DE2135492C3

DE2135492C3 - Gewinnung eines Anacardhim occidentale L-Rindenextraktes mit antihypertensiver Wirkung

Info

Publication number: DE2135492C3
Application number: DE2135492A
Authority: DE
Inventors: Paulette Giono-Barber; Yvonne Thuillier
Original assignee: Laboratoires Albert Rolland SA
Current assignee: Laboratoires Albert Rolland SA
Priority date: 1970-07-16
Filing date: 1971-07-15
Publication date: 1979-06-07
Also published as: ZA714631B; NO132377C; DE2135492A1; DE2135492B2; NO132377B; IL37312A0; FR2100918B1; AU458781B2; FI50298B; CA960967A; RO63588A; IL37312A; NL7109742A; DK128100B; BE770017A; CS154694B2; GB1344265A; CH533138A; SE377045B; AT306230B

Description

2. Blutdrucksenkendes Arzneimittel, dadurch π gekennzeichnet, daß es 1 bis 95 Gew.-% des Produkts, das nach Anspruch 1 erhalten worden ist, enthält.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung eines Anacardium occidentale L-Rindenextraktes mit antihypertensiver Wirkung.

Der Anacardium occidentale L oder Kaschubaum ist r. ein Baum nordamerikanischen Ursprungs, der vielfach in Senegal angepflanzt wird. Die Früchte finden äußere Anwendung in der Medizin, wie für die Behandlung von Geschwüren und Warzen. Die hauptsächliche therapeutische Anwendung der Frucht liegt auf dem Gebiet der «ι Leprabekämpfung: Man läßt den Saft des Mesokarps auf die Lepfaflecke tropfen, Und dank der blasenbildenden Wirkung desselben kann man dann auf die künstlich erzeugten Schädigungen antilepröse Pasten auftragen.

Nach Untersuchungen eines brasilianischen For- f>i scherteams (A g u i a r u. a.; siehe »Anais da Faculdade da Medicina da Universidade do Recife«, Bd. 18, Nr. 2, 1958, Seiten 193-197) ist außerdem bekannt, daß die Rinde des Anacardium occidentale L einen blutzuckersenkenden Wirkstoff enthält, der erhalten wird, wenn man Pulver der Anacardiumrinde einer Behandlung mit siedendem Wasser unterzieht (Herstellung einer Abkochung). Neben der blutzuckersenkenden Wirksamkeit des auf diese Weise erhaltenen Extraktes ergab die Behandlung von Ratten mit einer solchen Abkochung von 50 g Ringe pro Liter Wasser keinerlei Hinwe'se auf eine antihypertensive Wirkung.

In der DE-OS 20 34 708 wurde ein Verfahren zur Extraktion einer antihypertensiv wirksamen Fraktion angegeben, das sich vom Extraktionsverfahren nach Agu iar deutlich unterscheidet und in einer wäßrigen Mazeration von Anecardium occidentale L-Rinde unter Lichtabschluß bei niedrigen Temperaturen von am besten 0 bis 5° C besteht

Der nach dem vorstehend skizzierten Verfahren erhaltene Extrakt zeigt überraschenderweise eine antihypertensive Wirksamkeit, während die nach dem älteren Verfahren erhaltene Abkochung von Anacardium occidentaie Rinde, die in kaltes wasser gegeben und dann zum Sieden erhitzt wird, keinerlei drücksenkende Wirksamkeil besitzt. Dieser Umstand beweist, daß es notwendig ist, bei niedriger Temperatur und unter Lichtabschluß zu arbeiten, wenn man einen Extrakt erhalten will, der mit einer antihypertensiven Wirksamkeit ausgestattet ist.

Gemäß der Erfindung wird nun ein neues Verfahren zur Extraktion von Anacardium occidentale L-Rinde angegeben, das zu einem sehr viel reineren Produkt führt als das in der DE-OS 20 34 708 beschriebene Verfahren. Ausgangspunkt für das erfindungsgemäße Verfahren bildet die Feststellung, daß das antihypertensiv wirksame Prinzip in den Gerbstoffen bzw. Tanninen der Anacardiumrinde enthalten ist

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung eines Anacardium occidentale L-Rindenextraktes mit antihypertensiver Wirkung ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die zerkleinerte Rinde mit Petroläther extrahiert,

b) den nach Abtrennung der Petroläther-Fraktion verbleibenden unlöslichen Rückstand mit Diäthyläther extrahiert.

