DE2735411A1 - Verfahren zur herstellung von acellulaeren vaccinen und nach diesem verfahren gewonnene vaccine - Google Patents

Verfahren zur herstellung von acellulaeren vaccinen und nach diesem verfahren gewonnene vaccine

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DE2735411A1 DE19772735411 DE2735411A DE2735411A1 DE 2735411 A1 DE2735411 A1 DE 2735411A1 DE 19772735411 DE19772735411 DE 19772735411 DE 2735411 A DE2735411 A DE 2735411A DE 2735411 A1 DE2735411 A1 DE 2735411A1
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Description

£735411
PATENTANWÄLTE
ΐ)Γ-4-H Bartels
Dipt.-Chem. Dr. Brandes Dr.-lng.Held Dipl.-Phys. Wolff
Reg. Nr. 125
8 München 22. ThierschstraBe 8
Tel (089) 293297
Telex 0523325 (patwo d) Telegrammadresse: wolffpatent, münchen Postscheckkonto Stuttgart 7211 (BLZ 60010070)
Deutsche Bank AG, 14/28630 (BLZ 600 700 70)
Bürozeit: 8-12 Uhr, 13-16.30 Uhr außer samstags
21. Juli 1977 R/dö
Pierre Pabre S.A. Paris, Prankreich
Verfahren zur Herstellung von acellulären Vaccinen und nach diesem Verfahren gewonnene Vaccine
(Zusatz zu Patent (Patentanmeldung P 26 13 943.5-41)
709886/0988
273S I I
Verfahren zur Herstellung von acellulären Vaccinen und nach diesem Verfahren gewonnene Vaccine
Die Erfindung betrifft eine Verbesserung und weitere Ausgestaltung des Verfahrens zur Herstellung von acellulären
Vaccinen nach Patent (Patentanmeldung P 26 13 943)»
und sie betrifft ferner die nach diesem Verfahren erhaltenen Vaccine, die eine Kombination darstellen aus Ribosomenfraktionen und aus Membran-Saccharidfraktionen, welche aus Membran-Polysacchariden und -Lipopolysacchariden bestehen.
Die bekannten Vaccine, welche aus abgetöteten, abgeschwächten oder löslich gemähten Mikroorganismen bestehen, haben eine Vaccinwirkung, die geringer ist als diejenige von lebenden Mikroorganismen. Es besteht daher das Bedürfnis nach neuen Vaccinen, die eine bessere Antigenaktivität besietzen als bekannte Vaccine.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß die Ribosomen von Bakterienzellen Träger der Vaccinaktivität sind und daß letztere nur zur Wirkung kommt zusammen mit einem Immunitätshilfsmittel. Erfindungsgemäß wird dieses lösliche Hilfsmittel aus Zellmembranen von Bakterien extrahiert in Form einer Saccharidfraktion.
Gegenstand der Erfindung ist eine Verbesserung und weitere Ausgestaltung des Verfahrens zur Herstellung von acellulären
Vaccinen nach Patent (Patentanmeldung P 26 13 943),
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) die Ribosoraenfraktion mindestens eines pathogenen Bakterienstammes, der die zu behandelnde oder zu verhindernde Krankheit hervorruft, und
b) die Saccharidfraktion, die aus Bakterienmembranen mindestens eines Bakterienstammes des Genus Klebsiella, Serratin
709β8Β/09ββ
oder Corynebacterium extrahiert ist, miteinander vermischt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein acelluläres Vacein, das gekennzeichnet ist durch eine Kombination aus
a) der Ribosomenfraktion mindestens eines pathogenen Bakterienstammes, der die zu behandelnde oder zu verhindernde Krankheit hervorruft, und
b) der Saccharidfraktion, die aus Bakterienmembranen mindestens eines Bakterienstammes des Genus Klebsiella, Serratia oder Corynebacterium extrahiert ist·
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Saccharidfraktion des Vaceins vorzugsweise aus Bakterienmembranen mindestens eines der folgenden Bakterienstämee extrahiert des Genas:
Klebsiella pneumoniae Klebsiella rhinoscleromatis Serratia corallina Serratia indica Serratia keilensis Serratia kiliensis Serratia marsescens Serratia plymuthica Corynebacterium avidum Corynebacterium bovis Corynebacterium enzymicum Corynebacterium equi Corynebacterium fascians Corynebacterium flaccumfaciene Corynebacterium flavidum Corynebacterium fueiforme Corynebacterium granulosum Corynebacterium helvolum
709886/0988
Corynebacterium hypertrophicans
Corynebacterium insidiosum
Corynebacterium liquefaciens
Corynebacterivun parvum
Corynebacterium parvum infectiosum
Corynebacteriuin paurometabolum
Corynebacterium pyogenes
Corynebacterium tumescens
Corynebacterium xerosis
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die als Hilfsmittel verwendete Saccharidfraktion aus Membranen von Klebsiella pneumoniae extrahiert.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird als Hilfsmittel neben der angegebenen Membran-Saccharidfraktion eine Membran-Saccharidfraktion verwendet, die aus Bakterien extrahiert ist, welche den verwendeten Ribosomen entsprechen.
