DE2723451A1 - Polyribonucleotide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als oder in arzneimitteln - Google Patents

Polyribonucleotide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als oder in arzneimitteln

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Description

Die Erfindung betrifft durch Abbau von aus Mikroorganismen oder Tierorganen extrahierten Ribosomen-Ribonucleinsäuren hergestellte Polyribonucleotide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel.
Vor kurzem wurde ein Verfahren zur Herstellung von PoIyribonucleotiden, auch als "ARN-Bruchstücke" bezeichnet, durch Einwirkung von Ribonucleasen, welche die Sequenzen G-A intakt lassen, insbesondere Pankreas-Ribonuclease, auf Ribosomen-Ribonucleinsäuren, de reich an den Nucleotiden G und A sind, die aus Bakterien oder Zellen von Tierorganen extrahiert wurden, beschrieben (vgl. die französische Patentanmeldung Nr. 7V38 768 und "CR. Acad. Sei. Paris", Serie D, T. 280 (20. Januar 1975)» Seiten 363 bis 366). Die dabei erhaltenen Polyribonucleotide bestehen aus einfachen Ketten, die etwa 20 bis etwa 80 Ribonucleotid-Einheiten aufweisen und in denen die Purinbasen im Überschuß gegenüber den Pyrimidinbasen vorliegen und in denen die aufeinanderfolgenden G-A-Einheiten vorherrschen.
Die Polyribonucleotide wurden anschließend in verschiedene Fraktionen aufgeteilt, indem man sie auf eine mit einem Molekularsieb, das im Handel unter der Bezeichnung "Sephadex G 25 fein" erhältlich ist, gefüllte Kolonne in einem Tris-Puffer M/100, pH 7,4-, aufgab und mit dem gleichen Puffer eluierte. Die so voneinander getrennten Fraktionen werden in der Reihenfolge ihrer Elution mit P^, Ρ~, P*, P4, und P, bezeichnet und sie entsprechen den Maxima der in der Fig. 1 der beiliegenden Zeichnung dargestellten Kurve, in der die Eluatvolumina auf der Ordinate und die bei 260 mu gemessene Absorption (Extinktion) auf der Abszisse aufgetragen sind.
Die verschiedenen Familien der dabei erhaltenen Polyribonucleotide wurden spektrophotometrisch analysiert und ihre Gehalte an Purinbasen, wie Guanin (G) und Adenin (A), und Pyrimi-
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dinbasen, wie Cytosin (C) und Uracil (U), wurden bestimmt; sie unterscheiden sich voneinander durch die Art und das Verhältnis der Basen, wobei die Produkte P^ und P2 die an den Purinbasen G und A reichsten Produkte darstellen.
Es wurde bereits darauf hingewiesen, daß die mit P^ und P2 bezeichneten Produkte, hergestellt aus Ribosomen-ARN von Escherichia coli M 500» eine antivirale Aktivität, insbesondere gegenüber dem Virus des Shope-Fibroms, dem Vakzine-Virus und dem Herpes-Virus, aufweisen.
Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß die an den Purinbasen G und A ärmsten Produkte und insbesondere die Produkte, in denen das Gesamtverhaltnis von Purinbasen zu Pyrimidinbasen C(G+A)/(C+U)] zwischen 1,0 und 2,3 liegt, eine interessante (vorteilhafte) Aktivität bei der Bildung der Leukozyten und der Blutplättchen aufweisen und als oder in Arzneimitteln verwendet werden können, die für die Aktivierung der Leukopoere unter Bildung von Blutplättchen bestimmt sind, wenn ein Mangel daran vorliegt.
Insbesondere weisen die mit P, und P^ bezeichneten Produkte, die aus Ribosomen-ARN von Escherichia coli M 500 Sho-R mittels Pankreas-Ribonuclease hergestellt worden sind, beide ein Verhältnis (G+A)/(C+U) auf, das zwischen 1,° und 2,5 liegt und sie stellen infolgedessen erfindungsgemaße Arzneimittel dar, die für den "Wiederanstieg" der Leukozyten und Blutplättchen verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bzw. Arzneimittel können nach dem Verfahren hergestellt werden, wie es in der französischen Patentanmeldung Nr. 74/38768 beschrieben ist, bei dem man von verschiedenen Quellen (Hefen, Bakterien, Tierorganen) ausgeht, wobei man, insbesondere beim Ausgehen von E. coli M 500 Sho-H,die Fraktionen oder ARN-Bruchstücke, deren
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Verhältnis (G+A)/(C+U) zwischen 1,0 und 2,5 liegt, durch Passieren durch ein Molekularsieb trennt.