c) den nach Abtrennung der Diäthyläther-Fraktion verbleibenden unlöslichen Rückstand mit Äthanol, Methanol oder Mischungen dieser Alkohole untereinander oder Mischungen dieser Alkohole mit Wasser extrahiert,

d) den nach Abtrennung des unlöslichen Rückstandes und Einengen der alkohollöslichen Fraktion unter vermindertem Druck erhaltenen Trockenexlrakt in Wasser auflöst und den antihypertensiven Wirkstoff durch Ausfällen mit Alkaloiden oder Hautpulver gewinnt,

wobei die Extraktionen nach a), b) und c) unter Lichtabschluß und bei niedriger Temperatur vorgenommen werden und das Einengen im Vakuum bei einer Temperatur unter 6O⁰C erfolgt,

e) 5 Gewichtsteile dieses Trockenextraktes in Wasser löst und dazu eine wässerige Coffeinlösung mit 1,32 Gewichtsteilen Coffein gibt,

f) die so erhaltene Ausfällung in einer minimalen Menge Methanol in Lösung bringt, Wasser hinzugibt und das Coffein mit Chloroform extrahiert,

g) die Melhanol-Wasser-Phase im Vakuum bei einer Temperatur unter 60"C bis zur Trocknung einengt,

das so erhaltene Pulver in der kleinütmögljchen Menge Methanol in Lösung bringt, eine Ausfällung durch Zugabe von Dimethyläther vornimmt und den Niederschlag nach Abtrennung des Filtrats gewinnt. -,

Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein blutdrucksenkendes Arzneimittel, das I bis 95 Gewichtsprozent des Produkts, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten v/orden ist, enthält. |_U

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die zerkleinerte Rinde des Anacardium occideintale L mit Lösungsmittel steigender Polarität behandelt. Dabei werdeii zunächst die in der Rinde enthaltenen Wachse und Fette durch Behandlung mit Petroläther und dann ι -, mit Diäthyläther entfernt Der verbleibende unlösliche Rückstand wird einer weiteren Extraktion mit einem Lösungsmittel unterworfen, in dem die im Ausgangsmaterial enthaltenen Tannine in Lösung gehen können. Für die Auflösung der Tannine kennt man diverse >o Lösungsmittel wie Wasser, Alkohole und Aceton. Diess sind jedoch nicht alle geeignet, denn es wurde gefunden, daß die Extraktion mit Aceton keine gute Ausbeute an gesuchtem Wirkstoff ergibt. Weiter wurde festgestellt, daß die für die Wirkstoffextraklion geeigneten Lösungs- _>-, mittel durch niedere Alkohole, wie Methanol und Äthanol sowie ihre Mischungen untereinander und mit Wasser gebildet v/erden.

Die minimale Zeitdauer jeder Extraktionsbehandlung beträgt 3: Stunden. Es ist jedoch vor allem im _J() Anfangsstadium a) zweck näßig, die Behandlungsdauer über diesen Mindestv/ert zu steigern, wenn die Rinde nicht fein zerkleinert ist; unter solchen Bedingungen ist vielmehr eine 7eitdauer für die Extraktion mit Petroläther von zu rundest 8 Stunden vorzuziehen, j-, damit gute Ergebnisse erhalten werden

Eine besonders gute Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung eines antihypertensiv wirksamen Prinzips, ausgehend von Anacardium occidental'B L-Rinde, besteht darin, daß man

a) die Rinde in Mengenverhältnissen von 20 bis 80 g pro Liter Extraktionsmittel mit Pe"-oläther behandelt,

b) den nach Abtrennung der Petnläther-Fraktion 4-, verbleibenden unlöslichen Rückstand imit 1 I Diäthyläther behandelt,

c) den nach Abtrennung der Diäthyläthor-Fraktion verbleibenden unlöslichen Rückstand mit 1 I eines Lösungsmittels behandelt, das durch Äthanol, Methanol oder Mischungen dieser Alkohole untereinander oder Mischungen dieser Alkohole mit Wasser gebildet wird und

d) nach Abtrennung des im alkoholhaltigen Lösungsmittel unlöslichen Rückstandes aus der löslichen Fraktion durch Einengen im Vakuum bei einer Temperatur unter 6O⁰C einen Trockenextrakt herstellt, den man in Wasser auflöst, und daß man den interessierenden Wirkstoff aus dieser wäßrigen Lösung durch Ausfällung mit Coffein od«r (lautpulver gewinnt,

wobei die Extraktionen a), b) und c) zumindest etwa 3 Stunden lang unter Lichtabschluß und bei einer Temperatur zwischen 0 und 15°C und am besten zwischen 2 und 5° C durchgeführt Werden.

