DE2735411C2 - Verfahren zur Herstellung von acellulären Impfstoffen auf Ribonucleinsäurebasis - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von acellulären Impfstoffen auf Ribonucleinsäurebasis

Info

Publication number
DE2735411C2
DE2735411C2 DE2735411A DE2735411A DE2735411C2 DE 2735411 C2 DE2735411 C2 DE 2735411C2 DE 2735411 A DE2735411 A DE 2735411A DE 2735411 A DE2735411 A DE 2735411A DE 2735411 C2 DE2735411 C2 DE 2735411C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
corynebacterium
serratia
fraction
bacterial
extracted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2735411A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2735411A1 (de
Inventor
Jacques Castres Durand
Lucien Dussourd D'hinterland
Gerard Normier
Anne Marie Pinel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pf Medicament Sa Paris Fr
Original Assignee
Pierre Fabre SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pierre Fabre SA filed Critical Pierre Fabre SA
Publication of DE2735411A1 publication Critical patent/DE2735411A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2735411C2 publication Critical patent/DE2735411C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0266—Klebsiella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Gemäß einer besonders zweckmäßigen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die als Hilfsmittel verwendete Saccharidfraktion aus Membranen von Klebsiella pneumoniae extrahiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfin-
jo dung wird als Hilfsmittel neben der angegebenen Membran-Saccharidfraktion eine Membran-Saccharidfraktion verwendet, die aus Bakterien extrahiert ist, welche den verwendeten Ribosomen entsprechen.
Die Einheitsdosis des Impfstoffes kann in Abhängigkeit von den Erfordernissen der Behandlung oder der Art der Verabreichung variieren.
Im folgenden werden Beispiele für Dosierungen angegeben.
Broncho-HNO-Impfstoff
(wobei HNO für Hals-Nasen-Ohren, entsprechend dem französischen Ausdruck ORL steht):
Ribosomenfraktionen
Ribosomen von 3,5 μβ
Klebsiella pneumoniae
Ribosomen von 3,0 μδ
Diplococcus pneumoniae
Ribosomen "von 3,0 μ8
Streptococcus pyogenes Gruppe A12
Ribosomen von 0,5 μ8
Hemophilus influenzae
Lösliches Hilfsmittel
Membran-Saccharidfraktion
von Klebsiella pneumoniae
1 Dosis enthält reine aktive
Komponente in einer Menge von
Dental-Impfstoff der Zusammensetzung:
Ribosomenfraktionen
Ribosomen von
Actinomyces viscosus
10,0 μg
15,0 μβ
25,0 μδ
Ribosomen von
Rothia dentocariosus
Ribosomen von
Streptococcus mutants
Ribosomen von
Streptococcus salivarius
Ribosomen von
Lactobacillus casei
Lösliches Hilfsmittel
Membran-Saccharidfraktion
von Klebsiella pneumoniae
1 Dosis enthält reine aktive
Komponente in einer Menge von
Veterinär-Impfstoff der Zusammensetzung:
Ribosomenfraktionen
Ribosomen von
Pasteurella hemolytica Hi
Ribosomen von
Pasteurella multocida Ai — 1048 Ribosomen von
Pasteurella multocida A3 - A13
1,2 μ8 0,8 μ§ 1.0 μg
5,4 μg
15,0 μδ
3,0 g 3,0 μ8 3,0 μg
Lösliches Hilfsmittel 9,0 με
Membran-Saccharidfraktion
von Klebsiella pneumoniae 13,5 μ§
Membran-Saccharidfraktion
von Pasteurella hemolytica Hi 1^g
Membran-Saccharidfraktion
von Pasteurella multocida Ai —1048 1.0 μg
Membran-Saccharidfraktion
von Pasteurella multocida A3 — A13 1.0 μg
1 Dosis enthält reine aktive
Komponente in einer Menge von
16,5 g 25,5 μ8
lü
15
20
25
30
35
40
Die Saccharidfraktion des erfindungsgemäßen Impfstoffs ist z. B. herstellbar durch Extraktion einer wäßrigen Membransuspension mit Hilfe von Phenol, wobei die Saccharide aus der wäßrigen Phase gewonnen werden nach Abtrennung der Phenolphase. Diese Phenolextraktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 60 und 70° C, insbesondere bei 65° C, mit einer 90%igen Phenollösung durchgeführt.
