DE2159923A1

DE2159923A1 - Verfahren zur gewinnung von stoffen mit insulinaehnlicher wirkung aus pflanzen und diese stoffe enthaltende arzneipraeparate

Info

Publication number: DE2159923A1
Application number: DE19712159923
Authority: DE
Inventors: Spaeter Genannt Werden Wird
Original assignee: Dr Willmar Schwabe GmbH and Co KG
Current assignee: Dr Willmar Schwabe GmbH and Co KG
Priority date: 1971-12-02
Filing date: 1971-12-02
Publication date: 1973-06-14
Also published as: DE2159923C3; DE2159923B2

Description

Verfahren zur-Gewinnung von Stoffen mit insulinähnlicher Wirkung aus Pflanzen und diese Stoffe enthaltende Arzneipräparate Im menschlichen und tierischen Serum kommen Faktoren vor, die im Fettgewebe insuliähnliche Wirkungen d.h."insulin like activityrt ILA-Wirkung, zeiqen. Insulin drängt im Fettgewebe die Fettmobili-und sierung zurück /begünstigt die Bildung von Fett aus Kohlenhydraten ebenso wie die Ablagerung von Triglyceriden. Entsprechend wird der Gehalt des Blutes an Lipiden, vor allem von freien Fettspuren, erniedrigt. Da diese als Insulininhibitoren wirken, wird die Insulinwirkung durch ILA-Stoffe verstärkt.
Der Nachweis der ILA-Wirkung wird im epididymalen Fettgewebe von 14 männlichen Ratten mit Glucose-(l)-C14 nachgewiesen. Durch Insulin bzw. durch Stoffe mit ILA-Wirkung wird diese in Glycerin und Fett 14 umgewandelt und das dabei freiwerdende CO2 gemessen. Durch Vergleich mit Standard-Insulin wird die ILA-Aktivät ermittelt; vgl. A.E. Renold et al., J. clin. Invest., Bd. 39 (1960), S. 1487 und G. Ehrhart und II. Ruschig, Arzneimittel, Verlag Chemie, 1968, S. 888.
Substanzen, die ILA-Wirkung zeigen, eignen sich zur Behandlung von Krankheiten, die durch bestimmte Fettstoffwechselstörungen hervorgerufen werden.
Plasmafaktoren, die eine ILA-Wirkung aufweisen, werden schon seit einiger Zeit therapeutisch in Form von eiweiß freien Extrakten äus Kälberblut "Actyhämyl(R)" verwendet, ohne daß die für die Wirkung verantwortlichen Substanzen aufgeklärt werden konnten; vgl. K.F.
Weinges et al, Arzneim. Forsch. Bd.'18, tal968), S. 1019.
Aufgabe der Erfindung ist es, neue Stoffe oder Stoffgemische mit ausgeprägter ILA-Wirkung zu schaffen.
Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß Pflanzen derartige Stoffe enthalten können. Der Nachweis, daß bestimmte Pflanzen Stoffe mit ILA-Wirkung enthalten, läßt sich nach dem vorstehend angegebenen Test von A.E. Renold et al. führen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von Stoffen mit insulinähnlicher Wirkung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Pflanzen der Gruppe Datisca cannabina, Emblica officinalis, Gunnera manicata, Mulgedium alpinum, Phytolacca abyssillica, Peter;' ,1r:8 spinosum, Polygonum cuspidatwn, Soymida febrifuga und SyzygiunI Jambolanum mit wassermischbaren organischen Lösungsmitteln extrahiert, den Extrakt unter schenenden Bedingungen vom organischen Lösungsmittel befreit, den wässrigen Rückstand nach üblichen Methoden von lipophilen Substanzen befreit, den lipoidfreien Rückstand entweder (a) an einen Kationenaustauscher in der H+-Form bindet, diesen mit einer wässrig-ammoniakalischen Lösung eluiert und das Eluat unter schonenden Bedingungen eindampft oder gefriertrocknet oder (b) mit Chloroform-Phenol-Gemischen mit einem Phenolgehalt von 20 bis 50 Prozent extrahiert, diesen Extrakt mit einemUberschuß eines unpolaren organischen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemlsches, das ein Lösungsmittel für das Phenol darstellt, versetzt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, phenolfrei wäscht, den Niederschlag in wenig Methanol oder Äthanol löst, diese Lösung mit überschüssigem Aceton versetzt, den Niederschlag abtrennt, jn Wasser löst, an einen Kationenaustauscher in der H+-Form bindet, diesen mit Wasser neutral wäscht und hierauf mit einer wässrig-ammoniakalischen Lösung eluiert und das Eluat unter schonenden Bedingungen eindampft oder gefriertrocknet.
