DE2159923B2

DE2159923B2 - Verfahren zur Gewinnung eines Stoffes mit insulinähnlicher Wirkung und diese Stoffe enthaltende Arzneipräparate

Info

Publication number: DE2159923B2
Application number: DE2159923A
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag; Hermann Dr.Rer.Nat. 7525 Bad Mingolsheim Jaggy; Peter Dr.Rer.Nat. 7500 Karlsruhe Kloss
Original assignee: SCHWABE WILLMAR DR 7500 KARLSRUHE-DURLACH
Current assignee: SCHWABE WILLMAR DR 7500 KARLSRUHE-DURLACH
Priority date: 1971-12-02
Filing date: 1971-12-02
Publication date: 1973-10-31
Also published as: DE2159923A1; DE2159923C3

Description

45

Im menschlichen und tierischen Serum kommen Faktoren vor, die im Fettgewebe insulinähnliche Wirkungen, d. h. »insulin like activity« ILA-Wirkung, zeigen. Insulin drängt im Fettgewebe die Fettmobilisierung zurück und begünstigt die Bildung von Fett aus Kohlenhydraten ebenso wie die Ablagerung von Triglyceriden. Entsprechend wird der Gehalt des Blutes an Lipiden, vor allem von freien Fettsäuren, erniedrigt. Da diese als Insulininhibitoren wirken, wird die Insulinwirkung durch ILA-Stoffe verstärkt.

Der Nachweis der I LA-Wirkung wird im epididymalen Fettgewebe von männlichen Ratten mit Glucose-(1)-C¹⁴ nachgewiesen. Durch Insulin bzw. durch Stoffe mit ILA-Wirkung wird diese in Glycerin und Fett umgewandelt und das dabei frei werdende ¹⁴CO₂ gemessen. Durch Vergleich mit Standard-Insulin wird die ILA-Aktivität ermittelt (vgl. A. E. R e η ο 1 d und Mitarbeiter, J. elin. Invest , Bd. 39 [1960], S. 1487 bis 1498 und G. E h r h a r t und H. R u s c h i g, Arzneimittel, Verlag Chemie, 1968, S. 8881.

Substanzen, die ILA-Wirkung zeigen, eignen sich zur Behandlung von Krankheiten, die durch bestimmte Fettstoffwechselstörungen hervorgerufen werden.

Plasmafaktoren, die eine ILA-Wirkung aufweisen, werden schon seit einiger Zeit therapeutisch in Form von eiweißfreien Extrakten aus Kälberblut verwendet, ohne das die für die Wirkung verantwortlichen Substanzen aufgeklärt werden konnten (vgl. K. F. W e i η g e s und Mitarbeiter, Arzneim.-Forsch., Bd. 18 [1968], S. 1019).

Aufgabe der Erfindung ist es, einen neuen Stoff mit ausgeprägter ILA-Wirkung zu schaffen.

Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß Pflanzen einen derartigen Stoff enthalten können. Der Nachweis, daß bestimmte Pflanzen Stoffe mit ILA-Wirkung enthalten, läßt sich nach dem vorstehend angegebenen Test von A. E. R e η ο 1 d et al. führen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung eines Stoffes mit insulinähnlicher Wirkung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den oberirdischen Teil der Pflanze Polygonum cuspidatum, Mulgedium alginum oder Datisca cannabina mit Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol oder Aceton, gegebenenfalls unter Wasserzusatz bei einer Temperatur von 5 bis 50⁰C extrahiert, aus dem Extrakt das Lösungsmittel bei 20 bis 6O⁰C unter vermindertem Druck entfernt, den wäßrigen Rückstand mittels eines halogenierten niederen aliphatischen Kohlenstoffwasserstoffes durch Extraktion bei 10 bis 5O⁰C von lipophilen Substanzen befreit und den lipoidfreien Rückstand entweder

