DE2833545A1 - Hochmolekulare meningokokken- gruppe c-vaccine und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

DR.-ING. WALTER ABITZ DR. DIETER F. MORF DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER

Patentanwälte ι

Munch an,

31. JuIi 1978

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Hochmolekulare Meningokokken-Gruppe C-Vaccine und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Die Erfindung betrifft eine hochmolekulare Meningokokken-Gruppe C-Vaccine und ein "Verfahren zu ihrer Herstellung.

Insbesondere wird erfindungsgeiaäss eine Vaccine gegen Meningokokken-Gruppe C-Meningitis, die aus einem Polysaccharid, von dem mindestens 80 Gewichtsprozent ein Molekulargewicht von mehr als 1 000 000 Dalton aufweisen, hergestellt. Dieses PoIysaccharid wird vorzugsweise aus einer Hexadecyltrimethylajnmoniumbromid-Zellpaste von Meningokokken der Gruppe C durch Extraktion mit 1,0m CaCIp isoliert und durch Phenolextraktion, Ultrazentrifugati on bei 100 000 g und Äthano!fraktionierung (Äthanolkonzentration 30 bis 4-5 Prozent (Vol./Vol.)) isoliert.

Die erfindungsgemässen Vaccinen dienen zur Immunisierung gegen Meningokokken-Gruppe C-Meningitis. Insbesondere handelt es sich bei den erfindungsgemässen Vaccinen um hochmolekulare Vaccinen, die dahingehend wirksam sind, dass sie eine Immunität gegen Meningokokken-Gruppe C-Meningitis bei Kindern unter 2 Jahren induzieren. Diese Personengruppe von besonders geringem Lebensalter ist bei Epidemien besonders infektionsanfällig.

Meningokokken-Meningitis ist eine Krankheit, bei der eine Entzündung der das Gehirn und das Rückenmark umhüllenden Membranen. In der Vergangenheit sind die meisten Eälle von bakterieller Meningitis sehr schwer verlaufen und hatten einen tödlichen Ausgang. Die Einführung der Therapie mit Antibiotika brachte eine Verringerung der Sterblichkeit bei früh erkannten Fällen. Trotzdem bleibt aber nicht diagnostizierte Meningitis eine schwere Krankheit. Auch bei Verabfolgung von Antibiotika ist die Prognose insbesondere für jüngere Patienten schlecht. Diese negative Prognose ist teilweise darauf zurückzuführen, dass Kinder von 3 Monaten bis 2 Jahren selten die

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typischen Kxankheitssymptome zeigen. Dadurch wird die Therapie mit Antibiotika, die früh beginnen muss, häufig so lange verzögert, bis das Kind offensichtlich und damit hoffnungslos erkrankt ist oder bis die Krankheit durch Laborbefunde festgestellt wird.

Meningokokken-Meningitis wird durch die Spezies Neisseria meningitidis verursacht. Diese Spezies lässt sich in serologische Gruppen klassifizieren, nämlich A, B, C, D usw. Jede

_ . , . . . , charakteristisches dxeser Gruppen zexchnet sxch durch exn/kapsulares, mxt der Zellwand der speziellen Gruppe assoziiertes Polysaccharid aus. Es wurde festgestellt, dass diese ein Polysaccharid enthaltende Zellkomponente bei Einführung in Säugetiere eine Antikörperproduktion induziert und infolgedessen gegen eine spätere Infektion schützt.

Erfindungsgemäss wird ein Verfahren zur Herstellung von Meningokokken-Polysaccharid-Vaccinen zur Verfugung gestellt, bei dem eine Phenol-Extraktionsstufe zur Reinigung des Polysaccharids und zur Entfernung von Proteinen angewendet wird. Dabei erhält man ein Vaccinprodukt von hohem Molekulargewicht. Dies ist vorteilhaft, da es als gesichert gilt, dass höhermolekulare Polysaccharide im Vergleich zu einem Material von geringerem Molekulargewicht ein höheres Mass an Immunogenität ergeben.