Bei den erfindungsgemäß gewonnenen Stoffen mit ILA-Wirkung handelt es sich um stickstoffhaltige polare Verbindungen, die in Wasser leicht löslich sind.
Fig. 1 zeigt das Gaschromatogramm des erfindungsgemäß hergestellten Produktes vor der Hydrolyse (zugesetzter Standard: Ornithin).
In Fig. 2 ist das Gaschro?ratogramm der nacii 24 24 stündiger Ilydrolyse mit 6n Salzsäure bei 1100C erhaltenenund nach dcr rsethode von J. Metz, W. Ebert und H. Weicker, Chromatographia, Band 6 (1971), S. 259 derivatisierten Hydrolyseprodukte dargestellt. Aus den Figuren ist ersichtlich, daß es sich bei dem erfindungsgemäß hergestellten Produkt um ein Peptid oder einen peptidhaltigen Stoff handelt Im erfindungsgemäßen Verfahren werden aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit Datisca cannabina, Mulgedium alpinum und Polygonum cuspidatum bevorzugt.
Spezielle Beispiele für bevorzugt verwendete wassermischbare organische Lösungsmittel sind Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol und Aceton. Bei Verwendung frischer Pflanzen oder Pflanzen teile wird das wassermischbare organische Lösungsmittel vorzugsweise ohne Wasserzusatz verwendet. Bei Verwendung getrockneter Drogen werden diese Lösungsmittel mit einem Wasserzusatz von 20 bis 70 Prozent verwendet. Die Extraktionstemperatur beträgt vorzugsweise 5 bis 500C, insbesondere etwa 20 bis 30°C.
Aus dem Extrakt wird das organische Lösungsmittel vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 600C, insbesondere bei etwa 500C unter vermindertem Druck entfernt. Der wässrige'Rückstand wird hierauf mit dem lipophilen, mit Wasser nicht mischbaren Lösung mittel bei Temperaturen von vorzugsweise etwa 10 bis 500C extrahiert. Vorzugsweise wird für diesen Zweck ein halogenierter, niederer aliphatischer Kohlenwasserstoff verwendet, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff oder Trichonthylen.
Chloroform ist besonders bevorzugt. Die vcissrige, lipoidfreie Phase zeigt bereits eine geringe ILA-Wirkung. Sie wird gemaß Verfahrensvariante (a) auf einen Kationenaustauscher in der H+-Form gegeben und mit 1 bis 25prozentiger wässriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird eingedampft oder gefriergetrocknet.
Gemäß Verfahrensvariante (b) wird die wässrige Phase mit dem Chloroform-Phenol-Gemisch extrahiert. Vorzugsweise wird ein Gemisch gleicher Gewichtsteile Chloroform und Phenol verwendet. Die wSssrige Phase wird vorzugsweise zwei- bis dreimal mit dem Chloroform-Phenol-Gemisch ausgeschüttelt. Das Volumverhältnis von wässriger zu organischer Phase beträgt vorzugsweise etwa 20 : 1. Die vereinigten Chloroform-Phenol-Extrakte werden anschließend unter Rühren und bei einer Temperatur von vorzugsweise 5 bis 250C in-die etwa fünf- bis zehnfache Menge eines Gemisches aus einem niederen aliphatischen äther und einem niedrigsiedenden aliphatischen Kohlenwasserstoff eingetragen. Ein Gemisch aus Diäthyläther und Petroläther (Siedebereich 30 bis 600C) im Volumverhältnis 1 -: 2 ist bevorzugt. Vorzugsweise wird ein Filtrierhilfsmittel zugesetzt; Diatomeenerde ist besonders bevorzugt. Nach 5 bis 20minUtigem Rühren wird abgesaugt und der Rückstand so lange mit Äther -gewaschen bis der Phenolgeruch nicht mehr wahrnehmbar ist. Anschließend werden die organischen Stoffe vom Filtrierhilfsmittel mit einem niederen aliphatischen Alkohol eluiert. Methanol ist hierbei besonders bevorzugt. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bis zur Sirupkonsistenz eingeengt und unter Rühren in die zehnfache Menge Aceton eingetropft. Hierbei werden die stark polaren Stoffe mit ILA-Wirkung ausgefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit Aceton und äther nachgewaschen und bei vermindertem Druck bei Raumtemperatur im Exsiccator getrocknet.