Die Erfindung betrifft ferner ein verbessertes Verfahren zur Herstellung dieser Polyribonucleotide, mit dessen Hilfe es möglich ist, diese auf einfachere Weise und in einer wesentlich höheren Ausbeute zu erhalten. Bei diesem verbesserten Verfahren sind die Methoden zur Kultivierung der Bakterien, zur Isolierung der Ribosomen-Ribonukleinsäuren (ARN-r) und ihrer· Konservierung (Aufbewahrung) identisch mit denjenigen, wie sie in der französischen Patentanmeldung Nr. 7V38 768 beschrieben sind. Die Verbesserung bezieht sich auf drei Punkt e:
- auf die Auswahl des Bakterienstammes oder eines anderen Ausganßsmaterials (Pilze,Hefen oder Tierorgane);
- auf das für die Auftrennung der ARN-r in ARN-Bruchstücke verwendete Abbau-Agens;
- auf die Unterdrückung der Trennphase der ARN-Bruchstücke in einer Kolonne.
Was den ersten Punkt anbetrifft, so verwendet man vorzugsweise einen wilden Stamm von E. coli T 3000 (K 12), der nicht pathogen ist und zu den Arten gehört, die üblicherweise Wirte der Intestinalflora sind; bei diesem Stamm ist das Verhältnis von Purinbasen zu Pyrimidinbasen kleiner als das entsprechende Verhältnis des Stammes E. coli M 500 Sho-R und es liegt in der Nähe von 1,0.
Man kann aber auch ARN-r verwenden, die aus anderen Bakterienstämmen, Pilzen, Hefen oder Tierorganen isoliert worden sind, deren Verhältnis von Purinbasen zu Pyrimidinbasen geeignet ist.
Bei den für die ARN-r erfindungsgemäß verwendeten Abbaumitteln kann es sich nicht nur um Ribonucleasen, wie Pankreas-Ribo-
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nuclease oder eine aus Neurospora crassa extrahierte Ribonuclease, sondern auch um eine starke Base (Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid), vorzugsweise mit einer Endkonzentration von 0,1 η in der Reaktionslösung,handeln. Die auf diese Weise aus einem geeigneten Ausgangsmaterial erhaltenen ARN-Bruchstücke weisen ein Gesamtverhältnis (G+A)/(C+U) zwischen 1,0 und 2,5 auf und es braucht keine Fraktionierung auf einer Kolonne durchgeführt zu werden.
In dem nachfolgenden Beispiel wird die Herstellung von P, und P^ aus einem Stamm von E. coIi beschrieben, der gegen Showdomycin reistent gemacht worden ist, wie von M. Beljanski et al,"CR. Acad. Sei. Paris", Serie D, 272, Seiten 2107-2110 be· sdmeben,der ii dem Centraal Bureau Voor Schimmelcultures unter der Nr. CBS 615-74 registriert ist und nachfolgend als E. coli M 500 - Sho-R bezeichnet wird.
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Beispiel 1
Herstellung von P, und P^ aus E. CoIi M 500-Sho-R.
Die Bakterien dieses Stammes werden bei 37°C in einem gut durchlüfteten Milieu kultiviert entweder auf einem Nährmedium, das pro Liter Medium enthält: 10 g Bacto-Trypton
5 g Hefeextrakt
5 g Natriumchlorid und
Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 7»3 zu bringen,
oder, wenn man die antiviralen Produkte Ρ,, und P2 und die Produkte P^ und P^, gleichzeitig isolieren will, in einem synthetischen Milieu, das pro Liter Milieu enthält: 100 ml Monokaliumphosphat (136 g/l) 10 ml 20 %iges Ammoniumsulfat
1 ml 0,05 %iges Eisensulfat
1 ml Magnesiumsulfat (20 g/100 ml)
2 ml Vitamin B^ (0,5 pro 1000) und Kaliumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,2 zu bringen ,
wobei man zu diesem Milieu nach dem Sterilisieren 4 oder 5 S sterilisierte Glukose (20 %ige Lösung) auf 1000 g zugibt.
Nach Beendigung der Kultivierung werden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren gesammelt und sie können durch Tiefgefrieren aufbewahrt werden. Sie werden anschließend in der Kälte in einem Puffer A (2 M Tris-HCl: 5 ml, 2 M KCl: 30 ml, Magnesiumacetatlösung (30 g/100 ml): 10 ml) homogenisiert, dann zerkleinert und ihre Zerstörung wird durch Ultraschallbehandlung vervollständigt.