Das für die Auflösung der Tannine in Stufe c) bevorzugte Lösungsmittel ist eine Mischung von Wasser und Äthanol oder Wasser und Methanol mit 35 bis 85 Vol.-% Alkohol, sm besten 75% Alkohol.

Zur Ausfällung der den antihypertensiven Wirkstoff enthaltenden Tannine benutzt man entweder ein Alkaloid oder Hautpulver. Von den Alkaloiden ergab Coffein bei Einwirkung auf den durch Einengen oder bei (c) löslicher Fraktion erhaltenen Trockenextrakt gute Ergebnisse. Man löst daher 5 Gewichtsteile dieses Trockenextraktes in Wasser und gibt dazu eine wäßrige Coffeinlösung mit 1,32 Gewichtsteilen Coffein. Im allgemeinen werden dazu 5 g Trockenextrakt in 30 ml Wasser gelöst und mit 110 ml einer wäßrigen Coffeinlösung mit 12 g/l umgesetzt.

Bei Stufe f) des erfindungsgemäßen Verfahrens löst man den Niederschlag in etwa 10 bis 20 ml Methanol auf (für 5 g Trockenextrakt), gibt 250 ml Wasser hinzu (für die oben angegebenen Mengen) und extrahiert dreimal mit Chloroform (jeweils mit 10 bis 100 ml, am besten 15 bis 50 ml Chloroform für die oben angegebenen Mengen).

Die Reinigung gemäß g) dient - wie weiter unten deutlich werden wird - einer Verminderung der Toxizität des antihypertensiv wirkenden Prinzips.

Hautpulver ist ein von Lohgerbern zur Kennzeichnung der Tanninine benutztes Reagenz (die Tannine werden von Hautpulver adsorbiert). Die Rückgewinnung der adsorbierten Tannine erfolgt am besten durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, wobei das Produkt dann bei Bedarf gereinigt wird, wie für den Extrakt der Methanol-Wasser-Phase angegeben wurde.

Die Auswahl der vorstehend erläuterten aufeinanderfolgenden Operationen ist das Ergebnis von parallel durchgeführten chemKhen und pharmacodynamischen Untersuchungen, durch die eine mögliche Zersetzung, Verdünnung oder Konzentrierung des Wirkstoffs während der verschiedenen Behandlungen gegenüber einem durch wäßrige Mazeration von 50 g pro Liter nach der obengenannten DE-OS erhaltenen Extrakt nachgewiesen werden konnte.

Die Rinde wurde nacheinander mit Lösungsmitteln steigender Polarität ausgezogen und die verschiedenen Extrakte wurden nach den beiden folgenden Verfahren überprüft:

1) Indirektes Verfahren:

Untersuchung an Ratten mit Normaldruck, Karotid-Überdruck und renalem Überdruck bei oraler Verabreichung oder Injektion;

2) »Chirurgische« Methode:

Unter Anästhesie mit Karotidkanüle und ohne Anästhesie mit bleibender Abdominalaortenkanüle; die untersu«.nU'n Ratten hatten ein Gewicht zwischen 250 und 300 g.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen antihypertensiven Extrakte werden in der Therapie in Form von Zusammensetzungen mit 1 bis 95 Gew.-% Wirkstoff verwendet

Für die Herstellung therapeutisch wirksamer Kompositionen ausgehend von den antihypertensiven Extrakten werden physiologisch akzeptable Trägcrn'/ittel in fester oder flüssiger Form verwendet. Von geeigneten therapeutischen Präparaten in fester Form sind Pulver, Tabletten, dispergicrbrre Granalien, Pastillen, Kapseln, Oblatenkapseln und Suppositorien zu nennen. Ein festes Trägermittel kann durch eine mehr oder mehrere Substanz(en) gebildet werden, die als Verdünnungsmittel, Absüßmittel, auflösend, als Fett- oder Schmiermittel.

Bindemittel, Suspensionsmittel oder Mittel zum Zer-Nießlichmachen wirken, Das Trägermittel kann auch eine einkapselnd wirkende Substanz sein.