Zur weiteren Anreicherung wird das so erhaltene Pulver in wenig Wasser gelöst. Die Lösung wird an einen Kationenaustauscher in der H+-Form gebunden, und der Kationenaustauscher wird mit Wasser neutral gewaschen. Das hierbei erhaltene stark saure Eluat zeigt keine ILA-Aktivität. Bei der anschließenden Elution mit 1 bis 25ptozentiger wässriger Ammoniaklösung wird die Fraktion mit starker ILA-Wirkung erhalten.
Die Verfahrensvariante (a) hat den Vorteil, daß auf die Chloroform-Phenol-Extraktion verzichtet werden kann. Die nach dem Ausschttteln mit einem halogenierten Kohlenwasserstoff erhaltene wässrige Phase kann nach EntEernung des gelösten halogenierten Kohlenwasserstoffs sofort auf den Kationenaustauscher in der H+-Form gegeben werden.Bei der anschließenden Elution mit aSssrigen Ammoniaklösungen wird die Fraktion mit ILA-Wirkung erhalten.
Bei dieser Verfahrensvariante muß jedoch eine gegenüber der der fahrensvariante (b) verminderte Ausbeute in Kauf genommen werden.
Zum Vergleich wurde ein handelsüblicher Extrakt aus Kälberblut, der ebenfalls eine ILA-Wirkung aufweist, gemäß Verfahrensvariante (b) gereinigt. Ein Vergleich der so erhaltenen Fraktion mit der gemäß Verfahrensvariante (b) aus Polygonum cuspidatum erhaltenen Fraktion ergab, daß das aus der Pflanze erhaltene Produkt eine wesentlich stärkere ILA-Wirkung hat als das aus dem handelsüblichen Präparat gewonnene Produkt. Der Nachweis erfolgte nach der vorstehend beschriebenen Methode von A. E. Renold et al.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengestellt.
Tabelle Wirkung wie Stoff Dosis, 25 µe 100 tE über lOOtE Insulin mg Fraktion aus handelsüblichem RAlberblutextrakt 5 x 2,3 x 1,1 x bis x 0,5 x Fraktion aus Polygonum cuspidatum 5,0 x 2,3 x 1,1 0,5 x 0,1 x bis x Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 154 kg frische blühende Pflanze von Polygonum cspidatum werden in einem Kutter zerkleinert und mit 300 kg Methanol mazeriert. Nach 10 Tagen wird das Mazerat abgepreßt. Der erhaltene Rückstand mit einem Gewicht von 74 kg wird erneut mit 150 kg Methanol mazeriert und nach 2 Tagen wieder abgepreßt. Die vereinigten Methanolextr<kte werden untcr srermindertem Druck auf 100 kg eingeengt und drei-Liter mal mit je 20 / Chloroform ausgeschüttelt. Danach wird der Extrakt dreimal mit je 5 kg eines Chloroform-Phenol-Gemisches (Gewichtsverhältnis 1 : 1) ausgeschUttelt. Die vereinigten Chloroform -Phenol-Extrakte werden sofort bei 50C in ein Gemisch von 20 Liter Diäthyläther und 40 Liter Petroläther (Siedebereich 30 bis 600C>, das 1,5 kg Diatomeenerde enthält, eingerührt. Nach $minütigem Rühren wird der Feststoff abgesaugt und der Filterrückstand mit Diäthyläther phenolfrei gewaschen. Anschließend wird der gewaschene Filterrückstand mit 15 Liter Methanol eluiert und dieses Eluat unter vermindertem Druck bis auf Sirupkonsistenz eingeengt. Es werden etwa 200 bis 300 ml Sirup erhalten Dieser Sirup wird unter Rühren in 5 Liter Aceton getropft. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt,mit Aceton gewaschen und im Exsiccator unter vermindertem Druck getrocknet. Rückstand; 31 g.