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Nach dem Verdünnen mit einem Puffer B (analog zu dem Puffer A, der jedoch nur 0,1 ml Magnesiumacetat und 0,1 ml Mercapto-» äthanol enthält) zentrifugiert man 20 Minuten (25 000 bis 30 000 g), dann gibt man zu der überstehenden Flüssigkeit 10 bis 20 ug Desoxjribunuclease pro ml zu. Man läßt 15 Minuten lang bei 30 bis 37°C einwirken, dann zentrifugiert man 20 Minuten lang (bei 25 000 bis 30 000 g). Die überstehende Flüssigkeit wird anschließend erneut 2 Stunden lang bei 40 UpM in einer Ultrazentrifuge filtriert, um die Ribosomen zu gewinnen und die Gesamtmenge der unbrauchbaren ARN 4- S zu eliminieren.
Die Ribosomen (der Bodensatz) werden in Gegenwart des Puffers B in einem Behälter homogenisiert. Man gibt 2 bis 3 Tropfen 20 %iges Laurylsulfat zu und unterwirft einer guten mechanischen Rührung. Die Ribosomen-ARN wird nach dem klassichen Verfahren mit Phenol in Gegenwart des Puffers B extrahiert. Es sind mehrere Extraktionen erforderlich. Eine Schlußextraktion mit Chloroform ist erforderlich, um das Phenol und die noch vorhandenen Proteine zu entfernen·
Die wäßrigen Phasen werden miteinander vereinigt und mit kaltem % %igem Alkohol versetzt, der etwas KCl enthält, um die Ausfällung der ARN zu begünstigen· Durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 5000 g ist es möglich, die ARN zu sammeln, die anschließend eine Nacht lang gegen destilliertes Wasser, das 0,1 M KCl enthält, dialysiert wird.
Am Morgen setzt man die Dialyse 1 Stunde lang nur gegen destilliertes Wasser fort. Man bestimmt die ARN bei 260 nm (UV) mit Hilfe eines Spektrophotometers. Das Verhältnis 260/280 erlaubt die Steuerung der Eigenschaften bei der Herstellung der ARN. Dieses Verhältnis muß sehr nahe bei 2 liegen.
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Die ARN wird im eingefrorenen Zustand oder in Form eines lyophilisierten Pulvers aufbewahrt. Die Auftrennung der ARN in die Polyribonucleotide (ARN-Bruchstücke) wird wie folgt durchgeführt: 70 mg Ribosomen-ARN (etwa 10 ml) werden mit 0,2 ml einer kristallisierten Pankreas - Ribonuclease versetzt (die Pankreas-Ribonucleaselösung mit 5 mg/ml wurde vorher 10 Minuten lang zum Kochen gebracht und dann abgekühlt). Man inkubiert die ARN 30 Minuten lang bei 36°C (Wasserbad) mit der Ribonuclease. Der Abbau wird durch Zugabe eines gleichen Volumens Chloroform und mehrminütiges starkes Rühren gestoppt. Man zentrifugiert 5 Minuten lang bei 5000 g. Die wäßrige Phase (die obere Phase) wird entnommen und ein zweites Mal mit einem gleichen Volumen Chloroform versetzt, gerührt und zentrifugiert. Die wäßrige Phase wird sofort auf eine Cephadex G-25-Kolonne, die mit einem Puffer H2O-O,1 M Tris-NCl, pH 7,4-, fein äquilibriert worden ist f aufgegeben.
Die ARN-Bruchstücke werden mit dem gleichen Puffer eluiert. Unter diesen Bedingungen sind 5 Absorptionsmaxima bei 260 nm nachweisbar, die regelmäßig aussehen, wie durch die Elutionskurve dargestellt. Sie werden in der Reihenfolge ihrer Elution aus der Kolonne mit 1 bis 5 bezeichnet. Die ARN-Bruchstücke, welche die Maxima 1 und 2 darstellen, weisen eine Antivirus-Aktivität auf. Die ARN-Bruchstücke, welche die Maxima 3 und 4 darstellen, weisen immer eine sehr spektakuläre Aktivität auf wie "angestiegene" Leukozyten und Blutplättchen und sie stellen die erfindungsgemäßeη Arzneimittel dar. Die ARN-Bruchstücke, welche das Maximum 5 darstellen, werden nicht aufbewahrt.
Die jedes der Maxima darstellenden Fraktionen werden miteinander vereinigt und lyophilisiert. Auf diese Weise erhält man die Produkte P1, P2, P, und P^, nachdem man den trockenen Rückstand in der minimalen Menge an destilliertem Wasser aufg·-
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nommen, einmal mit dem gleichen Voltamen Chloroform kräftig behandelt und zentrifugiert hat, wobei die überstehende Flüssigkeit 24 Stunden lang (unter axenischen Bedingungen) gegen steriles destilliertes Wasser dialysiert und trocken lyophilisiert worden ist. Die Produkte P* und P^ stellen erfinduncsgemäße Produkte dar ebenso wie ihre Mischungen "in allen Mengenverhältnissen.
