 g/kg bei der Ratte hervor. Die Symptome sind Ataxie. die mit steigender Dosis zunimmt. Bei Dosen oberhalb von 1 g/kg geht die Ataxie in ein Koma mit respiratorischer Depression über. Bei der Maus zeigen sich nervöse Symptome, die bei höheren Dosierungen zum Tod nach einem kurzen konvulsivischen Stadium führen. Im Gegensatz dazu zeigt die Madecassäure kein Zeichen von Toxizität. Das Verhalten der Testtiere bleibt innerhalb von 14 Tagen nach Verabfolgung völlig normal. Die akute Toxizität von Madecassäure konnte nicht bestimmt werden, da selbst bei hohen Dosierungen von 4 g/kg kein Todesfall bei Ratte oder Maus auftrat.

60

2, Madecassäure und ihr Osid haben eine bessere Heilwirkung bei Wunden als der Gesamtextrakt von Centella Asiatica. Sowohl bei äußerlicher als auch bei oraler Anwendung zeigt sich, daß Hautwunden, die Ratten als Versuchstieren zugefügt worden sind, wesentlich besser zuheilen als bei Tieren, denen der Centella-Gesamtextrakt verabfolgt wurde. Die Heilwirkung wurde dabei einmal als Narbenfestigkeit bestimmt, wobei die Menge Quecksilber gemessen wird, die notwendig ist, um einen bereits verheilten Schnitt wieder aufzubrechen (Bestimmungsmethode von Rosen, Blumenthal und Mac Ca 11 um »Proc. Soc. Exp. Biol. Med.« (1967), 125, S. 279 und 280). Zum zweiten wird die Heilwirkung gegenüber der die Heilung verzögernden Wirkung von Cortison bestimmt. Während der Centella-Gesamtextrakt in zwei Versuchen eine Verbesserung der Heilung, ausgedrückt als Festigkeit der Narbe gegen das künstliche Aufbrechen von 25 bzw. 15% bei einer Wahrscheinlichkeit von 0,01 nach dem f-Test von Student — Fischer, gegenüber dem Vergleichstier hervorruft, liegen die entsprechenden Werte für Madecassäure bzw. ihr Osid bei 62 bzw. 75%. Bei Hautwunden, deren Heilung durch die vorherige Vergabe von Cortison verzögert worden ist, sind die entsprechenden Werte bei einei Wahrscheinlichkeit von 0,05 nach Student — Fischer 20 bzw. 26% für den Centella-Gesamtextrakt, jedoch 41 und 67% für Madecassäure.

Aus den vorstehenden Ausführungen ergibt sich, daß Madecassosid und Madecassäure Modifikatoren des Bindegewebes sind. Sie begünstigen die Stickstoffretention und die Synthese des Kollagens. Sie eignen sich somit für die Behandlung von Brandwunden, Atomwunden, hartnäckigen Geschwüren inallgemeinen und Geschwüren der Hornhaut, insbesondere Erkrankungen des Kollagens und lepröser Geschwüren. Sie eignen sich ferner zur Vorbereitung von Hautpfropfungen.

Hieraus ergeben sich die therapeutischen Indi kationen für die beiden Derivate, die zu diesem ZwecV in therapeutische Zubereitungen für die orale, parcn terale oder örtliche Anwendung eingearbeitet werdei können. Der Wirkstoff wird hierbei mit den entsrn-¹· chenden Hilfs- und Trägerstoffen kombiniert, du diesen verschiedenen Behandlungsweisen entsprechen Geeignete therapeutische Zubereitungen sind somi beispielsweise Tabletten. Lösungen für die Injektion Puder. Salben und Augensalben und -pulver. Einijn Beispiele für solche Zubereitungen sind nachstehem aufgeführt.