Diese höhermolekulare Vaccine wird aus einer von Dr. Emil C. Gotschlich, Rockefeller University, zur Verfügung gestellten Kultur von Neisseria meningitidis hergestellt. Bei der Kultur handelt es sich um gram-negative Diplokokken, die Katalase— positiv, Qxydase-positiv und vom Typ G in bezug auf Neisseria meningitidis-Typ C-Antiseren sind. Dxeser Stamm wurde bei- der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852

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unter der Hummer ATCC 31275 hinterlegt. Die nachstehend erläuterten Herstellungsstufen, die eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellen, beziehen sich auf die Verwendung dieses Stamms. Somit wird erfindungsgemäss dieser Stamm bevorzugt, wenngleich auch andere geeignete Stämme verwendet werden können.

Die nachstehend beschriebenen Verfahren, die sich auf das Wachstum von H". meningitidis-Kultüren sowie auf die Isolierung und Eeinigung des Polysaccharide beziehen, sind allgemein in der US-PS 3 636 192, insbesondere Spalten 3 "bis 5, beschrieben. Auf die Teile dieser Druckschrift, die für die vorgenannten Gesichtspunkte und die Verwendung der erfindungsgemässen Vaccine von Bedeutung sind, wird hier besonders verwiesen.

Eine Kultur von N.meningitidis wird auf an sich übliche Weise gezüchtet, wobei aber vorzugsweise das in der nachstehenden Beschreibung erläuterte Verfahren angewendet wird. Mach dem Ende der Züchtung werden die gewünschten Feststoffe, die das Polysaccharid enthalten, aus der Gesamtkultur mit einem entsprechenden katxonxschen Material, beispielsweise einem quaternären Ammoniumsalz, ausgefällt. Vorzugsweise wirkt dieses Salz gegen ΪΓ. meningitidis ebenfalls bakterizid. Vorzugsweise wird " als derartiges Salz Hexadecyltrime thy lamm oniumbr omid verwendet. Bei Verwendung dieses Salzes entfällt die Notwendigkeit einer Pasteurisierung. Die ausgefällten Fermentationsfeststoffe werden abzentrifugiert. Das Polysaccharid wird aus dem Zentrifugationsrückstand (Pellet) mit wässrigem. Calciumchlorid extrahiert.

Die vereinigten Extrakte werden mit Äthanol versetzt, bis die Extraktionslösung 25 bis 35 Prozent (Vol./Vol.) Äthanol enthält. Anschliessend wird die Extraktionslösung filtriert und mit Äthanol versetzt, bis die Äthanolkonzentration im FiItrat

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75 bis 85 Prozent (Vol./Vol.) "beträgt. Der rohe Polysaccharidniederschlag wird sodann abfiltriert oder zentrifugiert.

Dieses Produkt kann sofort verarbeitet werden. Vorzugsweise wird der Niederschlag des Polysaccharids aber mit Aceton oder einer anderen nicht-mischbaren !Flüssigkeit für Aufbewahrungszwecke getrocknet.

Dieses rohe Polysaccharidzwischenprodukt wird sodann in einer möglichst geringen Menge einer gepufferten wässrigen Lösung gelöst. Ss ist wichtig, die Polysaccharide sung auf einem pH-Wert von 6,8 bis 7»2 zu halten. Es können beliebige, diesen Bereich abdeckende Puffer verwendet werden. Vorzugsweise wird eine wässrige Natriumacetatlösung verwendet und insbesondere eine 0,4- bis 0,6 m Natriumacetatlösung. Die gepufferte PoIysaccharidlösung wird sodann mit einer gepufferten Phenollösung extrahiert und zwar mindestens 2 mal und vorzugsweise 4- mal. Eine gut gepufferte Phenollösung enthält 70 bis 80 Prozent (Gew./Vol.) Phenol in wässrigem Puffer und weist einen pH-Wert von 6,8 bis 7,2 auf.

Bei dem wässrigen Gemisch mit einem Gehalt an Polysaccharid und Phenol handelt es sich um eine Emulsion, die beim Aufbrechen eine organische, an Phenol reiche Schicht, die Protein und andere Zellbruchstücke enthält, eine Zwischenschicht und eine wässrige, an Polysaccharid reiche Schicht bildet. Die Phenolschicht wird verworfen. Die Extraktion der wässrigen Phase wird genügend oft wiederholt, dass Proteinverunreinigungen des Polysaccharids beseitigt werden.