50 g stark saurer Kationenaustauscher in der H+-Form wird in eine Säule (50 cm öhe und 2 cm Durchmesser) gefüllt, und die Füllung wird mit Wasser gewaschen. 2 g des vorstehend erhaltenen acetonunlöslichen Produktes werden irf wenig Wasser gelöst, und die Lösung wird auf die Säule gegeben. Die Säule wird so lange mit Wasser bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 1 Tropfen pro Sekunde eluiert, bis das Eluat nicht mehr sauer reagiert. Anschließend wird die Säule mit loprozentiger Ammoniaklösung und nach beginnender basischer Reaktion des Eluats mit 30 ml 25prozentiger Ammoniaklösung eluiert. Durch das basisch reagierende Eluat wird so lange Stickstoff geleitet, bis die Lösung fast neutral reagiert. Anschließend wird die Lösung gefriergetrocknet.
Rückstand: 0,8 g.
Beispiel 2 2,5 kg getrocknete, gemahlene oberirdische Teile von Polygonum cuspidatum werden mit 20 Liter 60prozentigem Äthanol percoliert.
Das Percolat wird unter vermindertem Druck vom Äthanol befreit und der wässrige Rückstand dreimal mit je 1 Liter Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird dann unter vermindertem Druck auf die Hälfte ihres Ausgangsvolumens eingedampft. Nach zweitägiger Aufbewahrung im Kühlschrank wird der ausgefallene Niederschlag abgesaugt und das Filtrat auf eine mit 200 g stark saurem Kationenaustauscher in der +-Form gefüllte Säule gegeben.
Die Säule wird so lange gewaschen, bis das Filtrat nicht mehr sauer reagiert. Anschließend wird die Säule, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit Ammoniaklösungen eluiert. Nach Austreiben des Ammoniaks wird die Lösung gefriergetrocknet. Rückstand: 1,2 g.
Beispiel 3 47 kg frisches Kraut von Mulgedium alpinum werden im Kutter zerkleinert und mit 80 kg 80prozentigem Äthanol mazeriert. Nach zwei Tagen wird das Mazerat abgepreßt und der Extrakt unter vermindertem Druck auf 12 Liter eingeengt. Nach 2tägiger Aufbewahrung im Kühlschrank wird der Niederschlag abfiltriert und das Filtrat dreimal mit je 1 Liter Chloroform ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird wie in Beispiel 1 weiter aufgearbeitet. Acetonunlöslicher Rückstand: 35,6 g. Rückstand nach Passage über den Kationenaustauscher: 14,2 g.
Beispiel 4 1 kg getrocknete, fein gemahlene oberirdische Teile von Datisca cannabina werden mit 10 Liter 50prozentigem Isopropanol percoliert. Das.Percolat wird unter vermindertem Druck vom Isopropanol befreit und der wässrige Rückstand dreimal mit je 500 ml Chloroform ausgeschüttelt. Anschließend wird die wässrige Phase dreimal mit je 200 ml eines Gemisches gleicher Gewichtsteile von Chloroform und Phenol ausgeschüttelt. Die vereinigten Chloroform-Phenol-Extrakte werden in ein Gemisch aus 1 Liter Diäthyläther und 2 Liter Petroläther (Siedebereich 40 bis 600C) eingerührt. Dieses Gemisch wird mit 100 g Diatomeenerde versetzt. Nach lOminütigem Rühren wird das Gemisch filtriert. Der Filterrückstand wird mit Diäthyläther phenolfrei gewaschen. Danach wird der Filterrückstand mit 500 ml Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei 300C bis zur Sirupkonsistenz eingedampft Der erhaltene Sirup wird in das zehnfache Volumen Aceton eingerührt.
Der gebildete Niederschlag wird über eine feinporige Glasfilternutsche abgesaugt und getrocknet. Rückstand: 5 g.
5, g des Rückstandes werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise an 50 g des Kationenaustauschers adsorbiert. Die weitere Aufarbeitung erfolgt gemäß Beispiell. Rückstand:2 g.
Die erfindungsgemäß hergestellten Wirkstoffe können zur Behandlung von Stoffwechselstörungen, die auf eine verminderte Insulinwirkung zurückzuführen sind, verwendet werden. Zu diesem Zweck werden die erfindungsgemäß gewonnenen Stoffe vorzugsweise parenteral oder rektal appliziert. Zur Herstellung von Arzneipräparaten önen übliche Träger- und hilfsstoffe und verdiinnungsmittel verwendet werden.