Die Konstitution der AEN-Bruchstücke P, und P^, die aus einfachen Ketten gebildet werden, die 25 bis 50 Nucleotide enthalten, wurden nach dem in der französischen Patentanmeldung Nr. 74/38768 beschriebenen Verfahren untersucht, um ihre Gehalte an Purinbasen und Pyrimidinbasen zu ermitteln.
Man hydrolysiert 1 Stunde lang bei 100°C (siedendes Wasserbad) ^50 iig ARN-Bruchstücke. Nach dem Eindampfen in einem Exsikkator nimmt man den Rückstand in 0,02 ml destilliertem Wasser wieder auf und führt eine Dünnschichtchromatographie (Cellulose-Bcteola) unter Anwendung des von G.R. BjÖrk und L. Svensson in "Biochim. Biophys. acta", 1%7, 128, Seiten 430 - 432, beschriebenen Verfahrens durch. Bei der Hydrolyse werden die Purinbasen freigesetzt und die Pyrimidinbasen verbleiben in Form der Nucleotide.
Die Bestandteile der ARN-Bruchstücke P, und P^ werden durch Chromatographie in einem geschlossenen Behälter voneinander getrennt und nach dem oben für die ARN-Bruchstücke P^ und P2 angegebenen Verfahren identifiziert.
Das ARN-Bruchstück P, besteht aus: A: 29,0
G: 41,1 C: 15,2 (<*A/C+U-2,3)
U: 15,0
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Das ARN-Bruchstück P^ besteht aus: A: 25,6
G: 26,3
C: 21,0 (G+A/C+ü-1,06)
U: 27,1
Die oben angegebenen Zahlen sind ausgedrückt in Mol pro 100 Mol der analysierten Nucleotide unter Verwendung der folgenden Streckungskoeffizienten A = 13; G = 12,81 C » 11,5; U ■ 10, die dem Absorptionsmaximum entsprechen (vgl. "Methode in Enzymology", XII, Nucleic Acides, Teil A, Ed. Grossman und K. Moldave, Academic Press (1967), Seite 386).
Die ARN-Bruchstücke P, und P^ enthalten keine Spur ADN. Dies wurde streng nachkontrolliert durch Colorimitrie (mit Diphenylamin) und durch Enzymologie (Aktivität in Gegenwart von DNA-Polymerase).
In den nachfolgenden Beispielen 2 bis 4· wird das Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen ARN-Bruchstücken aus ARN-r von E. coli T 3000 mit verschiedenen Ribonucleasen und mit einer alkalischen Base beschrieben.
Beispiel 2
Abbau der ARN-r von E. coli T 3000 durch die Pankreas-Ribonuclease A _______________«__
Die ARN-r werden erhalten aus einer Kultur von E. coli T 3000 nach einem Verfahren, das identisch ist mit demjenigen let, wie es in Beispiel 1 für die ARN-r von E. coli M 500 Sho-R beschrieben worden ist. Der Abbau der erhaltenen ARN wird erfindunßsnemäß durchgeführt mit einer Pankreas-Ribonuclease-Lösung (Sorte A, 5 mg/ml), die vorher 10 Minuten lang auf 100°C (in einem siedenden Wasserbad) gebracht und dann schnell abgekühlt worden ist.
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Man inkubiert eine Mischung aus ARN-r und Ribonuclease der gleichen Konzentration an Ribonuclease wie in Beispiel 1 bei 36°C, jedoch für eine kürzere Zeitspanne von 20 Minuten (anstelle von 30 Minuten). [Wenn man eine andere Probe von mehr oder weniger kritallisierter Pankreas-Ribonuclease verwendet, muß die Konzentration an Ribonuclease oder die Inkubationszeit angepaßt werden].
Die Reaktion wird durch Zugabe einer 10 % destilliertes Wasser enthaltenden Phenollösung (1 Vol.-Teil dieser Lösung auf 1 Vol.-Teil Reaktionsmischung) gestoppt und die Mischung wird stark gerührt, um die Ribonuclease zu entfernen. Nach 5-minütigem Zentrifugieren bei 10 000 UpM wird die wäßrige Phase (die obere Phase) anschließend mit einem gleichen Volumenanteil Phenol versetzt, die Mischung gerührt und dann zentrifugiert. Der Arbeitsgang wird erneut begonnen mit Chloroform (1 Volumenteil auf 1 Volumenteil). Nach der Phasentrennung und nach zweimaliger oder dreimaliger Wiederholung des Arbeitsganges wird die wäßrige Phase unter axeni^chen Bedingungen 16 Stunden lang gegen steriles destilliertes Wasser bei 4 C .dialysiert.