Man erhält eine klare, wässrige an Polysaccharid reiche Phase. Diese Phase wird mit einer 0,1 bis 0,01 m Calciumchloridlösung verdünnt, bis die Phenolkonzentration unter Ί Prozent (Vol./Vol.) sinkt.

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Die Lösung wird sodann auf eine Äthanolkonzentration von 30 bis 33 Prozent (Vol./Vol.) gebracht und bei 100 000 g ultrazentrifugiert. Die klare, überstehende Flüssigkeit wird verworfen, indem man die Lösung auf eine Ithanolkonzentration von 40 bis 50 Prozent (Vol.AoI.) bringt.

Der Niederschlag wird zum Absetzen gebracht, vorzugsweise durch 8-stündiges Stehenlassen bei 5°C. Sodann wird der Riederschlag gesammelt, mit einem nicht-mischbaren Lösungsmittel gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält das gewünschte Material, von dem mindestens 80 Prozent ein Molekulargewicht von 1 000 000 aufweisen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung des Inokulums Stufe 1 Stadium vor der Anzucht

Ein Röhrchen mit einer lyophilisierten Kultur von Keisseria meningitidis ATCC 31275 wird geöffnet und in 0,5 ml modifiziertem Frantz-Medium suspendiert. Die Zusammensetzung dieses Mediums und der übrigen verwendeten Medien ist im Anschluss an dieses Beispiel .in der Aufstellung I angegeben. Die Suspension wird auf Mueller-Hinton-Medium—Agarplatten (0,1 ml pro Platte) gesprüht. Die Platten werden 18 Stunden bei 37°C in einem Kerzengefäss inkubiert. Das auf diesen Platten gebildete Wachstum wird in 3 ml (pro Platte) modifiziertem Frantz-Medium resuspendiert und auf Mueller-Hinton-Platten (0,1 ml pro Platte) gesprüht. Die Platten/18 Stunden bei 37°C in einem Kerzenbehälter inkubiert. Das auf dieser zwexten Plattengruppe gebildete Wachstum wird in modifiziertem Frantz-Medium (5 ml pro

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Platte) resuspendiert. Die vereinigte Suspension wird in 2 ml-Aliquotanteilen in verschraubbare Phiolen gegeben und bei -70⁰C als im Voranzuchtstadium befindlicher Vorrat eingefroren. Die vereinigte Suspension wird mikroskopisch untersucht und zur Reinheitsprüfung auf Mueller-Hinton-Platten (25 und 37°C) ausgestrichen, ferner wird eine serologische Untersuchung durchgeführt.

Stufe 2 Anzucht stadium

Eine eingefrorene Phiole von Stufe- 1 wird aufgetaut. 0,1 ml davon werden auf Mueller-Hinton-Platten gesprüht und 16 Stunden bei 37⁰C in einem Kerzenbehälter inkubiert. Das auf den Platten gebildete Wachstum wird in modifiziertem IPrantz-Medium (5 ml pro Platte) suspendiert. Die vereinigte Suspension wird durch Ausstreichen auf Mueller-Hinton-Platten (25 und 37°C), mikroskopische Untersuchung und serologische Identifizierung auf ihre Reinheit geprüft. Die Suspension wird in 2 ml-Aliquotanteilen in verschraubbare Phiolen gegeben und als Vorrat für Anzuchtzwecke bei -70⁰C eingefroren.