In den erfindungsgemäßen Vaccinen liegt das Gewichtsverhältnis von Ribosomenfraktion zu Saccharidfraktion vorzugsweise zwischen 0,5 und 1.
Die Einheitsdosis des Vaccine kann selbstverständlich variieren in Abhängigkeit von den Erfordernissen der Behandlung oder der Art der Verabreichung.
Im folgenden werden Beispiele für Dosierungen gegeben, die selbstverständlich keine Beschränkung darstellen, sondern bevo rzugt e Aus führungsfοrmen.
709886/0988
Broncho-HNO-Vaccin (wobei HNO für Hals-Nasen-Ohren, entsprechend dem französischen
Ausdruck ORL steht):
Ribosomenfraktionen
Ribosomen von Klebsieila pneumoniae 3,5 /ug
Ribosomen von Diplococcus pneumoniae 3,0 /ug
Ribosomen von Streptococcus pyogenes Gruppe Α.. ρ 3,0 /Ug
Ribosomen von Hemophilus influenzae 0,5 /ug
10,0 /ug
lösliches Hilfsmittel
Merabran-Saccharidfraktion
von Klebsiella pneumoniae 15,0 /ug
1 Dosis enthält reine aktive Komponente in
einer Menge von 25,0 /ug
Dental-Vaccin der Zusammensetzung:
Ribo3omenfraktionen
Ribosomen von Actinomyces viscosus 1,2 /ug
Ribosomen von Rothia dentocariosus 1,2 /ug
Ribosomen von Streptococcus mutants 0,8 /ug
Ribosomen von Streptococcus salivarius 1,0 /Ug
Ribosomen von Lactobacillus casei 1,2 /Ug
5,4 /ug
709RHf, /0988
lösliches Hilfsmittel
Membran-Saccharidfraktion
von Klebsiella pneumoniae j,6 /Ug
1 Dosis enthält reine aktive Komponente in
einer Menge von 15,0 /ug
Veterinär-Vaccin der Zusammensetzung:
Ribosomenfraktionen
Ribosomen von Pasteurella hemolytica H. 3,0 /ug
Ribosomen von Pasteurella multocida A1 - IO48 3,0 /ug Ribosomen von Pasteurella multocida A, - AI3 3,0 /ug
9,0 /ug lösliches Hilfsmittel
Membran-Saccharidfraktion
von Klebsiella pneumoniae 13»5 /ug
Membran-Saccharidfraktion
von Pasteurella hemolytica H1 1,0 /ug
Membran-Saccharidfraktion
von Pasteurella multocida A1 - IO48 1,0 /ug
Membran-Sac chari d frakt i on
von Pasteurella multocida A, - A13 1,0 /ug
16,5 /ug
1 Dosis enthält reine aktive Komponente in
einer Menge von 25,5 /ug
7 0 9 R R F. / Π 9 8 fl
Die Saccharidfraktion der erfindungsgemäßen Vaccine ist ζ. Β. herstellbar durch Extraktion einer wäßrigen Membransuspension mit Hilfe von Phenol, wobei die Saccharide aus der wäßrigen Phase gewonnen werden nach Abtrennung der Phenolphase. Diese Phenolextraktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 60 und 70 0C, insbesondere bei 65 0C, mit einer 90 #igen Phenollösung durchgeführt.