In Pulvern ist das Trägermittel ein fein zerteilter Feststoff, der mit der selbst fein zerteilten wirksamen -, Verbindung innig vermischt ist. Von festen Trägermitteln sind Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Talkum, Zucker wie Lactose, Pectin, Dextrin, Stärke, Gelatine, Traganthgummi, Mcihylccllulöse, Nalrium-Carboxymelhylcellulose, Wachse mit niedrigem n> Schmelzpunkt und Kakaobutter zu nennen. Unter Präparaten versteht man ebenfalls Rezepturen oder Zusammensetzungen des aktiven Produktes mit einer Substanz zum Einkapseln bzw. Einschluß mit einem Trägermittel in der Weise, daß eine Kapsel erhalten i> wird, in der die Verbindung (mit oder ohne Exzipicnt) durch das Einkapselungsmitlel eingeschlossen ist.

Präparate in flüssiger Form umfassen Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispielswelse kann man für die parentcrale Injektion Lösungen in physiologisrher Lösung oder Mischungen von Propylenglykol und Wasser nennen.

Für die orale Anwendung kann man den Wirkstoff bei Bedarf zusammen mit tensioaktiven Mitteln, wie beispielsweise Gummiarabikum und Methylcellulose, in 2> Wasser dispergieren.

Am besten enthält die therapeutische Zusammensetzung für orale Verabreichung (pro Dosieningieinheit) 100 mg bis Ig des antihypertensiven Extraktes in Verbindung mit einem physiologisch akzeptablen jo Trägermittel, und für Injektionen enthält die therapeutische Zusammensetzung 30 bis 300 mg Wirkstoff.

Die Behandlung der Hypertension beim Menschen und bei Tieren (Warmblütern) besteht in der täglichen Verabreichung von 1 bis 5 Gaben einer Zusammensetzung bzw. eines Präparates mit 100 mg bis 1 g Wirkstoff (für die orale Verabreichung) oder 30 bis 300 mg Wirkstoff (für Injektionen), wobei die orale Verabreichung in Form von Kapseln, Tabletten oder Geleekügelchen bevorzugt wird.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

1) 12 g in einem Mischwerk zerkleinerte oder geschliffene und pulverisierte Anacardium occidentale L-Rinde wurden zur Entfettung 8 Stunden lang bei 2⁰C mit 2Oi¹Cm³ Petroläther behandelt. Dabei wurde ein Filtrat A und ein unlöslicher Rückstand B erhalten. Vom Filtrat A wurden durch Einengen im Vakuum bei einer Temperatur untc. 60° C 0,053 g eines in Petroläther löslichen teigigen Pulvers gewonnen.

Der in Petroläther unlösliche Rückstand B wurde 8 Stunden lang mit 200 cm³ Diethylether unter Lichtabschluß bei 2°C extrahiert bzw. behandelt Auf diese Weise wurde ein Filtrat C und ein unlöslicher Rückstand D erhalten. Vom Filtrat C wurden durch Abdestillieren des Diäthyläthers bei einer Temperatur unter 60° C im Vakuum 0.084 g Produkt gewonnen.

Der in Diäthyläther unlösliche Rückstand D wurde ω mit einer 75 Vol.-prozentigen wäßrigen Äthanollösung 24 Stunden lang bei 2° C unter Lichtabschluß extrahiert Dabei wurde ein Filtrat E und ein unlöslicher Rückstand F erhalten. Nach Eindampfen des Filtrats E im Vakuum unter Lichtabschluß bei einer Temperatur unter 6O⁰C wurden 432 g eines braunen Pulvers (ET) gewonnen.

Der in 75prozentiger Äthanollösung unlösliche Extraktionsrückstand F wurde 24 Stunden lang mit 200 cm³ Wasser unter Lichlabschluß bei einer Temperatur von 2°C behandelt und ergab nach Abdestillieren des Lösungsmittels unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 60°C 1,22 g eines dunkelbraunen Pulvers (aus dem wäss. Auszug).

Die nach den Extraktionen mit Pclrolälhcr, Diäthyläther und 75prozentigem Äthanol erhaltenen Extrakte wurden wie oben angegeben an Ratten geprüft und mit den durch 24 Stunden lange Mazeration von 50 g Anacardium occidentale L-Rinde in einem Liter Wasser gemäß der oben angegebenen DE-OS erhaltenen Extrakt verglichen.