Stufe 3

Vegetatives Stadium (2 Liter)

Eine gemäss Stufe 2 hergestellte eingefrorene Phiole für Anzuchtzwecke wird aufgetaut und auf 4- Mueller-Hinton-Platten (0,1 bis 0,15 ml pro Platte) aufgesprüht. Die Platten werden 16 Stunden bei 37⁰G in einem Kerzenbehälter inkubiert. Das auf den Platten gebildete Wachstum wird in 5 ml modifiziertem Frant ζ -Medium suspendiert. 4- Platten werden zur Beimpf ung eines 2 Liter-Erlenmeyerkolbens (mit einem Gehalt an 1 Liter modifiziertem Frantz-Medium) verwendet. Der 2 Liter-Kolben wird 5 Stunden bei 37⁰C bei einer Schüttelbewegung von 200 U/min

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inkubiert. Das 1 Liter-Inokulum weist zum Verwendungszeitpunkt eine optische Dichte von 0,5 und einen pH-Wert von 6,4 auf. Der 2 Liter-Kolben wird einer mikroskopischen Reinheitsprüfung unterzogen. Das auf Mueller-Hinton-Platten ausgestrichene Inokulum wird 24 Stunden (25 und 37°C) inkubiert und auf seine Reinheit untersucht.

Stufe 4

Inokulati ons stufe

1 Liter des Inokulums von Stufe 3 werden zur Inokulation eines 14 Liter fassenden New Brunswick Scientific-Fermenters (MA-100 Modell) mit einem Gehalt an 9 Liter Fermentationsmedium verwendet. Die Züchtung wird 14 Tage bei 37°C durchgeführt, wobei durchschnittlich 1,5 Liter/min Luft durchgeleitet werden und mit einer Geschwindigkeit von 200 U/min gerührt wird. Zu diesem Zeitpunkt weist das Inokulum eine optische Dichte von 0,84 und einen pH-Wert von 5₅3 auf. Das Inokulum wird mikroskopisch auf seine Reinheit untersucht und auf Mueller-Hinton-Agarplatten ausgestrichen, die 24 Stunden (25 und 37°C) inkubiert und anschliessend auf ihre Reinheit untersucht werden.

Stufe 5 Herstellungsstufe

10 Liter des Inokulums von Stufe 4 werden zur Inokulation eines New Brunswick Scientific-Fermenters (Modell I¹M 250), das 190 Liter Herstellungsmedium (vgl. Aufstellung I) enthält, verwendet. Die Belüftungsgeschwindigkeit des Fermenters beträgt

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0/0283 m pro Minute unter einem Überdruck von 6/895.10 bar bei einer Durchschnittstemperatur von 37 ⁰C und einer Rührgeschwindigkeit von 200 U/min. Die Züchtung wird nach 12 Stunden beendet. Die optische Dichte beträgt 1,6 und der endgültige pH-Wert 5,5. Nach vollendeter Züchtung wird eine Kulturprobe zur Bestätigung der Reinheit mikroskopisch auf

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einem feuchten Objektträger -und durch Gramfärbung untersucht. Ferner wird auch eine serologische Identifikation durchgeführt. Eine Probe wird auf Mueller-Hinton-Agarplatten ausgestrichen, 24 Stunden (25 und.37⁰C) inkubiert und auf ihre Reinheit untersucht.

Stufe 6

Ernte- und Inaktivierungsstufe

Der in Stufe 5 erhaltene Ansatz wird in Behälter mit einem Fassungsvermögen von 18,9 Liter, die pro 1 Liter Gärbrühe 10 ml 10-prozentiges Getavlon (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) enthalten, überführt und gründlich vermischt. Nach der Inaktivierung wird der Ansatz auf seine Sterilität untersucht. Vor dem Zentrifugieren wird der Ansatz mindestens 2 Stunden mit Getavlon stehengelassen um eine gute Ausfällung sicherzustellen.

Aufstellung I (Fermentationsmedien) Anzuchtmedium

a. Mueller-Hinton-Agar

1. 40 g entwässertes Difco-Mueller-Hinton-Agar pro 1 Liter.

b. Modifiziertes Frantz-Medium (2 Liter-Kolben)

Casaminsäuren (für medizinische Zwecke) 300 g Dextrose 150 g

wasserfreies Ea₂HPO^ 82,5 g

MgSO₄ . 7H₂O ' 19,5 S

KCl ' 2,75 S

L-Cystein-HCl-monohydrat 605 mg

Phenolrot 99 mg

destilliertes H₂O · 3Ö Liter

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Dieses Medium wird durch Filtration durch ein Millipore-Filter (0,22 μ) sterilisiert und aseptisch in Mengen von 1 Liter in Liter-Erlenmeyerkolben gegeben.

c. Inokulationsmedium (14- Liter fassender Fermenter)

Die folgenden Bestandteile werden in den Fermenter gegeben und 60 Minuten bei 121⁰C sterilisiert:

UCOF LB625-Gleitmittel 8% 10 ml

Phenolrot 30 mg

Na₂BPO₄ 27,5 S

destilliertes B₂O 8 Liter

Das LB625-Gleitmittel wird vor Zusatz in den Fermenter 60 Minuten bei 121⁰C vorsterilisiert.