Die für die angegebene Extraktion verwendete wäßrige Membransuspension kann erhalten werden, wie dies im Hauptpatent beschrieben ist, nämlich aus einer Bakterienkultur, die zerkleinert und anschließend zentrifugiert wird unter selektiver Sedimentation der Membranen, die dann in einer wäßrigen Lösung suspendiert werden. Die Sedimentation der Membranen kann z. B. durch Zentrifugation unter einer Beschleunigung in der Größenordnung von 30 000 g nach Abtrennung von Zellbruchslacken erfolgen.
Die Ribosomenfraktion ist herstellbar durch Extraktion von zerkleinerten Bakterienzellen mit einem sauren Salzpuffer, der Salzsäure, MgCb und Natriumdodecylsulfat enthält, wobei eine wäßrige Lösung anfällt, die mit Polyäthylenglycol und Äthylalkohol ausgefällt wird, wobei der erhaltene Niederschlag die Ribosomenfraktion enthält. Zur Vervollständigung der Reinigung wird der Niederschlag vorzugsweise in einem Puffer aufgenommen, der Salzsäure, MgCl2, NaCl und Natri-
45
50
55
60 umdodecylsulfat enthält, worauf die erhaltene wäßrige Phase erneut ausgefällt wird mit Äthyialkohol, vorzugsweise mit 95%igem Äthyialkohol.
Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag kann als Ausgangssubstanz für den erfindungsgemäßen Impfstoff dienen, indem er in den angegebenen Gewichtsverhältnissen, die weiter unten noch näher erläutert werden, mit der angegebenen Saccharidfraktion vermischt wird.
Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen Impfstoffe entsprechend den sie aufbauenden Komponenten in der auf dem Gebiete der Impfheilkunde üblichen Weise zur Behandlung von oder zur Vorbeugung gegen Krankheiten des verschiedensten Typs angewandt werden, und so ermöglicht z. B. der oben definierte Bronche-HNO-Impfsloff die Behandlung oder Verhinderung von verschiedenen Arten von chronischer Rhinotracheo-bronchitis, mit Bronchitis einhergehendem Asthma, Bronchektasien, superinfizierten viralen Pneumopathien sowie Sinusitis und Rhino-pharyngo-laryngitis.
Der angegebene Dental-Impfstoff ermöglicht die Vorbeugung gegen die hauptsächlichen Mundaffektionen.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe liegen vorzugsweise in Form von Aerosolen vor. Es ist jedoch auch möglich, sie in Form anderer pharmazeutischer Zubereitungen vorzusehen. So können z. B. bestimmte erfindungsgemäße Impfstoffe parenteral, z. B. durch Injektion, angewandt werden.
Es ist selbstverständlich überflüssig, an dieser Stelle die lange Liste von Komponenten anzuführen, die als Träger- oder Verdünnungsmittel für den erfindungsgemäßen Impfstoff in Frage kommen, da es sich hierbei um übliche bekannte Techniken auf dem Gebiete der Impfstoffe oder der alenischen Arzneimittel handelt.
In der Regel werden die beiden Komponenten des Impfstoffs in Form einer Lösung konserviert, doch können sie auch lyophilisiert werden nach der Herstellung des Impfstoffs, wozu es genügt, die verschiedenen Impfstoffkomponenten in den vorbestimmten Gewichtsverhältnissen miteinander zu vermischen.
Die analytischen Normwerte 3es erhaltenen Produkts können wie folgt bestimmt werden:
Der Gehalt an Ribosomen in der Ribosomenfraktion wird aus dem RNS-Gehalt wie folgt berechnet:
Ribosomengehalt =
RNS-Gehalt x 100
70
Der RNS-Gehalt wird seinerseits gemessen durch spektrophotometrische Gewichtsbestimmung des Phosphormolybdänkomplexes im Vergleich mit einer RNS-Probe von Klebsiella bekannten Gehalts, der bestimmt wurde durch Gewichtsbestimmung des Phosphors.
Der Proteingehalt der Ribosomenfraktion wird bestimmt durch die kolorimetrische Biuret-Reaktion im Vergleich mit einer Albumin-Eichfarbskala.
Der Prozentgehalt an RNS in der Gesamtmenge an RNS + Proteine variiert von etwa 55 bis 65%.
Der Gehalt an Sacchariden des Hilfsmittels wird bestimmt aus dem durch kolorimetrische Gewichtsbestimmung nach der Anthron-Methode gemessenen Glucosegehalt in folgender Weise:
Saccharidgehalt = G'"cosegehalt x 100
Ein hochgereinigtes Saccharid-Eichpräparat dient zur Bestimmung des Glucosegehalts der Saccharide, der nach dieser gewichtsanalytischen Methode 50% beträgt
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs nach der Erfindung anhand eines Beispiels erläutert.