Die ausgehend von den Fillratcn A und C und vom Rückstand F erhaltenen Pulver erwiesen sich bei Verabreichung an Ratten als unwirksam. Der Extrakt ET ergab dagegen in wäßriger Lösung mit 20 g/l positive Resultate bei Injektion von 0,1 bis 0,3 cm' wäßriger ET-Lösung.

Die wäßrige Lösung (50 g/l) des durch wäßrige Mazeration gemäß der genannten DE-OS erhaltenen Extraktes lieferte ebenfalls gute Ergebnisse: Bei der Ratte wurde ein Druckabfall von 133 bis 26,6 mbar (1 bis 2 cm Hg) während 20 Minuten nach Verabreichung in ^piner Dosis von 1 ml/kg beobachtet.

Bei Ersatz der 75prozenligen Älhanollösung durch eine 75vol.-prozcntige Methanollösung wurde praktisch die gleiche Wirksamkeil der alkohollöslichen Fraktion bei der iiatte festgestellt. Ganz allgemein erhält man aus dem Extrakt mit 75prozentigem Äthanol praktisch ein Drittel des Gewichtes der Anacardium occidentale L-Rinde.

Im übrigen konnte beobachtet werden, daß ausgehend von einigen der gemäß der oben beschriebenen Verfahrensweise erhaltenen Trockenextrakten einige Verbindungen spontan in alkoholischer Lösung ausfallen, sobald die Trockenextrakte in Lösung gebracht sind.

So wurden einige Gramm des in Stufe (c) mit Äthanol erhaltenen löslichen Extraktes in Methanol gelöst. Nach Ruhenlassen der Lösung und anschließendem Aufsammeln des Niederschlags durch Zentrifugieren wurde das erhaltene Produkt bei der Ratte geprüft. Dieses in Wasser wenig lösliche Produkt erwies sich bei einer konzentration von 3 g/l als unwirksam. In gleicher Weise wurden, ausgehend von dem Extrakt ET bisweilen in Wasser wenig lösliche Kristalle mit einem salzigen Geschmack gewonnen, die bei der Ratte in einer Konzentration von 3 g/I (in Wasser) inaktiv waren.

Der von diesen Verunreinigungen befreite Extrakt ET ist stabil. Bei Lagerung im Dunklen zeigt er nach mehreren Monaten praktisch die gleiche Aktivität

Einige Gramm des äthanolischen Extraktes ET wurden in Methanol gelöst und die Lösung mindestens 24 Stunden ruhengelassen. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt

Ausgehend von dem Extrakt mit 75prozentigem Äthanol wurden ebenfalls Kristalle mit einem salzigen Geschmack gewonnen.

Diese beiden in Wasser wenig löslichen Produkte wurden bei der Ratte in einer Konzentration von 3°/oo geprüft und erwiesen sich als inaktiv.

Durch die Untersuchung der Wirksamkeiten bei der Ratte konnte festgestellt werden, daß ganz allgemein der Extrakt mit 75prozentigem Äthanol in einer Konzentration von 2% (bezogen auf das Trockengewicht des Extraktes) bei Injektion von 0,1 bis 03 cm³ Lösung positive Ergebnisse liefert

Der wäßrige Extrakt mit 5% (bezogen auf das Gewicht der trockenen Rinde) liefert ebenfalls gute

Resultate: einen Druckabfall um 13,3 bis 26,6 mbar (1 bis 2 cm Hg) während 20 Minuten.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß der Extrakt mit 75prozentigem Äthanol (ET) bei einer Konzentration von 2% bei Injektionen von 0,1 bis 0,3 cm^J bei Rallen von 250 bis 300 g wirksam ist.

D/y Wirkstoff ist anscheinend relativ stabil; bei Aufbewahrung im Dunkeln zeigt er nach 1 bij 2 Monaten eine praktisch gleichgebliebene Aktivität.