Die für die angegebene Extraktion verwendete wäßrige Membransuspension kann erhalten werden, wie dies im Hauptpatent beschrieben ist, nämlich aus einer Bakterienkultur, die zerkleinert und anschließend zentrifugiert wird unter selektiver Sedimentation der Membranen, die dann in einer wäßrigen Lösung suspendiert werden. Die Sedimentation der Membranen kann z. B. durch Zentrifugation unter einer Beschleunigung in der Größenordnung von 30 000 g nach Abtrennung von Zellbruchstücken erfolgen.
Die Ribosomenfraktion ist herstellbar durch Extraktion von zerkleinerten Bakterienzellen mit einem sauren Salzpuffer, der Salzsäure, MgCl2, NaCl und Natriumdodecylsulfat enthält, wobei eine wäßrige Lösung anfällt, die mit Polyäthylenglycol und Äthylalkohol ausgefällt wird, wobei der erhaltene Niederschlag die Ribosomenfraktion enthält. Zur Vervollständigung der Reinigung wird der Niederschlag vorzugsweise in einem Puffer aufgenommen, der Salzsäure, MgCl2, NaCl und Natriumdodecylsulfat enthält, worauf die erhaltene wäßrige Phase erneut ausgefällt wird mit Äthylalkohol, vorzugsweise mit 95 tigern Äthylalkohol,
Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag kann als Ausgangssubstanz für die erfindungsgemäßen Vaccine dienen, indem er in den angegebenen Gewichtsverhältnissen, die weiter unten noch näher erläutert werden, mit der angegebenen Saccharidfraktion vermischt wird.
709886/0988
Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen Vaccine entsprechend den sie aufbauenden Komponenten in der auf dem Gebiete der Impfheilkunde üblichen Weise zur Behandlung von oder zur Vorbeugung gegen Krankheiten des verschiedensten Typs angewandt werden, und so ermöglicht z. B, das oben definierte Bronche-HNO-Vaccin die Behandlung oder Verhinderung von verschiedenen Arten von chronischer Rhinotracheo-bronchitis, mit Bronchitis einhergehendem Asthma, Bronchektasien, superinfizierten viralen Pneumopathien, sowie Sinusitis und Rhino-pharyngo-laryngitis.
Das angegebene Dental-Vaccin ermöglicht die Vorbeugung gegen die hauptsächlichen Mundaffektionen.
Die erfindungsgemäßen Vaccine liegen vorzugsweise in Form von Aerosolen vor. Es ist jedoch auch möglich, sie in Form anderer pharmazeutischer Zubereitungen vorzusehen. So können z. B. bestimmte erfindungsgemäße Vaccine parenteral, z. B. durch Injektion, angewandt werden.
Es ist selbstverständlich überflüssig, an dieser Stelle die lange Liste von Komponenten anzuführen, die als Träger- oder Verdünnungsmittel für das erfindungsgemäße Vaccin in Frage kommen, da es sich hierbei um übliche bekannte Techniken auf dem Gebiete der Impfstoffe oder der galenischen Arzneimittel handelt·
In der Regel werden die beiden Komponenten des Vaccins in Form einer Lösung konserviert, doch können sie auch lyophilisiert werden nach der Herstellung des Vaccins, wozu es genügt, die verschiedenen Vaccinkomponenten in den vorbestimmten Gewichtsverhältnissen miteinander zu vermischen.
Die analytischen Normwerte des erhaltenen Produkts können wie folgt bestimmt werden:
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£735411
Der Gehalt an Ribosomen in der Ribosomenfraktion wird aus dem RNS-Gehalt wie folgt berechnet:
RNS-Gehalt χ 100 Ribosomengehalt = ■ ■
Der RNS-Gehalt wird seinerseits gemessen durch spektrophotomefrische Gewichtsbestimmung des Phosphormolybdänkomplexes im Vergleich mit einer RNS-Probe von Klebsiella bekannten Gehalts, der bestimmt wurde durch Gewichtsbestimmung des Phosphors.
Der Proteingehalt der Ribosomenfraktion wird bestimmt durch die kolorimetrische Biuret-Reaktion im Vergleich mit einer Albumin-Eichfarbskala.