Claims

P a t e n t a n s r Ü c h e

1. Verfahren zur Gewinnung von Stoffen mit insulinähnlicher Wirkung, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man Pflanzen der Gruppe Datisca cannabina, Emblica officinalis, Gunnera manicata, Mulgedium alpinum, Phytolacca abyssinica, Poterium spinosum, Polygonum cuspidatum, Soymida febrifuga und Syzygium Jambolanum mit wassermischbaren organischen Lösung mitteln extrahiert, den Extrakt unter schonenden Bedingungen vom organischen Lösungsmittel befreit, den wässrigen Rückstand nach üblichen Methoden von lipophilen Substanzen befreit, den lipoidfreien Rückstand entweder (a) an einen Kationenaustauscher in der H+-Form bindet, diesen mit einer wässrig-ammoniakalischen Lösung eluiert und das Eluat unter schonenden Bedingungen eindampft oder cgefriertrocknet oder (b) mit Chloroform-Phenol-Gemischen mit einem Phenolgehalt von 20 bis 50 Prozent extrahiert, diesen Extrakt mit einem über schuß eines unpolaren organischen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches, das ein Lösungsmittel für das Phenol darstellt, versetzt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, phenolfrei wäscht, den Niederschlag in wenig Methanol oder Äthanol löst, diese Lösung mit überschüssigem Aceton versetzt den Niederschlag abtrennt, in Wasser löst, an einen Katwonenaustauscher in der H+-Form bindet£ diesen mit Wasser neutral wäscht und hierauf mit einer wässrig-arroniakalischen Lösu.n eluiert und das Eluat unter schonenden Bedingungen eindampft oder gefriertrocknet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Datisca cannabina, Mulgedium alpinum und Polygonum cuspidatum extrahiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als wassermischbares organisches Lösungsmittel Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol oder Aceton einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion bei 5 bis 500C, insbesondere bei etwa 20 bis 3O0C,durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das organische Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei Temperaturen von 20 bis 60°C, insbesondere bei etwa 50)C, entferne.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den wässrigen Rückstand mit dem lipophilen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel bei Temperaturen von etwa 10 bis OOC extrahiert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion mit Methylenchlorid, Tetrachiorkohlenstoff, Trichlorthylen und insbesondere mit Chloroform durchfUhrt.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch gleicher Cewichtsteile Chloroform und Phenol cinsetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die wässrige Phase zwei- bis dreimal mit dem Chloroform-Phenol-Gemisch bei einem Volumverhältnis von wässriger Phase zu organischer Phase von etwa 20 : 1 ausschüttelt.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die vereinigten Chloroform-Phenol-Extrakte bei einer Temperatur von 5 bis 25 0C in die etwa fünf- bis zehnfache Menge eines Gemisches aus einem niederen aliphatischen Äther und einem niedrigsiedenden aliphatischen Kohlenwasserstoff einträgt.

11. Verfahren-nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Diäthyläther und Petroläther (Siedebereich 30 bis 60°C) im Volumverhältnis 1 : 2 einsetzt.

12. Verfahren nach Anspruch 10 ound 11, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Gemisch ein Filtrierhilfsmittel, insbesondere Dlatomeenerde, zusetzt.

13. Verfahren nach Anspruch l'bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die organischen Stoffe vom Filtrierhilfsmittel mit Methanol eluiert.

14. Arzneipräparate, gekennzeichnet durch einen Gehalt eines nach Anspruch 1 bis 13 hergestellten Stoffes als Wirkstoff.