Die Extrakfion gemäß Beispiel 1 ist cn Tabelle II schematisch zusammengefaßt

2) Reinigungsstufe Reinigung der Äthanolfraktion ET

Unter Berücksichtigung der vorstehenden Ergebnisse wurde versucht, eine Tannin-Fraklion von einer Nicht-Tannin-Fraktion zu trennen. Zu diesem Zweck würden die Tsnnirse rni! einer C^y^^^ⁿ*ⁿ'^^ci>n'^{T π}*>°'^τηΓοΐΐι ■

Aus einer Lösung von 5 g ET in 30 ml Wasser wurden die Tannine durch Zugabe von 110 ml Coffeinlösung (12 g/l) ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wurde abzentrifugierl oder abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in einem Minimum an Methanol gelöst (etwa 12 ml). Diese Lösung der Tanninfällung in Methanol wurde mit Wasser auf 250 cm³ ergänzt und zur Abtrennung des Coffcins 3mal mit Chloroform extrahiert. Die erhaltene Methanol-Wasser-Lösung wurde im Vakuum eingedampft. Erhallen wurden 2,80 g eines Pulvers (T.A.N.).

Das Filtrat des Tanninniederschlages ist eine grur Jsätzlich von Tanninen befreite wäßrige Lösung. Diese Lösung wurde mit Chloroform extrahiert und im Vakuum eingedampft. Es wurden so 1,60 g eines Pulvers (S.T.A.N.) erhalten.

Die Chloroform-Lösungen wurden ebenfalls eingedampft. Für die Tannin-Fraktion wurden dabei 1,06 g und für die Nicht-Tannin-Fraktion 0,120 g Coffein gewonnen (entsprechend einer Wiedergewinnung von 1,18 g Coffein für 13 g eingesetztes Coffein).

Bilanz:

Mit 5 g Anacardium occidentale L-Rinde (bzw. Extrakt) erhält man gemäß einer Fraktionierungsweise, die schematisch in Tabelle II angegeben ist, 2,8 g Tannine und 1,60 g Nicht-Tannine.

Diese Fraktionierungsweise ermöglicht die Gewinnung einer Tannin-Fraktion und einer Nicht-Tannin-Fraktion ohne Vergällung der Lösungen mit anderen Produkten, da das Coffein wieder entfernt wird.

Die Wirksamkeit der verschiedenen Extrakte wurde anhand von physiologischer Untersuchungen überprüft.

Eine wäßrige Lösung der Nicht-Tannin-Fraktion STAN, mit einer Konzentration von 30 g/l wurde Ratten in Dosen von 0,1 bis 0,3 cm³ intravenös injiziert; dabei wurde keinerlei Drucksenkung festgestellt Die Ratten in Dosen von 0,1 bis 0,2 cm³ injizierte wäßrige Lösung der Tannin-Fraktion (ΤΛ.Ν.) mit 10 g/l erwies sich als sehr aktiv. Unter den gleichen Bedingungen hatte die Lösung des Extraktes ET mit 10 g/I praktisch keinerlei Wirkung. Die wäßrige Lösung des ET-Exlraktes mit 20 g/l zeigte eine gute Wirksamkeit bei Injektion bei der Ratte in Dosen von C',1 bis 0,2 cm³.

Aus dieser Versuchsreihe folgt, daß sich der Wirkstoff wie ein Tannin verhält.

3) Reinigung des tanninhalügen Extraktes
(ΤΛ.Ν.)

Der feste Extrakt ΤΛ.Ν. wurde in einem Minimum an Methanol (etwa 10 bis 12 ml) wieder in Lösung gebracht

und dann erneut mit Dimclhyläthcf ausgefällt. Der Äther wurde tropfenweise bis zur vollständigen Ausfällung des Produktes zu der methanolischen Lösung hinzugegeben. Es wurde filtriert. Trockengewicht: 2,50g.

Ein Vergleich des T.A.N.-Extrakles mit dem durch Wiederauflösung in Methanol und Ausfällung mit Äther erhaltenen Produkt ergab die gleiche Wirksamkeit, aber eine Abnahme der Toxizitäl bei intrapcritonealer Injektion beim Tier.

Der Unterschied hinsichtlich derToxizität wird durch die nachfolgende Tabelle I veranschaulicht.

Tabelle I

Inji/ierter [ixlrakt
(wäßrige Lösung mit 10 g/I)

LDsn bei der Maus
bei inlrapcritoncalcr
Verabreichen"

Extrakt nach DE-OS 20 34 708 135 mg/kg

lixlraktET 280 mg/kg

Extrakt T.A.N. nach Rcini- 600 mg/kg
gung gemäß Beispiel 1 (3)

Aus Tabelle I ist zum einen zu entnehmen, daß die Reinigung durch Ausfällung mit Coffein und nachfolgende Behandlung gemäß Beispiel 1 (3) zu einer Abnahme der Toxizität (Zunahme der LD50) von 280 mg/kg auf 600 mg/kg führt und zum anderen, daß das erfindungsgemäße Verfahren deutlich fortschrittlich ist, da das erhaltene Endprodukt viel weniger toxisch ist als der durch wäßrige Mazeration nach der genannten DE-OS erhaltene Extrakt.