Die Menge an nicht dialysierbaren ARN-Bruchstücken wird durch Ultraviolett-Absorption bei 260 mn bestimmt. Die Ausbeute an aktiven ARN-Bruchstücken, bezogen auf die Anfangsmenge der Ribosomen-ARN, variiert von 50 bis 60 %. Die ARN-Bruchstücke werden nach dem Iyophilisieren aufbewahrt.
Die Elektrophorese der ARN-Bruchstücke auf Acrylamidgel zeigt die Anwesenheit eines einzigen Maximums von ARN-Bruchstücken einer geringeren Höhe als der ARN-Übergang 4 S, wie die beigefügte Fig. 1 zeigt, in der auf der Ordinate die Absorption (Extinktion) bei 260 nm und auf der Abszisse die innerhalb von 1 1/2 Stunden durchlaufene Strecke aufgetragen sind (vgl, das
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Verfahren von M. Beljanski, P. Bourgarel und Madame M. Beljanski in "Ann. Inst. Pasteur" 1970, ri8, Seite 253).
Beispiel 3
Abbau der ARN-r von E. coIi T 3000 durch die Ribonuclease N*
Die aus Neurospora crassa stammende Ribonuclease N^., die nach K. Kasei et al, "J. Bio. Chem." 1969, 66, Seite 389, gereinigt und einmal kristallisiert worden ist, baut die Polyribonucleotidketten auf dem Niveau der Base G ab und ihre Wirkung auf die ARN-r erlaubt die Herstellung von ARN-Bruchstücken, die aktiv sind in bezug auf die Leukopoese und in bezug auf die Bildung von Blutplättchen. Es wurden die folgenden Bedingungen angewendet :
100 mg ARN-r von E. coli T 3000, gelöst in destilliertem Wasser, werden in Gegenwart von 0,73 ml Ribonuclease N,. (Anfangslösung 1000 Einheiten/2 ml) 30 Minuten lang bei 360C inkubiert. Die Ribonuclease wird sofort mit Phenol und Chloroform wie im Falle der Ribonuclease A beschrieben eliminiert; die Bruchstücke werden gegen steriles destilliertes Wasser dialysiert. Das dabei erhaltene Produkt wird lyophilisiert.
Beispiel 4
Abbau der ARN-r von E. coli T 3000 durch Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid
Eine Lösung von 7 bis 10 mg ARN-r/ml wird mit einer NaOH- oder KOH-Lösung versetzt, bis die Endkonzentration der letzte ren 0,1 η beträgt.
Es wird 30 Minuten lang bei 36°C inkubiert. Man neutralisiert sofort mit einer gleichen Volumenmenge 0,1 η HCl. Man dialysiert
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die Lösung 16 Stunden lang bei 4°C gegen destilliertes Wasser. Das dabei erhaltene nicht-dialysierbare Produkt wird lyophilisiert. Nach der Hydrolyse der verschiedenen ARN-Bruchstücke der Beispiele 2, 3 und 4 bestimmt man das Verhältnis zwischen den Purinbasen und den Pyrimidinbasen. Sie dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben, wobei sie durch die Hole auf 100 Mole der analysierten Nucleotide ausgedrückt sind.
ARN-Bruchstücke
des Beispiels 2		 Tabelle ARN-Bruchstücke
des Beispiels 4
Basen 42,0 ARN-Bruchstücke
des Beispiels 3		 34,0
G 28,8 24,3 23,1
A 15,7 26,8 21,2
C 13,5 25,0 21,7
U Verhältnis
(G+A)/(C+U) 2,3		 23,6 1,36
1,06
Zwischen den mit den verschiedenen oben genannten Abbauagentien und unter Anwendung der oben genannten Bedingungen erhaltenen ARN-Bruchstücken sind keine signifikanten Unterschiede erkennbar: ihre Größen sind praktisch identisch und immer unterhalb derjenigen der ARN 4 S (vgl. Fig. 4).
PhanaakoloKJsche Eigenschaften
Eb wurde die Verteilung der ARN-Bruchstücke Fx und P-, des
14 ^
Beispiels 1, die mit C markiert waren, im Organismus nach der Injektion in Mäuse oder Kaninchen auf intravenösem Wege untersucht·
Ί4
Das mit C markierte ARN-Bruchstück P^ wird im wesentlichen
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in der Milz eingelagert, weniger in der Leber und findet sich auch in dem Knochenmark. Das mit C markierte ARN-Bruchstück P^ wird in gleichem Maße und im wesentlichen in den gleichen Organen, jedoch in einer geringeren Menge gespeichert. Nach dem Töten der mit diesen Produkten behandelten Mäuse stellt man eine Zunahme des Volumens und des Gewichtes der Milz (dargestellt in den Fig. 3 und 4) nur bei den mit P^ behandelten Tieren fest. In der Fig. 3 ist auf der Ordinate das Gewicht der Milz (in mg) angegeben und in der Fig. 4 ist das Gewicht der Leber (in g) als Funktion der Anzahl der Tage (auf der Abszisse) angegeben, die verstrichen sind, nachdem dem Tier eine Dosis von 0,3 mg des Produkts P (Kurven 3) oder P^ (Kuven 4) auf 20 g Körpergewicht der Maus auf intravenösem oder intraperitonealem Wege verabreicht worden sind. Die beiden Organe nehmen nach 5 bis 6 Wochen ihr Normalpewicht wieder an und es ist keine Radioaktivität mehr festzustellen, die auf natürliche Weise ausgeschieden worden ist.