Der Prozentgehalt an RNS in der Gesamtmenge an RNS + Proteine variiert von etwa 55 tis 65 #.
Der Gehalt an Sacchariden des Hilfsmittels wird bestimmt aus dem durch kolorimetrische Gewichtsbestimmung nach der Anthron-Methode gemessenen Glucosegehalt in folgender Weise:
Glucosegehalt χ 100
Saccharidgehalt = ———————
Ein hochgereinigtes Saccharid-Eichpräparat dient zur Bestimmung des Glucosegehalts der Saccharide, der nach dieser gewichtsanalytischen Methode 50 i» beträgt.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Vaccine nach der Erfindung anhand eines Beispiels erläutert.
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A) Herateilen einer wäßrigen Lösung von Ribosomen
Die verschiedenen Bakterienstämme, deren Ribosomen extrahiert werden sollten, wurden in üblicher bekannter Weise auf geeigneten Nährmedien in Permentern kultiviert.
Die Bakterienzellen wurden nach der Kultivierung in einer Zentrifugiervorrichtung des Typs "Westfalie11 oder "Sharpies1* gesammelt und anschließend gewaschen durch Zentrifugieren mit physiologischer Kochsalzlösung, die auf eine Temperatur in der Größenordnung von 4 0C gekühlt war.
Das auf diese Weise erhaltene Bakterienkonzentrat konnte durch Einfrieren bei -2<
sofort gebraucht wurde.
durch Einfrieren bei -20 C konserviert werden, wenn es nicht
Ebenso wie die Extraktion von Sacchariden ließ sich auch die Extraktion von Ribosomen an einem Gemisch von verschiedenen Bakterienstämmen durchführen, doch wird es vorgezogen, jeden Stamm separat zu behandeln, um die Kontrolle über das erhaltene Produkt zu erleichtern, wobei im letztgenannten Falle die Ribosomen und/oder die Saccharide nach durchgeführter Extraktion vermischt werden zur Erzeugung des Vaccins.
Von dem erhaltenen Bakterienkonzentrat wurde eine Probe entnommen, um das Trockengewicht der Zellen nach der Trocknung in einem Trockenschrank zu bestimmten (das Verhältnis trockene Zellen/feuchte Zellen variierte von 20 bis 25 #)·
Eine weitere Probeentnahme war dazu bestimmt, die Reinheit der Kultur zu kontrollieren und den Bakterienstamm zu identifizieren.
Das erhaltene Bakterienkonzentrat wurde sodann in folgender Weise suspendiert und homogenisiert:
Eine kleine Menge an feuchten Zellen (weniger als 50 g) wurde dispergiert im Verhältnis von 1 g (Feuchtgewicht) Zellen pro 4 ml Puffer der folgenden Zusammensetzung:
Tris-HCl (M/100) pH 7,2 mit einem Gehalt an
MgCl2.6 H2O 0,01 M
HaCl 9 g/l
Natriumdodecylsulfat 5 g/l
Sobald die Suspension gut homogen war, wurde sie einer Verteilungsoperation durch Ultraschallbehandlung 3 mal 10 Minuten lang unterworfen, während sie in einem Eisbad gehalten wurde, wobei z. B. ein "Sonnimasse 500 T"-Ultraschallapparat verwendet werden konnte.
Eine größere Menge an Zellen (mehr als 50 g) wurden in der Weise behandelt, daß die aufgetauten Zellen im gleichen Puffer wie oben angegeben und im gleichen Mengenverhältnis dispergiert und anschließend homogenisiert wurden durch 10 Minuten langes heftiges Rühren in einem Reaktor mit großer Geschwindigkeit.
Sie wurden sodann einer Zerkleinerungsbehandlung unterworfen in einer "Manton-Gaulin" -Vorrichtung in der Kälte (5 Zyklen für jeden Stamm). Die größten Zellbruchstücke wurden entfernt durch Durchleiten durch eine nSharpleslf-Apparatur, worauf der Überstand bei 4 0C 30 Minuten lang bei 30 000 g zentrifugiert wurde (Zentrifuge "Beckman 521-B" mit Rotor 6 χ 250 ml JA 14)·
Der Zentrifugenkuchen wurde entfernt und der die Ribosomen enthaltende Oberstand wurde bei 4 0C aufbewahrt.