(a) zur Hälfte einengt, filtriert und über einen stark sauren Kationenaustauscher in der Η-Form gibt, den Austauscher neutral wäscht, anschließend mit 1- bis 25prozentiger wäßriger Ammoniaklösung eluiert und das Eluat nach dem Austreiben des Ammoniaks unter schonenden Bedingungen eindampft oder gefriertrocknet oder

(b) mit Chloroform-Phenol-Gemischen mit einem Phenolgehalt von 20 bis 50 Gewichtsteilen extrahiert, diesen Extrakt bei 5 bis 25° C mit der etwa 5- bis lOfachen Menge eines Gemisches aus Äther und Petroläther (Siedebereich 30 bis 6O⁰C), im Volumenverhältnis 1: 2, und Diatomeenerde versetzt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, mit Äther phenolfrei wäscht, in Methanol oder Äthanol löst, diese Lösung bis zur Sirupkonsistenz einengt, mit einem Überschuß an Aceton versetzt, den abgetrennten Niederschlag in Wasser löst und diese Lösung wie unter a) beschrieben an einem Kationenaustauscher weiterreinigt

und Arzneipräparate gegen Hyperlipidämien, die den so gewonnenen Stoff enthalten.

Bei dem erfindungsgemäß gewonnenen Stoff mit ILA-Wirkung handelt es sich um stickstoffhaltige polare Verbindungen, die in Wasser leicht löslich sind.

F i g. 1 zeigt das Gaschromatogramm des aus Polygonum cuspidatum gewonnenen Produktes vor der Hydrolyse (zugesetzter Standard: Ornithin). In F i g. 2 ist das Gaschromatogramm der nach 24stündiger Hydrolyse mit 6 η-Salzsäure bei 110⁰C erhaltenen und nach der Methode von J. M e t z, W. E b e r t und H. Weicker, Chromatographia, Bd. 6 (1971), S. 259, derivatisierten Hydrolyseprodukte dargestellt. Aus den Figuren ist ersichtlich, daß es sich bei dem

erfindungsgemäß gewonnenen Stoff um ein Peptid oder einen peptidhaltigen Stoff handelt.

Bei Verwendung frischer Pflanzen ode- Pflanzenteile werden Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol bzw. Aceton vorzugsweise ohne Wasserzusatz verwendet. Bei Verwendung getrockneter Drogen werden diese Lösungsmittel mit einem Wasserzusatz von 20 bis 7O°/o verwendet. Die Extraktionstemperatur beträgt 5 bis 50° C, insbesondere etwa 20 bis 20° C.

Aus dem Extrakt wird das Lösungsmittel vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 60° C, insbesondere bei etwa 50° C, unter vermindertem Druck entfernt. Der wäßrige Rückstand wird hierauf mit dem halogenierten niederen aliphatischen Kohlenwasserstoff bei Temperaturen von vorzugsweise etwa 10 bis 50° C extrahiert und dadurch von lipophilen Substanzen befreit. Vorzugsweise wird für diesen Zweck Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff oder Trichloräthylen verwendet. Chloroform ist besonders bevorzugt. Der wäßrige, lipoidfreie Rückstand wird gemäß Verfahrensvariante (a) eingeengt, nitriert und über einen stark sauren Kationenaustauscher in der H+-Form gegeben. Nach dem Neutralwaschen wird der Austauscher mit 1- bis 25°/₀iger wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird eingedampft oder gefriergetrocknet.