Das nachstehende Konzentrat wird nach Sterilfiltration in den sterilen Fermenter gegeben:

Casaminsäuren (für technische Zwecke) 100 g Dextrose . 50 g

MgSO^ . 7H₂O 6,5 S

KCl 917 mg

L-Cystein-HCl-monohydrat 201,8 mg

destilliertes H₂O 1 Liter

Als Filter wird ein 293 ra (0,22_/n)-Millipore-Filter verwendet.

Züchtungsmedium

Die nachstehenden Bestandteile werden in den Fermenter gegeben und 30 Minuten bei 121⁰C sterilisiert:

UCON LB525-Gleitmittel 8% 400 ml

Phenolrot 634- mg

Na₂HPP₄ 530 g

destilliertes H₂O 170 Liter

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Das LB625-Gleitmittel wird vor Zusatz in den Fermenter 60 Minuten bei 121⁰C vorsterilisiert.

Das nachstehend angegebene Konzentrat wird steril filtriert und in den sterilen Fermenter gegeben:

Casaminsäuren (für technische Zwecke) 2700 g

Glucose 1080 g

MgSO₄ . 7H₂O . 140,4 g

KCl 19,8 g

L-Cystein-HCl-monohydrat 4-,4 g

destilliertes HO 20 Liter

Zur Torf iltration wird eine Horm-Presse unter Verwendung eines D-8-]?ilterkissens und zur endgültigen Filtration ein 293 (0,22 μ)-Μί11χρθΓβ-Ι¹ί1ΐβΓ verwendet.

Aufstellung II .

Inaktivierungsverfahren

Die minimale Kontaktzeit mit dem Cetavlon beträgt 2 Stunden. Der Ansatz wird sodann gemäss der Aufstellung III bezüglich seiner Sterilität untersucht.

Aufstellung III Sterilitätstest für die Inaktivierung

Ein 0,5 ml-Aliquotanteil der zu untersuchenden Lösung wird auf eine Mueller-Hinton-Platte gesprüht und 18 Stunden bei ■ 37⁰C in einem Kerzenbehälter inkubiert. Der Sterilitätstest ist positiv, wenn die Platten bei einer mikroskopischen Untersuchung bei 10-facher Vergrösserung kein Bakterienwachstum erkennen lassen.

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Aufstellung: IV Makroskopischer Objektträger-Agglutinationstest (serologischer

Ein Tropfen von rehydratisiertem Bacto-Meningokokken-Antiserum (Typ C) wird auf einen Objektträger gegeben. Eine öse einer Kultur von N. meningococcus wird sodann auf den Antiseruaitropfen übertragen und mit dem Antiserum vermischt. Der Test ist positiv, wenn eine Agglutination der Zellen eintritt.

Beispiel 2 Herstellung einer hochmolekularen Vaccine

Nach dem Zusatz von Cetavlon ( Hexade cyl trim ethyl β,τητη oniumbr omi d ) in einer Konzentration von 0,1 Prozent (Vol./Vol.) werden aus 600 Liter einer nicht-pasteurisierten Kultur von Ή. meningitidis der Gruppe C durch Zentrifugation in einer Sharples-Zentrifuge mit röhrenförmigen Gefässen von 10,2 cm Durchmesser (4- in.), 2,24 kg feuchte Permentationsfeststoffe erhalten.

Die Fermentationsfeststoffe werden durch Homogenisieren mit 20 Liter pyrogenfreiem Wasser in einem 30,3 Liter fassenden Dispersionsmischer gewaschen. Die gewaschenen Feststoffe werden durch Zentrifugieren in einer Sharpies-Zentrifuge der vorgenannten Art gesammelt.