A) Herstellen einer wäßrigen Lösung von Ribosomen
Die verschiedenen Bakterienstämme, deren Ribosomen extrahiert werden sollten, wurden in üblicher bekannter Weise auf geeigneten Nährmedien in Fermentern kultiviert
Die Bakterienzellen wurden nach der Kultivierung in einer Zentrifugiervorrichtung des Typs »Westfalie« oder »Sharpies« gesammelt und anschließend gewaschen durch Zentrifugieren mit physiologischer Kochsalzlösung, die auf eine Temperatur in der Größenordnung von 4° C gekühlt war.
Das auf diese Weise erhaltene Bakterienkonzentrat konnte durch Einfrieren bei —20° C konserviert werden, wenn es nicht sofort gebraucht wurde.
Ebenso wie die Extraktion von Sacchariden ließ sich auch die Extraktion von Ribosomen an einem Gemisch von verschiedenen Bakterienstämmen durchführen, doch wird es vorgezogen, jeden Stamm separat zu behandeln, um die Kontrolle über das erhaltene Produkt zu erleichtern, wobei im letztgenannten Falle die Ribosomen und/oder die Saccharide nach durchgeführter Extraktion vermischt werden zur Erzeugung des Vaccins.
Von dem erhaltenen Bakterienkonzentrat wurde eine Probe entnommen, um das Trockengewicht der Zellen nach der Trocknung in einem Trockenschrank zu bestimmen (das Verhältnis trockene Zellen/feuchte Zellen variierte von 20 bis 25%).
Eine weitere Probeentnahme war dazu bestimmt, die Reinheit der Kultur zu kontrollieren und den Bakterienstamm zu identifizieren.
Das erhaltene Bakterienkonzentrat wurde sodann in folgender Weise suspendiert und homogenisiert:
Eine kleine Menge an feuchten Zellen (weniger als 50 g) wurde dispergiert im Verhältnis von 1 g (Feuchtgewicht) Zellen pro 4 ml Puffer der folgenden Zusammensetzung:
stand bei 4°C 30 Minuten lang bei 30 000 g zentrifugiert wurde (Zentrifuge »Beckman 521-B« mit Rotor 6 χ 250 ml JA 14).
Der Zentrifugenkuchen wurde entfernt, und der die Ribosomen enthaltende Überstand wurde bei 4° C aufbewahrt
B) Extraktion der Ribosomen
Der angegebene Überstand wurde mit 100 g/l
ίο Polyäthylenglycol4000(PEG 4000-Merck) und anschließend nach vollständiger Lösung mit 1 Volumen 95%igem Äthylalkohol bei - 20° C versetzt.
Es wurde sodann 20 Minuten lang in der Kälte stehengelassen, worauf der Niederschlag in einer »Sharpless«-Apparatur bei 4° C gewonnen wurde (der Überstand wurde entfernt).
Der Niederschlag wurde sodann gelöst im gleichen Volumen-Puffer, der auch für die Zerkleinerung verwendet wurde (Tris-HCl, MgCI2, NaCl, 0,5%iges Natriumdodecylsulfat), durch 30 bis 60 Minuten langes Rühren im Reaktor bei Umgebungstemperatur (das Waschen bei Umgebungstemperatur diente der Entfernung der Nichtribosomen-Proteine).
Es wurden sodann 0,8 Volumen 95%iger Äthylalkohol bei -20° C zugegeben und 30 Minuten lang bei 1O0C ausfällen gelassen.
De·· Niederschlag aus Ribosomen wurde in einer »Sharpless«-Apparatur gesammelt, und der Überstand wurde entfernt (ohne Kühlung, um zu verhindern, daß das Natriumdodecylsulfat ausfällt). Der Ribosomenkuchen wurde in Puffer aufgenommen (0,02 M-MgCl2, 0,02 M-KCl, pH 7) bei 4° C im Mengenverhältnis von 2 ml pro g feuchte Ausgangs-Zellen (unter Rühren zwischen 2 und 4 Stunden).
Das erhaltene Material wurde 45 Minuten lang bei 30 000 g und bei 00C zentrifugiert (Entfernung des restlichen Natriumdodecylsulfats).
Der Zentrifugenkuchen wurde entfernt und der Überschlag aufbewahrt. Es wurde eine Probe entnommen (1 bis 2 ml), in welcher der Gehalt an RNS, der Gehalt an Proteinen und die Gewichtsmenge pro ml bestimmt wurde.
Die Ribosomen wurden in sterilen Plasmakolben bei — 20° C bis zum Gebrauch aufbewahrt.
Tris-HCl (M/100) pH 7,2 mit
einem Gehalt an MgCl2 · 6 H2O 0,01 M
NaCl 9 g/l
Natriumdodecylsulfat 5 g/l
Sobald die Suspension gut homogen war, wurde sie einer Verteilungsoperation durch Ultraschallbehandlung 3mal 10 Minuten lang unterworfen, während sie in einem Eisbad gehalten wurde, wobei z. B. ein »Sonnimasse 500 T«-Ultraschallapparat verwendet werden konnte.