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B) Extraktion der Ribo3omen
Der angegebene Überstand wurde mit 100 g/l Polyäthylenglycol 4000 (PEG 4000-Merck) und anschließend nach vollständiger Lösung mit 1 Volumen 95 #igem Äthylalkohol bei -20 0C versetzt.
Es wurde sodann 20 Minuten lang in der Kälte stehen gelassen, worauf der Niederschlag in einer "Sharpless^-Apparatur bei 4 0C gewonnen wurde (der Überstand wurde entfernt).
Der Niederschlag wurde sodann gelöst im gleichen Volumen Äffer, der auch für die Zerkleinerung verwendet wurde (Tris-HCl, MgCIp, NaCl, 0,5 #iges Natriumdodecylsulfat), durch 30 bis 60 Minuten langes Rühren im Reakt&or bei Umgebungstemperatur (das Waschen bei Umgebungstemperatur diente der Entfernung der Nichtribosomen-Proteine)·
Es wurden sodann 0,8 Volumen 95 #iger Äthylalkohol bei -20 0C zugegeben und 30 Minuten lang bei 10 0C ausfällen gelassen.
Der Niederschlag aus Ribosomen wurde in einer "Sharpless"-Apparatur gesammelt und der Überstand wurde entfernt (ohne Kühlung, um zu verhindern, daß das Natriumdodecylsulfat ausfällt). Der Ribosomenkuchen wurde in Puffer aufgenommen (0,02 M-MgCl2, 0,02 M-KCl, pH 7) bei 4 0C im Mengenverhältnis von 2 ml pro g feuchte Ausgangs-Zellen (unter Rühren zwischen 2 und 4 Stundend
Das erhaltene Material wurde 45 Minuten lang bei 30 000 g und bei 0 0C zentrifugiert (Entfernung des restlichen Natriumdodecylsulfats).
Der Zentrifugenkuchen wurde entfernt und der Überschlag aufbewahrt. Es wurde eine Probe entnommen (1 bis 2 ml) in welcher der Gehalt an RNS, der Gehalt an Proteinen und die Gewichtsmenge pro ml bestimmt wurde.
709886/0989
27354)1
Die Ribosomen wurden in sterilen Plasmakolben bei -20 0C bis zum Gebrauch aufbewahrt.
C) Herstellung einer wäßrigen Membransuspenaion
Die Zellen wurden nach der Kultivierung durch Zentrifugation in einer "Westfalia"- oder "Sharplesw-Apparatur gesammelt und anschließend durch Zentrifugation mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Das erhaltene Bakterienkonzentrat konnte bei -20 0C konserviert werden.
In einer Probe wurde der Trockenrückstand bestimmt durch Trocknen in einem Trockenschrank und es wurden bakteriologische Untersuchungen bezüglich Reinheit und Identität durchgeführt.
Die aufgetauten Zellen wurden in kaltem Puffer suspendiert im Verhältnis von 1 g Zellen pro 4 ml Puffer. Der verwendete Puffer hatte die folgende Zusammensetzung:
Tris-HCl 0,01 M, pH 7
NaCl 9 g/l
MgCl2.6 H2O 0,01 M
Die Zerkleinerung erfolgte in einer "Manton-Gaulinll-Vorrichtung (3 Zyklen bei maximalem Druck). Die intakten Zellen sowie die Zellbruchstücke wurden entfernt durch Durchleiten durch eine ••Sharplesw-Apparatur und der Überstand wurde bei 4 0C aufbewahrt·
Die Membranen wurden sodann gesammelt durch 43 Minuten lange Zentrifugation bei 30 000 g und 4 °C ("Beckman J 21-B", Rotor JA 14).
709886/0988
Der Überstand wurde entfernt (ein Teil davon kann aufbewahrt werden zur Herstellung einer RNS-Ribosomen-Standardprobe für analytische Zwecke). Der Zentrifugenkuchen wurde aufbewahrt zur Extraktion des löslichen Hilfsmittels. Die Zentrifugenkuchen wurden suspendiert in destilliertem Wasser im Verhältnis von 2,5 ml pro g feuchte Ausgangs-Zellen (1 bis 2 Minuten lange Homogenisierung in einer "Turrax^-Apparatur).