Gemäß Verfahrensvariante (b) wird die wäßrige Phase mit dem Chloroform-Phenol-Gemisch extrahiert. Vorzugsweise wird ein Gemisch gleicher Gewichtsteile Chloroform und Phenol verwendet. Die wäßrige Phase wird vorzugsweise zwei- bis dreimal mit dem Chloroform-Phenol-Gemisch ausgeschüttelt. Das Volumverhältnis von wäßriger zu organischer Phase beträgt vorzugsweise etwa 20:1. Die vereinigten Chloroform-Phenol-Extrakte werden anschließend unter Rühren und bei einer Temperatur von vorzugsweise 5 bis 25⁰C in die etwa 5- bis lOfache Menge eines Gemisches aus Äther und Petroläther (Siedebereich 30 bis 60°C) im Volumverhältnis 1: 2 eingetragen. Vorzugsweise wird ein Filtrierhilfsmittel zugesetzt; Diatomeenerde ist besonders bevorzugt. Nach 5- bis 20minutigem Rühren wird abgesaugt und der Rückstand mit Äther phenolfrei gewaschen. Anschließend werden die organischen Stoffe vom Filtrierhilfsmittel mit Methanol oder Äthanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bis zur Sirupkonsistenz eingeengt und unter Rühren in einen Überschuß an Aceton, vorzugsweise die lOfache Menge Aceton eingetropft. Hierbei werden die stark polaren Stoffe mit ILA-Wirkung ausgefällt. Der Niederschlag wird abgetrennt, mit Aceton und Äther nachgewaschen und bei vermindertem Druck bei Raumtemperatur im Exsikkator getrocknet.

Zur weiteren Anreicherung wird das so erhaltene Pulver in wenig Wasser gelöst. Die Lösung wird an einen Kationenaustauscher in der H^-Form gebunden, und der Kationenaustauscher wird mit Wasser neutral gewaschen. Das hierbei erhaltene stark saure Eluat zeigt keine ILA-Aktivität. Bei der anschließenden Elution mit 1- bis 25°/_oiger wäßriger Ammoniaklösung wird die Fraktion mit starker ILA-Wirkung erhalten.

Die Verfahrensvariante (a) hat den Vorteil, daß auf die Chloroform-Phenol-Extraktion verzichtet werden kann. Die nach dem Ausschütteln mit einem halogenierten Kohlenwasserstoff erhaltene wäßrige Phase kann nach Entfernung des gelösten halogenierten Kohlenwasserstoffs sofort auf den Kationenaustauscher in der H+-Form gegeben werden. Bei der anschließenden Elution mit wäßrigen Ammoniaklösungen wird die Fraktion mit ILA-Wirkung erhalten. Bei dieser Verfahrensvariante muß jedoch eine gegenüber der Verfahrensvariante (b) verminderte Ausbeute in Kauf genommen werden.

Zum Vergleich wurde ein handelsüblicher Extrakt aus Kälberblut, der ebenfalls eine ILA-Wirkung aufweist, gemäß Verfahrensvariante (b) gereinigt. Ein Vergleich der so erhaltenen Fraktion mit der gemäß

ίο Verfahrensvarianten (a) bzw. (b) aus Polygonum cuspidatum erhaltenen Fraktion ergab, daß das aus der Pflanze erhaltene Produkt eine wesentlich stärkere ILA-Wirkung hat als das aus dem handelsüblichen Präparat gewonnene Produkt. Der Nachweis erfolgte nach der vorstehend beschriebenen Methode von A. E. R e η ο 1 d et al.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengestellt.