Eine größere Menge an Zellen (mehr als 50 g) wurden in der Weise behandelt, daß die aufgetauten Zellen im gleichen Puffer wie oben angegeben und im gleichen Mengenverhältnis dispergiert und anschließend homogenisiert wurden durch 10 Minuten langes heftiges Rühren in einem Reaktor mit großer Geschwindigkeit.
Sie wurden sodann einer Zerkleinerungsbehandlung unterworfen in einer »Manton-Gaulin«-Vorrichtung in der Kälte (5 Zyklen für jeden Stamm). Die größten Zellenbruchstücke wurden entfernt durch Durchleiten durch eine »Sharples«-Apparatur, worauf der Über-
C) Herstellung einer wäßrigen Membransuspension
Die Zellen wurden nach der Kultivierung durch Zentrifugation in einer »Westfalia«- oder »Sharples«- Apparatur gesammelt und anschließend durch Zentrifugation mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Das erhaltene Bakterienkonzentrat konnte bei — 20° C konserviert werden.
In einer Probe wurde der Trockenrückstand bestimmt durch Trocknen in einem Trockenschrank, und es wurden bakteriologische Untersuchungen bezügliqh Reinheit und Identität durchgeführt.
Die aufgetauten Zellen wurden in kaltem Puffer suspendiert im Verhältnis von 1 g Zellen pro 4 ml Puffer. Der verwendete Puffer hatte die folgende Zusammensetzung:
Tris-HCl
NaCI
MgCl2 · 6 H2O
0,01 M, pH 7
9g/gl
0,01 M
Die Zerkleinerung erfolgte in einer »Manton-Gau-Iin«-Vorrichtung (3 Zyklen bei maximalem Druck). Die intakten Zellen sowie die Zellbruchstücke wurden
entleint durch Durchleiten durch eine »Sharples«-Apparauir. und der Überstand wurde bei 4 (.' aufbewahrt.
Die Membranen wurden sodann gesammeil durch 45 Minuten lange Zenirifugation bei 30 000 g und 4 ( (»Bcckmanl 21-B«. Rotor |A 14).
Der Überstand wurde entfernt (ein Teil davon kann aufbewahrt werden zur Herstellung einer RNS-Ribosomen-Standardprobe für analytische Zwecke). Der Zentrifugenkuchen wurde aufbewahrt zur Extraktion des löslichen Hilfsmittels. Die Zentrifugenkuchen wurden suspendiert in destilliertem Wasser im Verhältnis von 2.5 ml pro g leuchte Ausgangs-Zcllcn (1 bis 2 Minuten lange Homogenisierung in einer »Turrax«-Apparatur).
D) Saccharid-Extraktion
Zu der erhaltenen wäßrigen Suspension wurde 1 Volumen Phenol-Wasser (Phenolgehalt 90%). das zuvor auf =80~C thermostatisiert worden war. zugegeben, worauf das Gemisch 5 Minuten lang bei 65"C heftig -'< gerührt wurde.
Dann wurde sofort rasch auf 0cC gekühlt. In kleinen Volumen wurde die wäßrige Phase durch 5 Minuten lange Zcntrifugation bei 5000 UpM bei 00C in Bechern aus rostfreiem Stahl abgetrennt. Die überstehende .'" wäßrige Phase wurde sodann gesammelt.
In der Hauptmenge der Suspension wurde die wäßrige Phase abgetrennt durch Durchleiten durch einen »Wcstfalia«- oder »Sharplcsw-Flüssig/Flüssig-Abscheider. m
Die Phenolphase wurde entfernt.
Das restliche in der wäßrigen Phase befindliche Phenol wurde abgetrennt durch 24 bis 48 Stunden lange Dialyse gegen fließendes Wasser entweder in einem DiaKsesehlauch in kleinem Volumen oder in einem Plattendialysator (Typ »Sartorius«) in größeren Volumen.
Der leichte Niederschlag, der sich während der Dialyse bildet, wurde abgetrennt durch 30 Minuten lange Zentrifugation bei 10 000 g bei 0cC. J"
Der erhaltene Überstand wurde in sterilen Plasmako'ben bei — 20" Γ eingefroren und aufbewahrt.
Es wurde eine Probe von 1 oder 2 ml entnommen zur Durchführung der analytischen Untersuchungen.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe sind sowohl in der -ti Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin verwendbar.
1) Untersuchung der Antigenwirkung
des angegebenen Veterinär-Impfstoffs
Diese Untersuchung wurde mit dem Ziele durchgeführt, das Auftreten und die Beständigkeit spezifischer Antikörper im Serum geimptter Mäuse zu bestimmen.
Es wurden weibliche Mäuse der Rasse Swiss mit einem Körpergewicht von 20 ± 2 g verwendet, die zu 10 w in Käfigen gehalten wurden bei einer Ernährung in Form von abgeteilten Stücken (Mäusediät UAR) und von Trinkwasser in einem Tierhaltungsraum bei einer konstanten Temperatur von 22±I0C unter einer Feuchtigkeit von 40 bis 60%. *