Die Wirkung bei der Entstehung der Leukozyten und Blutplättchen wurde bei mit Methotrexat behandelten Kaninchen untersucht. Bei den Tieren, denen Methotrexat (35 mg auf intramuskulärem Wege pro Kaninchen) verabreicht worden ist, ist 48 Stunden nach der Verabreichung des Antimitotikums eine Verringerung der Anzahl der Leukozyten um etwa 30 % festzustellen. Bei drei Versuchskaninchen wird einem Kaninchen 2 mg des Gemisches aus P, + P^ (in dem Gewichtsverhältnis 1:1) subkutan verabreicht, einem Kaninchenwird die gleiche Dosis intraperitoneal verabreicht, einem dritten Kaninchen wird nur Methotrexat (zum Vergleich) verabreicht. Die beiden mit P, + P^ behandelten Kaninchen erreichen nach 5 bis 7 Tagen wieder einen praktisch normalen Gehalt an Leukozyten, während das Vergleichskaninchen erst nach etwa 15 Tagen den Normalwert wieder erreicht hat.
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Den gleichen Kaninchen wird danach eine zweite Dosis Methotrexat (55 mg i.v. pro Kaninchen) verabreicht, Tag 0 in der Fig. 5· Zwei Tage danach verabreicht man einem Kaninchen 5 mg P, + P^, (Gewichtsverhältnis 1:1,5) auf intraperitonealem Wege, einem Kaninchen verabreicht man die gleiche Dosis auf subkutanem Wege und dem dritten Kaninchen (dem gleichen Vergleichskaninchen wie in dem vorausgegangenen Versuch) verabreicht man nur das Methotrexat. Die Ergebnisse der Analyse des Gehaltes an Leukozyten in dem alle zwei Tage 20 Tage lang entnommenen Blut sind in der Fig. 5 dargestellt.
Aus der Fig. 5» in der auf der Ordinate die Gehalte an Leukozyten als Funktion der Anzahl der nach der Injektion von Methotrexat verstrichenen Tage (auf der Abszisse) angegeben sind, sieht man, daß die Wirkung des Methotrexats sich bei den drei Kaninchen in einer sehr starken Verringerung des Gehaltes an Leukozyten (Vergleichstiere: Kuve 1) äußert, die jedoch weniger stark ist bei den beiden Kaninchen, die vorher mit P, + P^, auf subkutanem Wege (Kuve 2) oder auf intraperitonealem Wege behandelt worden sind, als bei dem Vergleichskaninchen.
Bei dem Kaninchen, dem zum zweiten Mal P, + P^ auf intravenösem Wege (Kurve 3) verabreicht worden ist, wird der Gehalt an Leukozyten innerhalb von 48 Stunden normal, steigt in 24 oder 48 Stunden an, bevor er sich schnell stabilisiert. Bei dem Kaninchen, dem P, + P^. auf subkutanem Wege verabreicht worden ist, erreicht die Kurve 2, welche die Zunahme des Gehaltes an Leukozyten darstellt, ihr Maximum am 6. Tage und stabilisiert sich danach (Fig. 5)· Dagegen bleibt bei dem Vergleichskaninchen (das nicht mit P, + P^ behandelt worden ist) der Gehalt an Leukozyten auf dem niedrigen Niveau und das Tier erreicht während der Beobachtungezeit den Normalwert nicht mehr. Der Gehalt an roten Blutkörperchen variiert bei den so behandelten Kaninchen nicht.
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Die mit den mit verschiedenen Abbauagentien gemäß den Beispielen 2 bis 4- erhaltenen ARN-Bruchstücken durchgeführten phnrmakologischen Untersuchungen haben gezeigt, daß kein signifikanter Unterschied besteht in bezug auf die Aktivität bei der Leukopoese und bei der Bildung von Blutplättchen zwischen den Produkten P* und P^ des Beispiels 1, die einzeln oder in Form einer Mischung in beliebigen Mengenverhältnissen verabreicht worden sind^und jedem der Produkte der Beispiele 2 bis 4.