Man erhält 2,0 kg gewaschenen Brei, aus dem das Polysaccharid durch Homogenisieren des Breis in einem 30,3 Liter fassenden Dispersionsmischer mit 15 Liter ionogener Calciumchloridlösung homogenisiert wird. Der Brei wird mit Äthanol bis zu einer Ithanolkonzentration von 33 Prozent (Vol./Vol.) versetzt. Nach. 30-minütigem Zentrifugieren bei -5 bis -10⁰C und 12 000 g in klinischen Kühlzentrifugen erhält man einen klaren Überstand. Dieser Überstand wird durch Filtration durch ein Druck-

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filter mittlerer Porosität von 670 cm weiter geklärt.

Das Eiltrat wird sodann mit Äthanol versetzt, wobei eine endgültige Konzentration von 80 Prozent (Vol./Vol.) Äthanol berechnet wird. Dabei wird das Filtrat in einen 114 Liter fassenden Kessel aus korrosionsbeständigem Stahl bewegt. Der erhaltene rohe Polysaccharidniederschlag wird unter Verwendung einer Sharples-Zentrifuge mit 5,1 cm (2 in.) Durchmesser gesammelt. Sodann werden die !Feststoffe in einem 0,95 Liter (1 quart) Varring-Mischer mit 500 ml Aceton homogenisiert und anschliessend durch 10-minütige Zentrifugation bei 12 000 g in einer klinischen Zentrifuge gesammelt. Man erhält 500,4 g mit Aceton befeuchteten Niederschlag.

250,2 g dieses rohen Zwischenprodukts werden in 12,8 Liter 0,48 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 6,9 gelöst, wozu ein 30,3 Liter fassender Dispersionsmischer verwendet wird. Die Lösung wird mit 4,48 Liter einer Phenollösung, die durch Zusatz von 9OO ml des Natriumacetatpuffers zu 2,27 kg kristallinem Phenol hergestellt worden ist, versetzt. Die Emulsion wird sodann mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 300 ml/min in eine kontinuierliche Electronucleonics K-Ultrazentrifuge von 30 000 U/min eingeführt. Unlösliches Phenol und Zwischenphasenmaterial verbleiben in dem rotierenden Gefäss, während die deproteinisierte, überstehende !Flüssigkeit überläuft und gesammelt wird. Die Phenolphase wird verworfen. Der mit Phenol gesättigte Überstand wird für eine weitere Extraktion mit 3,2 Liter Phenollösung vermischt. Insgesamt werden mit der Polysaccharidlösung 4 Phenolextraktionen durchgeführt. Man erhält'15,2 Liter einer klaren wässrigen Phase. Die restlichen 250,2 g des rohen Zwischenprodukts werden auf die vorstehend angegebene Weise mit Phenol zu 15,6 Liter einer klaren wässrigen Phase extrahiert.

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Die wässrigen Phasen werden jeweils 20-fach (300 Liter) mit einer 0,05 m Calciumchloridlösung auf eine Phenolkonzentration unter 0,5 Prozent (Vol./Vol.) verdünnt. Die Lösungen werden jeweils unter Verwendung einer Amicon-Hohlfaser-Ultrafiltrationsvorrichtung mit 10 000 Molekulargewicht-Trennmembranen (10 000 molecular weight cut off membranes) auf 15 Liter eingeengt. Phenol und niedermolekulares Material werden ferner durch Ultrafiltration (Diafiltration) bei konstantem Retentatvolumen entfernt. Dabei werden weitere 30 Liter Permeat gewonnen.

Die Eetentatfraktionen von beiden Hälften werden in einem 114 Liter fassenden Kessel aus korrosionsbeständigem Stahl vereinigt und durch Zusatz von wasserfreiem Äthanol unter Bewegen auf eine Ithano!konzentration von 30 Prozent (Vol./Vol.) gebracht. Diese Lösung wird mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/min in eine Ele'ctronucleonics K-Ultrazentrifuge von 30 000 U/min eingeführt. Der geklärte Überstand wird sodann in einen 114 Liter fassenden Kessel aus korrosionsbeständigem Stahl gegeben und unter Bewegen auf eine Äthanolkonzentration von 40 bis 45 Prozent (Vol./Vol.) gebracht. Der Niederschlag wird durch 18-stündiges Stehenlassen bei 5°C zum Absetzen gebracht.