Beispiel 2
Behandlung mit Hautpulver

Ausgehend von dem löslichen Extrakt ET der Stufe c) wurde versucht·, eine Trennung von Tannin-Fraktion und Nicht-Tannin-Fraktion mit Hautpulver zu erreichen.

Eine Lösung von 0,400 g ET in 100 ml Wasser wurde 1 Stunde lang mit 6,25 g trockenem Hautpulver gerührt. Die Tannine vereinigen sich dabei mit dem Hautpulver. Nach Filtrieren und Eindampfen des Filtrats im Vakuum bei einer Temperatur unter 60°C zum Trocknen erhält man 0,195 g Nicht-Tannine und mithin 0,400 - 0,195=0,205 g an Hautpulver adsorbierte Tannirie. Eine mit diesen Nicht-Tanninen hergestellte Lösung mit 20 g/l zeigte bei Überprüfung keine Aktivität.

Die gleiche Operation wurde mit einer Lösung von 0350 g Tanninen (ΤΛ.Ν.) in 100 cm³ durchgeführt. Nach dem Filtrieren und Eindampfen wurden 0,024 g in Wasser wenig lösliche Nicht-Tannine erhalten, die in wäßriger Lösung mit einer Konzentration von 20 g/l keine Aktivität zeigten.

Zur Gewinnung der an Hautpulver adsorbierten Tannine kann man ein Ionenaustauscherharz heranziehen; die so wiedergewonnene Tannin-Fraktion wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 6O⁰C getrocknet und kann dann nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 (3) gereinigt werden.

Die weiter oben beschriebenen verschiedenen Versuche besagen, daß sich die wirksame Fraktion wie ein Tannin verhält, da sie von Hautpulver adsorbiert und durch Alkaloide ausgefällt wird.

Zur Untersuchung der antihypertensiven Wirkung wurden Versuche an Ratten unter Normaldruck und an nach 3 unterschiedlichen Typen (renal, metakortikoid und neurogen) experimentell auf hohen Druck gebrachten Ratten durchgeführt. Der erfindungsgemäß erhalte- > ne Extrakt gemäD Beispiel 1 (3) wurde Gruppen von 8 bis 14 Tieren in einer Dosis von 40 mg/kg verabreicht.

Der arterielle Druck wurde von der Verabreichung durch eine Schlundsonde und dann alle Stunden registriert. ι ο

Die Kontrolltiere mit Normaldruck zeigen wenig Reaktion. Ratten mit neurogener Hypertension zeigten den stärksten Druckabfall, wobei eine mittlere Abnahme um 55,9 ±6,65 mbar (4,2 cm ±0,5 cm Hg) während etwa 9 Stunden beobachtet wurde. Bei Ratten mit ι ^r> metakortikoider Hypertension wurde eine Abnahme der mittleren Tension um 41,23 ± 17,3 mbar (3,1 ± 1,3 cm Hg) beobachtet. Bei Ratten mit renaler Hypertension wurde eine Abnahme der mittleren Tension um 37,9 ± 6,65 mbar (3,6 ± 0,5 cm Hg) festgestellt.

Ganz allgemein wurde das verabreichte Produkt von den Ratten gut vertragen. Einige der erhaltenen Ergebnisse wurden graphisch dargestellt und sind in Fig. 1 und 2 zu sehen. Fig. 1 zeigt die mittlere Kurve des arteriellen Drucks von 8 Ratten unter renaler Hypertension, denen 0,4 ml (40 mg/kg) einer wäßrigen Lösung des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Extraktes mit 20 g/l oral durch Schlundsonde verabreicht wurden.

Fig.2 zeigt den mittleren Verlauf des arteriellen Drucks von 13 Ratten mit renaler Hypertension nach m intraperitonealer Injektion von 0,2 ml (20 mg/kg) einer wäßrigen Lösung des gemäß Beispiel 1 (3) erhaltenen Extraktes mit 20 g/l.