Eine einzige Dosis jedes der Produkte der Beispiele 2 bis 4· (2 bis 5 mg), verabreicht auf intravenösem Wege an Kaninchen mit starker und ständiger Immununterdrückung (mit um 60 bis , 70 % verringertem Leukozytengehalt) erlaubt die Wiedereinstellung eines normalen Gehaltes an Leukozyten innerhalb von 24 bis 48 Stunden. Die Anzahl der Blutplättchen kann durch diese ARN-Bruchstücke von 50 auf 100 %y bezogen auf die Anzahl der Blutplättchen der Vergleichstiere, erhöht werden. Die Fig. 6 erläutert die während der Dauer eines Versuchs (20 bis 50 Tage) bei durchgehend mit Endoxan (65 mg/Tag) und periodisch mit den ARN-Bruchstücken, die nach dem einen oder anderen der Beispiele 1 bis 4 hergestellt worden sind, behandelten Kaninchen erhaltenen Ergebnisse.
In der Fig. 6 ist auf der Abszisse die Anzahl der Tage des Versuchs angegeben, während der den Kaninchen 65 ag Endoxan pro Tag verabreicht wurden.Zu dem durch den Pfeil A angegebenen Zeitpunkt wurden den Kaninchen auf intravenösem Wege 2 mg ARN-Bruchstücke verabreicht. Eine der Kurven der Pig. 6 wurde erhalten durch Auftragen der Anzahl der Leukozyten auf der Ordinate und die andere Kurve wurde erhalten durch Auftragen der Anzahl der Blutplättchen auf der Ordinate.
Für die Injektion der aktiven ARN-Bruchstücke können alle Verabreichungsarten angewendet werden: intramuskulär (i.m.),
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intravenös (i.V.), subcutan (s.c), intradermal (i.d.) und per os (p.o.). Die Dauer bis zum "Ansprechen" variiert mit der gewählten Verabreichungsart und ist eine Funktion der Dosis des Produkts. Bei den nicht mit Endoxan behandelten Kaninchen, deren Blutzusammensetzung normal ist, verändert die Verabreichung von ARN-Bruchstücken auf intravenösem Wege den Gehalt an weißen Blutkörperchen nicht. Wenn die Dosis des Produktes hoch ist, stellt man eine Erhöhung fest, innerhalb von 24 Stunden wird der Gehalt an weißen Blutkörperchen jedoch wieder normal.
Die Wirkung von verschiedenen chemischen und physikalischen Agentien (Endoxan, Methotrexat, Thiotepa, Strahlung) und selbst eine genetische Schwäche, die eine leukopoetische Verminderung oder eine Abnahme der Blutplättchen mit sich bringt, kann von diesem Gesichtspunkt aus betrachtet durch diejenige der verschiedenen oben genannten ARN-Bruchstücke ausgeglichen werden. Die Wirkung auf die Bildung der Blutplättchen ist weniger schnell als diejenige auf die weißen Blutkörperchen, sie ermöglicht jedoch einen bedeutenden allmählichen Wiederanstieg· Klinische Versuche haben diese Ergebnisse bestätigt. Die Verlängerung der Chemotherapie macht eine erneute Verabreichung der ARN-Bruchstücke erforderlich, ohne daß das Phänomen dadurch erschöpft wird.
Toxikologie
Die Produkte P- und P^, des Beispiels 1 und diejenigen der Beispiele 2 bis 4, gelöst in physiologisch sterilem Wasser, wurden auf intravenösem, intraperitonealem, intramuskulärem, subcutanem und oralem Wege an Mäuse und Kaninchen verabreicht. Dosen von 1 bis 5 ag in einer einzigen Injektion bei der Maus und von 4 bis 25 ng beim Kaninchen, die mehrere Tage lang und bis zu 15 Tage hintereinander wiederholt wurden, zeigten keinerlei toxische Wirkung der Produkte. Auch deutlich höhere
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Dosen, die auf oralem Wege verabreicht wurden, zeigten keine toxische Wirkung. Teratologische Untersuchungen haben gezeigt, daß die Injektion der erfindungsgemäßen Produkte in trächtige weibliche Mäuse keine nachteilige Wirkung weder für die erste Generation noch für die folgenden Generationen hatte. Die erfindungsgemäßen Produkte sind somit für das Tier völlig unschädlich.
Therapeutische Anwendung
Klinische Versuche haben gezeigt, daß die erfindungsgeaäßen Produkte auch an Menschen verabreicht werden können, jedesmal, wenn eine Leukopenie oder ein Mangel an Blutplattchen vorliegt, um den normalen Gehalt an Leukozyten und Blutplattchen wieder—' herzustellen, ohne daß die übrige Blutzusammensetzung geändert wird. Zwischen den verschiedenen Typen von weißen Blutkörperchen stellt sich wieder ein Gleichgewicht ein.