D) Saccharid-Extraktion
Zu der erhaltenen wäßrigen Suspension wurde 1 Volumen PhenoL-Wasser (Phenolgehalt cj0 $>), das zuvor auf ^f 80 0G thermostatisiert worden war, zugegeben, worauf das Gemisch 5 Minuten lang bei 65 0C heftig gerührt wurde.
Dann wurde sofort rasch auf 0 0C gehkühlt. In kleinen Volumen wurde die wäßrige Phase durch 5 Minuten lange Zentrifugation bei 5000 UpM bei 0 0C in Bechern aus rostfreiem Stahl abgetrennt. Die überstehende wäßrige Phase wurde sodann gesammelt.
In der Hauptmenge der Suspension wurde die wäßrigen Phase abgetrennt durch Durchleiten durch einen "Westfalia·*- oder "SharplesM-Plüssig/Plüssig-Abscheider.
Die Phenolphase wurde entfernt.
Das restliche in der wäßrigen Phase befindliche Phenol wurde abgetrennt durch 24 bis 48 Stunden lange Dialyse gegen fließendes Wasser entweder in einem Dialyseschlauch in kleinem Volumen oder in einem Plattendialysator (Typ "Sartorius") in größeren Volumen.
Der leichte Niederschlag, der sich während der Dialyse bildet, wurde abgetrennt durch 30 Minuten lange Zentrifugation bei 10 000 g bei 0 0C.
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£735411
Der erhaltene Überstand wurde in sterilen Plasmakolben bei -20 0C eingefroren und aufbewahrt.
Es wurde eine Probe von 1 oder 2 ml entnommen zur Durchführung der analytischen Untersuchungen.
Die erfindungsgemäßen Vaccine sind sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin verwendbar.
1) Untersuchung der Antigenwirkung des angegebenen Veterinär-Vaccins
Diese Untersuchung wurde mit dem Ziele durchgeführt, das Auftreten und die Beständigkeit spezifischer Antikörper im Serum geimpfter Mäuse zu bestimmen.
Es wurden weibliche Mäuse der Rasse Swiss mit einem Körpergewicht von 20 + 2 g verwendet, die zu 10 in Käfigen gehalten wurden bei einer Ernährung in Form von abgeteilten Stücken (Mäusediät UAR) und von Trinkwasser in einem Tierhaltungsraum bei einer konstanten Temperatur von 22 + 1 0C unter einer Feuchtigkeit von 40 bis 60 £·
Immunisierung dar Tiere
Subcutan wurde jedem Tier die Vaccindosis in einem Volumen von 0,2 ml injiziert· Der Injektionsrhythmus war wie folgtt
- 5 Impfungen in 15 Tagen (d. h. eine Injektion alle 3 Tage),
- 1 Woche lang Pause,
- 2 Impfungen in 8 Tagen (Wiederholungsimpfung),
- Punktion durch die retro-orbitalen Höhlen mindestens 10 und höchstens 15 Tage nach der letzten Wiederholungsinjektion·
709Rfifi/0988
Methode zur Untersuchung der Antikörper
Das Serum jeder geimpften Maus wurde untersucht durch Immuno elektrodiffusion nach der Technik von Laurell·
Jedes Versuchstierserum wurde untersucht auf das Antigen von dem Pasteurella-Bakterium, von dem die Membransaccharide abstammen: Pasteurella hämolytica H.. und Pasteurella multocida
In gleicher Weise wurde jedes Serum untersucht auf die Gesamtmenge an Pasteurella, aus dem die Ribosomen des Präparats extrahiert wurden.
Das zu testende Antigen wurde einem Agarosegel in einer Konzentration von 1 i» in Veronalpuffer von pH 8,6 einverleibt. Dieses Gel wurde auf eine Glasplatte von 1,5 x 90 χ 110 mm geschüttet·
Es wurden 7 /ul Serum jeder Maus in Vertiefungen eingebracht, die zuvor in dem Gel ausgehoben wurden.
Die Ablagerung diente als Kathode. Die Wanderung dauerte 9 Stunden unter Gleichstrom bei einer Potentialdifferenz von 2 bis 3 Volt/cm.