Imunisierung der Tiere
Subcutan wurde jedem Tier die Impfstoffdosis in einem Volumen von 0.2 ml injiziert Der Injektionsrhylhmus war wie folgt: t
— 5 Impfungen in 15 Tagen (d. h. eine Injektion alle 3 Tage).
— I Woche lang Pause.
— 2 Impfungen in 8Tagen(Wied(.Tholungsimpfung).
— Punktion durch die rctro-orbitalcn Höhlen mindestens 10 und höchstens 15 Tage nach der letzten Wiederholungsinjektion.
Methode zur Untersuchung der Antikörper
Das Serum jeder geimpften Maus wurde untersucht durch Immunoelektrodiffiision nach der Technik von l.aurell.
Jedes Versuchslicrscrum wurde untersucht auf das Antigen von dem Pastcurella-Baktcrium, von dem die Membransaccharide abstammen: Pastcureila hämolytica Hi und Pasteurella multocida A1.
In gleicher Weise wurde jedes Serum untersucht auf die Gesatrumenge an Pasteurella. aus dem die Ribosomen des Präparats extrahiert wurden.
Das zu testende Antigen wurde einem Agarosegel in einer Konzentration von 1% in Veronalpuffer von pH 8.6 einverleibt. Dieses Gel wurde auf eine Glasplatte von 1.5 χ 90 χ 110 mm geschüttet.
Es wurden 7 μΙ Serum jeder Maus in Vertiefungen eingebracht, die zuvor in dem Gel ausgehoben wurden.
Die Ablagerung dient als Kathode. Die Wanderung dauerte 9 Stunden unier Gleichstrom bei einer Potcntialdifferenz von 2 bis 3 Volt/cm.
Am Ende der Wanderung wurden die Platten gewaschen und getrocknet, und die Immunoniedcrschlägc wurden ausgewertet durch Anfärbung mit Coomassic-Brillantblau.
Ergebnisse
Es wurde das Vorliegen von spezifischen Immunoniedcrschlägen zwischen den Antikörpern des Serums der behandelten Mäuse und dem Entwicklungsantigen festgestellt in Form von »Erhebungen«, deren Höhe repräsentativ ist für die Menge an Antikörpern, die in dem Serum der geimpften Tiere enthalten sind.
Es wurden auf allen Platten sehr ausgeprägte positive Ergebnisse mit dem Serum geimpfter Mäuse im Vergleich zu den Sera von Vergleichsmäusen erhalten, was die starke Impfstoffwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen bestätigt.
2) Untersuchung der Immunwirkung
des angegebenen Dental-Impfstoffs
Ebenso wie bei den unter 1) beschriebenen Versuchen wurden weibliche Mäuse der Rasse Swiss mit einem Körpergewicht von 20±2g verwendet, die zu 5 in Käfigen gehalten wurden bei einer Ernährung in Form von abgeteilten Stücken (Mäusediät UAR) und von Trinkwasser in einem Tierhaltungsraum bei einer konstanten Temperatur von 22±1"CJ unter einer Feuchtigkeit von 40 bis 60%.
Immunisierung der Tiere
Subcutan wurde jedem Versuchstier die Impfstoffdosis in einem Volumen von 0,2 ml injiziert (wobei hervorgehoben zu werden verdient daß Versuche, die bei einem Verhältnis von Ribosomenfraktion/Saccharidfraktion von 1:1, 1:1,5 und 1:2 durchgeführt wurden, zeigten, daß die angegebene Zusammensetzung von 1 :1,5 zu den besten Ergebnissen führte).
Der Injektionsrhythmus war wie folgt:
— 5 Impfungen in 15 Tagen (d. h. eine Impfung alle 3 Tage),
— eine Pause von einer Woche,
— 2 Impfungen in H f'agcn (Wiederholungsimpfung),
— Punktion durch die retro-orbitalen Höhlen mindestens 10 Tage und höchstens l'j Tage nach der let/ten Wieder hol ungsimpiu ng.
Methode zur Bestimmung der Antikörper
Das Serum jeder geimpften Maus wurde untersucht durch Immunoelektrodiffusion nach der Technik von l.aurell.
Das Antigen, welches jedem Mikroorganismus entsprach, von dem die Ribosomen stammten, wurde einem Agaroscgel einverleibt in einer Konzentration von 1% in Veronalpuffer von pH H.b. Dieses Gel wurde auf eine Glasplatte von 1,5 χ 90 χ 110 mm geschüttet.
Es wurden 7 μΙ Serum jeder Maus in die Vertiefungen eingebracht, die zuvor in dem Ge! ausgehoben wurden.
Die Ablagerung stellte die Kathode dar. Die Wanderung dauerte 9 Stunden unter Gleichstrom bei einer Potenlialdifferenz von 2 bis 3 Volt/cm.
Am KmIo der Wanderung wurden die Platten gewaschen und getrocknet und die Immunoniederschläge ausgewertet durch Anfärbung mit Coomassie-Iiril- !anlblau.
Krgebnisse