Da die Produkte in Wasser löslich sind, können sie auf Jedem parenteralen Wege in Form von physiologischen Lösungen oder auf oralem Wege in allen klassischen galenischen Formen (trinkbaren Lösungen, Tabletten, Kapseln und dgl.) verabreicht werden. Die zu verabreichende Dosis kann von 10 bis 20 mg, Je nach Art der zu behandelnden Krankheit, variieren und die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel bzw. Zubereitungen enthalten als aktiven Bestandteil mindestens eines der erfindungsgemäßen Produkte in einer Einheitsdosis von 2 bis 100 mg, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger.
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Claims (12)

  1. Mirko Beljanski
    Paris / Frankreich
    MEIN ZEICHEN: MVREFERENCE: B 953 K
    DATUM:
    Polyribonucleotide, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als oder in Arzneimitteln
    Patentan sprüche
    1, Polyribonucleotide, dadurch gekennzeichnet , daß sie hergestellt worden sind durch Abbau von aus Mikroorganismen oder Tierorganen extrahierten Ribosomen-Ribonucleinsäuren, bestehend aus einfachen Ketten, die als ARN-Bruchstücke bezeichnet werden, die etwa 20 bis etwa 80 Ribonucleotid-Einheiten enthalten und dadurch charakterisiert sind, daß das Gesamtverhältnis von Purinbasen zu Pyrimidinbasen C(G+A)/(C+U)3 zwischen 1,0 und 2,5 liegt.
  2. 2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie hergestellt worden sind aus aus Escherichia coli H 500-Sho-R extrahierten Ribosomen-Ribonucleinsäuren durch Abbau mittels Pankreas-Ribonuclease und anschließende Selektion durch Passieren durch ein Sephadex G 25-Molekularsieb und Eluieren mit einem Puffer mit pH 7 »4- nach einem an sich bekannten Verfahren, wobei man nur die Fraktionen gewinnt, die auf der Elutionskurve der Pig. 1 den Maxima P, und P^ entsprechen.
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    ORIGINAL INSPECTED
  3. 3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen bestehen aus Polyribonucleotiden der Fraktion P*, deren Gesamtverhältnis von Purinbasen* zu Pyrimidinbasen den folgenden Wert hat (G+A)/(C+U) » 2,3.
  4. 4-, Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen bestehen aus Polyribonucleotiden der Fraktion P^, deren Gesamtverhältnis von Purinbasen zu Pyrimidinbasen den folgenden Wert hat: (G+A)/(C+U) = 1,06.
  5. 5. Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Polyribonucleotiden der Fraktionen Ρ, und P^, in beliebigen Mengenverhältnissen bestehen.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung der Polyribonucleotide nach den Ansprüchen 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man die aus einem Mikroorganismus, der ein geeignetes Verhältnis (G+AyCG+U) ergibt, insbesondere Escherichia coli T 3000, extrahierten Ribosomen-Ribonucleinsäuren mittels einer Ribonuclease oder mittels eines chemischen Agens, insbesondere einer alkalischen Base, abbaut.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Abbau der Ribonucleinsäuren unter der Einwirkung einer Pankreas-Ribonuclease durchführt.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Abbau der Ribonucleinsäure mittels einer aus Neurospora crassa extrahierten Ribonuclease durchführt.
  9. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man nach 20-bis 30-minütiger Inkubation der Mischung der Ribosomen-Ribonucleinsäuren und der Ribonuclease bei 36°C die Reaktion durch Zugabe von Phenol und dann von Chloroform abstoppt, wobei man jedesmal die wäßrige Phase abtrennt, die man schließlich gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei man die nicht-dialysierbare Fraktion ge winnt, die man lyophilisiert.
    709851/0763
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 6, daudrch gekennzeichnet, daß man den Abbau der Ribonucleinsäure mittels Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid durchführt.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Natriumhydroxid oder das Kaiiumhydroxid in einer molaren Endkonzentration von 0,1 η 30 Minuten lang bei 360C einwirken läßt, dann sofort mit einem gleichen Volumen 0,1 η Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, die erhaltene Lösung etwa 16 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert und danach die nicht-dialysierbare Fraktion lyophilisiert.
  12. 12. Arzneimittel, insbesondere für die Behandlung von Leukozyten- und Blutplattchenmangelzuständen durch Verabreichung auf oralem Wege oder durch Injektion, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Polyribonucleotid nach den Ansprüchen 1 bis 5» gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger,, enthält.
    13· Arzneimittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff in einem physiologischen Serum in einer Einheitsdosis von 2 bis 100 mg gelöst ist.
    709R B1 /0763
DE19772723451 1976-06-03 1977-05-24 Polyribonucleotide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als oder in arzneimitteln Granted DE2723451A1 (de)

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