Am Ende der Wanderung wurden die Platten gewaschen und getrocknet und die Immunoniederschläge wurden ausgewertet durch Anfärbung mit Coomassie-Brillantblau.
709886/0988
Ergebnisse
Es wurde das Vorliegen von spezifischen Iramunoniederschlägen zwischen den Antikörpern des Serums der behandelten Mäuse und dem Entwicklungsantigen festgestellt in Form von "Erhebungen··, deren Höhe repräsentativ iat für die Menge an Antikörpern, die in dem Serum der geimpften Tiere enthalten sind.
Es wurden auf allen Platten sehr ausgeprägte positiva Ergebnisse mit dem Serum geimpfter Mäuse im Vergleich zu den Sera von Vergleichsmäusen erhalten, was die starke Vaccinwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen bestätigt.
2) Untersuchung der Immunwirkung des angegebenen Dental-Vaceins
Ebenso wie bei den unter 1) beschriebenen Versuchen wurden weibliche Mäuse der Rasse Swiss mit einem Körpergewicht von 20 + 2 g verwendet, die zu 5 in Käfigen gehalten wurden bei einer Ernährung in Form von abgeteilten Stücken (Mäusediät UAR) und von Trinkwasser in einem Tierhaltungsraum bei einer konstanten Temperatur von 22+1 0C unter einer Feuchtigkeit von 40 bis 60 #.
Immunisierung der Tiere
Subcutan wurde jedem Versuchstier die Vaccindosis in einem Volumen von O92 ml injiziert (wobei hervorgehoben zu werden verdient, daß Versuche, die bei einem Verhältnis von Ribosomenfraktion/Saccharidfraktion von 1:1,1:1,5 und 1:2 durchgeführt wurden, zeigten, daß die angegebene Zusammensetzung von 1 : 1,5 zu den besten Ergebnissen führte)·
Der Injektionsrhythmus war wie folgt:
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- 5 Impfungen in 15 Tagen (d. h. eine Impfung alle 3 Tage),
- eine Pause von einer Woche,
- 2 Impfungen in 8 Tagen (Wiederholungsimpfung),
- Punktion durch die retro-orbitalen Höhlen mindestens 10 Tage und höchstens 15 Tage nach der letzten Wiederholungsimpfung.
Methode zur Bestimmung der Antikörper
Das Serum jeder geimpften Maus wurde untersucht durch Immunoelektrodiffusion nach der Technik von Laurell·
Das Antigen, welches jedem Mikroorganismus entsprach, von dem die Ribo3omen stammten, wurde einem Agarosegel einverleibt in einer Konzentration von 1 # in Veronalpuffer von pH 8,6. Dieses Gel wurde auf eine Glasplatte von 1,5 x 90 χ 110 mm geschüttet.
Es wurden 7 /ul Serum jeder Maus in die Vertiefungen eingebracht, die zuvor in dem Gel ausgehoben wurden·
Die Ablagerung stellte die Kathode dar. Die Wanderung dauerte 9 Stunden unter Gleichstrom bei einer Potentialdifferenz von 2 bis 3 Volt/cm.
Am Ende der Wanderung wurden die Platten gewaschen und getrocknet und die Immunoniederschläge ausgewertet durch Anfärbung mit Coomassie-Brillantblau.
Ergebnisse
Es wurde das Vorliegen spezifischer Immunoniederschläge zwischen den Antikörpern des Serums der behandelten Mäuse und dem Entwicklungsantigen in Form von "Erhebungen** festgestellt, deren Höhe repräsentativ war für die Menge an Antikörpern, welche in dem Serum der geimpften Mäuse enthalten waren.
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Ee wurdmauf allen Platten stark ausgeprägte positive Ergebnisse mit dem Serum der geimpften Mäuse im Vergleich zu den Sera von Vergleichsmäusen beobachtet, was die starke Vaccinwirkung der erfindungsgemäßen Vaccine erkennen läßt«
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Claims (1)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur Herstellung von acellulären Vaccinen nach
    Patent (Patentanmeldung P 26 13 943), bei dem
    eine Ribonucleinsäurefraktion mit einer extrahierten Membran-Gaccharidfraktion vermischt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a) die Ribosomenfraktion mindestens eines pathogenen Bakterienstammes, der die zu behandelnde oder zu verhindernde Krankheit hervorruft, und
    b) die Saccharidfrnktion, die aus Bakterienmembranen mindestens eines Bakterienstammes des Genus FCLebsiella, Serratia oder Corynebacterium extrahiert ist,
    miteinander vermischt.