1. Tabletten

Beispiel der Zusammensetzung

Madecassäure oder
Madecassosid

Hilfsstoff (als Beispiel)
Stärke

Aluminiumoxydhydrat
Bodenmehl
Calciumcarbonat
Gummi arabicum
Magnesiumstearat

Menge nach Vorschrift bis
zum Endgewicht einer
Tablette von

Mittlere
Dosis

1 mg

Starke
Dosis

5 mg

0.20 0 I 0 50 β

11

2. Lösung (subkutan und intramuskulär)

a) Madecassosid

NaCl, Menge nach Vorschrift

gereinigtes pyrogenfreies Wasser

Mittlere Dosis

ma

Starke Dosis

20 me

	Mittlere j	Marke	ml
I ...., ι	Dosis ι	Dosis
Cjcraniumrosat-Esson/ ...	0.143 ml!	.1143
Destilliertes Wasser i
Mensze nach Vorschriii	100 si	100 ü

b) Madecassäure.... »Polysorbat80«*) Natriumchlorid

Gereinigtes pyrogenfreies Wasser Menge nach Vorschrift

Isotonie

1 ml

mg 0.0002 g 0,009 g

1 ml

5. Augenflüssigkeit

1 ml

20 mg 0.0002 g 0,009 g

ml Mittlere Dosis

*) Emulgator auf der Basis eines Kondensationsproduktes aus Äthylenoxyd und einer Fettsäure (insbesondere Ölsäure) und Sorbit, das etwa 20 Äthylenoxydeinheiten enthält.

3. Puder zur äußeren Anwendung

Mittlere Dosis

Madecassosid oder Madecassäure...

Hilfsstoff:

Talkum ,

Magnesiumstearat

49.5 g 49,5 g

100 g

Starke Dosis

a) Madecassäure

Benzylalkohol

Natriumcarboxy-

methylcellulose

NaCl Menge nach
Vorschrift

»Polysorbat 80«

Steriles destilliertes

Wasser

Menge nach Vorschrift

b) Madecassosid

15 mg 9 ma

15 mg

Starke Dosis

30 mg 9 mg

15 mg

Isotonie

49.0 g 49.0 g

100 c NaCl Menge nach
Vorschrift

Konservierungsmittel,

Menge nach Bedarf

Steriles destilliertes

Wasser

Menge nach Vorschrift

3 ml

15 mg ! 30 mg Isotonie

3 ml

4. Salbe

Madecassosid oder Madecassäure...

Maisöl

Glykolstearat

Propylenglykol.... Lavendelöl

Mittlere	Starke
Dosis	Dosis
0.5 g	1 g
10g	10 g
20 g	20 g
25 g	25 g
0,143 ml	0.143 ml

Für diese verschiedenen Formen eignet sich die folgende mittlere Dosierung:

1. Tabletten zu 1 mg: täglich 4 Tabletten bei laufender Behandlung;

Tabletten zu 5 mg: täglich 4 Tabletten bei Stoßbehandlung.

2. Lösung für Injektion: Injektion von 10 bis 20 mg täglich und dann alle 2 Tage.

3. Salbe und Puder: täglich örtliche Anwendung jeweils beim Verbandswechsel.

4. Augen flüssigkeit: zweimal täglich 1 bis 2 Tropfei in das kranke Auge.

Claims

Patentanspruch'*:

1. Verfahren zur Abtrennung von Madecassäure der Formel C₃₀H₄₈O₆ mit spezifischer Drehung [α]? von -19°C (C = 2,2% in Wasser) bzw. + 31⁰C (C = 1,5% in Methanol) bzw. von Madecassosid der Formel C₄₈H₇₈O₂₀, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach der Extraktion der Pflanze Centella Asiatica mit Alkohol, Einengen des alkoholischen Auszugs und Abtrennen der abgeschiedenen Kristalle von Asiatsäure bzw. von Asiaticosid erhaltene Mutterlauge in üblicher Weise zur Trockne eindampft und das erhaltene Rohprodukt entweder in an sich bekannter Weise, wie durch fraktionierte Kristallisation, oder durch Lösen des Rohproduktes in Äthanol und Zugabe von Äthylacetat oder durch Adsorption an Kieselsäure und Eluieren mittels eines Alkanol-Wasser-Gemisches reinigt und/oder in 2c wäßriger saurer Lösung in der Wärme hydrolysiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkanol Butanol verwendet.

3. Arzneimittel mit bindegewebsmodifizierender Wirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Madecassäure bzw. Madecassosid.