Dabei ist der arterielle Druck in den F i g. 1 und 2 (ausgedrückt in cm Hg, 1 cm Hg = 13,3 mbar) längs der y, Ordinate in Abhängigkeit von der Zeit (in Stunden; aufgetragen längs der Abszisse) aufgetragen.

Im übrigen wurden die gleichen Prüfungen der antihypertensiven Wirksamkeit bei Affen mit renaler Hypertension vorgenommen. Wie vorherzusehen war, wurde bei den Affen mit experimenteller Hypertension eine viel stärkere antihypertensive Wirkung festgestellt als beim Affen mit Normaldruck.

Der erfindungsgemäße Extrakt wurde 8 Affen mit Hypertension in wäßriger Lösung mit 10 g/l in einer Dosis von 3 ml/kg während einer Zeitdauer von 7 Tagen oral verabreicht. Gemessen wurde der arterielle Druck vor Beginn der Behandlung und dann während der Gesamtdauer der Behandlung jeden Tag in der 3. und 5. Stunde nach Verabreichung durch Schlundsonde.

Am Ende der 7 Tage dauernden Behandlung betrug der mittlere Abfall des arteriellen Druckes 45,22 mbar (3,4 cm Hg) und der Wiederanstieg des Druckes begann am 1 l.Tag nach Beginn der Behandlung.

Fig.3 zeigt die Zusammenfassung einer weiteren Reihe von Versuchen, die an 10 Affen mit renaler Hypertension durchgeführt wurden. Diese Tiere erhielten oral ίΰ mi einer wäßrigen Lösung des erfindungsgemäßen Extraktes mit 20 g/I (Dosis: 40 mg/kg) mittels Schlundsonde verabreicht. Längs der Abszisse ist die Zeit in Stunden nach der Verabreichung und längs der Ordinate der mittlere Druck ausgedrückt in cm Hg (1 cm Hg = 13,3 mbar) aufgetragen.

Es wurden ebenfalls Untersuchungen über den Wirkungsmechanismus des gemäß der Erfindung erhaltenen Extraktes durchgeführt. Die dabei beobachteten Resultate sind nachfolgend zusammengefaßt:

Die Herzfrequenzen ändern sich unter dem Einfluß des Extraktes wenig. Der Extrakt verändert kaum die adrenalinische Hypertension. Die hypertensive Wirkung des Extraktes wird durch Atropin nicht gehemmt, d. h. die Wirkung des Extraktes scheint nicht auf einem Muscarin-Effekt zu beruhen.

In Tabelle II ist das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren unter Angabe, welche Extrakte inaktiv sind Und weiche eine antihypertensive Wirksamkeit besitzen, zusammengefaßt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung eines Anacardium occidentale L-Rindenextraktes mit antihypertensiver Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die zerkleinerte Rinde mit Petroläther extrahiert,

b) den nach Abtrennung der Petroläther-Fraktion verbleibenden unlöslichen Rückstand mit Diäthyläther extrahiert,

c) den nach Abtrennung der Diäthyläther- Fraktion verbleibenden unlöslichen Rückstand mit π Äthanol, Methanol oder Mischungen dieser Alkohole untereinander oder Mischungen dieser Alkohole mit Wasser extrahiert,

d) den nach Abtrennung des unlöslichen Rückstandes und hinengen der alkohollöslichen Fraktion unter vermindertem Druck erhaltenen Troklcenextrakt in Wasser auflöst und den antihypertensiven Wirkstoff durch Ausfällen mit Aikaloiden oder Hautpulver gewinnt,

wobei die Extraktionen nach a), b) und c) unter r> Lichtabschluß und bei niedriger Temperatur vorgenommen werden und das Einengen im Vakuum bei einer Temperatur unter 60° C erfolgt,

e) 5 Gewichtsteile dieses Trockenextraktes in in Wasser Ic t und dazu eine wässerige Coffeinlösung mit 1,32 Gewichtsteile" Coffein gibt,

Q die so erhaltene Ausfällung in einer minimalen Menge Methanol in Lösung bringt. Wasser hinzugibt und das Coffein mit Chloroform r, extrahiert,

g) die Methanol-Wasser-Phase im Vakuum bei einer Temperatur unter 60°C bis zur Trocknung einengt, das so erhaltene Pulver in der kleinstmöglichen Menge Methanol in Lösung -to bringt, eine Ausfällung durch Zugabe von Dimethyläther vornimmt und den Niederschlag durch Abtrennung des Filtrats gewinnt.