Stoff

Fraktion aus handelsüblichem Kälberblutextrakt

Fraktion aus Polygonum
cuspidatum

Dosis

mg

2,3
1,1
0,5

5,0 2,3

1,1
0,5
0,1

Wirkung wie

25 μΕ

100 μΕ
Insulin

über 100 μΕ

X bis
X

X X

X bis χ

X X X X

Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1

154 kg frische blühende Pflanze von Polygonum cuspidatum werden in einem Kutter zerkleinert und mit 300 kg Methanol mazeriert. Nach 10 Tagen wird das Mazerat abgepreßt. Der erhaltene Rückstand mit einem Gewicht von 74 kg wird erneut mit 150 kg Methanol mazeriert und nach 2 Tagen wieder abgepreßt. Die vereinigten Methanolextrakte werden unter vermindertem Druck auf 100 kg eingeengt und dreimal mit je 20 1 Chloroform ausgeschüttelt. Danach wird der Extrakt dreimal mit je 5 kg eines Chloroform-Phenol-Gemisches (Gewichtsverhältnis 1:1) ausgeschüttelt. Die vereinigten Chloroform-Phenol-Extrakte werden sofort bei 5⁰C in ein Gemisch von 20 1 Diäthyläther und 40 1 Petroläther (Siedebereich 30 bis 60° C), das 1,5 kg Diatomeenerde enthält, eingerührt. Nach 5minutigem Rühren wird der Feststoff abgesaugt und der Filterrückstand mit Diäthyläther phenolfrei gewaschen. Anschließend wird der gewaschene Filterrückstand mit 15 1 Methanol eluiert und dieses Eluat unter vermindertem Druck bis auf Sirupkonsistenz eingeengt. Es werden etwa 200 bis 300 ml Sirup erhalten. Dieser Sirup wird unter Rühren in 51 Aceton getropft. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, mit Aceton gewaschen und im Exsikkator unter vermindertem Druck getrocknet. Rückstand :31g.

50 g stark saurer Kationenaustauscher in der H⁺-Form wird in eine Säule (50 cm Höhe und 2 cm Durchmesser) gefüllt, und die Füllung wird mit Wasser gewaschen. 2 g des vorstehend erhaltenen

acetonunlöslichen Produktes werden in wenig Wasser gelöst, und die Lösung wird auf die Säule gegeben. Die Säule wird so lange mit Wasser bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 1 Tropfen pro Sekunde eluiert, bis das Eluat nicht mehr sauer reagiert. Anschließend wird die Säule mit 10%iger Ammoniaklösung und nach beginnender basischer Reaktion des Eluats mit 30 ml 25%iger Ammoniaklösung eluiert. Durch das basisch reagierende Eluat wird so lange Stickstoff geleitet, bis die Lösung fast neutral reagiert. Anschließend wird die Lösung gefriergetrocknet. Rückstand: 0,8 g.

Beispiel 2

2,5 kg getrocknete, gemahlene oberirdische Teile von Polygonum cuspidatum werden mit 20 1 60°/₀igem Äthanol percoliert. Das Percolat wird unter vermindertem Druck vom Äthanol befreit und der wäßrige Rückstand dreimal mit je 11 Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird dann unter verminderten! Druck auf die Hälfte ihres Ausgangsvolumens eingedampft. Nach 2tägiger Aufbewahrung im Kühlschrank wird der ausgefallene Niederschlag abgesaugt und das Filtrat auf eine mit 200 g stark saurem Kationenaustauscher in der H⁺-Form gefüllte Säule gegeben. Die Säule wird so lange gewaschen, bis das Filtrat nicht mehr sauer reagiert. Anschließend wird die Säule, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit Ammoniaklösungen eluiert. Nach Austreiben des Ammoniaks wird die Lösung gefriergetrocknet. Rückstand: 1,2 g.

Beispiel 3

47 kg frisches Kraut von Mulgedium alpinum werden im Kutter zerkleinert und mit 80 kg 80°/₀igem Äthanol mazeriert. Nach 2 Tagen wird das Mazerat abgepreßt und der Extrakt unter vermindertem Druck auf 12 1 eingeengt. Nach 2tägiger Aufbewahrung im Kühlschrank wird der Niederschlag abfiltriert und das Filtrat dreimal mit je 11 Chloroform ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird wie im Beispiel 1 weiter aufgearbeitet. Acetonunlöslicher Rückstand: 35,6 g. Rückstand nach Passage über den Kationenaustauscher: 14,2 g. Bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose verhält sich dieser Stoff in gleicher Weise wie der gemäß Beispiel 1 bzw. 2 gewonnene Stoff.