Ks wurde das Vorliegen spezifischer Immunoniederschlägc zwischen den Antikörpern des Serums der behandelten Mäuse und dem Kntwicklungsaniigen in Korm von »Erhebungen« festgestellt, deren Höhe repräsentativ war für die Menge an Antikörpern, welche in dem Serum der geimpften Mäuse enthalten waren.
Es wurden auf allen Platten stark ausgeprägte positive Ergebnisse mit dem Serum der geimpften Mause im Vergleich zu den Sera von Vcrgleichsmäusen beobachtet, was die starke Impfstoffwirkung der erfindungsgemäl.lcn Vaccine erkennen läßt.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von aceliulären Impfstoffen auf Ribonucleinsäurebasis, bei dem man pro 100 Gewichtsteile RiLonucleinsäure des oder der dem Impfstoff entsprechenden Mikroorganismen zwischen 100 und 200 Gewichtsteile aus Bakterien extrahierte Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide miteinander vermischt, nach Patent 2613 943, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a) die Ribosomenfraktion mindestens eines pathogenen Bakterienstammes, der die zu behandelnde oder zu verhindernde Krankheit hervorruft, und
    b) die Saccharidfraktion, die aus Bakterienmembranen mindestens eines Bakterienstammes des Genus Klebsieila, Serratia oder Corynebacterium extrahiert ist,
    in einem Gewichtsverhältnis von Ribosomenfraktion zu Saccharidfraktion zwischen 0,5 und 1 miteinander vermischt.
    Gegenstand des Patents 26 13 943 ist ein Verfahren zur - Herstellung von aceliulären Impfstoffen auf Ribonucleinsäurebasis, bei dem man pro 100 Gewichtsteile Ribonucleinsäure des oder der dem Vaccin entsprechenden Mikroorganismen zwischen 100 und 200 Gewichtsteile aus Bakterien extrahierte Membranlipopolysaccharide und -polysaccharide miteinander vermischt.
    Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß die Ribosomen von Bakterienzellen Träger der Impstoffaktivität sind und daß letztere nur zusammen mit einem Immunitätshilfsmitte! zur Wirkung kommt. Erfindungsgemäß wird dieses lösliche Hilfsmittel aus Zellmembranen von Bakterien in Form einer Saccharidfraktion extrahiert.
    Gegenstand der Erfindung ist eine Verbesserung und weitere Ausgestaltung des in der Patentschrift 26 13 943 beschriebenen Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
    a) die Ribosomenfraktion mindestens eines pathogenen Bakterienstammes, der die zu behandelnde oder zu verhindernde Krankheit hervorruft, und
    b) die Saccharidfraktion, die aus Bakterienmembranen mindestens eines Bakterienstammes des Genus Klebsieila, Serratia oder Corynebacterium extrahiert ist,
    in einem Gewichtsverhältnis von Ribosomenfraktion zu Saccharidfraktion zwischen 0,5 und 1 miteinander vermischt.
    Gemäß einer zweckmäßigen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die Saccharidfraktion des Impfstoffs aus Bakterienmembranen mindestens eines der folgenden Bakterienstämme extrahiert:
    Klebsiella pneumoniae,
    Klebsieila rhinoscleromatis,
    Serratia corallina,
    Serratia indica.
    Serratia keilensis,
    Serratia kiliensis,
    Serratia marsescens,
    Serratia plymuthica,
    -, Corynebacterium avidum,
    Corynebacterium bovis,
    Corynebacterium enzymicum,
    Corynebacterium equi,
    Corynebacterium fascians,
    ίο Corynebacterium flaccumfaciens,
    Corynebacterium flavidum,
    Corynebacterium fusiforme,
    Corynebacterium granulosum,
    Corynebacterium helvolum,
    Corynebacterium hypertrophicans, Corynebacterium insidiosum,
    Corynebacterium liquefaciens,
    Corynebacterium parvum,
    Corynebacterium parvum infectiosum, Corynebacterium paurometabolum, Corynebacterium pyogenes,
    Corynebacterium tumescens,
    Corynebacterium xerosis.
DE2735411A 1976-08-06 1977-08-05 Verfahren zur Herstellung von acellulären Impfstoffen auf Ribonucleinsäurebasis Expired DE2735411C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR7624124A FR2360314A2 (fr) 1976-08-06 1976-08-06 Nouveaux vaccins perfectionnes a base de fractions ribosomales