Der klebrige, haftende Niederschlag wird mit 2 Liter 0,02 m Calciumchlorid von den Kesselwänden gelöst. Diese Lösung wird zu 4 Liter wasserfreiem Äthanol gegeben. Der Niederschlag wird 10 Hinuten bei 12 000 g zentrifugiert. Die Feststoffe werden 2 mal durch Homogenisieren in einem Warring-Mischer mit· 500 ml Aceton gewaschen und anschliessend durch 10-minütige Zentrifugation bei 12 000 g gesammelt. Das als Endprodukt erhaltene gereinigte Polysaccharid wird 72 Stunden bei 5⁰G unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 32,9g-Produkt, das

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folgende Analysenergebnisse zeigt:

Protein ' 0,33 %

Nucleinsäuren . 0,08 %

Sialinsäuren 85,2 %

!Feuchtigkeit 15,2 % O-Acetylreste 2,21 ^na/mg

Pyrogenität bei Kaninchen,

Temperaturanstieg bei Verabfolgung

"von 0,025 ^ug/kg Körpergewicht 0,0; 0,0; 0,2

Sepharose 4B Kd 0,2

% gewönne Sialinsäure vor Kd 0,40 86,1 Hämagglutinationshemmung 400

Ende der Beschreibung

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Claims (1)

1. Patentanspr ü c h e

   Hochmolekulares, antigenes Meningokokken-Polysaccharid mit einer Aktivität gegen Meningokokken der Gruppe C, wobei mindestens 80 Gewichtsprozent des Poly sac charids ein Molekulargewicht von mehr als 1 000 000 Dalton aufweisen.

   Verfahren zur Herstellung eines antigenen Meningokokken-Polysaccharids mit einer Aktivität gegen Meningokokken der Gruppe C, wobei mindestens 80 Gewichtsprozent des Polysaccharids ein Molekulargewicht von mehr als 1 000 000 Dalton aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Kultur von Meningokokken der Gruppe C in einem geeigneten Kulturmedium züchtet,

   Td) das Polysaccharid durch lällung mit einem quaternären Ammoniumhaiogenid aus der Kultur ausfällt,

   c) den Niederschlag in einer wässrigen CaIciumchloridlösung löst,

   d) das Polysaccharid ausfällt, indem man die wässrige PoIysaccharidlösung auf eine Äthanolkonzentration von 75 Ms 85 Prozent (Vol./Vol.) bringt,

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   e) den Niederschlag in einem Puffer vom pH-Wert 6,8 bis 7,2 löst und die Lösung mit einer wässrigen Phenollösung extrahiert,

   f) das Polysaccharid ausfällt, indem man die mit Phenol extrahierte Lösung auf eine Äthanolkonzentration von 40 bis 50 Prozent (Vol./YoI.) bringt und

   g) den Niederschlag gewinnt.

   3- Verfahren zur Reinigung eines Meningokokken-Gruppe C-PoIysaccharids, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Niederschlag des Polysaccharids in einem wässrigen Puffer vom pH-Wert 6,8 bis 7,2 löst, die Polysaccharide sung mehrmals mit einer wässrigen Phenollösung extrahiert, die Polysaccharidlösung auf eine Ithanolkonzentration von 30 bis 33 Prozent (Vol./Vol.) bringt und ultrazentrifugiert, anschliessend die überstehende Flüssigkeit auf eine Äthanolkonzentration von A-O bis 50 Prozent (Vol./Vol.) bringt, um das Polysaccharid auszufällen, und das Polysaccharid gewinnt.

   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Puffer eine wässrige 0,4 bis 0,6 m Natriumacetatlösung verwendet.

   5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässrige Phenollösung eine 70 bis 80-prozentige (Vol./ Vol.) Lösung in einem wässrigen Puffer verwendet.

   6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässrigen Puffer eine 0,4 bis 0,6 m Natriumacetatlösung verwendet.

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