    Acelluläres Vaccin, das gewonnen ist nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Kombination aus
    a) der Ribosomenfraktion mindestens eines pathogenen Bakterienstammes, der die zu behandelnde oder zu verhindernde Krankheit hervorruft, und
    b) der Saccharidfraktion, die aus Bakterienmembranen mindestens eines Bakterienstammes des Genus Klebsiella, Serratia oder Corynebacterium extrahiert ist.
    Vaccin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Saccharidfraktion aus Membranen mindestens eines der folgenden Bakterienstämme extrahiert ist: Klebsiella pneumoniae
    Klebsiella rhinoscleromatis
    Serratia corallina
    Serratia indica
    Serratia keilensis
    Serratia kiliensis
    Serratia marsescens
    709886/0980 ORIGINAL INSPECTED
    273SAI1
    Serratia plymuthica Corynebacterium avidum Corynebacterium bovis Corynebacteriujn enzyraicum Corynebacterium equi Corynebacterium fascians Corynebacterium flaccumfaciens Corynebacterium flavidum Corynebacterium fusiforme Corynebacterium granulosum Corynebacterium helvolum Corynebacterium hyoertrophicans Corynebacterium insidiosum Corynebacterium liquefaciens Corynebacterium parvum Corynebacterium parvum infectiosum Corynebacterium paurometabolum Corynebacterium pyogenes Corynebacterium tumescens Corynebacterium Xerosis.
    4. Vaccin nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich die Saccharidfraktion enthält, welche aus Membranen derjenigen Bakterien extrahiert ist, aus denen auch die Ribosomen extrahiert sind.
    5. Vaccin nach Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis der Ribosomenfraktion zur Saccharidfraktion zwischen 0,5 und 1 liegt.
    6. Vaccin nach Ansprüchen 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Saccharidfraktion aus Membranen von Klebsiella pneumoniae extrahiert ist.
    709RRR
    7· Vaccin nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Broncho-HNO-Vaccin handelt, dessen Ribosomenfraktion extrahiert ist aus
    KLebsiella pneumoniae
    Diplococcus pneumoniae
    Streptococcus pyogenes Gruppe Α..«
    Hemophilus influenzae.
    8. Vaccin nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Dental-Vaccin handelt, dessen Ribosomenfraktionen extrahiert sind aus
    Actinomyces viscosus
    Rothia dentocariosus
    Streptococcus mutans
    Streptococcus salivarius
    Lactobacillus casei.
    9. Vaccin nach Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Veterinär-Vaccin handelt, das als Ribosomenfraktion Ribosomenextrakte von
    Pasteurella hemolytica H1
    Pasteurella multocida A1 - 1048
    Pasteurella multocida A, - AI3
    enthält.
    10. Vaccin nach Ansprüchen 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Saccharidfraktion gewonnen ist durch Extraktion einer wäßrigen Membransuspension mit Hilfe von Phenol unter Isolierung der Saccharide aus der wäßrigen Phase.
    11. Vaccin nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion bei einer Temperatur zwischen 60 und 70 0C erfolgt ist.
    709886/0908
    12. Vaccin nach Ansprüchen 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Ribosomenfraktion gewonnen ist durch Extraktion von zerkleinerten Bakterienzellen mit einem HCl, MgCIp, NaCl und Natriumdodecylsulfat enthaltenden Puffer und Ausfällung der erhaltenen homogenen wäßrigen Phase mit Polyäthylenglycol und Äthylalkohol, wobei die Ribosomen im Niederschlag vorliegen.
    13. Vaccin nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Puffer 0,01 M-HCl, 0,01 M-MgCl2, 9 g/l NaCl und 5 g/l Natriumdodecylsulfat enthält.
    14. Vaccin nach Ansprüchen 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß der erhaltene Niederschlag in einem HCl, MgCl2, NaCl und Natriumdodecylsulfat enthaltenden Puffer aufgenommen und danach mit Hilfe von Äthylalkohol erneut ausgefällt ist,
    709806/09*8
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