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2735411A1 DE2735411A1 (de) 1978-02-09
DE2735411C2 true DE2735411C2 (de) 1982-07-29

Family

ID=9176646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2735411A Expired DE2735411C2 (de) 1976-08-06 1977-08-05 Verfahren zur Herstellung von acellulären Impfstoffen auf Ribonucleinsäurebasis

Country Status (9)

Country Link
JP (1) JPS5320418A (de)
AU (1) AU511331B2 (de)
BE (1) BE857014R (de)
CA (1) CA1087093A (de)
DE (1) DE2735411C2 (de)
ES (1) ES461415A2 (de)
FR (1) FR2360314A2 (de)
GB (1) GB1590144A (de)
ZA (1) ZA774733B (de)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1133829A (en) * 1978-08-24 1982-10-19 Neil J.L. Gilmour Pasteurellosis vaccines
JPS55106066U (de) * 1979-01-19 1980-07-24
JPS639754Y2 (de) * 1979-01-25 1988-03-23
FR2471785A1 (fr) * 1979-12-21 1981-06-26 Fabre Sa Pierre Preparations immunostimulantes a base d'arn ribosomaux et procede de preparation des arn
FR2475900A1 (fr) * 1980-02-20 1981-08-21 Fabre Sa Pierre Complexe vaccinal contenant un antigene specifique et vaccin le contenant
US4388299A (en) 1980-03-31 1983-06-14 Norden Laboratories, Inc. Modified pasteurella bacteria and vaccines prepared therefrom
US4335106A (en) 1980-03-31 1982-06-15 Norden Laboratories Inc. Processes for the growth of a modified Pasteurella multocida bacteria and preparation of a vaccine therefrom
US4328210A (en) 1980-03-31 1982-05-04 Norden Laboratories, Inc. Modified Pasteurella bacteria and vaccines prepared therefrom
US4293545A (en) 1980-03-31 1981-10-06 Norden Laboratories, Inc. Modified Pasteurella multocida bacteria vaccines
US4506017A (en) * 1981-04-17 1985-03-19 Norden Laboratories, Inc. Modified Pasteurella haemolytica bacteria
US4559306A (en) * 1981-04-17 1985-12-17 Norden Laboratories, Inc. Modified Pasteurella multocida bacteria
US4626430A (en) * 1981-04-17 1986-12-02 Norden Laboratories, Inc. Processes for growth of modified Pasteurella haemolytica bacteria and preparation of a vaccine therefrom
JPS58191628A (ja) * 1982-05-04 1983-11-08 Aisin Seiki Co Ltd 車輌ル−フパネル開閉装置
JPS626614A (ja) * 1985-07-03 1987-01-13 株式会社チノー 温室の天窓制御装置
JPS62104526A (ja) * 1985-10-30 1987-05-15 株式会社チノー 温室の制御装置
FR2596064B1 (fr) * 1986-03-18 1990-02-02 Pf Medicament Procedes industriels de fabrication de vaccins ribosomaux et vaccins ribosomaux obtenus
DE19703437A1 (de) * 1997-01-30 1998-08-06 Luitpold Pharma Gmbh Gemische äußerer Membranen und/oder Zellwände von Bakterien zur oralen Immunisierung gegen Schleimhautinfektionen
GB2370839A (en) * 2001-01-06 2002-07-10 Benedikt Timmerman Immunogenic complex useful for disease control