Beispiel 4

1 kg getrocknete, fein gemahlene oberirdische Teile von Datisca cannabina werden mit 10 1 50°/₀igem Isopropanol percoliert. Das Percolat wird unter vermindertem Druck vom Isopropanol befreit und der wäßrige Rückstand dreimal mit je 500 ml Chloroform ausgeschüttelt. Anschließend wird die wäßrige Phase dreimal mit je 200 ml eines Gemisches gleicher Gewichtsteile von Chloroform und Phenol ausgeschüttelt. Die vereinigten Chloroform-Phenol-Extrakte werden in ein Gemisch aus 11 Diäthyläther und 2 1 Petroläthei (Siedebereich 40 bis 6O⁰C) eingerührt. Dieses Gemisch wird mit 100 g Diatomeenerde versetzt. Nach lOminutigem Rühren wird das Gemisch filtriert. Der Filterrückstand wird mit Diäthyläther phenolfrei gewaschen. Danach wird der Filterrückstand mit 500 ml Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei 30⁰C bis zur Sirupkonsistenz eingedampft. Der erhaltene Sirup wird in das lOfache Volumen Aceton eingerührt. Der gebildete Niederschlag wird über eine feinporige Glasfilternutsche abgesaugt und getrocknet. Rückstand: 5 g.

5 g des Rückstandes werden auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise an 50 g des Kationenaustauschers adsorbiert. Die weitere Aufarbeitung erfolgt gemäß Beispiel 1. Rückstand: 2 g. Bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose verhält sich dieser Stoff in gleicher Weise wie der gemäß Beispiel 1 bzw. 2 gewonnene Stoff.

Die erfindungsgemäß hergestellten Wirkstoffe können zur Behandlung von Stoffwechselstörungen, die auf eine verminderte Insulinwirkung zurückzuführen sind, verwendet werden. Zu diesem Zweck werden die erfindungsgemäß gewonnenen Stoffe oral oder vorzugsweise parenteral oder rektal appliziert. Zur Herstellung von Arzneipräparaten können übliche Trägerund Hilfsstoffe und Verdünnungsmittel verwendet werden. Zur oralen Applikation werden z. B. Dragees mit einem dünndarmlöslichen Überzug verwendet. Injektions- oder Infusionspräparate werden mit physiologischer Kochsalzlösung hergestellt. Die Tagesdosis für Erwachsene beträgt etwa 25 bis 50 mg Wirkstoff,

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung eines Stoffes mit insulinähnlicher Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man den oberirdischen Teil der Pflanze Polygonum cuspidatum, Jviulgedium alginum oder Datisca cannabina mit Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol oder Aceton, gegebenenfalls unter Wasserzusatz, bei einer Tem- ίο peratur von 5 bis 50⁰C extrahiert, aus dem Extrakt das Lösungsmittel bei 20 bis 60°C unter vermindertem Druck entfernt, den wäßrigen Rückstand mittels eines halogenierten niederen aliphatischen Kohlenwasserstoffes durch Extraktion bei 10 bis 50⁰C von lipophilen Substanzen befreit und den lipoidfreien Rückstand entweder

(a) zur Hälfte einengt, filtriert und über einen stark sauren Kationenaustauscher in der H-Form gibt, den Austauscher neutral wäscht, ^ao anschließend mit 1- bis 25prozentiger wäßriger Ammoniaklösung eluiert und das Eluat nach dem Austreiben des Ammoniaks unter schonenden Bedingungen eindampft oder gefriertrocknet oder *⁵

(b) mit Chloroform-Phenol-Gemischen mit einem Phenolgehalt von 20 bis 50 Gewichtsteilen extrahiert, diesen Extrakt bei 5 bis 25° C mit der etwa 5- bis lOfachen Menge eines Gemisches aus Äther und Petroläther (Siedebereich 30 bis 6O⁰C), im Volumenverhältnis 1: 2, und Diatomeenerde versetzt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, mit Äther phenolfrei wäscht, in Methanol oder Äthanol löst, diese Lösung bis zur Sirupkonsistenz einengt, mit einem Überschuß an Aceton versetzt, den abgetrennten Niederschlag in Wasser löst und diese Lösung wie unter a) beschrieben an einem Kationenaustauscher weiterreinigt.

2. Arzneipräparate gegen Hyperlipidämien, gekennzeichnet durch einen Gehalt des Verfahrensprodukts gemäß Anspruch 1.

35