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS51142528A (en) * 1975-05-19 1976-12-08 Fabre Sa Pierre Production of vaccine based on antigenic libosome fractionation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS-ERMITTELT

Also Published As

Publication number Publication date
AU511331B2 (en) 1980-08-14
AU2753877A (en) 1979-02-08
DE2735411A1 (de) 1978-02-09
GB1590144A (en) 1981-05-28
ES461415A2 (es) 1978-07-16
JPS5320418A (en) 1978-02-24
FR2360314B2 (de) 1980-04-25
BE857014R (fr) 1978-01-20
FR2360314A2 (fr) 1978-03-03
ZA774733B (en) 1978-07-26
CA1087093A (en) 1980-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2735411C2 (de) Verfahren zur Herstellung von acellulären Impfstoffen auf Ribonucleinsäurebasis
DE60103066T2 (de) Chlorella zubereitungen mit immunmodulatorischen eigenschaften
DE3485778T2 (de) Vielwertiges pneumokokken-vakzin und herstellung desselben.
DE2457090C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen sowie Antibronchialimpfstoff
DE2024586C3 (de)
DE2833545A1 (de) Hochmolekulare meningokokken- gruppe c-vaccine und verfahren zu ihrer herstellung
DE1195905B (de) Verfahren zum Abtrennen der Zellwaende von Mycobacterium phlei
DE2518474A1 (de) Mitogenes mittel, verfahren zu seiner herstellung und diese mittel enthaltende arzneimittel und biologische reagenzien
DE69633233T2 (de) Multivalenter impstoff gegen bovines coronavirus und methode zur behandlung einer infektion mit bovinem coronavirus
EP0082890B1 (de) Verfahren zur Herstellung von immunbiologischen Präparaten, geeignet für den Nachweis von, die Vorbeugung gegen und/oder die Behandlung von Infektionen durch Candida guilliermondii
DE2613943C3 (de) Herstellung von Vaeeinen auf Ribonucleinsäurebasis
DE2756851A1 (de) Adjuvantien unspezifischer immunitaet
Rogers et al. The recognition of material present in horse muscle affecting the formation of α-toxin by a strain of Clostridium welchii
EP0173950A2 (de) Neuer alpha-Glukosidase Inhibitor, Verfahren zur seiner Herstellung, seine Verwendung und pharmazeutische Präparate
DE2845745C2 (de)
CH639667A5 (de) Verfahren zur herstellung von peptidkomplexen aus dns-haltigen organismen.
DE1185335B (de) Verfahren zur Herstellung von neuen Staphylococcen-Antigenen
DE2403733A1 (de) Neue lipopolysaccharide und verfahren zu ihrer herstellung
DE1265916B (de) Verfahren zur Herstellung eines Brucellose-Impfstoffs
DE69724156T2 (de) Aus mycobacterium tuberculosis extrahierter kohlenwasserstoffkomplex und verfahren zu dessen herstellung
DE2141901C3 (de) Steriler Impfstoff, der abgetötete Organismen des genus Fusiformis nodosus enthält
CN114853825B (zh) 一种从刺糖中制备海藻糖的方法及其应用
DE1966436C3 (de) Verwendung einer Antigen-Immunserum-Kombination als Impfstoff
DE1617605A1 (de) Antigenherstellung und Vakzine
DE1492042C (de) Verfahren zur Herstellung eines Pertussi-Antigens

Legal Events

Date Code Title Description
OD Request for examination
AF Is addition to no.

Ref country code: DE

Ref document number: 2613943

Format of ref document f/p: P

D2 Grant after examination
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: P.F. MEDICAMENT S.A., PARIS, FR

8328 Change in the person/name/address of the agent

Free format text: BARTELS, H. HELD, M., DIPL.-ING. DR.-ING. FINK, H., DIPL.-ING., PAT.-ANW., 7000 STUTTGART